JP5210620B2 - Method and use of peptide aptamer library - Google Patents
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Description
本発明は、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、第一のペプチドアプタマー群を統計解析およびブロックシャッフリング法で処理することにより、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを回収することを特徴とする、上記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a peptide aptamer library including peptide aptamers that interact with a target protein to a high degree. More specifically, the present invention recovers peptide aptamers that interact with a target protein to a high degree by processing the first group of peptide aptamers by statistical analysis and block shuffling. The present invention relates to a rally manufacturing method.
さらに本発明は、上記ペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを作製する方法に関する。さらに、本発明は、上記いずれかのライブラリーを利用して、最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングする方法に関する。 Furthermore, this invention relates to the method of producing the combination peptide aptamer library containing the combination peptide aptamer which interacts with a target protein more highly using the said peptide aptamer library. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a peptide aptamer or a combination peptide aptamer that interacts with a target protein to the highest degree using any of the above libraries.
ペプチドとは、2以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものの総称である。タンパク質間相互作用は、本質的にペプチド間相互作用である生理学的現象を基盤とする。したがって、ペプチドの中でも、特に酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチド(ペプチドアプタマー)は、酵素と疾患の関連性を解明する上でも非常に有用な研究対象であり、抗体医薬に続く有望な分子として期待されている。 Peptide is a general term for two or more amino acids bonded by peptide bonds. Protein-protein interactions are based on physiological phenomena that are essentially peptide-peptide interactions. Therefore, among peptides, peptides that interact with proteins such as enzymes and receptors (peptide aptamers) are very useful for elucidating the relationship between enzymes and diseases. It is expected as a new molecule.
これまでにペプチドアプタマーの研究は、組み合わせ合成、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイなどの手法を用いて実施されてきた(非特許文献1〜4)。ファージディスプレイは、ビリオン粒子の表面にファージDNAにコードされたペプチドを表示する手法であり、新規なタンパク質およびペプチドをもたらすことに成功している。 So far, research on peptide aptamers has been carried out using techniques such as combinatorial synthesis, phage display, ribosome display, and mRNA display (Non-Patent Documents 1 to 4). Phage display is a technique for displaying peptides encoded by phage DNA on the surface of virion particles, and has succeeded in producing new proteins and peptides.
しかし、ファージディスプレイは、処理できるペプチドおよび多様性の数が制限されるという問題があった。そこで、現在はリボソームディスプレイやmRNAディスプレイなどのインビトロシステムの開発が進められている。これまでにインビトロシステムを利用して、処理できるペプチドの分子スペクトルを拡張し、さらに1012−15(ファージ・ディスプレイは109)にまで分子の多様性を拡大化することに成功している(非特許文献3および4)。
しかし、従来のインビトロシステムは、上記した長所があるにもかかわらず、方法論の不備が多いために、その使用は非常に制限されている。したがって、特定の疾患に関連する標的タンパク質に高度に相互作用(例えば、活性の促進または阻害など)する数多くの有用なペプチドアプタマーを含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法については未だ開発されていない。 However, in spite of the above-mentioned advantages, the conventional in vitro system is very limited due to the lack of methodologies. Therefore, a method for producing a peptide aptamer library including many useful peptide aptamers that highly interact (eg, promote or inhibit activity) with a target protein associated with a specific disease has not yet been developed.
したがって、本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。 Therefore, this invention made it the subject which should be solved to eliminate the problem of the above-mentioned prior art. That is, an object of the present invention is to provide a method for preparing a peptide aptamer library that makes it possible to pool a large number of useful peptide aptamers that highly interact with a target protein.
さらに本発明は、作製したペプチドアプタマーライブラリーを利用して、標的タンパク質により高度に相互作用するコンビネーションペプチドを含む、コンビネーションペプチドライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for producing a combination peptide library including a combination peptide that interacts with a target protein to a high degree using the produced peptide aptamer library.
本発明者らは、上記課題を解決するために、任意のペプチドアプタマー群から統計学的手法により得たアミノ酸配列情報に基づいてブロックシャッフリングする、ASAC(All−Steps−All−Combinations)法を開発した。上記ASAC法を利用することで、高度に標的タンパク質に相互作用する多数のペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することに成功した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have developed an ASAC (All-Steps-All-Combinations) method that performs block shuffling based on amino acid sequence information obtained from any peptide aptamer group by a statistical technique. did. By using the above ASAC method, a peptide aptamer library containing a large number of peptide aptamers that interact with a target protein at a high level was successfully produced.
さらに、本発明者らは、上記ペプチドアプタマーライブラリーから選ばれるペプチドアプタマーを基に、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーを合成し、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを開発した。さらに、本発明者らは、これらのライブラリーの中から最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成した発明である。 Furthermore, the present inventors synthesized a combination peptide aptamer linked via a spacer based on a peptide aptamer selected from the above peptide aptamer library, and includes a combination peptide aptamer that interacts with a target protein to a higher degree. A combination peptide aptamer library was developed. Furthermore, the present inventors have found that a peptide aptamer or a combination peptide aptamer that interacts with a target protein most highly from these libraries can be screened. The present invention has been completed based on these findings.
すなわち、本発明によれば、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。 That is, according to the present invention, there is provided a method for producing a peptide aptamer library including peptide aptamers that interact with a target protein, wherein the first group of amino acid sequences consisting of peptide aptamers that interact with a target protein are statistically analyzed. A cluster analysis step, a step of extracting a common amino acid sequence in each cluster, the common amino acid sequence is divided into blocks consisting of several amino acids, and the peptide aptamer is obtained by a block shuffling method using two or more of the obtained blocks. A peptide aptamer that interacts with the target protein at the same level as or higher than the peptide aptamer that interacts with the target protein most highly among the peptide aptamers included in the first group. From the second group, Comprising the step of including in serial peptide aptamer library, a manufacturing method of the peptide aptamer library are provided.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library of the present invention, the cluster analysis is a method of clustering amino acid sequences based on a Hamming distance between amino acid sequences.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックシャッフリング法が、Y連結に基づくブロックシャッフリング(Y−ligation−based block shuffling:YLBS)法である。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library of the present invention, the block shuffling method is a Y-ligation-based block shuffling (YLBS) method.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックがいずれも3、4、5または6個のアミノ酸からなる。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library of the present invention, each of the blocks is composed of 3, 4, 5 or 6 amino acids.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library of the present invention, the interaction of the target protein is an action of promoting the activity of the target protein or an action of inhibiting the activity of the target protein.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼであり、より好ましくは、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンBまたはトリプシンである。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library of the present invention, the target protein is aspartic protease, cysteine protease, serine protease or metalloprotease, more preferably cathepsin D, cathepsin E, cathepsin B or trypsin. .
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。 Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a combination peptide aptamer library containing a combination peptide aptamer that interacts with a target protein, wherein at least 2 selected from the peptide aptamer library produced by the method described above. Creating a third group of combination peptide aptamers in which various peptide aptamers are linked via a spacer, and interact with the target protein to the highest degree among the peptide aptamers contained in the peptide aptamer library Combination peptide aptamers that interact with the target protein at the same level or higher than peptide aptamers are recovered from the third group and included in the combination peptide aptamer library. Comprising the step, a manufacturing method of the combination peptide aptamer library is provided.
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。 Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a combination peptide aptamer library containing a combination peptide aptamer that interacts with a target protein, wherein at least one selected from the peptide aptamer library produced by the method described above. Creating a fourth group of combination peptide aptamers in which a peptide aptamer of a species and a peptide aptamer that interacts with any at least one target protein are linked via a spacer, and the peptide aptamer library A combination peptide aptamer that interacts with the target protein at the same level or higher than the peptide aptamer that interacts with the target protein to the highest degree among the peptide aptamers contained in Recovered from the group of, comprising the steps included in the combination peptide aptamer libraries, a manufacturing method of the combination peptide aptamer library.
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である。 Preferably, in the method for producing a combination peptide aptamer library of the present invention, the linkage via the spacer is achieved by a peptide pair library method.
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーが、配列表の配列番号1〜3からなる群から選ばれる配列のスペーサーである。 Preferably, in the method for producing a combination peptide aptamer library of the present invention, the spacer is a spacer of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing.
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーまたはコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記タンパク質が酵素または受容体である。 Preferably, in the method for producing a peptide aptamer library or a combination peptide aptamer library of the present invention, the protein is an enzyme or a receptor.
本発明によれば、第一のペプチドアプタマー群よりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することが可能になる。さらに、本発明により作製されたペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むライブラリーを作製することが可能になる。したがって、疾患に関連のある酵素を標的タンパク質として、これらのライブラリーから最も高度に上記標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることで、上記疾患の治療または予防するための組成物を作製することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to produce a peptide aptamer library including peptide aptamers that interact with a target protein to a higher degree than the first peptide aptamer group. Furthermore, it becomes possible to produce a library containing a combination peptide aptamer that interacts with a target protein to a higher degree by using the peptide aptamer library produced according to the present invention. Therefore, a composition for treating or preventing the above disease by screening a peptide aptamer or a combination peptide aptamer that interacts with the target protein most highly from these libraries using an enzyme related to the disease as a target protein. It becomes possible to produce a thing.
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The method for producing a peptide aptamer library of the present invention is a method for producing a peptide aptamer library including a peptide aptamer that interacts with a target protein, the amino acid sequence of the first group consisting of peptide aptamers that interact with the target protein A step of statistically analyzing a cluster, a step of extracting a common amino acid sequence in each cluster, a block shuffling method using two or more blocks obtained by dividing the common amino acid sequence into blocks composed of several amino acids And obtaining a second group of peptide aptamers, and interacting with the target protein at the same level or higher than the peptide aptamers that interact with the target protein to the highest degree among the peptide aptamers included in the first group. Peptide aptamers that act The second was recovered from the group, comprising the step of including the peptide aptamer library, a method for manufacturing a peptide aptamer library.
本明細書にいう「標的タンパク質」とは、所望の標的となるタンパク質であれば特に制限されないが、上記タンパク質としては酵素や受容体が好ましい。標的タンパク質としての具体的な例としては、カテプシンDやカテプシンEなどのアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンBなどのシステインプロテアーゼ、またはトリプシンなどのセリンプロテアーゼなどを挙げることができる。 The “target protein” referred to in the present specification is not particularly limited as long as it is a protein that is a desired target. Specific examples of the target protein include aspartic proteases such as cathepsin D and cathepsin E, cysteine proteases such as cathepsin B, and serine proteases such as trypsin.
これらのプロテアーゼのうち、例えば、カテプシンEは、免疫反応の一部として外来タンパク質を分解消化する作用を有し、リンパ腺や他の細胞において発現することが知られている。これまでに、カテプシンEの異常活性はアトピーや癌などの疾患に関連することが知られているが、カテプシンE活性を特異的に促進または阻害する分子については未だ知られていない。したがって、実施例で示したような、カテプシンEの活性を促進または阻害するなどの相互作用を示すペプチドアプタマーをプールすることは、アトピーや癌の予防または治療剤の創製において非常に有用である。 Among these proteases, for example, cathepsin E has an action of degrading and digesting foreign proteins as part of an immune reaction, and is known to be expressed in lymph glands and other cells. Until now, it has been known that the abnormal activity of cathepsin E is related to diseases such as atopy and cancer, but a molecule that specifically promotes or inhibits cathepsin E activity is not yet known. Therefore, pooling peptide aptamers that exhibit interactions such as promoting or inhibiting the activity of cathepsin E, as shown in the Examples, is very useful in the creation of preventive or therapeutic agents for atopy and cancer.
本明細書にいう「相互作用」とは、標的タンパク質の有する機能または作用に影響を与えるものであれば特に制限されないが、例えば、標的タンパク質(酵素)の活性促進や活性阻害、標的タンパク質(受容体)のリガンドの結合促進や結合阻害などを意味し、広義には機能または作用の調節や適正化なども含みうる。 The “interaction” in the present specification is not particularly limited as long as it affects the function or action of the target protein. For example, the target protein (enzyme) activity promotion or activity inhibition, target protein (reception) Body) means binding promotion or binding inhibition of the ligand, and in a broad sense, may include regulation or optimization of function or action.
本明細書にいう「ペプチドアプタマー」とは、上記した通り、酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチドであれば特に制限されず、例えば、タンパク質に相互作用するアミノ酸残基の数が2〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜30個、さらに好ましくは2〜20個、最適に好ましくは2〜10個程度のペプチドをいう。したがって、「ペプチドアプタマーライブラリー」とは、上記したペプチドアプタマーが複数集まった集団をいう。より具体的には、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの規模は1010以上、好ましくは1011以上、より好ましくは1012以上である。 The “peptide aptamer” as used herein is not particularly limited as long as it is a peptide that interacts with a protein such as an enzyme or a receptor, as described above. For example, the number of amino acid residues that interact with a protein is 2 ~ 100, preferably 2-50, more preferably 2-30, still more preferably 2-20, and most preferably about 2-10 peptides. Therefore, the “peptide aptamer library” refers to a group in which a plurality of the peptide aptamers described above are gathered. More specifically, the scale of the peptide aptamer library of the present invention is 10 10 or more, preferably 10 11 or more, more preferably 10 12 or more.
本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、例えば、標的タンパク質に相互作用して、標的タンパク質の生理活性を阻害または促進等するペプチドアプタマーであって、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発(原料)分子を意味する。したがって、本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群」は、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発分子の母集団(ライブラリー)を意味するものである。このような標的タンパク質に相互作用する第一の群としては、例えば、実施例で示した第一ライブラリーを挙げることができる。 The “peptide aptamer that interacts with a target protein” as used herein refers to, for example, a peptide aptamer that interacts with a target protein to inhibit or promote the physiological activity of the target protein, and the peptide aptamer of the present invention. It refers to the starting (raw) molecule in creating a library. Therefore, the “first group of peptide aptamers that interact with the target protein” referred to in the present specification means a population (library) of starting molecules when preparing the peptide aptamer library of the present invention. It is. Examples of the first group that interacts with the target protein include the first library shown in the Examples.
本明細書にいう「アミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する」とは、統計学的手法を用いてアミノ酸配列を分類(クラスタリング)することができれば特に制限されないが、例えば、アミノ酸配列間のハミング距離を計算し、その結果に基づいてアミノ酸配列を分類する方法を挙げることができる。ここで、「ハミング距離」とは、特定の文字数を持つ二種の文字列の中で、対応する位置にある異なった文字の個数をいう。例えば、一文字表記で表したアミノ酸配列EDNTSとADNKSの間のハミング距離は、AとKの位置の相違から2として計算される。このようにして計算されたハミング距離に基づき、統計アルゴリズムにより計算することにより系統樹を作製することができる。これらは手動でも可能であるが、例えば、「ClustalW」(サービスの主体:http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)などの計算ソフトを用いれば簡便に作製できる。 As used herein, “statistical cluster analysis of amino acid sequences” is not particularly limited as long as the amino acid sequences can be classified (clustered) using a statistical method. For example, hamming between amino acid sequences is possible. The method of classifying an amino acid sequence based on the result of calculating a distance can be mentioned. Here, “Hamming distance” refers to the number of different characters at corresponding positions in two types of character strings having a specific number of characters. For example, the Hamming distance between the amino acid sequences EDNTS and ADNKS expressed in single letter notation is calculated as 2 from the difference in the positions of A and K. Based on the Hamming distance calculated in this way, a phylogenetic tree can be created by calculation using a statistical algorithm. These can be done manually, but can be easily produced by using a calculation software such as “ClustalW” (main service entity: http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html). .
本明細書にいう「各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する」とは、例えば、上記クラスター解析により一つの枝にまとめられたペプチドアプタマー群のアミノ酸配列について、共通するアミノ酸配列を手動または情報処理ソフトを使うなどして自動で抽出することを意味する。 As used herein, “extracting a common amino acid sequence in each cluster” means, for example, manual or information processing of a common amino acid sequence of peptide aptamer groups collected in one branch by the above cluster analysis. It means extracting automatically by using software.
本明細書にいう「数個のアミノ酸」とは、2、3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸を意味し、好ましくは3、4、5または6個のアミノ酸、より好ましくは4個のアミノ酸である。本明細書でいう「数個のアミノ酸からなるブロックに分ける」としては、例えば、8アミノ酸残基からなるペプチドを4個のアミノ酸を一つの単位として2つのブロックに分けるなどが該当する。したがって、共通アミノ酸配列を集めて、得られた配列情報から可変領域と定常領域に分け、可変領域を対象として数個のアミノ酸からなる1〜4程度のブロックに分ければよい。 As used herein, “several amino acids” means 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 amino acids, preferably 3, 4, 5 or 6 amino acids, and more Preferably 4 amino acids. As used herein, “dividing into blocks consisting of several amino acids” corresponds to, for example, dividing a peptide consisting of 8 amino acid residues into 2 blocks with 4 amino acids as one unit. Therefore, the common amino acid sequences are collected, divided into variable regions and constant regions from the obtained sequence information, and divided into about 1 to 4 blocks composed of several amino acids for the variable regions.
本明細書にいう「ブロックシャッフリング法」とは、例えば、可変領域が8アミノ酸残基からなる異なる2種のペプチドを4個のアミノ酸(前半・中央・後半)ごとにブロック化し、得られた計6ブロックをシャッフリングすることにより確率論的な組み合わせで種々のペプチドを合成することができる方法をいう。そのような方法として、例えば、本発明者らによって開発されたY連結に基づくブロックシャッフリング(Y−ligation−based block shuffling:YLBS)法がある(例えば、K.Kitamra et al., Protein Engineering, (2002)、Vol.15、No.10、pp.843-853を参照)。 The “block shuffling method” referred to in the present specification is, for example, a method in which two different peptides whose variable regions are composed of 8 amino acid residues are blocked every 4 amino acids (first half, middle, second half). It refers to a method by which various peptides can be synthesized in a stochastic combination by shuffling 6 blocks. As such a method, for example, there is a Y-ligation-based block shuffling (YLBS) method developed by the present inventors (for example, K. Kitamra et al., Protein Engineering, ( 2002), Vol.15, No.10, pp.843-853).
上記YLBS法の概略は図1に示した通りであり、この図を用いて以下に説明する。
2種の一本鎖DNA(5’ハーフ鎖と3’ハーフ鎖)をシャッフリング用配列として作製する。これらの5’ハーフ鎖と3’ハーフ鎖において、単一のブロック配列を3’末端または5’末端のいずれかに配置する。さらに、各鎖のステム領域は相補的であり、PCRのプライマー結合領域として作用するDブランチ領域(図中のBD5とBD3)が含まれる。3’ハーフ鎖の5’末端はライゲーション反応のために予めリン酸化されている必要がある。5’ハーフ鎖および3’ハーフ鎖の同量(通常10pmol/10μl)の組み合わせが用いられ、ステム領域でハイブリダイゼーションされる。5’ハーフ鎖の3’末端および3’ハーフ鎖の5’末端は、0.1mM ATPの存在下で50UのT4 RNAリガーゼ(タカラ、京都、日本)でライゲートされる。ライゲーション生成物のプレ増幅後(このステップを省くことも可能)、プレ5’ハーフ鎖およびプレ3’ハーフ鎖のPCR産物が2種のPCR(図中の2種のプライマーセット:pS5/pBD3とpBD3/pS3)により得られる。ステム領域を含むプライマー(プライマー、pS5およびpS3)をあらかじめ5’末端でビオチン化しておき、次のYライゲーションサイクル用一本鎖DNAを作製するために使用する。PCR産物は対応する制限酵素(3’ハーフ鎖はMboII、5’ハーフ鎖はAlwI)で分離消化され、その後アルカリ変性により分離された一本鎖DNAはアビジン−ビオチン結合(ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用)によって回収される。プレ5’ハーフのビオチン化鎖とプレ3’ハーフの非ビオチン化鎖は、引き続き5’ハーフ鎖および3’ハーフ鎖として、次のYライゲーションサイクルで使用される。サイクル数nに依存して、ライゲートされるブロックのサイズおよび多様性が指数的に増加しうる:サイズは2n(=s)であり生産物多様性はds(dは開始時のブロックの多様性の値)。例えば、d=8であれば、PCR生産物の多様性は、64、4096、1.7×107、2.8×1014と増加する。なお、図中の○で囲まれたBおよびPは、それぞれビオチン化とリン酸化を示す。したがって、上記したようなブロックシャッフリング法によれば、多様性のある数多くのペプチドアプタマーからなる第二の群を作製することができる。
The outline of the YLBS method is as shown in FIG. 1, and will be described below with reference to this drawing.
Two kinds of single-stranded DNAs (5 ′ half strand and 3 ′ half strand) are prepared as shuffling sequences. In these 5 ′ and 3 ′ halves, a single block sequence is placed at either the 3 ′ or 5 ′ end. Furthermore, the stem region of each chain is complementary and includes D branch regions (B D5 and B D3 in the figure) that act as primer binding regions for PCR. The 5 ′ end of the 3 ′ half strand needs to be phosphorylated in advance for the ligation reaction. A combination of the same amount of 5 ′ half strand and 3 ′ half strand (usually 10 pmol / 10 μl) is used and hybridized in the stem region. The 3 ′ end of the 5 ′ half strand and the 5 ′ end of the 3 ′ half strand are ligated with 50 U T4 RNA ligase (Takara, Kyoto, Japan) in the presence of 0.1 mM ATP. After pre-amplification of the ligation product (this step can be omitted), the PCR product of the pre-5 ′ half-strand and the pre-3 ′ half-strand was converted into two PCRs (two primer sets in the figure: pS 5 / pB D3 and pB D3 / pS 3 ). Primers containing the stem region (primer, pS 5 and pS 3 ) are biotinylated at the 5 ′ end in advance and used to prepare single-stranded DNA for the next Y ligation cycle. The PCR product was separated and digested with the corresponding restriction enzyme ( Mbo II for 3 ′ half strand, Alw I for 5 ′ half strand), and then single-stranded DNA separated by alkaline denaturation was bound to avidin-biotin bond (streptavidin-coated magnetic Using beads). The pre 5 ′ half biotinylated strand and the pre 3 ′ half non-biotinylated strand are subsequently used in the next Y ligation cycle as 5 ′ half strand and 3 ′ half strand. Depending on the number of cycles n, the size and diversity of the ligated blocks can increase exponentially: the size is 2 n (= s) and the product diversity is d s (d is the starting block size) Diversity value). For example, if d = 8, the diversity of PCR products increases to 64, 4096, 1.7 × 10 7 , 2.8 × 10 14 . In the figure, B and P surrounded by ○ indicate biotinylation and phosphorylation, respectively. Therefore, according to the block shuffling method as described above, a second group consisting of a large number of diverse peptide aptamers can be produced.
本明細書にいう「第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと比較した場合に、同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマーを意味する。ここで、「高度に標的タンパク質に相互作用する」とは、例えば、相互作用が活性阻害作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで阻害することを意味し、または相互作用が活性促進作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで促進することを意味する。または、「同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマー」とは、基準となる相互作用と比べて同じかそれよりも大きい度合いで標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを意味する。 As used herein, `` a peptide aptamer that interacts with a target protein at the same level or higher than a peptide aptamer that interacts with a target protein to the highest degree among peptide aptamers included in the first group '' It means a peptide aptamer that interacts with a target protein at an equivalent level or higher when compared to a peptide aptamer that interacts with a target protein to the highest degree among peptide aptamers included in one group. Here, “highly interacts with the target protein” means that, for example, when the interaction is an activity inhibitory activity, it means that the activity of the target protein is inhibited to a greater degree, or the interaction promotes the activity. When acting, it means promoting the activity of the target protein to a greater degree. Alternatively, “a peptide aptamer that interacts with a target protein at the same level or higher” means a peptide aptamer that interacts with the target protein to the same degree or higher than the reference interaction.
本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。 The method for producing a combination peptide aptamer library according to the present invention is a method for producing a combination peptide aptamer library containing a combination peptide aptamer that interacts with a target protein, wherein at least two peptides selected from the peptide aptamer library described above A step of producing a third group of combination peptide aptamers in which aptamers are linked via a spacer, and a peptide aptamer that interacts with a target protein most highly among the peptide aptamers included in the peptide aptamer library A combination peptide aptamer that interacts with the target protein at the same level or higher is recovered from the third group, and the combination peptide aptamer Comprising the step of including in the library, a method for manufacturing a combination peptide aptamers library.
別の側面によれば、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。 According to another aspect, the method for producing a combination peptide aptamer library of the present invention is a method for producing a combination peptide aptamer library including a combination peptide aptamer that interacts with a target protein, and comprises the above peptide aptamer library. Producing a fourth group of combination peptide aptamers in which at least one selected peptide aptamer and a peptide aptamer that interacts with any at least one target protein are linked via a spacer; and Combination that interacts with the target protein at the same level or higher than the peptide aptamer that interacts with the target protein to the highest degree among the peptide aptamers contained in the peptide aptamer library The Activation Peptide aptamers recovered from the fourth group, comprising the step of including in the combination peptide aptamer libraries, a manufacturing method of a combination peptide aptamers library.
本明細書にいう「コンビネーションペプチドアプタマー」は、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させるか、または、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させることにより作製が可能である。スペーサーとしては、一定数のアミノ酸残基からなるスペーサーであれば特に制限されないが、例えば、3〜30アミノ酸残基、好ましくは5〜15アミノ酸残基、より好ましくは8〜12アミノ酸残基からなるスペーサーが用いられる。スペーサーの例として、グリシンからなる配列(G10およびG15;アルファベットはアミノ酸の一文字表記を表し、数字はアミノ酸の数を表す。以下同じ。)、グリシンおよびセリンからなる配列(G3SG3G2およびG3SG3SG3SG3)ならびにグリシンおよびプロリンからなる配列(G3PG3PG2およびG3PG3PG3PG3)などがあり、具体例としては配列表の配列番号1〜3からなる群から選ばれる配列を利用できる。 As used herein, the “combination peptide aptamer” refers to at least two peptide aptamers selected from the above peptide aptamer library linked via a spacer, or at least one selected from the above peptide aptamer library. It can be prepared by linking a peptide aptamer of a species and a peptide aptamer that interacts with any at least one target protein via a spacer. The spacer is not particularly limited as long as it is a spacer composed of a certain number of amino acid residues. For example, it is composed of 3 to 30 amino acid residues, preferably 5 to 15 amino acid residues, more preferably 8 to 12 amino acid residues. A spacer is used. Examples of spacers include sequences consisting of glycine (G10 and G15; alphabets represent single letter amino acids, numbers represent the number of amino acids; the same shall apply hereinafter), sequences consisting of glycine and serine (G3SG3G2 and G3SG3SG3SG3) and glycine and There are sequences composed of proline (G3PG3PG2 and G3PG3PG3PG3) and the like. As a specific example, a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing can be used.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
1 材料および方法
(1)ライブラリーの構築
組み合わせDNAおよびIVV(in vitro virus)ペプチドライブラリーは、YLBS法およびcDNAディスプレイによって構築された。これらの実験に使用されたDNAブロックおよびプライマーの配列を表1および表2にまとめた。
1 Materials and Methods (1) Library Construction Combinatorial DNA and IVV (in vitro virus) peptide libraries were constructed by the YLBS method and cDNA display. The DNA block and primer sequences used in these experiments are summarized in Tables 1 and 2.
(2)選択に使用されたCE固定化ビーズ
カテプシンE(CE)は通常知られる方法に従ってネズミ脾臓から調製された。精製CEは、メーカーの指示に従って、化学的に安定したアミド結合を形成する化合物をカップリングし得るアミンを使用することにより、NHS活性化セファロース・ビーズ(GEヘルスケア)上で固定された。酵素をカップリングしたビーズは、使用時まで4℃で100mM リン酸緩衝液(pH 7.4)中に保管された。カップリング効率は、カップリングしていない酵素の吸光度を遊離酵素の吸光度と比較することにより計算された。
(2) CE-immobilized beads used for selection Cathepsin E (CE) was prepared from murine spleen according to a commonly known method. Purified CE was immobilized on NHS activated Sepharose beads (GE Healthcare) by using amines that can couple compounds that form chemically stable amide bonds according to the manufacturer's instructions. The enzyme-coupled beads were stored in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) at 4 ° C. until use. Coupling efficiency was calculated by comparing the absorbance of the uncoupled enzyme with the absorbance of the free enzyme.
(3)親和性選択
選択緩衝液(50mM トリス−HCl、100mM NaCl、5mM MgCl2、pH 7.2)の100μl中のIVVペプチドライブラリーは、CE固定化ビーズの5μlと30分間混合され、25℃で30分間インキュベートされた。ビーズは、選択ラウンドごと、つまり、ラウンド1は2:2:1、ラウンド2は2:2:2、ラウンド3は3:3:3に変えて洗浄プロトコールに従って、200μlの選択緩衝液、洗浄緩衝液−1(50mM トリス−HCl、0.5M NaCl、pH 7.2)および洗浄緩衝液−2(50mMトリス−HCl、1M NaCl、pH 7.2)で洗浄された。最後に、ビーズは、溶出緩衝液−1(50mM トリス−HCl、1M NaCl、10mM MgCl2、pH 7.2)の200μl中で懸濁され、5分間37℃でインキュベートされた。遠心分離(15,000rpm、1min)の後、ビーズは溶出緩衝液−1で再び洗浄された。結合した上清は保管された(Sup1)。ビーズは、溶出緩衝液−2(50mM トリス−HCl、2M NaCl、10mM MgCl2、pH 7.2)で懸濁され、5分間95℃でインキュベートされた。インキュベーション後、ビーズは取り除かれ、および上清は保管された(Sup2)。Sup1とSup2の中のIVVはBio−Spinカラム(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)で精製された。
(3) The IVV peptide library in 100 μl of affinity selection buffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , pH 7.2) is mixed with 5 μl of CE immobilized beads for 30 minutes, Incubated for 30 minutes at ° C. Beads should be 200 μl selection buffer, wash buffer per selection round, ie, 2: 2: 1 for round 1, 2: 2: 2 for round 2, 3: 3: 3 for round 3, and according to the wash protocol Washed with liquid-1 (50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.2) and wash buffer-2 (50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7.2). Finally, the beads were suspended in 200 μl of elution buffer-1 (50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM MgCl 2 , pH 7.2) and incubated for 5 minutes at 37 ° C. After centrifugation (15,000 rpm, 1 min), the beads were washed again with elution buffer-1. The bound supernatant was saved (Sup1). The beads were suspended in elution buffer-2 (50 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 10 mM MgCl 2 , pH 7.2) and incubated for 5 minutes at 95 ° C. After incubation, the beads were removed and the supernatant was saved (Sup2). The IVV in Sup1 and Sup2 was purified on a Bio-Spin column (Bio-Rad Laboratories).
(4)機能選択
親和性選択のラウンド3の結果として作製されたDNAライブラリーは、可変領域としてIVV−SF−連結DNA構築物(図2)に挿入された。反応緩衝液(50mM 酢酸ナトリウム、100mM NaCl、pH 4.5)の100μl中のIVV−SF−連結ペプチドライブラリーは、CE固定ビーズの5μlと混合され、10分間40℃でインキュベートされた。インキュベーション後に、ビーズは親和性選択に記載した通りに、洗浄および溶出された。
(4) Function selection The DNA library prepared as a result of round 3 of affinity selection was inserted into the IVV-SF-linked DNA construct (FIG. 2) as a variable region. IVV-SF-linked peptide library in 100 μl of reaction buffer (50 mM sodium acetate, 100 mM NaCl, pH 4.5) was mixed with 5 μl of CE immobilized beads and incubated for 10 minutes at 40 ° C. After incubation, the beads were washed and eluted as described in affinity selection.
選択緩衝液、洗浄緩衝液−1および洗浄緩衝液−2を使用した洗浄繰り返し回数のプロトコールは、選択ラウンド(F1−F9)によって以下のように実行された:F1は3:3:3;F2は4:5:3;F3は5:5:5;F4は5:7:5;F5は5:7:7;F6は5:10:7;F7は 5:10:10;F8は5:15:10;F9は5:15:15。 The protocol for the number of wash repetitions using selection buffer, wash buffer-1 and wash buffer-2 was performed by the selection round (F1-F9) as follows: F1 is 3: 3: 3; F2 4: 5: 3; F3 5: 5: 5; F4 5: 7: 5; F5 5: 7: 7; F6 5: 10: 7; F7 5:10:10; F8 5 : 15: 10; F9 is 5:15:15.
(5)IVVからのペプチドの回収
PCR溶液(7.5μl、5pmolのDNA)は、インビトロ翻訳システムキット(和光純薬システム、和光)の12.5μlのA溶液および5μlのB溶液で混合され、および1時間37℃でインキュベートされた。事前に200μlの1×結合緩衝液(TaKaRa)で2度洗浄され、および25μlの2×結合緩衝液で懸濁された磁気ビーズ懸濁液(10μl、Magnotex SA、TaKaRa)は、翻訳混合物に加えられ、1時間37℃でインキュベートされた。インキュベーション後、磁気ビーズは磁石で取り除かれ、200μlの0.01% BSA溶液で洗浄された。
(5) Recovery of peptide from IVV PCR solution (7.5 μl, 5 pmol DNA) was mixed with 12.5 μl A solution and 5 μl B solution of in vitro translation system kit (Wako Pure Chemicals System, Wako) And incubated for 1 hour at 37 ° C. Magnetic bead suspension (10 μl, Magnotex SA, TaKaRa) previously washed twice with 200 μl 1 × binding buffer (TaKaRa) and suspended in 25 μl 2 × binding buffer is added to the translation mixture. And incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the magnetic beads were removed with a magnet and washed with 200 μl of 0.01% BSA solution.
ビーズは、2UのファクターXaを含む、ファクターXa反応混合物(20mM トリス−HCl、50mM NaCl、1mM CaCl2、pH6.8)の中で懸濁され、混合の後に1時間37℃でインキュベートされた。上清は磁石で回収され、0.25μlの1M トリス−HCl(pH8.0)でpHを調節された。次に、事前に1×Xa緩衝液(pH 8.0)で洗浄されたXa除去樹脂(QIAGEN)の10μlが、回収された溶液に加えられ、混合の後に10分間室温でインキュベートされた。上清は遠心分離によって回収された。回収されたペプチドは合計10pmolであると見積もられ、溶液の2μlが阻害活性を測定するために使用された。 The beads were suspended in a Factor Xa reaction mixture (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 6.8) containing 2 U of Factor Xa and incubated at 37 ° C. for 1 hour after mixing. The supernatant was collected with a magnet and the pH was adjusted with 0.25 μl of 1M Tris-HCl (pH 8.0). Next, 10 μl of Xa removal resin (QIAGEN) previously washed with 1 × Xa buffer (pH 8.0) was added to the recovered solution and incubated for 10 minutes at room temperature after mixing. The supernatant was collected by centrifugation. The recovered peptide was estimated to be a total of 10 pmol and 2 μl of the solution was used to measure inhibitory activity.
(6)活性分析
阻害活性分析のために、(IVVまたは有機合成の何れかから得られた)ペプチドアプタマーは、90μlの選択緩衝液において1:1のモル比で(0.1%のBSA中の)CEとプレインキュベートされた。次に、0.1mM 蛍光性CE基質(ペプチド研究所)の10μlが溶液に加えられ、10分間40℃でインキュベートされた。反応生成物の蛍光強度(λem:430nm、λex:360nm)は、蛍光マイクロプレートリーダー(FluPOLO、TaKaRa)によって測定された。
(6) Activity analysis For inhibitory activity analysis, peptide aptamers (obtained from either IVV or organic synthesis) were prepared at a 1: 1 molar ratio (in 0.1% BSA) in 90 μl of selection buffer. Preincubated with CE). Next, 10 μl of 0.1 mM fluorescent CE substrate (Peptide Laboratories) was added to the solution and incubated for 10 minutes at 40 ° C. The fluorescence intensity (λem: 430 nm, λex: 360 nm) of the reaction product was measured by a fluorescence microplate reader (FluPOLO, TaKaRa).
パーセント阻害は下記式(1)によって計算された:
コントロールの%阻害=100×(1−Sf/CEf) (1)
上記式(1)中、Sfは酵素(CE)、蛍光性基質および潜在的な阻害剤を含む試料溶液の蛍光強度であり、CEfはブランク溶液の蛍光強度であり、阻害剤のない試料溶液と同様である。
Percent inhibition was calculated by the following equation (1):
% Inhibition of control = 100 × (1-Sf / CEf) (1)
In the above formula (1), Sf is the fluorescence intensity of the sample solution containing the enzyme (CE), the fluorescent substrate, and the potential inhibitor, and CEf is the fluorescence intensity of the blank solution. It is the same.
(7)マルチ・ミクロ・ヴェッセル(MMV)およびその中での反応
MMVに基づいたクローン淘汰用のDNA構築物、およびMMVを使用した実験操作を、図3の中で簡潔に示した。MMVは、光照射による重合反応を開始するためにDMD(ディジタル多重反射鏡装置)プロジェクターを使用して、アクリルアミド(18%)ゲルで作られた。MMVは、通常2.5×2.5cm2の面積の上に1024個の小さなウェルを保持する。ここでPCR、インビトロ転写、インビトロ翻訳およびカテプシンE−反応のすべてが行なわれた。
(7) The DNA construct for clone clones based on multi-micro-vessel (MMV) and the reaction MMV therein, and the experimental procedure using MMV are shown briefly in FIG. The MMV was made of acrylamide (18%) gel using a DMD (Digital Multiple Reflector Device) projector to initiate the polymerization reaction by light irradiation. MMV holds 1024 small wells on the area of the normal 2.5 × 2.5 cm 2. Here, PCR, in vitro transcription, in vitro translation and cathepsin E-reaction were all performed.
(8)IC50阻害の特性
CEは上記された通りに、ペプチド・クローンの濃度を変えてインキュベートされた。パーセント阻害は上記式(1)によって計算された。IC50(50%の阻害が観察された濃度)は、投与−反応曲線から決定された。
(8) Characteristics of IC 50 inhibition
CE was incubated as described above with varying concentrations of peptide clones. Percent inhibition was calculated by equation (1) above. IC 50 (the concentration at which 50% inhibition was observed) was determined from the dose-response curve.
(9)解離定数の測定
解離定数の測定はFriguetらの方法を改良して実施された。上記の方法の中で言及されているように、それぞれのペプチドのIVVが用意された。大型のmRNAおよびリボソームは、ペプチド結合物を遊離するために30分間25℃でリボヌクレアーゼAおよびリボヌクレアーゼH(Ambion)を用いて消化によって放出された。一定量のペプチド結合物(〜2nM)はCEの量を変えて(1nM〜1μM)1時間インキュベートされた。混合物は、一定量の固定化CE(〜200nM)に適用され、さらに30分間インキュベートされた。PBS−T(リン酸緩衝化塩溶液;0.1% Tween20)を用いた数回の洗浄後、Penta.His HRP(QIAGEN)が1/2000希釈で加えられ、1時間インキュベートされた。ビーズはPBS−Tで徹底的に洗浄され、その後基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB、シグマ)を添加した。発色をさせた後、反応は0.5M H2SO4の添加によって止められた。吸光度はマイクロプレート・リーダ(Tecan)を用いて450nmで測定された。データはGraphPadプリズム(GraphPadソフトウェア社)を使用してプロットされた。
(9) Measurement of dissociation constant The dissociation constant was measured by improving the method of Friguet et al. As mentioned in the method above, an IVV for each peptide was prepared. Large mRNAs and ribosomes were released by digestion with ribonuclease A and ribonuclease H (Ambion) at 25 ° C. for 30 minutes to release the peptide conjugate. A fixed amount of peptide conjugate (-2 nM) was incubated for 1 hour with varying amounts of CE (1 nM-1 μM). The mixture was applied to a fixed amount of immobilized CE (˜200 nM) and incubated for an additional 30 minutes. After several washes with PBS-T (phosphate buffered salt solution; 0.1% Tween 20), Penta. His HRP (QIAGEN) was added at a 1/2000 dilution and incubated for 1 hour. The beads were washed thoroughly with PBS-T and then the substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) was added. After color development, the reaction was stopped by the addition of 0.5 MH 2 SO 4 . Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Tecan). Data was plotted using a GraphPad prism (GraphPad Software).
(10)ペプチドペアライブラリー法(図12)
ペプチドペアライブラリー法は下記の通りに実施した。
[a]材料
(10) Peptide pair library method (FIG. 12)
The peptide pair library method was performed as follows.
[A] Material
[b]ペプチドアプタマーの連結候補
配列表の配列番号4および5の配列が、ペプチドアプタマーをコードするDNA配列と連結させる配列として用いられた。ペプチドアプタマーをコードするDNAは、配列番号4の5’末端または配列番号5の3’末端に連結する。
[B] Candidates for Peptide Aptamer Sequences SEQ ID Nos. 4 and 5 in the sequence listing were used as sequences to be linked to a DNA sequence encoding a peptide aptamer. DNA encoding the peptide aptamer is linked to the 5 ′ end of SEQ ID NO: 4 or the 3 ′ end of SEQ ID NO: 5.
CEに相互作用するペプチドおよびYタグを配列表の配列番号6〜18とした(表3)。 Peptides that interact with CE and the Y tag were set as SEQ ID NOs: 6 to 18 in the Sequence Listing (Table 3).
[c]プライマー
ペプチドペアライブラリー法に用いたプライマーを配列表の配列番号19〜28とした(表4)。
[C] Primer The primers used in the peptide pair library method were set as SEQ ID NOS: 19 to 28 in the Sequence Listing (Table 4).
[d]バッファー
[D] Buffer
[e]方法
(1)ペプチドとスペーサーの結合
4)電気泳動
5)5’ハーフDNAの抽出
(2)ペプチドとyタグの連結
4)電気泳動
5)3’ハーフDNAの抽出
(3)ペプチド+スペーサー+ペプチド+yタグの連結
3)電気泳動
4)DNAの抽出
[E] Method (1) Binding of peptide and spacer
4) Electrophoresis 5) Extraction of 5 ′ half DNA
(2) Linking peptide and y tag
4) Electrophoresis 5) Extraction of 3 ′ half DNA
(3) Linking peptide + spacer + peptide + y tag
3) Electrophoresis 4) DNA extraction
2 結果
(1)ペプチドアプタマーの選択(淘汰)のための戦略
mRNAディスプレイに基づいたインビトロ選択を使用して、ペプチドアプタマーの選択および淘汰の戦略を開発した(図4)。第一ライブラリーは、新規な機能を備えた生物活性分子の同定において不可欠である。第二ライブラリーの選択は、分子淘汰のさらなる選抜を可能にする。第一および第二ライブラリーの選択段階は、両方とも二種の淘汰、すなわち集団淘汰とクローン淘汰を含んでいる。
2 Results (1) Strategies for Peptide Aptamer Selection (淘汰) In vitro selection based on mRNA display was used to develop a peptide aptamer selection and selection strategy (Figure 4). The first library is essential in identifying bioactive molecules with novel functions. The selection of the second library allows further selection of molecular cages. The selection steps for the first and second libraries both include two types of selection, a population selection and a clone selection.
集団淘汰は、プールされた分子のライブラリーを選別する。しかし、クローン淘汰は、クローンごとに分子を個々に選別する。これに加えて、従来方式の困難な段階を回避するために、用途の広い有用性のあるマイクロアレイ、換言すればマルチ・ミクロ・ヴェッセル(MMV)を用いるクローニングである新たな方法を用いた。この種のマイクロアレイの導入は、選択の後期段階における迅速なスクリーニングに非常に有用であった。淘汰の進行とともに、より低活性の分子が削除されていくと同時に、各ライブラリー内の多様性は減少していく。第二ライブラリーの構築は、第一ライブラリーの淘汰で生成した配列情報に基づいて達成される。すなわち、第一ライブラリーから選ばれたペプチドブロックを使用して行う、ブロックシャッフリング法(All−steps−all−combinations(ASAC)法)を開発して組み込んだeRAPANSY(evolutionary rapid panning and analysis system)と呼ばれるシステムを用いて、カテプシンE阻害ペプチドの選択に成功し、この方法の有効性を実証した。 A population selection screens a library of pooled molecules. However, clone clones screen molecules individually for each clone. In addition, in order to avoid the difficult steps of the conventional method, a new method was used which was a versatile and useful microarray, in other words, cloning using multi-micro vessel (MMV). The introduction of this type of microarray was very useful for rapid screening in the late stages of selection. As the selection progresses, less active molecules are deleted and at the same time the diversity within each library decreases. The construction of the second library is achieved based on the sequence information generated at the first library cage. That is, an eRaPANSY (evolutionary rapid panning and analysis system) developed and incorporated using a block shuffling method (All-steps-all-combinations (ASAC) method) performed using a peptide block selected from the first library Using the so-called system, the selection of cathepsin E-inhibiting peptides was successful and the effectiveness of this method was demonstrated.
(2)第一ライブラリーの選択
YLBS法を使用して、図2の中で示されるように、第一ライブラリーが構築された。eRAPANSY(図4に示されるシステム)においてライブラリーをIVV型(図5)にすることが重要である。すなわち機能的な分子(ペプチド)とその情報分子(mRNAであり、引き続きcDNAに変換される)が連結される。このように作られたライブラリーは、スクリーニングに使用できる:親和性選択および機能選択(図2)。後者が特定の分子構築物、すなわち、プロテアーゼ阻害剤のためのSF連結を必要としている一方、前者はターゲット分子への結合を評価することにより通常実行される。
(2) Selection of the first library Using the YLBS method, the first library was constructed as shown in FIG. In eRAPANSY (system shown in FIG. 4) it is important that the library is of type IVV (FIG. 5). That is, a functional molecule (peptide) and its information molecule (mRNA, which is subsequently converted to cDNA) are linked. Libraries created in this way can be used for screening: affinity selection and function selection (Figure 2). While the latter requires SF linkage for a specific molecular construct, ie protease inhibitor, the former is usually performed by assessing binding to the target molecule.
図6に示される通りに、スクリーニングが進行するとともに、いずれの選択でもより大きな活性をもつペプチド集団に移行していった。個々にスクリーニングして得られたライブラリーのメンバーをクローニングすることによって、ペプスタチンA(これまでに同定された最も有力なCE阻害剤)のCE阻害活性のおよそ30%を有するCE阻害ペプチドを生成した(図6および表5)。 As shown in FIG. 6, as the screening progressed, it shifted to a peptide population having a larger activity in any selection. By cloning the members of the library obtained by individual screening, a CE inhibitory peptide having approximately 30% of the CE inhibitory activity of pepstatin A (the most potent CE inhibitor identified so far) was generated. (Figure 6 and Table 5).
IVV由来のペプチド(つまり、エンドヌクレアーゼ分解(図4のクローン淘汰段階)によってIVVからDNAとリンカー部分を分離することにより得られたペプチド)を使用して、選択されたペプチドを化学的に合成する前に、これらのクローンの阻害活性は迅速に測定した。選択された分子のコーディングDNA配列に基づいてペプチドを合成し、それらの真の活性(Asyと名付けられた)を確認した。しかし、IVV由来ペプチド(Adpと名付けられた)によっておおよその活性をモニターすることができた(表5)。 Chemically synthesize selected peptides using IVV-derived peptides (ie, peptides obtained by separating DNA and linker moieties from IVV by endonuclease degradation (clone の step in FIG. 4)) Previously, the inhibitory activity of these clones was measured rapidly. Peptides were synthesized based on the coding DNA sequences of the selected molecules and their true activity (named Asy) was confirmed. However, approximate activity could be monitored by IVV-derived peptide (named Adp) (Table 5).
興味深いことには、IVV由来ペプチド(Adp)とIVVs自体(Aiv)との活性の間に優れた相関性があった。一般に、IVVの阻害活性は同系統のIVV由来ペプチド(約2倍以上;表1)より大きく、恐らくIVVのかさばったDNA部分がカテプシンEの活性部位中への基質のアクセスを妨害することにより、ペプチドの阻害作用を増強する場合があることを示唆している。 Interestingly, there was an excellent correlation between the activity of IVV-derived peptides (Adp) and IVVs themselves (Aiv). In general, IVV inhibitory activity is greater than the same strain of IVV-derived peptides (more than about twice; Table 1), probably because the bulky DNA portion of IVV interferes with substrate access into the active site of cathepsin E, This suggests that the inhibitory action of peptides may be enhanced.
(3)第二ライブラリーに対して使用されたブロック
第一ライブラリーの選択の生産物が8つのアミノ酸を含む可変領域を含んでいたために、4個のアミノ酸を一つのブロック単位とした。それらの阻害性ペプチド(表5中のPi1〜Pi6)は、ClustalWを使用してクラスター分析された(図7)。そして、四量体配列は、比較的高い阻害活性(表5中のPi1、Pi5およびPi6)を示したコンセンサスペプチド配列から同定された。これらの4ペプチド配列に加えて、カテプシンE基質配列としてのSF連結の構築に必要な、保存された領域(GGRP/PTIFFRLK/DYKDDDDK)の配列も四量体に分割され、および出発ブロック(図8)として使用された。
(3) Blocks used for the second library Since the selected product of the first library contained a variable region containing 8 amino acids, 4 amino acids were taken as one block unit. Those inhibitory peptides (Pi1-Pi6 in Table 5) were clustered using ClustalW (FIG. 7). And the tetramer sequence was identified from the consensus peptide sequence which showed comparatively high inhibitory activity (Pi1, Pi5 and Pi6 in Table 5). In addition to these 4 peptide sequences, the sequence of the conserved region (GGRP / PTIFFFRLK / DYKDDDDK) required for the construction of SF linkage as a cathepsin E substrate sequence was also divided into tetramers and the starting block (FIG. 8). ) Was used.
これは、共通のペプチド配列のある部分がキメラ・ペプチドのフォールディングに影響を与え、その結果その機能に影響がある場合がありうるからである。
さらに、多様性を増強するために二つの任意のブロック(X1とX2)を加えた。出発ブロックとしてこれらの16個の四量体配列を使用して、徹底的にシャッフルされたDNAライブラリーは、連結化(つまり、1、2、3、4、5および6個までのブロックの連結化;したがって、このライブラリーはall steps and all combinations(ASAC)ライブラリーとして指定された)のすべての段階の生産物を含めて生成された。このように生成されたライブラリーは、第二ライブラリーの選択に使用された。
This is because certain portions of the common peptide sequence can affect the folding of the chimeric peptide and consequently its function.
In addition, two optional blocks (X1 and X2) were added to enhance diversity. Using these 16 tetramer sequences as starting blocks, a thoroughly shuffled DNA library was ligated (ie, ligation of up to 1, 2, 3, 4, 5 and 6 blocks). Therefore, this library was generated including the products of all stages (designated as the all steps and all combinations (ASAC) library). The library thus generated was used for the selection of the second library.
(4)第二ライブラリーの選択
この段階のほとんどのペプチドが前の選択によってカテプシンEへの親和性を有するものになっているので、親和性に基づいた選択過程は省略された。したがって、機能(SF−連結)選択が直接行なわれた。また、予想通りに、このプールからスクリーニングされた分子群からの平均活性は第一ラウンドの選択後に観察された平均活性より高かった(第二ライブラリー(2nd A)の平均活性と第一ライブラリー(1st F)との平均活性の比較)(図9)。
2回目のSF−連結選択 (図10および表5)の後にクローン・ペプチドの阻害活性を測定することによりシャッフルされたペプチドの阻害活性の向上が確認された。さらに大きな阻害活性のペプチドを同定するために、MMVを用いたクローン淘汰実験が行なわれた。
(4) Selection of the second library Since most peptides at this stage have affinity for cathepsin E by the previous selection, the selection process based on affinity was omitted. Therefore, function (SF-linkage) selection was made directly. Also, as expected, the average activity from the group of molecules screened from this pool was higher than the average activity observed after the first round of selection (the average activity of the second library (2nd A) and the first library). (Comparison of average activity with 1st F)) (FIG. 9).
An increase in the inhibitory activity of the shuffled peptide was confirmed by measuring the inhibitory activity of the cloned peptide after the second SF-linkage selection (Figure 10 and Table 5). In order to identify peptides with even greater inhibitory activity, clone clone experiments using MMV were performed.
MMVをライブラリーDNAの転写および翻訳に用いて得られたMMV中のペプチドが酵素反応を阻害すると、蛍光シグナルが生成しない。この原理に基づき、阻害活性の高いペプチド分子が提案されたわずかな体積の溶液のウェルからウェルへの転送などの必要な手順のすべては、遠心操作によって行なわれた。表1にまとめたように、(2Am−21および2Am−301など、この研究で生成されたペプチドの中で最も大きな阻害活性を有した)Asyの活性の40%以上の阻害活性もつペプチドはMMVを使用した第二ライブラリーの選択後に得られた。したがって、ブロック・シャッフルされた第二ライブラリー方法は、約50%(45.2%、31.5%(2Am−301)(F9−65))近くに活性を増強することができた。 When a peptide in MMV obtained using MMV for transcription and translation of library DNA inhibits the enzyme reaction, no fluorescent signal is generated. Based on this principle, all of the necessary procedures such as transfer of small volumes of well-proposed peptide molecules from well to well were performed by centrifugation. As summarized in Table 1, peptides with an inhibitory activity of 40% or more of the activity of Asy (which had the greatest inhibitory activity among the peptides generated in this study, such as 2Am-21 and 2Am-301) were MMV Obtained after selection of the second library using. Thus, the block-shuffled second library method was able to enhance activity close to about 50% (45.2%, 31.5% (2Am-301) (F9-65)).
次に、アスパラギン酸プロテアーゼ(カテプシンD(CD))、システインプロテアーゼ(カテプシンB(CB))およびセリンプロテアーゼ(トリプシン)(図11)の活性阻害を調べるために、スクリーニングで選択されたペプチドのいくつかについて実験した。ペプチド2Am−301がCD、CBまたはトリプシンに対して阻害または亢進活性を示した。興味深いことに、ペプチド2A−28およびF9−65がカテプシンD亢進活性を有した。これはアスパラギン酸プロテアーゼに対する特異性を示唆する。これらのプロテアーゼは同じアスパラギン酸プロテアーゼカテゴリーに属する。また、それらの三次元構造は解明されており、これらの三次元構造は類似しているので、CEおよびCD活性において全く逆の効果を示したことは興味深い。 Next, some of the peptides selected in the screen were examined to examine the activity inhibition of aspartic protease (cathepsin D (CD)), cysteine protease (cathepsin B (CB)) and serine protease (trypsin) (FIG. 11). Experimented with. Peptide 2Am-301 showed inhibitory or enhancing activity against CD, CB or trypsin. Interestingly, peptides 2A-28 and F9-65 had cathepsin D enhancing activity. This suggests specificity for aspartic proteases. These proteases belong to the same aspartic protease category. It is also interesting that their three-dimensional structure has been elucidated and because these three-dimensional structures are similar, they have shown the exact opposite effect on CE and CD activity.
(5)ペプチドペアライブラリー法の結果
図12および表3に示した通り、カテプシンEの活性を促進または阻害する種々のコンビネーションペプチドアプタマーを取得することができた。
(5) Results of Peptide Pair Library Method As shown in FIG. 12 and Table 3, various combination peptide aptamers that promote or inhibit cathepsin E activity could be obtained.
Claims (12)
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、但し、前記クラスター解析が、7個、8個または9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、
各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、
前記共通アミノ酸配列を4個、5個または6個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。 A method for producing a peptide aptamer library including peptide aptamers that interact with a target protein,
Statistically clustering a first group of amino acid sequences consisting of peptide aptamers that interact with a target protein , wherein the cluster analysis is hamming between amino acid sequences consisting of 7, 8, or 9 amino acids A method of clustering amino acid sequences based on distance,
Extracting a common amino acid sequence in each cluster;
Dividing the common amino acid sequence into blocks consisting of 4, 5 or 6 amino acids and obtaining a second group of peptide aptamers by block shuffling using two or more of the obtained blocks; and A peptide aptamer that interacts with the target protein at the same level or higher than the peptide aptamer that interacts with the target protein most highly among the peptide aptamers included in one group is recovered from the second group, and Said method comprising the step of inclusion in a peptide aptamer library.
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。 A method for producing a combination peptide aptamer library including a combination peptide aptamer that interacts with a target protein,
A peptide peptide comprising a peptide aptamer library produced by the method according to any one of claims 1 to 7 , and at least two peptide aptamers selected from the produced peptide aptamer library being linked via a spacer. Creating a third group of aptamers, and interacting with the target protein at or higher than the peptide aptamer that interacts with the target protein most highly among the peptide aptamers contained in the peptide aptamer library Collecting the combination peptide aptamer to be collected from the third group and including it in the combination peptide aptamer library.
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。 A method for producing a combination peptide aptamer library including a combination peptide aptamer that interacts with a target protein,
A peptide aptamer library is prepared by the method according to any one of claims 1 to 7 , and at least one peptide aptamer selected from the prepared peptide aptamer library and any at least one target protein are used. A step of preparing a fourth group of combination peptide aptamers in which interacting peptide aptamers are linked via a spacer, and the highest degree of interaction with a target protein among peptide aptamers contained in the peptide aptamer library. Recovering from said fourth group a combination peptide aptamer that interacts with a target protein to the same or higher extent as a working peptide aptamer and including it in said combination peptide aptamer library.
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