JP5220598B2 - キャピラリーゾーン電気泳動の感度を向上させるための方法及び装置 - Google Patents
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Description
本発明は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の感度を向上させるための新規な方法及び装置に関する。本発明は特に、キャピラリーゾーン電気泳動にかけるサンプルを濃縮するためにインラインゾル−ゲルカラムを収容しているチャネルを含むデバイス及びキャピラリーゾーン電気泳動の感度を高めるための前記デバイスの使用に関する。
タンパク質、ポリペプチド及びＤＮＡを含めた生体分子の分析に対する要望は増えつつある。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）はサイズまたは電荷に基づいて分子を分離するための方法である。キャピラリー電気泳動では、分子を流体が充填されているキャピラリーチューブに導入し、電場を印加する（Ｇ．Ｋｅｍｐ，“CAPILLARY ELECTROPHORESIS: A VERSATILE FAMILY OF ANALYTICAL TECHNIQUES”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：９−１７（１９９８）；Ｄ．Ｗｕら，（１９９２）参照）。キャピラリー電気泳動技術はＨ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら，“SEPARATION OF PROTEINS AND PEPTIDES BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS: APPLICATION TO ANALYTICAL BIOTECHNOLOGY”，Ｂｅｃｋｍａｎ．ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｎｏ．７２７４８４により検討されている。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、最小のサンプル容量要件で迅速且つ高効率でサンプルを分離できるために生体分子を分離するための従来のスラブゲル電気泳動に代わる魅力的な方法になった（Ｍ．Ｒ．Ｍｏｎｔｏｎ，“RECENT DEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASS SPECTROMETRY OF PROTEINS AND PEPTIDES”，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２１（１）：５−１３（２００５））。キャピラリー電気泳動を実施するための多数のアプローチは既に記載されている（例えば、米国再発行特許第３７，６０６号、米国特許第６，４４０，２８４号、同第６，４３６，６４６号、同第６，４１０，６６８号、同第６，３７２，３５３号、同第６，３５８，３８５号、同第６，３５５，７０９号、同第６，３１６，２０１号、同第６，３０６，２７３号、同第６，２７４，０８９号、同第６，２３５，１７５号、同第６，１５３，０７３号、同第６，１２９，８２６号、同第６，１０７，０４４号、同第６，０７４，５４２号、同第６，０６８，７５２号、同第６，０４２，７１０号、同第６，０３３，５４６号、同第６，００１，２３２号、同第５，９８９，３９９号、同第５，９７６，３３６号、同第５，９６４，９９５号、同第５，９５８，６９４号、同第５，９４８，２２７号、同第５，９１６，４２６号、同第５，８９１，３１３号、同第５，８４６，３９５号、同第５，８４０，３８８号、同第５，７７７，０９６号、同第５，７４１，４１１号、同第５，７２８，２８２号、同第５，６９５，６２６号、同第５，６６５，２１６号、同第５，５８２，７０５号、同第５，５８０，０１６号、同第５，５６７，２９２号、同第５，５５２，０２８号、同第５，５４５，３０２号、同第５，５３４，１２３号、同第５，５１４，５４３号、同第５，５０３，７２２号、同第５，４２３，９６６号、同第５，４２１，９８０号、同第５，３８４，０２４号、同第５，３７４，５２７号、同第５，３７０，７７７号、同第５，３６４，５２０号、同第５，３３２，４８１号、同第５，３１０，４６２号、同第５，２９２，４１６号、同第５，２９２，３７２号、同第５，２６４，１０１号、同第５，２５９，９３９号、同第５，１３９，６３０号、同第５，１２０，４１３号、同第５，１１２，４６０号、同第５，０１５，３５０号、同第４，８６５，７０６号参照）。ＣＥでは通常２つの主な分離メカニズム、すなわちアナライトの分子サイズの差に基づいて分離する方法及びアナライトの電荷密度（電荷／質量比）の差を利用して分離する方法が使用されている。
アナライトを分子サイズの差に基づいて分離するために“キャピラリーゲル電気泳動”（“ＣＧＥ”）が使用されている。典型的には、ＣＧＥはコントロールされた孔径を有するゲルマトリックスを用いて実施される。異なるサイズの分子がゲルマトリックスに貫入する能力の差から分離が生ずる。小さい分子は大きな分子よりも分離ゲル中をより迅速に移動するのでサイズ分離が達成される。ＣＧＥをポリペプチド及びタンパク質と使用するためには、すべてのアナライトが同一の有効電荷密度を有するように通常、分子を（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて）変性させる必要がある。ＣＧＥは、Ｓ．Ｒ．Ｂｅａｎら，“SODIUM DODECYL SULFATE CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF WHEAT PROTEINS. 1. UNCOATED CAPILLARIES”，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７（１０）：４２４６−５５（１９９９）；Ｄ．Ｗｕら，“SODIUM DODECYL SULFATE-CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS USING NON-CROSS-LINKED POLYACRYLAMIDE”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：３４９−３５６（１９９２）；Ｒ．Ｌａｕｓｃｈら，“RAPID CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６５４：１９０−１９５（１９９３）；Ｔ．Ｍａｎａｂｅら，“SIZE SEPARATION OF SODIUM DODECYL SULFATE COMPLEXES OF HUMAN PLASMA PROTEINS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS EMPLOYING LINEAR POLYACRYLAMIDE AS A SIEVING POLYMER”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：２３０８−２３１６（１９９８）；及びＫ．Ｇａｎｚｌｅｒら，“High-Performance Capillary Electrophoresis of SDS-Protein Complexes Using UV-Transparent Polymer Networks”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６４：２６６５−２６７１（１９９２）において検討されている。
対照的に、“キャピラリーゾーン電気泳動”（“ＣＺＥ”、自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）としても公知）は電荷密度の差に基づいてアナライトを分離する。電荷密度の差により電気泳動移動度に差が生じ、よって泳動速度に差が生ずる。一般的にいって、ＣＺＥはサンプルをキャピラリーチューブに導入し、前記チューブに電場を印加することを含む。電場によりサンプルはチューブを通って引き寄せられ、その構成成分に分離される（すなわち、サンプル成分の各々はそれ自体の電気泳動移動度を有している；より速い移動度を有している成分はより遅い移動度を有している成分よりもより速くキャピラリー中を移動する）。その結果、サンプルの成分はキャピラリーチューブを通って泳動中にキャピラリーチューブ中の別個のゾーンに分割される。オンライン検出器を使用して、分離を連続的にモニターし、別個のゾーンに基づいて各種成分に関するデータが得られ得る。前記検出器は特定波長での各成分による光の吸光度を測定する。各種成分は光を異なって吸収する。このために、成分は相互に区別され得る。
ＣＺＥの２つの一般的なカテゴリーがキャピラリーカラムの内容物に基づいて記載され得る。“ゲル”ＣＺＥでは、キャピラリーチューブに適当なゲル（例えば、ポリアクリルアミドゲル）を充填する。サンプル中の成分の分離は一部ゲルマトリックス中を移動する成分のサイズ及び電荷に基づく。“オープン”ＣＺＥでは、キャピラリーチューブに導電性バッファー溶液を充填する。キャピラリーをイオン化すると、負に荷電したキャピラリー壁はバッファーから正イオンの層を引き寄せる。イオンが電気ポテンシャルの影響下でカソードに向かって流れると、バルク溶液（バッファー溶液及び分析するサンプル）も電気的中性を維持するためにこの方向に流れなければならない。この電気浸透流により、電荷に関係なく中性種及びイオン種の両方をカソードの方に動かす一定速度成分が与えられる。ヒュームドシリカは原則として、ＣＺＥ中で使用される比較的高い電圧に耐えることができ、ヒュームドシリカキャピラリーの内壁はイオン化して、所望の電気浸透流を生じさせる負の電荷を発生させるのでキャピラリーチューブの材料として使用される（例えば、国際特許出願公開第９３１０２５８号参照）。
ＣＺＥを用いて最適分離を達成するためには、使用するバッファー溶液が均質であること及びキャピラリーの長さのどこでも一定の電場強度を使用することが重要である。分離は主に溶質上の酸性基のｐＨ制御解離または溶質上の塩基性官能基のプロトン化に頼っている。よって、ＣＺＥのアナライトを分離する能力及び分離の程度または限度はバッファー系のｐＨを変化させるかまたはそのイオン強度を変化させることにより強化され得る。典型的には、オープンＣＺＥにおいて使用されるバッファーのｐＨはサンプル中の成分の等電点（ｐＩ）を参照して選択される。
ＣＺＥはＪ．Ｐ．Ｑｕｉｒｉｎｏら，“SAMPLE STACKING OF CATIONIC AND ANIONIC ANALYTES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１１９−１３５（２００１）；Ｖ．Ｋａｓｉｃｋａ，“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS AND CAPILLARY ELECTROCHROMATOGRAPHY OF PEPTIDES”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４（２２−２３）：４０１３−４０４６（２００４）；Ｖ．Ｋａｓｉｃｋａ，“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF PEPTIDES”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１９）：４１３９−４１６２（２００１）；Ｘ．Ｂｏｓｓｕｙｔ，“SEPARATION OF SERUM PROTEINS BY AUTOMATED CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，４１（６）：７６２−７７２（２００３）；及びＭ．Ｒ．Ｍｏｎｔｏｎ，“RECENT DEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASS SPECTROMETRY OF PROTEINS AND PEPTIDES”，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２１（１）：５−１３（２００５）により、米国特許出願公開第２００２／００２９９６８号（Ｔａｎら）；同第２００２／００５５１８４号（Ｎａｙｌｏｒら）；同第２００２／０１１９４８２号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第２００３／００５７０９２号（Ｃｈｉｅｎら）；同第２００３／０２１７９２３（Ｈａｒｒｉｓｏｎら）；同第２００３／０２２４４３６号（Ｎｅｌｓｏｎら）；米国特許第４，４８３，７７３号（Ｙａｎｇ）；同第４，７９３，９２０号（Ｃｏｒｔｅｓら）；同第５，１２０，４１３号（Ｃｈｅｎら）；同第５，１３９，６３０号（Ｃｈｅｎ）；同第５，１４５，５６７号（Ｈｓｅｉｈら）；同第５，１６４，０５５号（Ｄｕｂｒｏｗ）；同第５，２０２，００６号（Ｃｈｅｎ）；同第５，２６４，０９５号（Ｈｓｅｉｈら）；同第５，３１０，４６２号（Ｃｈｅｎ）；同第５，３４０，４５２号（Ｂｒｅｎｎｅｒら）；同第５，３４８，６５８号（Ｆｕｃｈｓら）；同第５，４０５，７８２号（Ｋｏｈｎら）；同第５，４２３，９６６号（Ｗｉｋｔｏｒｏｗｉｃｚ）；同第５，４５３，３８２号（Ｎｏｖｏｔｎｙら）；同第５，５７１，６８０号（Ｃｈｅｎ）；同第５，５９３，５５９号（Ｗｉｋｔｏｒｏｗｉｃｚ）；同第５，５９９，４３３号（Ｋｅｏら）；同第５，７５３，０９４号（Ａｌｔｅｒら）；同第５，７６６，４３５号（Ｌｉａｏら）；同第５，７７０，０２９号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第５，９９９，６８１号（Ｇｒａｂｂｅら）；同第６，００７，６９０号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第６，０７４，５４１号（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら）；同第６，０７４，８２７号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第６，３４４，３２６号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第６，４１６，６４２号（Ａｌａｊｏｋｉら）；同第６，４２８，６６６号（Ｓｉｎｇｈら）；同第６，４３２，２９０号（Ｈａｒｒｉｓｏｎら）；同第６，４７５，３６２号（Ｇｏｒｆｉｎｋｅｌら）；同第６，４７５，３６３号（Ｒａｍｓｅｙ）；同第６，６１３，５２５号（Ｎｅｌｓｏｎら）；同第６，６６４，１０４号（Ｐｏｕｒａｈｍａｄｉら）；同第６，６８６，０３５号（Ｊｉａｎｇら）；同第６，６９５，００９号（Ｃｈｉｅｎら）；同第６，７５９，１２６号（Ｍａｌｉｋら）；同第６，７６４，８１７号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）；同第６，７７０，２０１号（Ｓｈｅｐｏｄｄら）；及び同第６，７８７，０１６号（Ｔａｎら）に、欧州特許出願公開第０８５２００７号；同第０５７２６０４号；同第０５１８４７５号；及び同第０５１７３７０号に、国際特許出願公開第９３１０２５８号に記載されている。
ＣＺＥのピーク容量（すなわち、単位時間あたりに分離されるピークの数）が高いと、ＣＺＥがタンパク質及びペプチド（Ｖ．Ｋａｓｉｃｋａ，“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS AND CAPILLARY ELECTROCHROMATOGRAPHY OF PEPTIDES”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４（２２−２３）：４０１３−４０４６（２００４）；Ｖ．Ｋａｓｉｃｋａ，“RECENT ADVANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF PEPTIDES”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１９）：４１３９−４１６２（２００１）；Ｘ．Ｂｏｓｓｕｙｔ，“SEPARATION OF SERUM PROTEINS BY AUTOMATED CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，４１（６）：７６２−７７２（２００３）；Ｍ．Ｒ．Ｍｏｎｔｏｎ，“RECENT DEVELOPMENTS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS-MASS SPECTROMETRY OF PROTEINS AND PEPTIDES”，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２１（１）：５−１３（２００５））；核酸分子（Ｋ．Ｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｓｏｎ，“THE APPLICATION OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS FOR DNA POLYMORPHISM ANALYSIS”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６２：３−２６（２００１））；薬物（Ｍ．Ｊ．Ｈｉｌｈｏｒｓｔら，“CAPILLARY ELECTROKINETIC SEPARATION TECHNIQUES FOR PROFILING OF DRUGS AND RELATED PRODUCTS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１２）：２５４２−２５６４（２００１））；農業用化合物（Ｆ．Ｍｅｎｚｉｎｇｅｒら，“ANALYSIS OF AGROCHEMICALS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，８９１（１）：４５−６７（２０００））；並びに細菌及びウイルス（Ｌ．Ｋｒｅｍｓｅｒら，“CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF BIOLOGICAL PARTICLES:VIRUSES,BACTERIA,AND EUKARYOTIC CELLS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２５（１４）：２２８２−２２９１（２００４））を含めた広範囲の生体分子の分析に対する望ましいアプローチとなる。
ＣＺＥは多くの利点を有しているが、濃度に基づくＣＺＥの検出限界はＨＰＬＣの検出限界に比してかなり劣り、多くの実際用途にとって十分でない。ＣＺＥの限界は、キャピラリーチューブのフローセルのインキャピラリー路長（すなわち、検出器のウィンドウ）が非常に短いこと（典型的にはＨＰＬＣフローセルの路長のたった１％）を反映している。路長が短いことは、検出するためにはより高濃度のアナライトを存在させなければならないことを意味する（Ｚ．Ｋ．Ｓｈｉｈａｂｉ，“STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１０７−１１７（２０００）。
ある状況では、サンプル中に存在するアナライトの濃度がＣＺＥ分離方法を使用するには余りに低いことがあり得る。そのようなサンプルを慣用方法を用いて濃縮することもできるが、容量が少なくなるためにサンプルの操作が煩わしくなり、取り扱いによりアナライトが損失する恐れがある。場合により、サンプルのイオンプロフィールが電気的注入法により損なわれ、その結果精度が悪くなる。サンプル中の塩濃度が高いと、望ましくない加熱をもたらす高度に局在化した電流の問題も生じる恐れがある。
ＣＺＥの感度向上の問題に対する１つのアプローチはキャピラリー検出ウィンドウを調節することを含む（Ｊ．Ｐ．Ｑｕｉｒｉｎｏら，“SAMPLE STACKING OF CATIONIC AND ANIONIC ANALYTES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１１９−１３５（２００１）。この調節により応答を１０倍改善し得る。強化された検出手段は希釈サンプルの分析の問題を解決するためにも使用されてきた。その手段は質量分析、光学蛍光、電気化学酸化または還元、プラズマ共鳴、放射能、屈折率及び導電率を含む。公知の最も感度の良い検出方法を使用しても、非常に希薄なアナライトは検出できないままであり得る（例えば、Ｎａｙｌｏｒらの米国特許第５，８００，６９２号参照）。
希薄なアナライトの検出を改善するための別の方法は、分離前または分離と同時にアナライトを濃縮することである。分離前または分離と同時のアナライト濃縮方法を高感度検出方法と組み合わせると、ＣＥの有用性及び効率が大きく高まる。しかしながら、現在のオフラインの分離前濃縮方法は時間がかかり、こぼれたりまたは容器壁に吸着するために汚染またはサンプル損失のような各種サンプル取り扱いのリスクを受ける。これらの問題に応答して各種のオンライン集束方法が開発された。前記問題に対する１つのアプローチは、アナライト分子が“スタック”するようにサンプル及びバックグラウンド溶液の組成を操作することを含む。カラムの低導電率領域に置いたイオン化アナライト分子を電場により誘導させてカラムの高導電率領域に動かすとき、スタッキングが得られる。低導電率領域は高導電率領域よりもより高い電場を受けるので、低導電率領域のアナライト分子は２つの領域間のバリアに迅速に泳動し、これにより検出感度が１０〜１，０００倍以上向上する（Ｊ．Ｐ．Ｑｕｉｒｉｎｏら，“SAMPLE STACKING OF CATIONIC AND ANIONIC ANALYTES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１１９−１３５（２００１）；Ｚ．Ｋ．Ｓｈｉｈａｂｉ，“STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１０７−１１７（２０００）；Ｐ．Ｇｅｂａｕｅｒら，“THEORY OF SYSTEM ZONES IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３（１２）：１７７９−１７８５（２００３）；Ｊ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒｓら，“SAMPLE STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS: PRINCIPLES,ADVANTAGES AND LIMITATIONS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１（１４）：２７４７−２７６７（２０００）；Ｊ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒｓら，“SYSTEM ZONES IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１７）：３６４８−３６５８（２００１年１０月）。
スタッキングは若干の恩恵を有しているが、ある重要な限界を有している。重要なことは、スタッキングはアナライトの検出能力を改善するが、汚染アナライト種の濃度も上昇する。スタッキングは、標的アナライトがバックグラウンド電解質よりも低い濃度で存在している状況でのみ可能である（Ｊ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒｓら，“SAMPLE STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS: PRINCIPLES,ADVANTAGES AND LIMITATIONS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１（１４）：２７４７−２７６７（２０００））。更に、ＣＺＥで２つのアナライトを分割する能力はそれぞれの泳動時間の差の半分に正比例し、アナライトピークの標準偏差の合計に反比例する。よって、アナライトピークの大きさはサンプル容量により影響されるので、より大きなサンプル容量を使用するとピーク分割が悪影響を受ける恐れがある（Ｊ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒｓら，“SAMPLE STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS: PRINCIPLES, ADVANTAGES AND LIMITATIONS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１（１４）：２７４７−２７６７（２０００）。スタッキングを達成する方法はＺ．Ｋ．Ｓｈｉｈａｂｉ，“STACKING IN CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１０７−１１７（２０００）により検討されている。従って、当業界はＣＺＥの感度を高めるための代替解決法を求めている。
アナライトの濃縮を促進させるために各種機械的処置が使用されている。Ｇｕｚｍａｎ（米国特許第５，２０２，０１０号）は、流体透過性末端プレート及び分析するサンプル中の標的アナライトに結合する能力について選択した抗体または他の化学的物質をコーティングした複数の小ボディを含む管状構造物を含むアナライト濃縮装置を開示している。操作に際し、サンプルアナライトに接触させた後、キャピラリーを洗浄して過剰の材料を除去し、次いで構造物の小ボディ上で濃縮されたトラップされた標的アナライトを研究のために除去し、処理する。自明のように、アナライトをうまく取り扱わなければならない。Ｇｕｚｍａｎ（米国特許第６，４０６，６０４号）は、より高い効率を有するアナライト濃縮装置を開示している。ここに開示されている装置は、比較的大きいボアの輸送キャピラリーを複数の小ボアの分離キャピラリーと交差して含む。大ボアキャピラリー中に存在するアナライトは捕捉され、大ボアキャピラリーと分離キャピラリーの交差部位で蓄積する。Ｎａｙｌｏｒら（米国特許第５，８００，６９２号）は、キャピラリー電気泳動に使用するための分離前処理装置を開示している。この処理装置は、サンプルを濃縮または化学的に処理するため、或いは化学反応を触媒するためにサンプル処理材料、好ましくは膜、ゲルまたは充填ビーズの形態のサンプル処理材料を収容している。希薄サンプルの濃縮または汚染サンプルの精製のために特に適していると記述されている。Ｚａｒｅら（米国特許第６，１３６，１８７号）は、粒子が多孔質シランゾル−ゲルマトリックス中に埋め込まれているフリットレスキャピラリー分離デバイスを開示している。ゾル−ゲルマトリックス中には荷電及び非荷電分子が埋め込まれている。揮発性成分を蒸発させると、硬質多孔質ガラスが生ずる。異なる物理的特性（例えば、孔径及び表面電荷）を有するゾル−ゲルガラスを作成するために異なる官能化または誘導体化ゾル−ゲル前駆体が使用され得る。ガラスの多孔性によりプロトン及び他の中性またはイオン性種が拡散するが、大量のクロマトグラフィー粒子がガラスマトリックスから離れるのが制限される。Ｚａｒｅら（米国特許第６，１３６，１８７号）のアプローチにより幾つかの利点が得られるが、カラムを作成するためにかなりの時間が必要であり、固化前にマトリックスをサンプルとインキュベートするという要件によりピーク分割が制限される。
米国再発行特許第３７，６０６号
米国特許第６，４４０，２８４号
米国特許第６，４３６，６４６号
米国特許第６，４１０，６６８号
米国特許第６，３７２，３５３号
米国特許第６，３５８，３８５号
米国特許第６，３５５，７０９号
米国特許第６，３１６，２０１号
米国特許第６，３０６，２７３号
米国特許第６，２７４，０８９号
米国特許第６，２３５，１７５号
米国特許第６，１５３，０７３号
米国特許第６，１２９，８２６号
米国特許第６，１０７，０４４号
米国特許第６，０７４，５４２号
米国特許第６，０６８，７５２号
米国特許第６，０４２，７１０号
米国特許第６，０３３，５４６号
米国特許第６，００１，２３２号
米国特許第５，９８９，３９９号
米国特許第５，９７６，３３６号
米国特許第５，９６４，９９５号
米国特許第５，９５８，６９４号
米国特許第５，９４８，２２７号
米国特許第５，９１６，４２６号
米国特許第５，８９１，３１３号
米国特許第５，８４６，３９５号
米国特許第５，８４０，３８８号
米国特許第５，７７７，０９６号
米国特許第５，７４１，４１１号
米国特許第５，７２８，２８２号
米国特許第５，６９５，６２６号
米国特許第５，６６５，２１６号
米国特許第５，５８２，７０５号
米国特許第５，５８０，０１６号
米国特許第５，５６７，２９２号
米国特許第５，５５２，０２８号
米国特許第５，５４５，３０２号
米国特許第５，５３４，１２３号
米国特許第５，５１４，５４３号
米国特許第５，５０３，７２２号
米国特許第５，４２３，９６６号
米国特許第５，４２１，９８０号
米国特許第５，３８４，０２４号
米国特許第５，３７４，５２７号
米国特許第５，３７０，７７７号
米国特許第５，３６４，５２０号
米国特許第５，３３２，４８１号
米国特許第５，３１０，４６２号
米国特許第５，２９２，４１６号
米国特許第５，２９２，３７２号
米国特許第５，２６４，１０１号
米国特許第５，２５９，９３９号
米国特許第５，１３９，６３０号
米国特許第５，１２０，４１３号
米国特許第５，１１２，４６０号
米国特許第５，０１５，３５０号
米国特許第４，８６５，７０６号
米国特許出願公開第２００２／００２９９６８号
米国特許出願公開第２００２／００５５１８４号
米国特許出願公開第２００２／０１１９４８２号
米国特許出願公開第２００３／００５７０９２号
米国特許出願公開第２００３／０２１７９２３号
米国特許出願公開第２００３／０２２４４３６号
米国特許第４，４８３，７７３号
米国特許第４，７９３，９２０号
米国特許第５，１４５，５６７号
米国特許第５，１６４，０５５号
米国特許第５，２０２，００６号
米国特許第５，２６４，０９５号
米国特許第５，３４０，４５２号
米国特許第５，３４８，６５８号
米国特許第５，４０５，７８２号
米国特許第５，４５３，３８２号
米国特許第５，５７１，６８０号
米国特許第５，５９３，５５９号
米国特許第５，５９９，４３３号
米国特許第５，７５３，０９４号
米国特許第５，７６６，４３５号
米国特許第５，７７０，０２９号
米国特許第５，９９９，６８１号
米国特許第６，００７，６９０号
米国特許第６，０７４，５４１号
米国特許第６，０７４，８２７号
米国特許第６，３４４，３２６号
米国特許第６，４１６，６４２号
米国特許第６，４２８，６６６号
米国特許第６，４３２，２９０号
米国特許第６，４７５，３６２号
米国特許第６，４７５，３６３号
米国特許第６，６１３，５２５号
米国特許第６，６６４，１０４号
米国特許第６，６８６，０３５号
米国特許第６，６９５，００９号
米国特許第６，７５９，１２６号
米国特許第６，７６４，８１７号
米国特許第６，７７０，２０１号
米国特許第６，７８７，０１６号
欧州特許出願公開第０８５２００７号
欧州特許出願公開第０５７２６０４号
欧州特許出願公開第０５１８４７５号
欧州特許出願公開第０５１７３７０号
国際特許出願公開第９３１０２５８号
米国特許第５，８００，６９２号
米国特許第５，２０２，０１０号
米国特許第６，４０６，６０４号
米国特許第６，１３６，１８７号
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：９−１７（１９９８）
Ｂｅｃｋｍａｎ．ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｎｏ．７２７４８４
Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２１（１）：５−１３（２００５）
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４７（１０）：４２４６−５５（１９９９）
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：３４９−３５６（１９９２）
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６５４：１９０−１９５（１９９３）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：２３０８−２３１６（１９９８）
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Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１１９−１３５（２００１）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４（２２−２３）：４０１３−４０４６（２００４）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１９）：４１３９−４１６２（２００１）
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，４１（６）：７６２−７７２（２００３）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６２：３−２６（２００１）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１２）：２５４２−２５６４（２００１）
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，８９１（１）：４５−６７（２０００）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２５（１４）：２２８２−２２９１（２００４）
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９０２（１）：１０７−１１７（２０００）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３（１２）：１７７９−１７８５（２００３）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１（１４）：２７４７−２７６７（２０００）
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２（１７）：３６４８−３６５８（２００１年１０月）
従って、従来技術は進歩しているにもかかわらず、希薄サンプルを分析する問題を解決し、よって低濃度サンプルが分析できるようにＣＺＥの有用性を広げる方法及び装置に対する要望が依然としてある。本発明は、この要望及び他の要望に向けられている。
詳細には、本発明は、クロマトグラフィー吸着剤粒子を含有している重合アルキルシリケートゲルマトリックスのモノリスカラムを収容しているチャネルを含み、前記ゲルマトリックスが前記モノリスを実質的に不安定化させることなく溶媒を蒸発させるのに十分な条件下で重合されているゾル−ゲル濃縮デバイスを提供する。
本発明は、特にチャネルがマイクロチャネル、キャピラリーチューブ、カラム等である上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。本発明は特に、ゲルマトリックスが多孔質フリットに挟まれているキャピラリーチューブ内で重合されており、マイクロチャネルがチップまたはプレート内に埋め込まれている上記デバイスの実施形態に関する。
本発明は更に、アルキルシリケートゲルマトリックスがテトラエチルオルトシリケートゲルマトリックスであり、クロマトグラフィー吸着剤粒子がオクタデシルシリカ粒子であり、及び／またはゾル−ゲルが段階的マルチステップインキュベーションにより重合されている上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。
本発明は特に、段階的マルチステップインキュベーションが溶媒を著しく蒸発させることなくモノリスの重合を促進させるのに適当な条件下で加熱し、重合モノリスからの溶媒の蒸発を促進させるのに十分な条件下でインキュベートし、その後アルキルシリケートゲルマトリックスを硬化させるのに十分な条件下でインキュベートすることを含む上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。本発明は特に、サンプルのアナライトの濃縮を促進させるためにデバイスを分析または分取方法で使用する上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。
本発明は更に、分析または分取方法が液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び順相クロマトグラフィーからなる群から選択される上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。
本発明は特に、分析または分取方法がイムノアッセイ及び酵素反応からなる群から選択され、及び／またはアナライトがタンパク質、ペプチド、核酸分子、薬物、農業用化合物、細菌及びウイルスからなる群から選択される上記ゾル−ゲル濃縮デバイスの実施形態に関する。
本発明は更に、分析または分取方法にかけるサンプル中のアナライトをゾル−ゲル濃縮デバイスを用いて濃縮することを含む前記アナライトの濃縮方法を提供し、前記デバイスはクロマトグラフィー吸着剤粒子を含有している重合アルキルシリケートゲルマトリックスのモノリスを含み、前記ゲルマトリックスは前記モノリスを実質的に不安定化させることなく溶媒を蒸発させるのに十分な条件下で重合されている。
本発明は特に、デバイスがキャピラリーチューブ内で重合されており、多孔質フリットに挟まれており、アルキルシリケートゲルマトリックスがテトラエチルオルトシリケートゲルマトリックスであり、クロマトグラフィー吸着剤粒子がオクタデシルシリカ粒子であり、及び／またはゾル−ゲルが段階的マルチステップインキュベーションにより重合されている上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、段階的マルチステップインキュベーションが溶媒を著しく蒸発させることなくモノリスの重合を促進させるのに適当な条件下で加熱し、重合モノリスからの溶媒の蒸発を促進させるのに十分な条件下でインキュベートし、その後アルキルシリケートゲルマトリックスを硬化させるのに十分な条件下でインキュベートすることを含む上記方法の実施形態に関する。
本発明は特に、デバイスがサンプルのアナライトの濃縮を促進させるために分析または分取方法で使用される上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、分析または分取方法が液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び順相クロマトグラフィーからなる群から選択される上記方法の実施形態に関する。
本発明は特に、分析または分取方法がイムノアッセイ及び酵素反応からなる群から選択される上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、アナライトがタンパク質、ペプチド、核酸分子、薬物、農業用化合物、細菌及びウイルスからなる群から選択される上記方法の実施形態に関する。
本発明は、分析または分取技術（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）等）の感度を向上させるための新規な方法及び装置に関し、特にサンプル中に低濃度で存在しているアナライトの分析に使用できるように前記技術の使用を広げる要望に向けられている。本発明は特に、インラインゾル−ゲルカラムを収容しているチャネルを含む濃縮デバイスに関する。
本明細書中で使用されている用語「チャネル」は、広義にはアナライトを流すことができるデバイスを包含すると意図される。チャネル及び該チャネル内のカラムは任意の長さまたは形状（例えば、円筒形、“Ｖ”形、開放トラフ、密閉管状等）を有し得る。このデバイスは、多孔質フリットに挟まれている多孔質カラム充填材料を含み得る。適当なチャネルは分取または分析カラム（例えば、内部断面直径が＞２ｍｍのチャネル）、キャピラリー（例えば、内部断面直径が２０μｍ〜２ｍｍのチャネル）、またはマイクロチャネル（例えば、内部断面直径が＜２０μｍのチャネル）等であり得る。
本明細書中で使用されている用語「ゲル」は、１つの成分が剛性のために十分な構造組織を与え、他の成分が構造ユニットまたはスペース間の空間を埋めている少なくとも２つの成分の系を指すと意図される（Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅら，Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，ニューヨークに所在のＶａｎ Ｎｏｓｔｒｕｍ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ（１９８４年）発行，ｐ．２７２参照）。用語「ゲル」はしばしば、絡み合ったモノマーを含む直鎖状または分岐状ポリマー（例えば、デキストラン）ではなく架橋ポリマーを指すべく使用されている（例えば、Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎら，“HIGH-PERFORMANCE ELECTROPHORESIS OF ACIDIC AND BASIC LOW-MOLECULAR-WEIGHT COMPOUNDS AND PROTEINS IN THE PRESENCE OF POLYMERS AND NEUTRAL SURFACTANTS”，Ｊ．ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧ．，１２：２４７１−２４９９（１９８９）参照）。しかしながら、キャピラリー電気泳動に使用される非架橋デキストラン及びポリアクリルアミドマトリックスも“ゲル”と見なされている（例えば、Ｇ．Ｋｅｍｐ，“CAPILLARY ELECTROPHORESIS: A VERSATILE FAMILY OF ANALYTICAL TECHNIQUES”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：９−１７（１９９８）；Ｄ．Ｗｕら，“SODIUM DODECYL SULFATE-CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS USING NON-CROSS-LINKED POLYACRYLAMIDE”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：３４９−３５６（１９９２）参照）。本発明のゲルは架橋ポリマーまたは非架橋ポリマーから構成され得る。
本明細書中で使用されている用語「ゾル−ゲル」は、小粒子（“ゾル”）を重合マトリックス（“ゲル”）中に懸濁して含む無機の触媒酸化ケイ素ゲルを指す。本発明の濃縮デバイスのゾル−ゲルは、好ましくはシリカゾル−ゲルプラグからなり、特に単一の連続重合マトリックス（“モノリス”）を形成するように熱重合されているゾル−ゲルプラグからなる。好ましい実施形態では、本発明は金属アルコキシドゾル−ゲル方法を使用している。金属アルコキシドゾル−ゲル方法は、水、アルコール及び金属アルコキシド源の溶液を加水分解することにより金属酸化物ガラスを作成する方法である。これらの金属酸化物またはシランの源は、Ｃ．Ｊ．Ｂｒｉｎｋｅｒら，Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０年）発行に記載されているタイプＲｎＳｉ（ＯＲ’）４−ｎのアルコキシ化合物である。これらの化合物の中で最も一般的に使用されているものはテトラエチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４）（“ＴＥＯＳ”）であるが、チタネートやジルコネートのような他の化合物を使用してもよい。図１は、本発明の好ましい実施形態に従うＴＥＯＳの加水分解及び重合を示している。前記物質が重合すると、溶液のゲル化が生ずる。湿ったゲル中の揮発性溶媒を蒸発させると、ゲルは縮み、固化し、硬質の多孔質ガラスが生ずる。最も好ましくは、前記プラグは、（ａ）３個のアルコキシ基及びアルキル鎖を有するアルキルシロキサン、すなわちビス（トリアルコキシシリル）化合物等、例えばアルキルシリケート（例：テトラエチルオルトシリケート）、（ｂ）有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、トルエン等）、及び（ｃ）無機酸（例えば、塩酸、リン酸、硝酸等（硝酸の使用が好ましい）の混合物をキャピラリーチューブに導入した後ゲルが形成するまで混合物を加熱することにより作成することができる。
好ましい実施形態において、ゾル−ゲルカラムのゾルは粒子、例えばポリスチレン、ラテックス、イオン交換樹脂、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリビニルピロリドンまたはオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）粒子（例：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ粒子（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含む。前記粒子は各種の所望のサイズであり得、好ましくは多孔性で、分離しようとするアナライトのサイズに依存する各種の所望の孔径（例えば、１００Å、５００Å、３μｍ、５μｍ、１０μｍ等）を有する。粒子がシラン、特に４、８または１８個の炭素原子を有するシランで被覆されていることが好ましい。粒子の表面が有機または無機官能基で修飾されていることが好ましい。有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を追加的に含んでもよい。ゲルの孔径は、吸着剤粒子のサイズまたは使用する水／有機溶媒の比を変更することによりコントロールすることができる（Ｊ．Ｍａｒｔｉｎら，“MECHANICAL AND ACOUSTICAL PROPERTIES AS A FUNCTION OF PEG CONCENTRATION IN MACROPOROUS SILICA GELS”，Ｊ．Ｎｏｎ−Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｓｏｌｉｄｓ，２８５：２２２−２２９（２００１））。
広範囲の組成物が本発明の濃縮デバイスのゾル−ゲルカラム中に使用され得る。例えば、０．１〜１．０Ｍの硝酸の使用が許容され得る。更なる例として、適当な組成物は有機溶媒が添加されていないＴＥＯＳ（例えば、３５６μｌの９９．９％ＴＥＯＳ）を含み得る。前記組成物の成分の相対濃度を変えると、得られるゾルゲルモノリスの特性（例えば、多孔性及び機械的強度）が変化する。組成物の１例は、約１５６μｌの９９．５％エタノール中に溶解させた約２００μｌの９９．９％ＴＥＯＳを約２５８マイクロモルの硝酸（例えば、２５８μｌの１．０Ｎ ＨＮＯ３）と混合して含む。前記ゲル成分と一緒に約４８５ｍｇの粒子（７５％ｗ／ｖ組成物を形成する）を使用する。前記組成物のスケールは所望のゾル−ゲル容量に合わせて拡大または縮小させることができる。
本発明のデバイスのゾル−ゲルカラムは熱を用いて重合されていることが好ましく、最も好ましくは段階的マルチステップ加熱方法が使用される。１つの好ましいマルチステップ方法では、ゾル−ゲル成分をエタノールを著しく蒸発させることなくゲル材料の重合を促進させるのに適当な条件下で加熱する。前記加熱ステップでは、モノリスを大きく脱安定化させるのに十分な程度であるならば蒸発は「著しい」と見なされる。３５〜６０℃の範囲の温度でのインキュベーションが適当である。より好ましくは、温度がまず約３５〜４５℃であり、その後約４５〜５５℃に上昇させる２ステップ方法が使用される。２ステップ方法の１例は、ゾル−ゲルを約４０℃で約１８時間加熱した後、約５０℃で約１時間インキュベートすることを含む。
上記処理後、ゾル−ゲル材料をエタノールの蒸発を促進させるのに十分な温度（例えば、６０〜８０℃）で更に加熱することが好ましい。方法の１例は、ゾル−ゲルを約７０℃で約１６〜１８時間加熱することを含む。ポリマーネットワーク（“マトリックス”）の形成が既に始まってるので、エタノールの蒸発はモノリスを実質的に不安定化させない。本明細書中で使用する場合、本発明のモノリスは、本発明の目的に従って濃縮デバイスとしての使用を妨げるクラック、亀裂または他の欠陥を示すならば「実質的に」不安定化されていると言える。
よって、マルチステップインキュベーション法を使用すると、ポリマーネットワークが形成し始めた後までエタノールの蒸発を遅らせることによりエタノール蒸発中にモノリスを保持するのに十分に強いポリマーネットワークが生ずる。従って、正確な長さを有するモノリスが非常に再現性良く作成され得る。１回の１００℃加熱ステップという従来技術（Ｚａｒｅらの米国特許第６，１３６，１８７号）を使用すると、強いマトリックスが形成される前に高いエタノール蒸気圧が生じ、よってモノリスは不安定化し、小片に割れる。
前記処理後、ゾル−ゲル材料をアルキルシリケートゲルマトリックスを硬化させるのに十分な温度で更に加熱することが好ましい。９０〜１３０℃の温度でのインキュベーションが適当である。温度をまず約９０〜１１０℃とした後、約１１０〜１３０℃に上げる２ステップ法を使用することがより好ましい。２ステップ法の１例は、ゾル−ゲルを約１００℃で少なくとも約１時間加熱した後、約１２０℃で約２時間インキュベートすることを含む。より長いインキュベーション時間が許容され得る。
好ましいマルチステップ方法では、ゾル−ゲル成分を２５℃で１時間、次いで４０℃で１６〜１８時間、次いで５０℃で１時間、次いで７０℃で１６〜１８時間、次いで１００℃で１時間、次いで１２０℃で２時間加熱する。
最も好ましくは、重合をデバイスのために所望するチャネル（例えば、キャピラリー、マイクロチャネル等）内で全部または部分的に実施する。よって、カラムの非重合材料、部分重合材料または完全重合材料をデバイスに導入または他の方法で適用して、所望のチャネルを形成する。使用前に、得られたチャネルのカラムを洗浄し、平衡化することが好ましい。サンプルをカラムに適用または注入し、圧力をかけることにより、出口から吸引することにより、または界面動電的等によりカラムで濃縮する。ＭＳ分析器に有害な塩を含む不純物を、サンプルを溶離させる前に洗い出してもよい。次いで、サンプルアナライトを、例えば薄い濃縮サンプルプラグにおいて吸着アナライトの一部（好ましくは、本質的に全部）を除去することができる有機溶媒を含むバッファーを用いて溶離させ得る。分離電圧を印加すると、ＣＺＥにより成分が分割される。アナライトが濃縮されているので、検出は非常により正確である。
ゾル−ゲル／粒子マトリックスの性質は大部分のアナライトが最小必要量の溶媒を用いて効率的に脱着できるようなものであることが好ましい。１つの好ましい実施形態では、キャピラリーチャネルを使用し、サンプル適用中の反復加圧に耐えることができるようにカラムをキャピラリーの壁に隣接してしっかり配置（または、固定）する。第２の好ましい実施形態では、マイクロチャネルを使用し、所望のマイクロチャネルを形成するようにカラムをチップまたはプレートに適用する。好ましくは、本発明のデバイスのゾル−ゲルマトリックス及びクロマトグラフィー粒子は化学的に安定であり、複数回再利用され得るようにサンプルアナライトを繰り返し同様に吸着・脱着できるように選択される。或いは、デバイスのカラムを１回用分析のために設計してもよい。
好ましい実施形態では、カラムの寸法は約５ｍｍよりも長くなく、約２５〜約３６０μｍの範囲の内径を有する。勿論、より大きいまたはより小さいカラムを使用してもよい。好ましくは、カラムのサイズは、脱着したとき調べようとする特定アナライトを十分に検出、分割できる特定アナライトに対する結合キャパシティーを与えるのに十分な吸着剤が存在するように選択する。本発明はキャピラリーゾーン電気泳動において使用するのに特に適しているが、本発明のゾル−ゲル組成物及びデバイスは任意の直径または長さを有するカラムを含み得、広範囲の別の分析及び分取方法（例えば、液体クロマトグラフィー（例えば、ミクロまたはナノ液体クロマトグラフィー）、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、酵素反応等）に使用するのに適したミクロボアまたはナノボアカラムを含み得ると認識される。
本発明の濃縮デバイスは、タンパク質、ペプチド、核酸分子、薬物、農業用化合物、細菌及びウイルスを含めた広範囲の生体分子を分析するために使用され得る。
上記したゾル−ゲル濃縮デバイスを使用すると、低濃度サンプルの分析が容易となる。その後小容量の溶離溶媒を注入すると、サンプルが高度に濃縮された、多くの場合精製された形態で迅速に取り出される。キャピラリー電気泳動システムを従来通り作動させることにより最小量のサンプルでも容易に操作され得る。サンプルが含んでいるアナライトは小容量の溶離溶媒で脱着される前にミニカラムで段階的に濃縮されるので、大容量のサンプルも容易に適応される。サンプルの濃縮は圧力、真空または電圧を用いて達成され得る。
本発明の組成物及び方法は、自動または半自動キャピラリー電気泳動システム（例えば、米国特許第６，００１，２３０号、同第５，３２０，７３０号等の教示と合わせて）に使用するのに特に適している。特に好ましい電気泳動システムは、選択可能な波長ＵＶ／Ｖｉｓ（例えば、２００、２１４、２５４及び２８０ｎｍ）検出器、ＵＶ源オプティクス、二波長レーザー励起蛍光検出器、４８８ｎｍアルゴンイオンレーザーモジュール、温度制御サンプル保存モジュールとコンフィギュレートしたＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＩＢＭパーソナルコンピューターでコンフィギュレートされる３２ Ｋａｒａｔ（商品名）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む。
本発明の組成物及び方法は、マイクロチャネルを用いる分析方法で使用するのにも特に適している。マイクロチャネルを形成し、使用する方法は、Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｋｈｏｕｓｅら，“IMPROVED RESOLUTION WITH MICROCHIP-BASED ENHANCED FIELD INVERSION ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４（１１）：１７７７−１７８６（２００３）；Ｒ．Ｂｈａｒａｄｗａｊら，“DESIGN AND OPTIMIZATION OF ON-CHIP CAPILLARY ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３（１６）：２７２９−２７４４（２００２）；Ａ．Ｂｒｏｍｂｅｒｇら，“MULTICHANNEL HOMOGENEOUS IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF 2,4,6-TRINITROTOLUENE(TNT) USING A MICROFABRICATED CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS CHIP”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２５（１２）：１８９５−１９００（２００４）；Ｇ．Ｃｈｅｎら，“FAST AND SIMPLE SAMPLE INTRODUCTION FOR CAPILLARY ELECTROPHORESIS MICROSYSTEMS”，Ａｎａｌｙｓｔ，１２９（６）：５０７−５１１（２００４）（電子版２００４年４月２０日）；Ｓ．Ｈ．Ｃｈｅｎら，“FLOW-THROUGH SAMPLING FOR ELECTROPHORESIS-BASED MICROCHIPS AND THEIR APPLICATIONS FOR PROTEIN ANALYSIS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４（１９）：５１４６−５１５３（２００２）；Ｅ．Ａ．Ｄｏｈｅｒｔｙら，“MICROCHANNEL WALL COATINGS FOR PROTEIN SEPARATIONS BY CAPILLARY AND CHIP ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４（１−２）：３４−５４（２００３）；Ｙ．Ｄｕら，“MICROCHIP CAPILLARY ELECTROPHORESIS WITH SOLID-STATE ELECTROCHEMILUMINESCENCE DETECTOR”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７（２４）：７９９３−７９９７（２００５）；Ｃ．Ｆｕｔｔｅｒｅｒら，“INJECTION AND FLOW CONTROL SYSTEM FOR MICROCHANNELS”，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．，４（４）：３５１−３５６（２００４）（電子版２００４年５月１１日）；Ｓ．Ｋ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，“DESIGN AND ANALYSIS OF FOLDED CHANNELS FOR CHIP-BASED SEPARATIONS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４（１３）：２９６０−２９６７（２００２）；Ｊ．Ｗ．Ｈｏｎｇら，“MICROFABRICATED POLYMER CHIP FOR CAPILLARY GEL ELECTROPHORESIS”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７（５）：９５８−９６２（２００１）；Ｂ．Ｊｕｎｇら，“ON-CHIP MILLIONFOLD SAMPLE STACKING USING TRANSIENT ISOTACHOPHORESIS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８（７）：２３１９−２３２７（２００６）；Ｇ．Ｂ．Ｌｅｅら，“ON THE SURFACE MODIFICATION OF MICROCHANNELS FOR MICROCAPILLARY ELECTROPHORESIS CHIPS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６（２４）：４６１６−４６２４（２００５）；Ｈ．Ｆ．Ｌｉら，“A COMPACTLY INTEGRATED LASER-INDUCED FLUORESCENCE DETECTOR FOR MICROCHIP ELECTROPHORESIS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２５（１２）：１９０７−１９１５（２００４）；Ｍ．Ｗ．Ｌｉら，“DESIGN AND CHARACTERIZATION OF POLY(DIMETHYLSILOXANE)-BASED VALVES FOR INTERFACING CONTINUOUS-FLOW SAMPLING TO MICROCHIP ELECTROPHORESIS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８（４）：１０４２−１０５１（２００６）；Ｊ．Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇら，“A MICROCHIP ELECTROPHORESIS SYSTEM WITH INTEGRATED IN-PLANE ELECTRODES FOR CONTACTLESS CONDUCTIVITY DETECTION”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３（２１）：３７６９−３７８０（２００２）；Ｊ．Ｌｉｕら，“SURFACE-MODIFIED POLY(METHYL METHACRYLATE) CAPILLARY ELECTROPHORESIS MICROCHIPS FOR PROTEIN AND PEPTIDE ANALYSIS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６（２３）：６９４８−６９５５（２００４）；Ｙ．Ｌｉｕら，“STACKING DUE TO IONIC TRANSPORT NUMBER MISMATCH DURING SAMPLE SWEEPING ON MICROCHIPS”，Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ，５（４）：４５７−４６５（２００５）（電子版２００５年３月７日）；Ａ．Ｐａｌｌａｎｄｒｅら，“SURFACE TREATMENT AND CHARACTERIZATION:PERSPECTIVES TO ELECTROPHORESIS AND LAB-ON-CHIPS”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２７（３）：５８４−６１０（２００６）；Ｄ．Ｎ．Ｐｅｔｓｅｖら，“MICROCHANNEL PROTEIN SEPARATION BY ELECTRIC FIELD GRADIENT FOCUSING”，Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ．，５（６）：５８７−５９７（２００５）（電子版２００５年４月１５日）；Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓら，“FUNCTIONAL PROTEOMICS USING MICROCHANNEL PLATE DETECTORS”,PＲＯＴＥＯＭＩＣＳ，２（３）：２５６−２６１（２００２）；Ｊ．Ｒｏｓｓｉｅｒら，“POLYMER MICROFLUIDIC CHIPS FOR ELECTROCHEMICAL AND BIOCHEMICAL ANALYSES”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３（６）：８５８−８６７（２００２）；Ｊ．Ｒ．Ｓｃｈｅｒｅｒら，“HIGH-PRESSURE GEL LOADER FOR CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS MICROCHANNEL PLATES”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１（５）：１１５０−１１５２，１１５４（２００１）；Ｋ．Ｗａｎｇら，“MICROCHANNEL-ELECTRODE ALIGNMENT AND SEPARATION PARAMETERS COMPARISON IN MICROCHIP CAPILLARY ELECTROPHORESIS BY SCANNING ELECTROCHEMICAL MICROSCOPY”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，１１１０（１−２）：２２２−２２６（２００６）（電子版２００６年２月３日）；及びＸ．Ｘｕａｎら，“ACCELERATED PARTICLE ELECTROPHORETIC MOTION AND SEPARATION IN CONVERGING-DIVERGING MICROCHANNELS”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７（１４）：４３２３−４３２８（２００５）に記載されている。
本発明の組成物及び方法は、複数のアナライトを同時に分析できるようにアッセイ方法（例えば、イムノアッセイ等；米国特許第５，８６３，４０１号参照）と一緒に使用され得る。また、本発明の組成物及び方法は、流体中のタンパク質成分及び全タンパク質の濃度を定量するために使用され得る（米国特許第５，４９０，９０９号参照）。
好ましい実施形態において、本発明の濃縮デバイスは更にサンプルを脱塩させる（すなわち、サンプルから望ましくない塩を一部または全部除去する）。非常に好ましい実施形態では、濃縮デバイスによりサンプルアナライトを濃縮するのと同時に適用サンプルが脱塩される。本発明によれば、１つの濃縮デバイスまたは（直列にまたは並列に配置した）複数のデバイスが使用され得る。
上記したゾル−ゲル濃縮デバイスは従来技術のデバイスに比して多くの利点を与える。本発明のゾル−ゲル濃縮デバイスはキャピラリーピースに接続させる必要がない。塩酸の代わりに硝酸が使用され得る。塩酸は硝酸と違ってシリカを溶解するので、硝酸の使用が好ましい。０．１Ｍ ＨＣｌの使用は硝酸ほど大きくｐＨを低下させないという欠点をも有しており、重縮合前の加水分解が不完全であるために機械的に弱いマトリックスしか生じない。対照的に、本発明により形成されるマトリックスは高い圧力（例えば、１３．８ＭＰａ（２０００ｐｓｉ）以上）に耐えることができる。加えて、本発明のゾル−ゲル濃縮デバイスは従来技術のデバイスよりも少ないエタノール及びより多い粒子を使用する。この属性により、本発明のゾル−ゲルモノリスはクラック及び亀裂を生じにくい。本発明によれば裸のシリカの使用が避けられ、これにより塩基性タンパク質及びペプチドの非可逆的吸着のような塩基性化合物の問題が避けられる。更に、段階的加熱方法を使用することは有利にはモノリスを固定し、不連続ピースの形成が避けられる。
本発明を概略的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。実施例は例示のために提示されており、特記されていない限り本発明を限定するものと意図されない。
好ましい濃縮デバイスを用いるＣＺＥ分析
本発明の原理に従ってカラム濃縮デバイスを製作する。カラムは内径が２５〜３６０μｍのキャピラリーチューブから作成する。カラム材料はテトラエチルオルトシリケート（２００μｌ）、エタノール（１５６μｌ）、１．０Ｍ 硝酸（２５８μｌ）及びサイズ及び細孔容量の異なるクロマトグラフィー粒子（例えば、４５５ｍｇの５μｍ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ（登録商標）粒子（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．））である。
本発明の原理に従ってカラム濃縮デバイスを製作する。カラムは内径が２５〜３６０μｍのキャピラリーチューブから作成する。カラム材料はテトラエチルオルトシリケート（２００μｌ）、エタノール（１５６μｌ）、１．０Ｍ 硝酸（２５８μｌ）及びサイズ及び細孔容量の異なるクロマトグラフィー粒子（例えば、４５５ｍｇの５μｍ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ（登録商標）粒子（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．））である。
以下のカラム充填方法を使用する：テトラエチルオルトシリケート（２００μ１）をエタノール（１５６μｌ）中に短時間撹拌することにより溶解させる。次いで、１．０Ｍ 硝酸（２５８μｌ）を添加し、溶液が透明で均質になるまで撹拌する。粒子をゆっくり添加し、すべての粒子が適度に湿るまで粒子を溶液と混合するために注意深く撹拌する。粒子の周りのトラップされた空気を除去するためにスラリーに短時間音波処理を施す。キャピラリーの末端がスラリー中に沈まるまでキャピラリーをＴｅｆｌｏｎ（登録商標）隔膜を貫いてスラリーを収容している容器に挿入する。キャピラリーの約５〜１０ｃｍがスラリーで充填されるまで窒素タンクレギュレーターを用いて約１３８ｋＰａ（２０ｌｂｓ／ｉｎ ２ （ｐｓｉ））の圧力を加える。
シリケートゾル−ゲルは以下の加熱方法を用いて形成する：すべてのキャピラリーをオーブン中のトレー上に平らに置く。キャピラリーを室温（２５℃）で１．０時間インキュベートした後、キャピラリーチューブを４００℃で１６〜１８時間、次いで５０℃で１．０時間、次いで７０℃で１６〜１８時間、次いで１００℃で１時間、次いで１２０℃で２時間という加熱プログラムに従って加熱する。
図２は本発明の濃縮デバイスを示す。図３は本発明の濃縮デバイスを用いるアナライトの濃縮、溶離及び分離方法を示す。図３に示すように、濃縮デバイス（濃縮装置）は所望のＣＺＥマトリックスを収容しているキャピラリーチューブで提供されている。サンプルを導入し、濃縮デバイスのマトリックスに結合させる。溶離バッファーで洗浄すると、サンプルは濃縮する。電場を印加すると、サンプルアナライトの電気泳動及び分離が起こる。
図４は本発明の濃縮デバイスを用いて得た分離プロフィールを示す。
図５Ａは本発明を用いて得た高い分離を示す。図５Ａに示すように、プレ濃縮の非存在下（１．３８ｋＰａ（０．２ｐｓｉ）で２秒間または６．８７ｋＰａ（１．０ｐｓｉ）で５秒間）ではウマ心臓シトクロムＣ（Ｈｃｙｔｃ）消化物がうまく分離されない。０．５ｃｍウルトラスフェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）ゾル−ゲルプラグを用いて３４４ｋＰａ（５０ｐｓｉ）で３、６または９分間濃縮すると、しだいにより分割されたピークが生じた。図５Ｂは８０００ピコモル／ｍｌくらいの低濃度でもＨｃｙｔｃ消化物のピークを分離する本発明の能力を示している。
図６は同一のアミノ酸配列からなるヒツジシトクロムＣ（ＳｈＣｙｔｃ）及びブタシトクロムＣ（ＰｃＣｙｔｃ）の消化産物を分離する本発明の濃縮デバイスの能力を示している。図６に示すように、本発明の濃縮デバイスを用いて２分間プレ濃縮すると、非濃縮材料の分離が検出できなかった条件下で分離されたペプチド断片が検出できた。
図７は本発明の濃縮デバイスを用いるアナライト分離の再現性を示す。消化前に還元し、アルキル化したＨｃｙｔｃの分離プロフィールが示されている。キャピラリーは７５μのキャピラリーに５μ／ゾル−ゲルの０．５ｃｍプラグを収容していた。電気泳動電圧は１６７ｖ／ｃｍ，５ｋｖであった。サンプルを０．５Ｍ 酢酸中に加え、充填バッファー中６０％ アセトニトリル（ＡＣＮ）で溶離した。図８はＨｃｙｔｃの消化物の分析（７ピコモル／μ；ラン７６〜９１；サンプル適用：１７２ｋＰａ（２５ｐｓｉ）で０．４分間）の再現性を示す。
図９は酵母ヘキソキナーゼのペプチド消化産物を分離するための本発明の方法及び装置の能力を示す。２００ｎｍでの吸光を検出するために酵母ヘキソキナーゼ調製物（５フェムトモル／μｌ）をゾルゲル濃縮装置を用いて濃縮した。図１０は酵母ヘキソキナーゼの消化物の複数分析（１０ナノモル／μｌ；ラン２〜１０，サンプル適用：１７２ｋＰａ（２５ｐｓｉ）で０．４分間）の再現性を示す。
図１１は本発明のデバイスを用いて得た検出の高い感度を示す。ウシヘキソキナーゼ（分子量５２ｋＤａ；５０フェムトモル（ｆｍｏｌｅ））消化物をゾル−ゲルキャピラリーを用いて異なる時間間隔で濃縮した。トレースＡは０．２ピコモル（ｐｍｏｌｅ）注入及び１．０ピコモル／μｌ溶離のエレクトロフェログラムを示す。トレースＢは６．２５ｐｍｏｌｅ注入及び８９ｆｍｏｌｅ／μｌ溶離のエレクトロフェログラムを示す。トレースＣは１．２５ｆｍｏｌｅ注入及び１７．８ｆｍｏｌｅ／μｌ溶離のエレクトロフェログラムを示す。
本明細書中に挙げた刊行物及び特許文献のすべては各刊行物または特許文献が具体的に且つ個別に参照により組み込まれると記載されているのと同程度に参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明をその具体的実施形態に関連して記載してきたが、更に修飾することができ、本出願は本発明が属する当業界の範囲内で公知または慣用のプラクティスの範囲内で生ずるような本出願の開示内容を逸脱するものを含め、本明細書中に記載されている必須要件に当てはまる一般的に本発明の原理に従う本発明の変更、使用または改変を包含すると意図されると理解される。
Claims (22)
- クロマトグラフィー吸着剤粒子を含有している重合アルキルシリケートゲルマトリックスのモノリスカラムを収容しているチャネルを含み、前記ゲルマトリックスが前記モノリスを実質的に不安定化させることなく溶媒を蒸発させるのに十分な条件下で重合されており、前記モノリスが少なくとも１３．８ＭＰａ（２０００ｐｓｉ）の圧力に耐えることができる、サンプルのアナライトの濃縮を促進させるために分析または分取方法で使用するゾル−ゲル濃縮デバイス。
- アルキルシリケートゲルマトリックスがテトラエチルオルトシリケートゲルマトリックスである、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- クロマトグラフィー吸着剤粒子がオクタデシルシリカ粒子である、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- ゾル−ゲルが段階的マルチステップインキュベーションプロセスにより重合されている組成物であり、前記プロセスが、ａ）組成物を約６０℃未満の温度で段階的に加熱してスラリーの重合を促進させる工程、ｂ）工程ａ）からの組成物を約８０℃未満の温度で加熱して溶媒を蒸発させる工程、及びｃ）工程ｂ）からの加熱組成物を約１３０℃未満の温度で硬化させる工程、を含む、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- 分析または分取方法が液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び順相クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- 分析または分取方法がイムノアッセイ及び酵素反応からなる群から選択される、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- アナライトがタンパク質、ペプチド、核酸分子、薬物、農業用化合物、細菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- デバイスのチャネルがチップまたはプレートのマイクロチャネルである、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- 分析または分取方法にかけるサンプル中のアナライトをゾル−ゲル濃縮デバイスを用いて濃縮することを含む前記アナライトの濃縮方法であって、前記デバイスがクロマトグラフィー吸着剤粒子を含有している重合アルキルシリケートゲルマトリックスのモノリスカラムを収容しているチャネルを含み、前記ゲルマトリックスが前記モノリスを実質的に不安定化させることなく溶媒を蒸発させるのに十分な条件下で重合されており、前記モノリスが少なくとも１３．８ＭＰａ（２０００ｐｓｉ）の圧力に耐えることができ、前記デバイスがサンプルのアナライトの濃縮を促進させるために分析または分取方法で使用される、前記方法。
- アルキルシリケートゲルマトリックスがテトラエチルオルトシリケートゲルマトリックスである、請求項９に記載の方法。
- クロマトグラフィー吸着剤粒子がオクタデシルシリカ粒子である、請求項９に記載の方法。
- ゾル−ゲルが段階的マルチステップインキュベーションプロセスにより重合されている組成物であり、前記プロセスが、ａ）組成物を約６０℃未満の温度で段階的に加熱してスラリーの重合を促進させる工程、ｂ）工程ａ）からの組成物を約８０℃未満の温度で加熱して溶媒を蒸発させる工程、及びｃ）工程ｂ）からの加熱組成物を約１３０℃未満の温度で硬化させる工程、を含む、請求項９に記載の方法。
- 分析または分取方法が液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び順相クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 分析または分取方法がイムノアッセイ及び酵素反応からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- アナライトがタンパク質、ペプチド、核酸分子、薬物、農業用化合物、細菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- デバイスのチャネルがチップまたはプレートのマイクロチャネルである、請求項９に記載の方法。
- ゲルマトリックスを３５〜６０℃で加熱している間にゲルマトリックスが重合する、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- ゲルマトリックスを第１ステップで３５〜４５℃、第２ステップで４５〜５５℃で加熱している間にゲルマトリックスが重合する、請求項１に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- ゲルマトリックスが第１ステップで１８時間４０℃に加熱され、第２ステップで１時間５０℃に加熱される、請求項１８に記載のゾル−ゲル濃縮デバイス。
- ゲルマトリックスを３５〜６０℃で加熱している間にゲルマトリックスが重合する、請求項９に記載の方法。
- ゲルマトリックスを第１ステップで３５〜４５℃、第２ステップで４５〜５５℃で加熱している間にゲルマトリックスが重合する、請求項９に記載の方法。
- ゲルマトリックスが第１ステップで１８時間４０℃に加熱され、第２ステップで１時間５０℃に加熱される、請求項９に記載の方法。
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