JP5224457B2 - 変異型ルシフェラーゼ - Google Patents
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Description
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(2)上記第375番目のリジンが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択されるアミノ酸に置換されていることを特徴とする、(1)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(5)上記第178番目のメチオニンがリジンに置換されていることを特徴とする、(4)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(8)上記第167番目のトレオニンがリジンに置換されていることを特徴とする、(7)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(11)上記第404番目のアスパラギンがグリシン又はセリンに置換されていることを特徴とする、(10)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(14)上記第405番目のトレオニンがイソロイシン又はメチオニンに置換されていることを特徴とする、(13)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(17)上記第406番目のセリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、(16)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(20)上記第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されていることを特徴とする、(19)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(23)以下の(A)〜(G)のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、(22)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(B)上記第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
(24)上記発光スペクトルピークが466nm〜490nmであることを特徴とする、(22)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(26)以下の(A)〜(G)のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、(25)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(B)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
(27)上記発光スペクトルピークが420nm〜435nmであることを特徴とする、(25)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質
(c)外来タンパク質又はペプチドと上記(a)又は(b)のタンパク質とが連結された融合タンパク質
(33)(32)記載の形質転換体の培養物又は培養上清をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と各ルシフェラーゼ活性に基づく発光スペクトルの発光強度を測定する工程とを含み、2以上のプロモーターの転写活性を評価することを特徴とする、プロモーター転写活性評価方法。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換;
(B)上記第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換;
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換;
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換;
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換;
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換;
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)上記第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換;
(B)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換;
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換;
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換;
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換;
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換;
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、分泌シグナルペプチドを欠失したアミノ酸配列から成る成熟タンパク質。
サッカロミセス・セレビシエにおいて、CLucを分泌発現させる発現ベクターとして、国際公開第2006/132350号パンフレットに開示のプラスミドpCLuRA-TDH3を用いた。
2-1.変異型CLuc遺伝子ライブラリー(N領域変異型ライブラリー)の作製
プラスミドpCLuRA-TDH3のαCLucコード領域にError Prone PCR (誤りがちPCR)を用いてランダム点突然変異を導入した。
mut-CLuc-NR2: CACGTGTGAGGCTCGCTCGTCTCCACCCAT(配列番号9)
N領域を対象としたError Prone PCRの反応液の組成は以下の通りであった:Taq DNA polymerase(ロッシュ、1 unit/μl)5μl; 10xPCR buffer without magnesium ion 10μl; Error Prone PCR用デオキシヌクレオチド混合溶液10μl; 25mM塩化マグネシウム28μl; 5mM塩化マンガン2.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(150ng/μl)1μl; mut-Cluc-F(配列番号8)(10pmol/μl)3μl; mut-CLuc-NR2(配列番号9)(10pmol/μl)3μl; 滅菌水37.3μl。
SQ-CLuc-NF2: TTCTCGAGCCGTACAAGGACAGCTGCCGCA(配列番号11)
PCRの反応液の組成は、以下の通りであった:KOD plus DNA polymerase(東洋紡績)1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; vec-CLuc-R(配列番号10)(10pmol/μl)1.5μl; SQ-CLuc-NF2(配列番号11)(10pmol/μl)1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(150ng/μl)1μl; 滅菌水33μl。
上述のN領域変異型ライブラリーの作製と同様に、αCLucコード領域の後半部分を変異を導入する対象領域としたC領域変異型ライブラリーを作製した。
mut-CLuc-R: AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT(配列番号13)
得られたPCR産物を、1%アガロースで電気泳動した結果、約1,100bpのDNA断片を確認した。次いで、このDNA断片(C領域断片)を、アガロースゲルからシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSを用いて精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液に溶解し、C領域断片溶液を得た。
SQ-CLuc-CR1: TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT(配列番号15)
PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、55℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
発光スペクトルがシフトした変異型ルシフェラーゼのスクリーニングは、その発光を、透過特性が異なる2種類の光学フィルターを使って、CCDカメラで順次撮影することによって行った。使用した光学フィルターは、SCHOTT社のGG495とBG28である。前者は、495nm付近を境とするロングパスフィルターである。後者は、450nm付近を透過極大とするバンドパスフィルターである。同一試料(ルシフェラーゼが含まれる培養上清)を、それぞれのフィルターを順次使用してCCDカメラで撮影し、その記録された信号強度を比較した。その比率が野生型CLucと異なっていれば、発光スペクトルのシフトが起きていることになる。
以下の(a)〜(d)の形質転換酵母を、それぞれbuffered SD-ura培地で振盪培養した後、遠心分離によって、その培養上清を回収した。回収した培養上清を、それぞれVivaSpin(分画分子量10,000、ザルトリウス社)で10倍程度に濃縮した。
(b)M178K変異体
(c)K375R変異体
(d)K375E変異体
次いで、得られた各培養上清の濃縮液を、ATTO社AB-1850発光分光光度計に供し、発光スペクトルを測定した。
ATTO社AB-1850発光分光光度計にて測定したスペクトルについては、以下のように、さらにデータを処理して、スペクトルピークを求めた。
実施例2に記載のスクリーニングの結果、T167I変異体(配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンがイソロイシンに置換されたT167I変異型CLucを有するクローン;第3変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する)を得た。このクローンが保持するプラスミドを「pCLuRA-TDH3[T167I]」と称する。このT167I変異体が分泌する変異型CLucによる発光スペクトルピークは、実施例2の2-5に記載した方法で測定した結果、458nmであり、野生型CLucと比べて4nm長波長側にシフトしていた。
プラスミドpCLuRA-TDH3[K375R]をもとにして、そのαCLuc遺伝子のうち、αファクターの分泌シグナルペプチド(アミノ酸配列:配列番号3)をコードする部分に変異を導入し、新たなプラスミド「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]」を作製した。このプラスミドでは、K375R変異に加えて、配列番号3と配列番号6に示される第21番目のプロリンがロイシンに置換されている(これを、以後「αP21L変異」と称する)。αP21L変異を有するαファクターの分泌シグナルペプチドは、そのC末端側に連結されている分泌されるべきタンパク質の分泌量を7倍以上に向上させる(特許文献3)。αP21L変異導入により、ルシフェラーゼの分泌量が増加し、結果として発光強度が増強される。当然、このプラスミドにコードされているCLucは、K375R変異型CLucである。なお、プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L](特許文献3)とは、pCLuRA-TDH3のαCLuc遺伝子について、配列番号3と配列番号6に示される第21番目のプロリンがロイシンに置換されるべく、配列番号7において762番目の塩基シトシンがチミンに塩基置換されているプラスミドである。
実施例2に記載の方法で新たな変異型CLuc遺伝子ライブラリーを作製した。ただし、PCRの鋳型として、プラスミドpCLuRA-TDH3の代わりにpCLuRA-TDH3[αP21L]を用いた。実施例2に記載の方法でスクリーニングを行った結果、配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第405番目のトレオニンがイソロイシンに置換されたT405I変異型CLucを有するクローン(第5変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する)を得た。
培養上清中に分泌されたCLucの精製を容易にするため、C末端にヒスチジンタグが付与され、且つαP21L変異を含むαCLuc(配列番号20)を発現するプラスミド「pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]」を構築した。配列番号23は、プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]の部分塩基配列である。
7-1.第375番目に相当するリジンが他のアミノ酸に置換された一群の変異型CLucを発現させるためのプラスミド
実施例2に示したとおり、配列番号2において第375番目に相当するリジンをアルギニン又はグルタミン酸に置換すると、発光スペクトルピークが長波長側にシフトする。そこで、第375番目のアミノ酸が、通常のタンパク質を構成する20種のアミノ酸のうちの1つとなっている一群の変異型(及び野生型)CLucを分泌発現させるための一群のプラスミドを、以下の7-2及び7-3に記述する方法で作製した。
以下のように4種のPCRと細胞内組換えによって、配列番号2において第375番目に相当するアミノ酸の飽和変異ライブラリーを構築した。
用いたオリゴDNAプライマーはK446X-F: TGAAGTAGAGAAAGTACGAATCAGGNNNCAATCGACTGTAGTAGTAGAACTCA(配列番号24)とmut-CLuc-R(配列番号13)であった。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった:KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; K446X-F(配列番号24)(10pmol/μl) 0.6μl; mut-CLuc-R(配列番号13)(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、45℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
用いたオリゴDNAプライマーはK446-R: CCTGATTCGTACTTTCTCTACTTCA(配列番号25)とmut-CLuc-F(配列番号8)であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった:KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; K446-R(配列番号25)(10pmol/μl) 0.6μl; mut-CLuc-F(配列番号8)(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 14.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、45℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
用いたオリゴDNAプライマーはmut-CLuc-F(配列番号8)とmut-CLuc-R:(配列番号13)であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった:KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; mut-CLuc-F(配列番号8)(10pmol/μl) 1.5μl; mut-CLuc-R(配列番号13)(10pmol/μl) 1.5μl; DNA溶液J 1μl; DNA溶液K 1μl; 滅菌水 33μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で2分20秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
用いたオリゴDNAプライマーはvec-CLuc-F(配列番号14)とvec-CLuc-R:(配列番号10)であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった:KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; vec-CLuc-F(配列番号14)(10pmol/μl) 1.5μl; vec-CLuc-R(配列番号10)(10pmol/μl) 1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 34μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で7分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
配列番号2において第375番目に相当するアミノ酸をコードするコドンが、フェニルアラニンをコードするコドンになっているプラスミドであるpCLuRA-TDH3[αP21L,K375F,-(GS)3H6]を以下のようにして作製した。
上記7-2及び7-3で得た20種の各プラスミドで、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,K375K,-(GS)3H6]で形質転換されたサッカロミセス・セレビシエが分泌するCLucは野生型CLucであり、それ以外の19種のプラスミドで形質転換されたサッカロミセス・セレビシエが分泌するCLucは変異型CLucである。それぞれ、実施例2に記載の方法で培養し、培養上清を用いて発光スペクトルを測定した。
8-1.N404飽和変異ライブラリーの作製
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第404番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。
以下、実施例2の2.3及び2.4と同じ方法により発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜し、さらに発光スペクトルを測定した。
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第405番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例8と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第406番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例8と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第407番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例8と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第167番目のアミノ酸がトレオニンからリジンに、さらに第375番目のアミノ酸がリジンからアルギニンに置換された二重変異型CLuc(第1及び第3変異型ルシフェラーゼ)をコードするDNAを以下のように作製した。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてT167KとQ403Pの二重変異型CLuc(第3変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてT167KとN404Gの二重変異型CLuc(第3及び第4変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてT167KとT405Iの二重変異型CLuc(第3及び第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
16-1.L197飽和変異ライブラリーの作製
配列番号2に示されるアミノ酸配列において第197番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例8と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてM178KとL197Pの二重変異型CLuc(第2変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号6に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は、配列番号6に示されるアミノ酸配列において第21番目の位置に相当する変異を含むDNA断片と、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第178番目及び第197番目のアミノ酸の位置の2つの変異を含むDNA断片をPCRにより増幅し、この2つのDNA断片を用いたオーバーラップPCRにより作製した。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてK375RとQ403Pの二重変異型CLuc(第1変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてK375RとN404Gの二重変異型CLuc(第1及び第4変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてK375RとT405Iの二重変異型CLuc(第1及び第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404Gの二重変異型CLuc(第4変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとT405Iの二重変異型CLuc(第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてN404GとT405Iの二重変異型CLuc(第4及び第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
23-1.第403番目、第404番目及び第405番目の位置における三重変異型CLuc遺伝子の作製(1)
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Iの三重変異型CLuc(第4及び第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Mの三重変異型CLuc(第4及び第5変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405MとS406Lの四重変異型CLuc(第4〜第6変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの五重変異型CLuc(第4〜第7変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてT167KとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの六重変異型CLuc(第3〜第7変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてK375RとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの六重変異型CLuc(第1及び第4〜第7変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。また、配列番号6に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてT167KとK375RとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの七重変異型CLuc(第1及び第3〜第7変異型ルシフェラーゼ)をコードする遺伝子を作製した。また、配列番号6に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は実施例12と同様である。
29-1.Q403P/N404G/T405M三重変異型CLucのC末端におけるHis-tagの導入
配列番号2に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Mの三重変異型CLuc(第4及び第5変異型ルシフェラーゼ)について、CLuc遺伝子の下流にHis-tag遺伝子を連結したCLuc-(GS)3H6遺伝子を作製した。また、配列番号6に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。
pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。なお、ここでは、配列番号23の塩基番号を用いて説明する。変異の導入方法としては、CLucを配列番号23において第900番目から第1813番目までのN末端側と第1554番目から第2699番目までのC末端側に分け、それぞれPCRで増幅する際にヌクレオチドの濃度を不均一にした。
pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。変異の導入方法は実施例29の29-2と同様である。
(2) R87S/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(3) K38R/R79S/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc
(4) L191Q/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(5) V75E/K126E/M223I/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M八重変異型CLuc
(6) K38I/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(7) S45G/E170G/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc
これらは、いずれも第4及び第5変異型ルシフェラーゼに相当する。それぞれの変異型CLucの発光スペクトルピークを、以下の表2に示す。
pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。変異の導入方法は実施例29の29-2と同様である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (13)
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、下記7つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
(A)第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換、
(B)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
(C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
(D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
(E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
(F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
(G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ下記7つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
(A)第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換、
(B)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
(C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
(D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
(E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
(F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
(G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、下記7つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
(A)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
(B)第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換、
(C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
(D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
(E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
(F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
(G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ下記7つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
(A)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
(B)第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換、
(C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
(D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
(E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
(F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
(G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンがリジン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンがリジン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第406番目のセリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第375番目のリジンがアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択される1種のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンがアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択される1種のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質 - 外来タンパク質又はペプチドと請求項1〜6のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼとが連結された融合タンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項7記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項8記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項9記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項8記載の遺伝子、並びに以下の(a)〜(c)のタンパク質から成るルシフェラーゼ又は融合タンパク質をコードする遺伝子から成る群より選択される2以上の遺伝子がそれぞれ異なるプロモーターの制御下に配置されていることを特徴とする、請求項10記載の形質転換体。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質
(c)外来タンパク質又はペプチドと上記(a)又は(b)のタンパク質とが連結された融合タンパク質 - 請求項11記載の形質転換体の培養物又は培養上清をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と、
各ルシフェラーゼ活性に基づく発光スペクトルの発光強度を測定する工程と、
を含み、2以上のプロモーターの転写活性を評価することを特徴とする、プロモーター転写活性評価方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項7記載の融合タンパク質をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と、
励起状態のオキシルシフェリン又はその誘導体を化学物質に作用させる工程と、
を含み、前記化学物質の励起に基づき発光させるか又はエネルギーを放出させることを特徴する、発光又はエネルギー放出方法。
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