JP5219435B2 - Nucleic acid detection method and test kit - Google Patents
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Description
本発明は、核酸の検出方法及び検査キットに関する。 The present invention relates to a nucleic acid detection method and a test kit.
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、標的核酸の検出を通して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。 Nucleotide sequence analysis of genomes of various organisms including humans has been energetically promoted. As a result, genetic diseases, cancer, infectious diseases, lifestyle-related diseases can be achieved through detection of target nucleic acids such as genes, DNA, and RNA. Etc., decision of treatment policy, management after treatment, prognosis prediction, etc. have come to be performed.
標的遺伝子の検出に使用される技術として、ラテックス微粒子や金属コロイド粒子とＤＮＡとの複合体の凝集を用いる遺伝子診断が注目されている。 As a technique used for detection of a target gene, gene diagnosis using agglomeration of a complex of latex microparticles or metal colloidal particles and DNA has attracted attention.
特許文献１では、核酸にインターカレートする性質と銀コロイドなどを凝集させる性質とを併せ持つ物質（遺伝子結合性凝集促進性物質）を用いて、分析対象試料中の標的核酸の有無を検出している。例えば、予めＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法などによって標的核酸のみを増幅する処理を施した試料中に、遺伝子結合性凝集促進性物質と銀コロイド粒子とを添加する。試料中に標的核酸が存在する場合にはＰＣＲにより標的核酸が増幅され、遺伝子結合性凝集促進性物質のほぼ全てが標的核酸に結合する。その結果、銀コロイドは凝集しない。一方、試料中に標的核酸が存在しない場合には、試料中の核酸は増幅されず、遺伝子結合性凝集促進性物質のほとんどは試料中の核酸には結合しないことになる。その結果、銀コロイドが凝集する。特許文献１では、このような銀コロイドの凝集の有無を目視等で確認することによって、試料中に標的核酸が存在するか否かを判定することができる。 In Patent Document 1, the presence or absence of a target nucleic acid in a sample to be analyzed is detected using a substance having both the property of intercalating with a nucleic acid and the property of aggregating silver colloid or the like (gene-binding aggregation promoting substance). Yes. For example, a gene-binding aggregation promoting substance and silver colloid particles are added to a sample that has been previously subjected to a treatment for amplifying only the target nucleic acid by a PCR (polymerase chain reaction) method or the like. When the target nucleic acid is present in the sample, the target nucleic acid is amplified by PCR, and almost all of the gene-binding aggregation promoting substance binds to the target nucleic acid. As a result, the silver colloid does not aggregate. On the other hand, when the target nucleic acid is not present in the sample, the nucleic acid in the sample is not amplified, and most of the gene-binding aggregation promoting substance does not bind to the nucleic acid in the sample. As a result, the silver colloid aggregates. In Patent Document 1, it is possible to determine whether or not a target nucleic acid is present in a sample by confirming the presence or absence of such agglomeration of silver colloid by visual observation or the like.
また、特許文献２では、金コロイドに固定化した一本鎖ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとが会合反応により相補鎖を形成した際に、金コロイドが凝集する性質を利用して、標的遺伝子の有無の検出を行っている。
特許文献１に記載の発明で使用される遺伝子結合性凝集促進性物質は、核酸特異的に結合する性質、例えば一本鎖または二本鎖の核酸を識別する性質を有しているが、核酸の塩基配列を認識して結合させることができない。それゆえ、配列特異的に標的核酸を検出するためには、予めＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により標的核酸のみを増幅させておく必要がある。このように遺伝子増幅法を用いざるを得ないことから、特許文献１に記載の発明を、複数の遺伝子を検出する場合や標的核酸以外の遺伝子が多く含まれている試料中の標的核酸を検出する場合に応用することは難しい。 The gene-binding aggregation-promoting substance used in the invention described in Patent Document 1 has a property of binding specifically to a nucleic acid, for example, a property of identifying a single-stranded or double-stranded nucleic acid. Cannot recognize and bind to the base sequence. Therefore, in order to detect a target nucleic acid in a sequence-specific manner, it is necessary to amplify only the target nucleic acid in advance by a gene amplification method such as a PCR method. Since the gene amplification method has to be used in this way, the invention described in Patent Document 1 is used to detect a target nucleic acid in a sample containing a large number of genes other than the target nucleic acid when detecting a plurality of genes. It is difficult to apply to.
一方、特許文献２に記載の発明では、金コロイドが凝集するのは、標的ＤＮＡとＤＮＡプローブのＤＮＡとが同一の長さであって完全相補鎖である場合と、標的ＤＮＡとＤＮＡプローブの核酸とが同一の長さであって標的ＤＮＡに内側欠損がある場合である。したがって、標的ＤＮＡと非標的ＤＮＡを凝集により識別するためには、ＤＮＡプローブの自由末端側に塩基の置換がくるようにＤＮＡプローブの配列を設計する必要がある（特許文献２の表１参照）。さらに、特許文献２に記載の発明では、試料中の標的ＤＮＡの長さを調整する必要があるために、遺伝子増幅反応後の増幅産物の精製やプライマー伸張反応、第二の核酸プローブの会合反応等、多くの準備が必要であり、煩雑である。 On the other hand, in the invention described in Patent Document 2, colloidal gold aggregates when the target DNA and the DNA of the DNA probe have the same length and are completely complementary strands, and when the nucleic acid of the target DNA and the DNA probe is Are the same length and the target DNA has an internal defect. Therefore, in order to distinguish between target DNA and non-target DNA by aggregation, it is necessary to design the sequence of the DNA probe so that the base substitution is placed on the free end side of the DNA probe (see Table 1 of Patent Document 2). . Furthermore, in the invention described in Patent Document 2, since it is necessary to adjust the length of the target DNA in the sample, purification of the amplification product after the gene amplification reaction, primer extension reaction, and association reaction of the second nucleic acid probe Etc., many preparations are necessary and complicated.
本発明は、上記課題点を克服するものであり、微小担体を用いた標的核酸の簡便な検出方法と検査キットを提供するものである。 The present invention overcomes the above-described problems and provides a simple method for detecting a target nucleic acid and a test kit using a microcarrier.
すなわち、本発明は、
検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有し、
前記核酸凝集剤は、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する物質であることを特徴とする核酸検出方法である。
That is, the present invention
A nucleic acid detection method for detecting a target nucleic acid in a sample liquid,
Producing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with a target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed;
Detecting the presence or absence or degree of aggregation of the microcarriers in the mixed solution;
I have a,
The nucleic acid agglutinating agent is a nucleic acid detection method characterized in that the nucleic acid agglutinating agent is a substance that does not bind to the nucleic acid probe itself but binds to an aggregate of the target nucleic acid and the labeled nucleic acid probe .
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと前記検体液とを混合させた後に前記核酸凝集剤を添加して混合液を作製する工程であることが好ましい。
A step of preparing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with the target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed,
It is preferable to add the nucleic acid agglutinating agent after mixing the labeled nucleic acid probe and the sample solution to prepare a mixed solution.
前記標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程が、
前記標識核酸プローブと、前記検体液と、核酸凝集剤とを同時に混合させる工程であることが好ましい。
前記核酸プローブがペプチド核酸であることが好ましい。
A step of preparing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with the target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed,
The step is preferably a step of mixing the labeled nucleic acid probe, the sample solution, and the nucleic acid agglutinating agent simultaneously.
The nucleic acid probe is preferably a peptide nucleic acid.
前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程が、前記混合液の色の変化を測定することによって行う工程であることが好ましい。 It is preferable that the step of detecting the presence / absence or degree of aggregation of the microcarriers is a step performed by measuring a color change of the mixed solution.
また、別の本発明は、
検体液中の標的核酸を検出するための検査キットであって、
前記検査キットが、少なくとも第一の検査試薬と第二の検査試薬とを備え、
前記第一の検査試薬には、核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブが含まれており、前記第二の検査試薬には、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する核酸凝集剤が含まれていることを特徴とする標的核酸の検査キットである。
Another aspect of the present invention is:
A test kit for detecting a target nucleic acid in a sample liquid,
The test kit includes at least a first test reagent and a second test reagent ,
The first test reagent includes a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe is immobilized on a microcarrier , and the second test reagent does not bind to the nucleic acid probe itself, and the target nucleic acid and A test kit for a target nucleic acid, which comprises a nucleic acid agglutinating agent that binds to the association with the labeled nucleic acid probe .
本発明の検出方法及び検査キットを用いることによって、簡便な標的核酸の調整、および目視を含む簡易な検出方法によって、配列特異的に標的核酸の検出を行うことが可能となる。 By using the detection method and test kit of the present invention, the target nucleic acid can be detected in a sequence-specific manner by a simple detection method including simple adjustment of the target nucleic acid and visual observation.
本発明は、
検体液中の標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有することを特徴とする核酸検出方法。
The present invention
A nucleic acid detection method for detecting a target nucleic acid in a sample liquid,
Producing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with a target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed;
Detecting the presence or absence or degree of aggregation of the microcarriers in the mixed solution;
A nucleic acid detection method comprising:
微小担体が凝集したことが検知された場合には、検体液中に標的核酸が存在するということになり、試料中に標的核酸が存在するということになる。 When it is detected that the microcarriers are aggregated, the target nucleic acid is present in the sample liquid, and the target nucleic acid is present in the sample.
これらの工程は、通常溶液中で行われる。一般的には、試料溶液と標識核酸プローブ含有溶液とを混合して混合液を形成した後に、この混合液中に核酸凝集剤を添加する又は核酸凝集剤を含む溶液を添加するという順序で行われる。 These steps are usually performed in solution. In general, after a sample solution and a labeled nucleic acid probe-containing solution are mixed to form a mixed solution, a nucleic acid aggregating agent is added to the mixed solution or a solution containing a nucleic acid aggregating agent is added in this order. Is called.
なお、後述する例のように、核酸凝集剤と、前記標的核酸と前記標識核酸プローブからなる会合体との反応に比べて、核酸凝集剤と核酸との反応が著しく早い場合には、核酸プローブと検体液とを混合させて、核酸プローブと標的核酸との会合が十分に進んだ後にこれらの会合体を含有する溶液に核酸凝集剤を添加すべきである。一方、これらの反応の速度に大きな差がないような場合など会合していない標的核酸と凝集剤との反応を問題にしなくてよいような場合には、試料中に標識核酸プローブと核酸凝集剤とを同時又はほぼ同時に添加するような手法を採ることも考えられる。 In the case where the reaction between the nucleic acid agglutinating agent and the nucleic acid is remarkably faster than the reaction between the nucleic acid aggregating agent and the aggregate consisting of the target nucleic acid and the labeled nucleic acid probe as in the example described later, the nucleic acid probe And the sample solution are mixed, and after the association between the nucleic acid probe and the target nucleic acid has sufficiently progressed, the nucleic acid aggregating agent should be added to the solution containing these aggregates. On the other hand, in cases where there is no significant difference in the speed of these reactions, such as when there is no need for the reaction between the target nucleic acid and the agglutinating agent that are not associated, the labeled nucleic acid probe and the nucleic acid aggregating agent are contained in the sample. It is also conceivable to adopt a method in which and are added simultaneously or almost simultaneously.
本発明に係る測定方法の一実施形態の概略を、図を用いて説明する。なお、本実施形態は、以下の手順に従って検出を実施することができるが、この手順に限定されるものではない。 An outline of an embodiment of the measurement method according to the present invention will be described with reference to the drawings. In addition, although this embodiment can implement | achieve detection according to the following procedures, it is not limited to this procedure.
図１は、本実施形態における検出方法を示すものである。この図の左側には、核酸プローブ３と相補的な配列を持つ核酸（標的核酸１）を用いた検出例を、右側には、核酸プローブ３と相補的な配列を持たない核酸（非標的核酸２）を用いた検出例を、それぞれ示す。 FIG. 1 shows a detection method in the present embodiment. On the left side of this figure is a detection example using a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid probe 3 (target nucleic acid 1), and on the right side is a nucleic acid having no sequence complementary to the nucleic acid probe 3 (non-target nucleic acid). Examples of detection using 2) will be shown respectively.
まず、図１（ａ）に示すように、標的核酸１を含む検体液と非標的核酸２を含み標的核酸１を含まない検体液を用意する。次に、図１（ｂ）に示すように、遺伝子増幅反応やプライマー伸張反応、ディネーチャー反応等を利用し、それぞれの核酸（標的核酸１あるいは非標的核酸２）の１本鎖核酸を形成する。その後、核酸プローブ３を微小担体９に固定させたもの（以下、「標識核酸プローブ１０」と呼ぶ）をそれぞれの検体液に加えて混合液を作製し、会合反応を行う。図１（ｃ）に示すように、前記会合反応により核酸プローブ３と相補的な配列を持つ標的核酸１は会合して会合状態４を形成、即ち会合体を形成するが、前記核酸プローブ３と相補的な配列を持たない非標的核酸２は会合しない（非会合状態５）。その後、それぞれの溶液に核酸凝集剤６を添加し、混合液を作製する。核酸凝集剤６は、検体液の１本鎖および２本鎖核酸と結合し、核酸を凝集させる性質を有している。それゆえ、前記会合状態４が形成された溶液に核酸凝集剤６を添加した場合、標的核酸同士が標識核酸プローブ１０を含んだ状態で凝集するが（標識核酸プローブの凝集７）、前記非会合状態５の混合液に核酸凝集剤６を添加した場合、非標的核酸２のみが核酸凝集剤６により凝集し、標識核酸プローブ１０は凝集しない（標識核酸プローブの非凝集８）。ここで、本発明において、「会合」とは、同種の分子が分子間力や水素結合などの比較的弱い力で数個結合して会合体を形成し、一つの分子のようにふるまうことである。また、「凝集」とは、多数の分子などが、互いの間の引力によって集合し、大きな集合体となる現象である。 First, as shown in FIG. 1A, a sample solution containing the target nucleic acid 1 and a sample solution containing the non-target nucleic acid 2 and not containing the target nucleic acid 1 are prepared. Next, as shown in FIG. 1 (b), a single-stranded nucleic acid of each nucleic acid (target nucleic acid 1 or non-target nucleic acid 2) is formed using gene amplification reaction, primer extension reaction, denature reaction, etc. . After that, the nucleic acid probe 3 immobilized on the microcarrier 9 (hereinafter referred to as “labeled nucleic acid probe 10”) is added to each sample solution to prepare a mixed solution, and an association reaction is performed. As shown in FIG. 1 (c), the target nucleic acid 1 having a sequence complementary to the nucleic acid probe 3 is associated with the nucleic acid probe 3 by the association reaction to form an association state 4, that is, an aggregate is formed. Non-target nucleic acid 2 having no complementary sequence does not associate (non-associated state 5). Thereafter, the nucleic acid aggregating agent 6 is added to each solution to prepare a mixed solution. The nucleic acid aggregating agent 6 has the property of binding to the single-stranded and double-stranded nucleic acids of the sample liquid and aggregating the nucleic acids. Therefore, when the nucleic acid aggregating agent 6 is added to the solution in which the association state 4 is formed, the target nucleic acids aggregate while containing the labeled nucleic acid probe 10 (aggregation 7 of the labeled nucleic acid probe). When the nucleic acid aggregating agent 6 is added to the mixed solution in the state 5, only the non-target nucleic acid 2 is aggregated by the nucleic acid aggregating agent 6, and the labeled nucleic acid probe 10 is not aggregated (non-aggregation 8 of the labeled nucleic acid probe). Here, in the present invention, “association” means that several molecules of the same type are combined by a relatively weak force such as intermolecular force or hydrogen bond to form an aggregate, and behave like a single molecule. is there. In addition, “aggregation” is a phenomenon in which a large number of molecules are aggregated by an attractive force between each other to form a large aggregate.
つまり、本実施形態では、試料中に標的核酸１が含まれている場合（言い換えれば、検体液中に標的核酸１が含まれている場合）、微小担体９は凝集し、含まれていない場合、微小担体９は凝集しない。そして、微小担体９の凝集の有無もしくは凝集の程度（言い換えれば凝集状態）は、肉眼による目視や吸光度測定器などの凝集状態検出器等で容易に検知できる。 That is, in this embodiment, when the target nucleic acid 1 is contained in the sample (in other words, when the target nucleic acid 1 is contained in the sample liquid), the microcarrier 9 is aggregated and not contained. The microcarrier 9 does not aggregate. The presence / absence of aggregation of the microcarriers 9 or the degree of aggregation (in other words, the aggregation state) can be easily detected by visual observation with the naked eye or an aggregation state detector such as an absorbance meter.
前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程において、前記微小担体の凝集の有無を検知する場合は、目視による測定で行うことが簡便で望ましい。一方、凝集の程度を検知する場合は、混合液の色の変化を分光光度計による吸光度の測定により行う方法や、静置下で沈殿した凝集体の大きさまたは空隙の密度もしくは大きさを凝集状態検知器によって検知する方法を用いることもできる。このような手法により、検出対象溶液中の標的核酸濃度の正確な測定が可能となる。なお、凝集の有無もしくは程度は、顕微鏡観察、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、磁気測定、または水晶振動子マイクロバランスなどの凝集状態検知方法によって検知することもできる。 In the step of detecting the presence / absence or degree of aggregation of the microcarriers, when detecting the presence / absence of aggregation of the microcarriers, it is convenient and desirable to perform the measurement by visual observation. On the other hand, when detecting the degree of agglomeration, the color change of the mixed solution is measured by measuring the absorbance with a spectrophotometer, or the size of aggregates or the density or size of voids precipitated under standing is agglomerated. A method of detecting by a state detector can also be used. Such a technique enables accurate measurement of the target nucleic acid concentration in the detection target solution. The presence / absence or degree of aggregation can also be detected by microscopic observation, detection of scattered light from particles, electrochemical detection, surface plasmon resonance, magnetic measurement, or an aggregation state detection method such as quartz crystal microbalance. .
＜核酸の種類＞
本発明の検出方法を適用することのできる標的核酸は、遺伝子増幅反応用のプライマーを設計することができ、そのプライマーを用いて遺伝子増幅反応を実施可能な塩基配列を有する核酸である限り、特に限定されるものではない。また、そのような核酸であれば、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも利用でき、更に一本鎖および二本鎖のいずれの核酸も利用できる。そのような核酸が有する塩基配列としては検出対象である遺伝子配列の少なくとも一部を含むものが好適に適用できる。そのような配列を含む核酸の有無あるいは量を検出することにより、当該遺伝子の有無あるいはコピー数を調べることができる。核酸の由来は問わない。すなわち、天然の核酸（例えば、動物、植物、微生物、ウイルスに由来する核酸）、人工的に合成した核酸（例えば、化学的に合成した核酸、あるいは、遺伝子工学的に合成した核酸）のいずれも、標的核酸として利用することができる。なお、本明細書中では、何かしらの機能を発現するための塩基配列を遺伝子と呼んでいる。したがって、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）と遺伝子とは必ずしも上位概念・下位概念の関係にはない。
<Nucleic acid type>
As long as the target nucleic acid to which the detection method of the present invention can be applied is a nucleic acid having a base sequence capable of designing a primer for gene amplification reaction and capable of performing the gene amplification reaction using the primer, It is not limited. Moreover, as long as it is such a nucleic acid, both DNA and RNA can be used, and also single-stranded and double-stranded nucleic acids can be used. As a base sequence possessed by such a nucleic acid, one containing at least a part of a gene sequence to be detected can be suitably applied. By detecting the presence or absence or amount of nucleic acid containing such a sequence, the presence or absence or copy number of the gene can be examined. The origin of the nucleic acid does not matter. That is, any of natural nucleic acids (for example, nucleic acids derived from animals, plants, microorganisms, viruses) and artificially synthesized nucleic acids (for example, chemically synthesized nucleic acids or nucleic acids synthesized by genetic engineering) Can be used as a target nucleic acid. In the present specification, a base sequence for expressing some function is called a gene. Therefore, nucleic acids (DNA, RNA) and genes are not necessarily in a high-level concept / low-level concept.
また、本発明の検出方法を適用することのできる試料は、標的となる核酸を含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料あるいは、環境由来の試料を挙げることができる。生物学的試料としては、例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿、***など）もしくは、毛髪、***物、臓器、組織、または動植物それ自体もしくは、それらの乾燥体などを挙げることができる。環境由来の試料としては、例えば、河川水、湖沼水、もしくは海水、土壌などを挙げることができる。また、これらの試料が液体である場合には、これらの試料を検体液として用いることができるが、必要に応じて試料溶液の希釈、分離、精製を施してもよい。また、これらの試料が固体である場合には、試料を溶出したものを検体液として用いることができるが、必要に応じて試料溶液の希釈、分離、精製を施してもよい。 Further, the sample to which the detection method of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it may contain a target nucleic acid, and examples thereof include biological samples and environmental samples. be able to. Biological samples include, for example, animal bodily fluids (eg, blood, serum, plasma, sputum, sweat, saliva, urine, semen, etc.) or hair, excrement, organs, tissues, or animals or plants themselves or These dry bodies can be mentioned. Examples of the sample derived from the environment include river water, lake water, seawater, and soil. Further, when these samples are liquids, these samples can be used as the sample liquid, but the sample solution may be diluted, separated, and purified as necessary. In addition, when these samples are solid, the sample eluted can be used as the sample liquid, but the sample solution may be diluted, separated, and purified as necessary.
＜核酸プローブ＞
本発明に用いられる核酸プローブとしては、配列特異的に核酸と会合し、核酸凝集剤とは結合をしない物質であれば何でも良い。好ましい核酸プローブとしてはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。合成の容易性の観点からは、核酸プローブの鎖長は１８ｍｅｒ以内であることが好ましい。また、核酸プローブの配列は、標的核酸の配列に応じて適宜決定することができる。なお、ペプチド核酸は、その構造中にリン酸ジエステル結合を有しないものである。すなわち、ペプチド核酸は、その名称中に「核酸」という文言を有してはいるものの、「核酸」の一種というわけではない。
<Nucleic acid probe>
The nucleic acid probe used in the present invention may be any substance as long as it is a substance that associates with a nucleic acid in a sequence-specific manner and does not bind to a nucleic acid aggregating agent. Preferable nucleic acid probes include peptide nucleic acids (PNA). From the viewpoint of ease of synthesis, the chain length of the nucleic acid probe is preferably within 18 mer. In addition, the sequence of the nucleic acid probe can be appropriately determined according to the sequence of the target nucleic acid. The peptide nucleic acid does not have a phosphodiester bond in its structure. That is, a peptide nucleic acid has the word “nucleic acid” in its name, but is not a kind of “nucleic acid”.
また、標識核酸プローブの核酸としてペプチド核酸を用いる場合、標的核酸の１塩基変異を検出することもできる。これは、ペプチド核酸の認識能が高いことによるものである。ペプチド核酸の認識能が高いため、標的核酸に一塩基変異がある場合、標的核酸と標識核酸プローブは会合体を形成しない。したがって、そのような場合には、凝集が生じない。一方、標的核酸に変異がない場合は、前述したように、会合体を形成するため凝集する。よって標的核酸に変異がない場合と、標的核酸に一塩基変異が存在する場合を区別することができる（すなわち一塩基変異を検出することができる）。なお、このような１塩基変異は、塩基の置換、挿入または欠損など、いずれであっても検出することができる。なお、ここで、「標的核酸の１塩基変異」とは、標的核酸が有する塩基のうちの一つの塩基が置換もしくは欠損していること、または、標的核酸が有する塩基のうち塩基に一つの塩基が挿入（付加）されたことを指す。 Further, when a peptide nucleic acid is used as the nucleic acid of the labeled nucleic acid probe, a single base mutation of the target nucleic acid can be detected. This is due to the high recognition ability of peptide nucleic acids. Since the recognition ability of peptide nucleic acid is high, when the target nucleic acid has a single nucleotide mutation, the target nucleic acid and the labeled nucleic acid probe do not form an aggregate. Therefore, in such a case, aggregation does not occur. On the other hand, when the target nucleic acid has no mutation, it aggregates to form an aggregate as described above. Therefore, a case where there is no mutation in the target nucleic acid and a case where a single base mutation exists in the target nucleic acid can be distinguished (that is, a single base mutation can be detected). Such single nucleotide mutations can be detected by any of substitution, insertion or deletion of bases. Here, “single base mutation of the target nucleic acid” means that one of the bases of the target nucleic acid is substituted or deleted, or one of the bases of the target nucleic acid has one base. Indicates that has been inserted (added).
＜微小担体＞
本発明に用いられる微小担体は、核酸プローブに固定できる微小物質であり、本手法の凝集反応の妨げにならない物質であれば何でもよく、例えば、金コロイド、銀コロイド、金や銀からなるナノロッドなどの微小金属構造体、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ等があげられる。また、本発明に係る微小担体の大きさは、本手法の凝集反応の妨げにならない大きさであればどのようなものでも利用できるが、その平均径が５ｎｍ〜５０００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
<Microcarrier>
The microcarrier used in the present invention is a micro substance that can be immobilized on a nucleic acid probe and may be any substance that does not interfere with the aggregation reaction of the present technique, such as gold colloid, silver colloid, nanorod made of gold or silver, etc. Fine metal structures, magnetic beads, polystyrene beads, glass beads and the like. In addition, the microcarrier according to the present invention may be of any size as long as it does not interfere with the aggregation reaction of the present method, but the average diameter may be in the range of 5 nm to 5000 nm. preferable.
微小担体表面への核酸プローブの固定は、既知のオリゴヌクレオチドの固定化方法等を利用することができる。例えば、微小担体に金コロイドを用いた場合、硫黄原子を持つ有機物中の硫黄原子が金などの金属の表面に共有結合することを利用する方法が挙げられる。この場合、予めチオール基を導入しておいた核酸プローブと金コロイドとを混合することで、金コロイドに核酸プローブを固定することができる。また、予め微小担体表面をシラン剤等でアミノ化、カルボキシル化、チオール化させておくことで、微小担体表面に核酸プローブを吸着法、カップリング反応等により固定することもできる。さらに、予めストレプトアビジンを微小担体に吸着させ、ビオチン修飾核酸プローブをストレプトアビジンに選択的に結合させて固定化する方法等も用いることもできる。 The nucleic acid probe can be immobilized on the surface of the microcarrier using a known oligonucleotide immobilization method or the like. For example, when a gold colloid is used for the microcarrier, a method utilizing a covalent bond of a sulfur atom in an organic substance having a sulfur atom to the surface of a metal such as gold can be mentioned. In this case, the nucleic acid probe can be fixed to the gold colloid by mixing the nucleic acid probe into which the thiol group has been introduced in advance and the gold colloid. In addition, by previously aminating, carboxylating, or thiolating the surface of the microcarrier with a silane agent or the like, the nucleic acid probe can be immobilized on the surface of the microcarrier by an adsorption method, a coupling reaction, or the like. Furthermore, a method in which streptavidin is previously adsorbed on a microcarrier and a biotin-modified nucleic acid probe is selectively bound to streptavidin and immobilized can also be used.
＜核酸凝集剤＞
本発明に用いられる核酸凝集剤は、核酸が１本鎖であるか、２本鎖であるかを問わず核酸に結合し、凝集する性質を有する物質である限り、特に限定されるものではない。核酸凝集剤の例としては、ヘキスト３３２５８［（Ｈｏｅｃｈｓｔ社）；２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（２’−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）］、ヘキスト３３３４２［（Ｈｏｅｃｈｓｔ社）；２’−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（２’−（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）］、
ヌクレアイエロー［（ｎｕｃｌｅａｒ ｙｅｌｌｏｗ；ＳＩＧＭＡ社）；４−［５−（４−メチル−１−ピペラジニル）［２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール］−２’−イル］−ベンゼンスルホンアミド（４−［５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）［２，５’−ｂｉ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ］−２’−ｙｌ］−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）］、ミトキサントロン［（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ；ＳＩＧＭＡ社）；１，４−ジヒドロキシ−５，８−ビス｛２−［（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］エチル｝アミノアントラセン−９，１０−ジオン（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５，８−ｂｉｓ｛２−［（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ｝ａｍｉｎｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９，１０−ｄｉｏｎｅ）］を挙げることができる。これらは、リン酸ジエステル結合を持たないＰＮＡとは結合しない。
<Nucleic acid agglutinating agent>
The nucleic acid aggregating agent used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that binds and aggregates with a nucleic acid regardless of whether the nucleic acid is single-stranded or double-stranded. . Examples of nucleic acid aggregating agents include Hoechst 33258 [(Hoechst); 2 ′-(4-hydroxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5′-bi-1H-benzimidazole ( 2 '-(4-hydroxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5'-bi-1H-benzimidazole)], Hoechst 33342 [(Hoechst); 2'-(4-ethoxyphenyl) ) -5- (4-Methyl-1-piperazinyl) -2,5′-bi-1H-benzimidazole (2 ′-(4-ethylphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5 '-Bi-1H-benzimidazole)],
Nuclea yellow [(nuclear yellow; SIGMA); 4- [5- (4-methyl-1-piperazinyl) [2,5′-bi-1H-benzimidazole] -2′-yl] -benzenesulfonamide ( 4- [5- (4-methyl-1-piperazinyl) [2,5′-bi-1H-benzimidazolol] -2′-yl] -benzensulfonamide)], mitoxantrone [(mitoxantrone; SIGMA); 4-dihydroxy-5,8-bis {2-[(2-hydroxyethyl) -amino] ethyl} aminoanthracene-9,10-dione (1,4-dihydroxy-5,8-bis {2-[(2 -Hydroxyethyl) -amino] ethyl} aminoanthrac ne-9,10-dione)] can be mentioned. They do not bind to PNAs that do not have a phosphodiester bond.
より、一般的には、核酸凝集剤として好適な物質は、標的核酸と核酸プローブとの会合体とは結合する一方で核酸プローブそのものとは結合しない（核酸と結合しない状態で存在する核酸プローブとは結合しない）物質である。すなわち、このような条件を満たす限り、核酸プローブと核酸凝集剤との組み合わせは任意に選択することができる。 More generally, a substance suitable as a nucleic acid agglutinating agent binds to an aggregate of a target nucleic acid and a nucleic acid probe, but does not bind to a nucleic acid probe itself (a nucleic acid probe that exists in a state in which it does not bind to a nucleic acid). Does not bind). That is, as long as these conditions are satisfied, the combination of the nucleic acid probe and the nucleic acid aggregating agent can be arbitrarily selected.
＜検査キット＞
次に本発明の検査キットの好適な実施形態例について説明する。
<Inspection kit>
Next, a preferred embodiment of the test kit of the present invention will be described.
本発明の検査キットは、検査試薬を少なくとも備えている。本発明の検査キットは、単数もしくは複数の検査試薬のみから構成されていても良いし、検査試薬以外に検査用の容器等を備えていても良い。検査試薬は、少なくとも核酸プローブ１と微小担体９とからなる標識核酸プローブ１０を有している。 The test kit of the present invention includes at least a test reagent. The test kit of the present invention may be composed of only one or a plurality of test reagents, or may include a test container in addition to the test reagents. The test reagent has a labeled nucleic acid probe 10 composed of at least a nucleic acid probe 1 and a microcarrier 9.
本発明の検査キットの好適な実施形態例に備わる検査試薬は、核酸プローブ１と微小担体９とからなる標識核酸プローブ１０そのものあるいはこれを有する試薬と、核酸凝集剤６そのものあるいはこれを有する試薬とからなる。また、これらの試薬は、乾燥状態であっても、溶液状態であってもよく、反応促進試薬、界面活性化剤等が添加されていても構わない。 A test reagent provided in a preferred embodiment of the test kit of the present invention includes a labeled nucleic acid probe 10 itself comprising a nucleic acid probe 1 and a microcarrier 9 or a reagent having the same, a nucleic acid aggregating agent 6 itself or a reagent having the same. Consists of. These reagents may be in a dry state or a solution state, and a reaction promoting reagent, a surfactant or the like may be added thereto.
本実施形態例の検査キットは、検体液に前記検査試薬（標識核酸プローブ１０そのものあるいはこれを有する試薬および核酸凝集剤６そのものあるいはこれを有する試薬）をこの順序で添加して混合液を作製し、混合液中の標的核酸の有無によって生じる微小担体の凝集程度を測定すればよい。この順序で試薬を添加するのは、核酸凝集剤と会合体との反応と比べて核酸凝集剤と核酸との反応が著しく早いからである。仮に、これらの反応の速度に大きな差がないような場合など会合していない標的核酸と凝集剤との反応を問題にしなくてよいような場合には検体液に標識核酸プローブと核酸凝集剤とを同時添加することが可能である。このような場合には、標識核酸プローブと核酸凝集剤との双方を有する試薬を用意してそれを添加することも考えられる。 In the test kit of this embodiment, the test reagent (the labeled nucleic acid probe 10 itself or a reagent having the same and the nucleic acid agglutinating agent 6 itself or a reagent having the same) is added in this order to the sample liquid to prepare a mixed solution. The degree of aggregation of the microcarriers generated depending on the presence or absence of the target nucleic acid in the mixed solution may be measured. The reason for adding the reagents in this order is that the reaction between the nucleic acid aggregating agent and the nucleic acid is significantly faster than the reaction between the nucleic acid aggregating agent and the aggregate. If the reaction between the target nucleic acid and the aggregating agent that are not associated with each other does not have to be a problem, such as when there is no significant difference in the speed of these reactions, the labeled nucleic acid probe and the nucleic acid aggregating agent are added to the sample solution. Can be added simultaneously. In such a case, it is conceivable to prepare a reagent having both a labeled nucleic acid probe and a nucleic acid aggregating agent and add it.
このキットを用いれば、迅速かつ簡便な標的核酸の検出が可能となる。 If this kit is used, the target nucleic acid can be detected quickly and easily.
以下、本発明の実施例を説明する。 Examples of the present invention will be described below.
（実施例１）
＜標識核酸プローブ溶液の調整＞
冷蔵状態にある、微小担体としての直径１５ｎｍの金コロイドが分散された金コロイド溶液を冷蔵状態から室温に戻し、その溶液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）０．９ｍｌと５０ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４０．１ｍｌとを混合して金コロイド溶液ａを用意する。
Example 1
<Preparation of labeled nucleic acid probe solution>
The colloidal gold solution having a diameter of 15 nm as a microcarrier dispersed in the refrigerated state is returned from the refrigerated state to room temperature, and 0.9 ml of the solution (manufactured by BB International) and 0.1 ml of 50 mM KH 2 PO 4 are added. A gold colloid solution a is prepared by mixing.
次に、３ｎｍｏｌのＮ末端にシステインを持つペプチド核酸（ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ｏ−Ｏ−ＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣ−Ｈ）（グライナージャパン製）と前記金コロイド溶液ａを混合し、室温で一晩反応させ混合液ｂを得る。次に、前記混合液ｂを１４０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上清を取り除き、新たに５０ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４を１ｍｌ加える。再度、同じ条件で遠心分離操作を行い、この沈殿物を標識核酸プローブ溶液とする。 Next, 3 nmol of peptide nucleic acid having a cysteine at the N-terminus (NH2-Cys-O-O-CTCCTCTTGACCTGC-H) (manufactured by Greiner Japan) and the colloidal gold solution a are mixed and reacted at room temperature overnight and mixed solution b Get. Next, the mixed solution b is centrifuged at 14000 rpm for 30 minutes, the supernatant is removed, and 1 ml of 50 mM KH 2 PO 4 is newly added. Again, centrifugation is performed under the same conditions, and this precipitate is used as a labeled nucleic acid probe solution.
＜検出反応＞
調整した標識核酸プローブ溶液５μｌに、標的核酸（５’−ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡ−３’）溶液（グナイナージャパン製）１０μｌを加えて、会合させる。次に、核酸凝集剤としての４００μＭ−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（和光純薬製）５μｌを加えて、凝集を促す。
<Detection reaction>
To 5 μl of the adjusted labeled nucleic acid probe solution, 10 μl of a target nucleic acid (5′-ACAGCAGGTCAAGAGGAGTA-3 ′) solution (manufactured by Gunner Japan) is added and associated. Next, 5 μl of 400 μM Hoechst 33258 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) as a nucleic acid aggregating agent is added to promote aggregation.
標的核酸を加えていない核酸プローブにＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を加える場合、溶液は色の変化を示さない。一方、標的核酸を加え、核酸プローブと会合させると、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の凝集作用により溶液は紫色に変化する。この色の変化は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８が標的核酸に結合し凝集する際、標的核酸に会合している核酸プローブに結合した金コロイドをも凝集させるために引き起こされる。それゆえ本実施例によれば、標的核酸の有無を簡便に検出することができる。 When Hoechst 33258 is added to a nucleic acid probe to which no target nucleic acid has been added, the solution does not show a color change. On the other hand, when the target nucleic acid is added and associated with the nucleic acid probe, the solution turns purple due to the aggregation action of Hoechst 33258. This color change is caused when the Hoechst 33258 binds to and aggregates with the target nucleic acid and also aggregates the gold colloid bound to the nucleic acid probe associated with the target nucleic acid. Therefore, according to this example, the presence or absence of the target nucleic acid can be easily detected.
（実施例２）
＜標的核酸の準備＞
検査試料として、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を用いてＰＣＲを行う。また標的核酸としては、Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子を選択する。
(Example 2)
<Preparation of target nucleic acid>
PCR is performed using Human Genomic DNA (manufactured by Novagen) as a test sample. In addition, as a target nucleic acid, a gene encoding Human Apolipoprotein E is selected.
ＰＣＲはＰＣＲ増幅キット（ＴｏＹｏＢｏ製）を用いて、下記の条件にて行う。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ：０．５μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ：２．５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ：２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４：１．５μｌ、ＫＯＤ：０．５μｌ、Ｆ−Ｐｒｉｍｅｒ：１．５μｌ、Ｒ−Ｐｒｉｍｅｒ：１．５μｌ、Ｈ２Ｏ：１４．５μｌを混合し、９５℃：１５秒−６８℃：１５秒の温度サイクルを３５回繰り返す。 PCR is performed using a PCR amplification kit (manufactured by ToYoBo) under the following conditions. Human Genomic DNA: 0.5 μl, 10 × Buffer: 2.5 μl, 2 mM dNTP: 2.5 μl, 25 mM MgSO 4 : 1.5 μl, KOD: 0.5 μl, F-Primer: 1.5 μl, R-Primer: 1. 5 μl and H 2 O: 14.5 μl are mixed, and the temperature cycle of 95 ° C .: 15 seconds-68 ° C .: 15 seconds is repeated 35 times.
その後、アシンメトリックＰＣＲにより１本鎖核酸を増幅し、このＰＣＲ産物を検査試料とする。 Thereafter, single-stranded nucleic acid is amplified by asymmetric PCR, and this PCR product is used as a test sample.
＜核酸プローブの調整＞
ペプチド核酸の塩基配列を表１に示すものとした点を除いては実施例１と同様の方法により、表１に示す核酸プローブを有する標識核酸プローブの溶液を調整する。
<Adjustment of nucleic acid probe>
A labeled nucleic acid probe solution having the nucleic acid probe shown in Table 1 is prepared in the same manner as in Example 1 except that the base sequence of the peptide nucleic acid is as shown in Table 1.
これらの核酸プローブは、それぞれ以下のようなものである。 Each of these nucleic acid probes is as follows.
１１２ＴＧＣは、１１２番目のアミノ酸がシステインであるＨｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。 112TGC is a peptide nucleic acid that is complementary to a part of a gene encoding Human Apolipoprotein E in which the 112th amino acid is cysteine.
１１２ＣＧＣは、１１２番目のアミノ酸がアルギニンであるＨｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。 112CGC is a peptide nucleic acid complementary to a part of a gene encoding Human Apolipoprotein E whose 112th amino acid is arginine.
１５８ＴＧＣは、１５８番目のアミノ酸がシステインであるＨｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。 158TGC is a peptide nucleic acid complementary to a part of a gene encoding Human Apolipoprotein E, in which the 158th amino acid is cysteine.
１５８ＣＧＣは、１５８番目のアミノ酸がアルギニンであるＨｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子の一部と相補的なペプチド核酸である。 158CGC is a peptide nucleic acid that is complementary to a part of a gene encoding Human Apolipoprotein E whose 158th amino acid is arginine.
＜検出反応＞
表１に示す各核酸プローブを有する標識核酸プローブ溶液５μｌのそれぞれに、調整した前記ＰＣＲ産物（標的核酸）の溶液を１０μｌずつ加えて、会合反応を行う。次に、それぞれの溶液に核酸凝集剤としての４００μＭ−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（和光純薬）を５μｌずつ加えて、凝集反応の有無を調べる。
<Detection reaction>
10 μl of the prepared solution of the PCR product (target nucleic acid) is added to each 5 μl of the labeled nucleic acid probe solution having each nucleic acid probe shown in Table 1, and an association reaction is performed. Next, 5 .mu.l of 400 .mu.M-Hoechst 33258 (Wako Pure Chemicals) as a nucleic acid aggregating agent is added to each solution, and the presence or absence of an agglutination reaction is examined.
表１に示すように、１１２ＴＧＣを有する標識核酸プローブ溶液および１５８ＣＧＣを有する標識核酸プローブ溶液は溶液の色変化を示すが、１１２ＣＧＣを有する標識核酸プローブ溶液および１５８ＴＧＣを有する標識核酸プローブ溶液は溶液の色変化を示さない。 As shown in Table 1, the labeled nucleic acid probe solution having 112 TGC and the labeled nucleic acid probe solution having 158 CGC show a color change of the solution, but the labeled nucleic acid probe solution having 112 CGC and the labeled nucleic acid probe solution having 158 TGC are the color of the solution. No change is shown.
つまり、試料中の標的核酸は、Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅをコードする遺伝子のうち、アミノ酸配列１１２番目に相当する１塩基置換部位の塩基がＴ、１５８番目に相当する１塩基置換部位の塩基がＣであることを意味し、これは１１２番目がシステイン、１５８番目がアルギニンであると分かる。なお、この組み合わせはε３型と呼ばれ、Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ３をコードする型である。また、アルツハイマー病及び心血管疾患の非常に強い危険因子であることが知られているε４は、１１２番目、１５８番目が共にアルギニンとなっている。 That is, in the target nucleic acid in the sample, among the genes encoding Human Apolipoprotein E, the base at the 1 base substitution site corresponding to the 112th amino acid sequence is T, and the base at the 1 base substitution site corresponding to the 158th is C. This means that the 112th is cysteine and the 158th is arginine. This combination is referred to as ε3 type, and is a type encoding Human Apolipoprotein E3. In addition, ε4, which is known to be a very strong risk factor for Alzheimer's disease and cardiovascular disease, is arginine at both the 112th and 158th.
このように、本実施例によれば、１塩基置換の有無も簡便に検出することができる。 Thus, according to this example, the presence or absence of single base substitution can also be detected easily.
１ 標的核酸
２ 非標的核酸
３ 核酸プローブ
４ 会合状態
５ 非会合状態
６ 核酸凝集剤
７ 標識核酸プローブの凝集
８ 標識核酸プローブの非凝集
９ 微小担体
１０ 標識核酸プローブ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Target nucleic acid 2 Non-target nucleic acid 3 Nucleic acid probe 4 Association state 5 Non-association state 6 Nucleic acid aggregating agent 7 Aggregation of labeled nucleic acid probe 8 Non-aggregation of labeled nucleic acid probe 9 Microcarrier 10 Labeled nucleic acid probe
Claims (6)
標的核酸と会合する核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブと、検体液と、核酸凝集剤とを混合させた混合液を作製する工程と、
前記混合液における前記微小担体の凝集の有無もしくは程度を検知する工程と、
を有し、
前記核酸凝集剤は、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する物質であることを特徴とする核酸検出方法。 A nucleic acid detection method for detecting a target nucleic acid in a sample liquid,
Producing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with a target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed;
Detecting the presence or absence or degree of aggregation of the microcarriers in the mixed solution;
I have a,
The nucleic acid agglutinating agent is a substance that does not bind to the nucleic acid probe itself, but binds to an aggregate of the target nucleic acid and the labeled nucleic acid probe .
前記標識核酸プローブと前記検体液とを混合させた後に前記核酸凝集剤を添加して混合液を作製する工程であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。 A step of preparing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with the target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed,
The nucleic acid detection method according to claim 1, wherein the nucleic acid agglutinating agent is added to the sample nucleic acid probe after mixing the labeled nucleic acid probe and the sample solution to prepare a mixed solution.
前記標識核酸プローブと、前記検体液と、核酸凝集剤とを同時に混合させる工程であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。 A step of preparing a mixed solution in which a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe that associates with the target nucleic acid is immobilized on a microcarrier, a sample solution, and a nucleic acid aggregating agent are mixed,
The nucleic acid detection method according to claim 1, wherein the nucleic acid detection method is a step of simultaneously mixing the labeled nucleic acid probe, the sample liquid, and a nucleic acid aggregating agent.
前記検査キットが、少なくとも第一の検査試薬と第二の検査試薬とを備え、
前記第一の検査試薬には、核酸プローブが微小担体に固定された標識核酸プローブが含まれており、前記第二の検査試薬には、前記核酸プローブそのものとは結合せず、前記標的核酸と前記標識核酸プローブとの会合体とは結合する核酸凝集剤が含まれていることを特徴とする標的核酸の検査キット。 A test kit for detecting a target nucleic acid in a sample liquid,
The test kit includes at least a first test reagent and a second test reagent ,
The first test reagent includes a labeled nucleic acid probe in which a nucleic acid probe is immobilized on a microcarrier , and the second test reagent does not bind to the nucleic acid probe itself, and the target nucleic acid and A test kit for a target nucleic acid, comprising a nucleic acid agglutinating agent that binds to an association with the labeled nucleic acid probe .
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