JP5232992B2 - グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤 - Google Patents
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Description
Laurent Meijer, Marc Flajolet and Paul Greengard, Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase 3, TRENDS in Pharmacological Sciences Vol.25 No.9 September 2004 p471-480
また、請求項2記載のGSK-3β阻害剤は、請求項1記載のGSK-3β阻害剤において、有効成分が前記一般式で表される化合物においてmが1で表される化合物であることを特徴とする。
また、請求項3記載のGSK-3β阻害剤は、請求項1または2記載のGSK-3β阻害剤において、有効成分が6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートであることを特徴とする。
・ 4-メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)4-SO-Me)
・ 6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)6-SO-Me)
・ 6-メチルスルフォニルヘキシルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)6-SO2-Me)
・ 7-メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)7-SO-Me)
・ 8-メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)8-SO-Me)
・ 9-メチルスルフィニルノニルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)9-SO-Me)
これらの化合物は、いずれも文献公知の化合物であり、市販もされている化合物である。中でも、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、ワサビに含まれる化合物としてよく知られている(その単離精製方法については例えばH. Etoh, et al., Agric. Biol. Chem., 54, 1587-1589 (1990)を参照のこと)。また、J. Kawabata, et al., Agric. Biol. Chem., 53, 3361-3362 (1989)には、8-メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートの合成方法が記載されており、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、8-メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートの合成方法に準じて合成することができる。なお、6-メチルスルフォニルヘキシルイソチオシアネートは、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを酸化することにより合成することができる。その他の化合物についても、同様の方法で合成することができる。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート(LKT laboratories, Inc.より購入)の10μM(溶媒:DMSO)におけるGSK-3β阻害活性を、Leclerc, S., et al., J. Biol. Chem., 276, 251(2001)記載の方法に従って測定した。即ち、昆虫のSf21細胞に発現させたヒトGSK-3βと5μMのPhospho-Glycogen Synthase Peptide-2を基質として用い、20mM MOPS (pH7.2)、5mM EGTA、20mM MgCl2、1mM DTT、25mM β-Glycerophosphate、1mM Na3VO4、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート(終濃度10μM)を添加した反応液(1% DMSO含有)にて37℃、15分間プレインキュベーションした後、基質として[32P]-γ-ATPを加え30分間反応させた。反応後、反応液をホスフォセルロースペーパーにスポット後、十分に1%リン酸水溶液中で洗浄してから乾燥し、液体シンチレーションカウンターにてリン酸化されたPhospho-Glycogen Synthase Peptide-2のカウントを測定した。その結果、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートのGSK-3βによるリン酸化反応に対する阻害率は42%であった(対:6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを添加しないコントロール)。従って、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、GSK-3βに対して優れた阻害作用を有することがわかった。一方、比較対照として、6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネート(S=C=N-(CH2)6-S-Me:LKT laboratories, Inc.より購入)の10μM(溶媒:DMSO)におけるGSK-3β阻害活性を測定したところ、阻害率は4%であった(対:6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを添加しないコントロール)。従って、わずかな化学構造の違いでGSK-3β阻害活性が大きく異なることがわかった。
表1に示す化合物(LKT laboratories, Inc.より購入)のGSK-3β阻害活性を、より簡便なGSK-3β活性の測定方法である基質のATPの減少を化学発光により定量する方法で測定した。即ち、40mM Tris-HCl (pH7.5)、20mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、0.2mM DTTの緩衝液に、1μM ATP、25ng ヒトGSK-3β、メタノールに所定の濃度で溶解した化合物2.5μlを加えて37℃、10分間プレインキュベーションした後、基質として2.5μMのPhospho-Glycogen Synthase Peptide-2を加え120分間反応させた。反応後、プロメガ社のKinase-Glo Luminecent Kinase Assayを説明書通りに加え、10分後プレートリーダーにて反応によって減少したATP量を定量した。10μMでのそれぞれの化合物のGSK-3βによるリン酸化反応に対する阻害率(%,対:被検物質を添加しないコントロール,n=2の平均)を表1に示す。表1から明らかなように、比較対照とした6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネート以外は、その構造に応じてGSK-3β阻害活性を有していた。
Lochhead, P.A., et al., Diabetes, 50, 937-946 (2001)記載の方法に従って、ラット肝臓由来細胞H4IIEを用いて調べた。即ち、10%牛胎仔血清を含むDMEMで培養し、コンフルエントとした細胞を無血清条件で24時間培養した後、500nM dexamethasoneおよび0.1mM Bt2cAMPを含むDMEM+0.1%牛血清アルブミン(BSA)培地に交換すると同時に、インスリン、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネート、メタノールのいずれかを加えるか、またはいずれも加えない条件で24時間培養した。また、コントロールとしてDMEM+0.1%BSA培地のみで細胞を培養した。培養後、それぞれの細胞からtotal RNAを調製し、Northern blotting法にてPEPCKおよびG6Paseの遺伝子発現量を定量した。結果をそれぞれ図1と図2に示す。なお、図1における縦軸は、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞におけるPEPCK遺伝子の発現量を100とした相対量(%)であり、平均±標準誤差(n=6〜9)を表す。図2における縦軸は、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞におけるG6Pase遺伝子の発現量を100とした相対量(%)であり、平均±標準誤差(n=6〜10)を表す。化合物Aは6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを表し、化合物Bは6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネートを表す(溶媒:メタノール)。異なる符号は処理間の有意差を示す(p<0.05)。
図1と図2から明らかなように、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞におけるPEPCKとG6Paseの遺伝子発現を顕著に抑制し、その程度はインスリン(10nM)とほぼ同じであった。一方、6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネートには、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞におけるPEPCKとG6Paseの遺伝子発現を抑制する作用は認められなかった。
Ito, Y., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 2191-2198 (2006)記載の方法に従って、ラット肝臓由来細胞H4IIEを用いて調べた。即ち、10%牛胎仔血清を含むDMEMで培養し、コンフルエントとした細胞を無血清条件で24時間培養した後、500nM dexamethasoneおよび0.1mM Bt2cAMPを含むDMEM+0.1%牛血清アルブミン(BSA)培地に交換すると同時に、インスリン、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネート、メタノールのいずれかを加えるか、またはいずれも加えない条件で24時間培養した。また、コントロールとしてDMEM+0.1%BSA培地のみで細胞を培養した。その後、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、20mMピルビン酸ナトリウムおよび2mM乳酸ナトリウムを含むDMEM(グルコースおよびフェノールレッド不含)培地に替え、さらに4時間培養した後、培養上清を回収し、培養液中のグルコース量を測定し、プレートのタンパク質量で補正した。結果を図3に示す。なお、図3における縦軸は、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞の培地へのグルコース放出量(細胞タンパク質量で補正)を100とした相対量(%)であり、平均±標準誤差(n=8)を表す。化合物Aは6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを表し、化合物Bは6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネートを表す(溶媒:メタノール)。異なる符号は処理間の有意差を示す(p<0.05)。
図3から明らかなように、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞における糖新生を抑制することで、培地へのグルコース放出を抑制した。一方、6-メチルスルフェニルヘキシルイソチオシアネートには、培地へのグルコース放出を抑制する作用は認められなかった。従って、実施例3と実施例4の結果から、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞におけるPEPCKとG6Paseの遺伝子発現に及ぼす作用と糖新生に及ぼす作用との間には、相関性があることが確認できた。
表2に示す化合物(LKT laboratories, Inc.より購入)について実施例4と同様にして調べた。結果を表2に示す。表2から明らかなように、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート類縁体も、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートと同様に、Dex/Bt2cAMPで刺激した細胞の培地へのグルコース放出を抑制する作用を有していた。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート1.5gを可溶化剤としてエタノールを含有する生理食塩水100 mlに溶解し(合計1.5 g/100 ml)、バイアルに充填した後、加熱殺菌を行って、静注用注射剤を製造した。
以下の組成で各成分を混合し、打錠して、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートを50 mg含む500 mgの錠剤400個を製造した。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート ・・・ 20 g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 6 g
ステアリン酸タルク ・・・ 4 g
6 % HPC乳糖 ・・・ 170 g
(合計200 g)
以下の組成で各成分を混合し、圧縮成形し、粉砕し、整粒して、20〜50メッシュの5 %顆粒剤を製造した。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート ・・・ 10 g
乳糖 ・・・ 187 g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 3 g
(合計200 g)
以下の組成で各成分をよく混合し、混合物を1号カプセルに充填して、カプセル剤300個を製造した。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート ・・・ 5 g
乳糖 ・・・ 40 g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 50 g
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ・・・ 3.5 g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 1.5 g
(合計100 g)
以下の各成分を滅菌精製水100 mlに溶解し、常法により点眼剤を製造した。
6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート ・・・ 5 g
塩化ナトリウム ・・・ 0.9 g
塩化ベンザルコニウム ・・・ 微量
1 N 水酸化ナトリウム ・・・ 適量
1 N 塩酸 ・・・ 適量
エタノール ・・・ 適量
Claims (3)
- 一般式:S=C=N-(CH2)n-S(O)m-R(Rは低級アルキル基、mは1または2、nは2〜10の整数である)で表される化合物を有効成分とすることを特徴とするグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤(但し、2型糖尿病とアルツハイマー病の予防・治療の用途を除く)。
- 有効成分が前記一般式で表される化合物においてmが1で表される化合物であることを特徴とする請求項1記載のグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤。
- 有効成分が6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートであることを特徴とする請求項1または2記載のグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤。
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