JP5204600B2 - How to predict teratogenicity - Google Patents
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Description
本発明は、化学物質が有する催奇形性の予測方法等に関する。 The present invention relates to a method for predicting teratogenicity of a chemical substance.
医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、親動物における配偶子形成、受胎能、妊娠維持といった生殖性及び胎児や出生児の発生に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、ほぼ全ての医薬品及び農薬の製造・販売に際して試験の実施が求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を哺乳動物の妊娠期に投与し、該哺乳動物の胎児の生存性及び形態的な変化等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、ラット（げっ歯類）及びウサギ（非げっ歯類）を用いて、化学物質を胎児の器官形成期に投与し、胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、該化学物質の催奇形作用の有無が評価される。
しかしながら、動物個体を使用した催奇形性試験は、妊娠動物の作出から化学物質の投与、熟練した技術を要する胎児観察に至るまで多大な労力と経費を要する他、動物愛護の観点から使用動物数の削減が求められている。そこで、その代替試験法として様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験法が開発されている。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ試験法として、例えば、マウス胚性幹細胞（以下、マウスＥＳ細胞）を用いた試験法（ＥＳＴ ： Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｓｔ）、ラット胎児の肢芽を用いる小塊培養法（Ｍｉｃｒｏ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）及びラットの初期胚を用いた全胚培養法（Ｗｈｏｌｅ ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ）等の哺乳動物の細胞や組織等を用いた試験系が確立されている。
例えば、非特許文献１には、マウスＥＳ細胞の収縮する心筋細胞への分化、マウスＥＳ細胞における毒性、および３Ｔ３マウス繊維芽細胞における毒性を分析することを含む、発生毒性の予測における胚性幹細胞の使用が開示されている。
However, the teratogenicity test using individual animals requires a lot of labor and expenses from the production of pregnant animals to the administration of chemical substances, fetal observation that requires skilled techniques, and the number of animals used from the viewpoint of animal welfare. Reduction is required. Therefore, various in vitro test methods have been developed as alternative test methods. As such an in vitro test method, for example, a test method using mouse embryonic stem cells (hereinafter referred to as mouse ES cells) (EST: Embryonic Stem cell Test), a small mass culture method using rat fetal limb buds (Micro mass). culture) and a test system using mammalian cells, tissues, etc., such as a whole embryo culture method using rat early embryos (Whole embryo culture).
For example, Non-Patent Document 1 includes embryonic stem cells in predicting developmental toxicity, including analyzing mouse ES cell differentiation into contracting cardiomyocytes, toxicity in mouse ES cells, and toxicity in 3T3 mouse fibroblasts. The use of is disclosed.
しかし、いずれの方法も予測精度の問題から、現状ではスクリーニング試験としても汎用されていない。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、株化細胞のみで実施できる優位性をもつマウスＥＳ細胞を用いた試験法（ＥＳＴ法）に改良を加え、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法を提供することを目的とする。
However, none of these methods are widely used as screening tests at present due to the problem of prediction accuracy.
The present invention has been made in view of such circumstances, and has improved the test method (EST method) using mouse ES cells having superiority that can be carried out only with established cell lines, and teratogenicity possessed by chemical substances. It is an object of the present invention to provide a method capable of predicting the property easily and with high accuracy.
本発明者らは、鋭意検討の結果、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性、化学物質が当該化学物質の哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性、および化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性を、特定の方法で比較および評価することにより、従来法よりも高い精度で化学物質の催奇形性を予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
（１）下記にそれぞれ定義される、阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および必要に応じて阻害活性ＳＧを測定する工程、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、
を有する方法；
前記阻害活性ＳＤは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性ＤＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性ＳＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である；
［２］
前記哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、およびウサギから選択される、上記［１］に記載の方法；
［３］
前記幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞から選択される、上記［１］または［２］に記載の方法；
［４］
前記分化細胞が、繊維芽細胞、神経細胞、羊膜細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞から選択される上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法；
［５］
前記阻害活性ＤＧおよび阻害活性ＳＧの測定が、
哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を用意すること、
前記哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を、それぞれ、化学物質の存在下、培養器内で細胞が飽和する前までの一定期間培養すること、
当該培養後の分化細胞および幹細胞の細胞数を、それぞれ、測定すること
を含む方法により行われる、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法；
［６］
催奇形性を、陽性および陰性の２段階で判定する、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法；
［７］
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度である、
上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法；
［８］
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の心筋への分化を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ ＩＤ５０であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３ ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ ＩＣ５０である、
上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法；
［９］
ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する、上記［７］または［８］に記載の方法；
［１０］
ｋ１が０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が０．９〜１．１である、
上記［９］に記載の方法；ならびに
［１１］
ｋ１が０．１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が１．０である、
上記［９］に記載の方法
等を提供するものである。
As a result of intensive studies, the present inventors have determined that a chemical substance inhibits the differentiation of stem cells derived from mammals, a chemical substance inhibits cell proliferation of differentiated cells derived from mammals of the chemical substance, and a chemical substance Finds that teratogenicity of a chemical substance can be predicted with higher accuracy than conventional methods by comparing and evaluating the activity of inhibiting cell growth of mammalian-derived stem cells by a specific method, and completes the present invention It came to.
That is, the present invention
[1]
A method for predicting teratogenicity of a chemical substance,
(1) a step of measuring inhibitory activity SD, inhibitory activity DG, and, if necessary, inhibitory activity SG as defined below,
(2) comparing the inhibitory activity SG or DG with a preset reference value; and (3) comparing the inhibitory activity SD with the inhibitory activity DG.
A method comprising:
The inhibitory activity SD is an activity in which the chemical substance inhibits the differentiation of stem cells derived from mammals,
The inhibitory activity DG is an activity in which the chemical substance inhibits cell proliferation of differentiated cells derived from mammals, and the inhibitory activity SG is an activity in which the chemical substance inhibits cell proliferation of stem cells derived from mammals. is there;
[2]
The method according to [1] above, wherein the mammal is selected from humans, monkeys, rats, mice, dogs, and rabbits;
[3]
The method according to [1] or [2] above, wherein the stem cells are selected from embryonic stem cells, tissue stem cells, and induced pluripotent stem cells;
[4]
Any one of the above [1] to [3], wherein the differentiated cells are selected from fibroblasts, nerve cells, amniotic cells, adipocytes, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, bone cells, and chondrocytes. the method of;
[5]
Measurement of the inhibitory activity DG and inhibitory activity SG
Preparing differentiated cells and stem cells derived from mammals;
Culturing the differentiated cells and stem cells derived from mammals in the presence of chemical substances for a certain period of time until the cells are saturated in the incubator,
The method according to any one of the above [1] to [4], which is performed by a method comprising measuring the number of differentiated cells and stem cells after the culture, respectively;
[6]
The method according to any one of [1] to [5] above, wherein teratogenicity is determined in two stages, positive and negative;
[7]
The inhibitory activity SD is a chemical substance concentration at which the chemical substance inhibits differentiation of stem cells derived from mammals by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical substance concentration at which the chemical substance inhibits cell proliferation of differentiated cells derived from mammals by 50%, and the inhibitory activity SG is the cell growth of stem cells derived from mammals derived from mammals. A chemical concentration that inhibits 50%,
The method according to any one of [1] to [6] above;
[8]
The inhibitory activity SD is a chemical substance concentration ES ID 50 at which the chemical substance inhibits the differentiation of mouse ES cells into myocardium by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical concentration 3T3 IC 50 at which the chemical substance inhibits cell proliferation of mouse 3T3 cells by 50%, and the inhibitory activity SG is a chemical substance at which cell proliferation of mouse ES cells is 50% Inhibiting chemical concentration ES IC 50 ,
The method according to any one of [1] to [6] above;
[9]
When SD, DG, and SG satisfy the conditional expression 1: SG or DG ≦ k1 (k1 represents a constant), or when the conditional expression 2: SD / DG ≦ k2 (k2 represents a constant), The method according to [7] or [8] above, wherein it is determined that the teratogenicity of the chemical substance is positive, and otherwise, it is determined that the teratogenicity of the chemical substance is negative;
[10]
k1 is 0.01-1 μg / mL and k2 is 0.9-1.1,
The method according to [9] above; and [11]
k1 is 0.1 μg / mL and k2 is 1.0,
The method described in [9] above is provided.
本発明によれば、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法が、提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method which can estimate the teratogenicity which a chemical substance has easily and highly accurately is provided.
本発明において「化学物質」は、医薬、農薬、化粧品、工業製品等の哺乳動物が、摂取または接触により暴露される可能性のある物質の全てを包含し、純物質であってもよく、混合物であってもよい。
本発明において、「催奇形性」とは、哺乳動物の胎児に奇形を起こす性質を意味する。したがって、本発明において、胚・児致死作用を有するものであっても、胎児に奇形を起こす性質を有さない化学物質は、「催奇形性」を有さない。
本発明において「哺乳動物」としては、ヒトおよびサル等の霊長類、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられる。
In the present invention, the “chemical substance” includes all substances that mammals such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, and industrial products may be exposed by ingestion or contact, and may be a pure substance or a mixture. It may be.
In the present invention, “teratogenicity” means a property of causing malformation in a mammalian fetus. Therefore, in the present invention, a chemical substance that does not have the property of causing malformation in the fetus, even if it has embryo / infant lethal action, does not have “teratogenicity”.
In the present invention, “mammals” include primates such as humans and monkeys, dogs, rabbits, rats, mice and the like.
本明細書中、前記阻害活性ＳＤは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
本明細書中、前記阻害活性ＤＧは、化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
本明細書中、前記阻害活性ＳＧは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。
In the present specification, the inhibitory activity SD is an activity in which a chemical substance inhibits the differentiation of stem cells derived from mammals,
In the present specification, the inhibitory activity DG is an activity in which the chemical substance inhibits cell proliferation of differentiated cells derived from mammals, and in the present specification, the inhibitory activity SG is a stem cell in which the chemical substance is derived from mammals. Activity of inhibiting cell growth.
本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
（１）阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および阻害活性ＳＧを測定する工程
を有する。
The method of predicting teratogenicity of a chemical substance of the present invention is
(1) It has the process of measuring inhibitory activity SD, inhibitory activity DG, and inhibitory activity SG.
本発明の予測方法で用いられる、「哺乳動物由来の幹細胞」、および「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」としては、前記で例示したものが挙げられる。なかでも、マウスが特に好ましい。「哺乳動物由来の幹細胞」における「哺乳動物」と「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」とは、好ましくは、同種である。
本発明の予測方法で用いられる「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。なかでも、胚性幹細胞（例、マウスＥＳ細胞）が好ましい。
本発明の予測方法で用いられる「分化細胞」としては、例えば、繊維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞が挙げられる。なかでも、繊維芽細胞が好ましく、マウス胎児由来繊維芽細胞（例、マウス３Ｔ３細胞）がより好ましい。
このような細胞は、公知の方法によって調製してもよいが、ＡＴＣＣ等の機関から入手可能である。
Examples of “mammals” in “mammal-derived stem cells” and “mammalian-derived differentiated cells” used in the prediction method of the present invention include those exemplified above. Of these, a mouse is particularly preferable. The “mammal” in the “mammal-derived stem cell” and the “mammal” in the “differentiated cell derived from a mammal” are preferably the same species.
Examples of “stem cells” used in the prediction method of the present invention include embryonic stem cells, tissue stem cells, and induced pluripotent stem cells. Of these, embryonic stem cells (eg, mouse ES cells) are preferable.
Examples of “differentiated cells” used in the prediction method of the present invention include fibroblasts, nerve cells, skeletal muscle cells, bone cells, and chondrocytes. Of these, fibroblasts are preferable, and mouse embryo-derived fibroblasts (eg, mouse 3T3 cells) are more preferable.
Such cells may be prepared by known methods, but are available from institutions such as ATCC.
「阻害活性ＳＤ」の測定
前記「阻害活性ＳＤ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること（工程１）、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化誘導培養すること（工程２）、
前記幹細胞の分化率を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
Measurement of “Inhibitory Activity SD” Specifically, the measurement of the “inhibitory activity SD” is, for example,
Preparing undifferentiated stem cells derived from mammals (step 1);
Culturing the stem cells in a differentiation-inducing manner in the presence of a chemical substance (step 2),
Measuring the differentiation rate of the stem cells (step 3),
It is performed by the method including.
以下に、「阻害活性ＳＤ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、例えば、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により分散させる。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる培地（例、非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）、マウスＥＳ細胞ではカルチセル無血清培地（ＥＳ細胞用）（大日本製薬）も使用可）にマウスＥＳ細胞ではＬＩＦ（白血病阻止因子、ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を添加したものを用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
Hereinafter, a preferred embodiment of the measurement of “inhibitory activity SD” will be described.
In the step 1, for example, mammal-derived stem cells cultured while maintaining undifferentiation are dispersed by trypsin treatment or the like. As the medium used for the culture, a medium usually used for culturing cells derived from mammals (eg, a DMEM medium containing inactivated fetal bovine serum), a mouse CA cell-free serum medium (for ES cells) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. can also be used) mouse ES cells to which LIF (leukemia inhibitory factor) is added may be used. The culture conditions may be those normally used for culturing mammal-derived cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
前記工程２では、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地中で、前記分散細胞を、ハンギングドロップ法（懸滴培養法）などにより凝集塊を作らせて胚様体が形成されるまで培養する。分化誘導用の培地は、用いられる未分化細胞および分化により生じさせる分化細胞の種類によって異なるが、例えば、マウスＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる場合、ＬＩＦを含有しない非働化処理済み牛胎児血清を含有する培地を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。培養期間は、マウスＥＳ細胞であれば好ましくは２〜３日間である。
次いで、前記工程１で得られた胚様体を、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地で更に（例えば、マウスＥＳ細胞であれば２〜３日間（懸滴培養開始から合計５日後まで））、浮遊培養する。「種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地」における培地としては、前記工程１における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
次いで、胚様体を、接着系のマルチウェルプレートに移し、例えば、マウスＥＳ細胞であれば分化誘導開始から合計１２日後まで接着培養する。当該接着培養における培地としては、前記工程２における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
In the step 2, an embryoid body is formed by forming an aggregate in the culture medium for inducing differentiation containing various concentrations of chemical substances by the hanging drop method (hanging drop culture method) or the like. Incubate until The medium for differentiation induction varies depending on the undifferentiated cells used and the types of differentiated cells generated by differentiation. For example, when mouse ES cells are differentiated into cardiomyocytes, the inactivated fetal bovine serum containing no LIF is used. A contained medium may be used. The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C. The culture period is preferably 2 to 3 days for mouse ES cells.
Next, the embryoid body obtained in Step 1 above is further added to a differentiation-inducing medium containing various concentrations of chemical substances (for example, 2 to 3 days for mouse ES cells (total from the start of hanging drop culture). 5 days later))), suspension culture. As the medium in the “differentiation-inducing medium containing various concentrations of chemical substances”, it is preferable to use the same medium as that used in Step 1. The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C. As a control, a group to which only a medium containing no chemical substance is added is used. The medium is preferably a solvent that dissolves the chemical substance.
Next, the embryoid body is transferred to an adhesion-type multiwell plate. For example, in the case of mouse ES cells, adhesion culture is performed until 12 days after the start of differentiation induction. As the medium for the adhesion culture, it is preferable to use the same medium as that used in the step 2. The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
前記工程３では、各ウェル内の培養細胞の形態観察などにより、各化学物質濃度における、細胞の分化率を求める。分化の判断は、例えば、心筋細胞の場合、拍動の有無によって、行う事ができる。
このようにして測定された分化率に基づく数値（例えば、分化を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＳＤを得ることができる。
In step 3, the cell differentiation rate at each chemical substance concentration is determined by, for example, morphological observation of the cultured cells in each well. For example, in the case of cardiomyocytes, differentiation can be determined based on the presence or absence of pulsation.
The inhibitory activity SD can be obtained as a numerical value based on the differentiation rate thus measured (for example, a chemical substance concentration that inhibits differentiation by 50%).
「阻害活性ＤＧ」の測定
前記「阻害活性ＤＧ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の分化細胞を用意すること（工程１）、
前記哺乳動物由来の分化細胞を、化学物質の存在下で、培養すること（工程２）、
前記分化細胞の細胞数を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
Measurement of “inhibitory activity DG” Specifically, the measurement of the “inhibitory activity DG” is, for example,
Preparing a differentiated cell derived from a mammal (step 1);
Culturing the differentiated cell derived from the mammal in the presence of a chemical substance (step 2),
Measuring the number of differentiated cells (step 3);
It is performed by the method including.
以下に、「阻害活性ＤＧ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、培養中の哺乳動物由来の分化細胞をトリプシン処理等により分散させ、哺乳動物由来の分化細胞を用意する。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる培地（例、非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）を用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５００〜２，０００の範囲内の所定の細胞数（好ましくは、１，０００個／ウェル）になるように播種する。
Hereinafter, a preferred embodiment of the measurement of “inhibitory activity DG” will be described.
In the step 1, differentiated cells derived from mammals in culture are dispersed by trypsin treatment or the like to prepare differentiated cells derived from mammals. As the medium used for the culture, a medium usually used for culturing differentiated cells derived from mammals (eg, DMEM medium containing inactivated fetal bovine serum) may be used. The culture conditions may be those normally used for culturing differentiated cells derived from mammals. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
The cells are preferably seeded in a 96-well plate so as to have a predetermined number of cells (preferably 1,000 cells / well) within a range of 500 to 2,000 per well.
前記工程２では、培地中の前記工程１で用意した分化細胞に、化学物質を加え、次いで、前記分化細胞を前記化学物質の存在下で培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程１で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間（マウス３Ｔ３細胞の場合は、好ましくは、３〜５日間）である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
In the step 2, a chemical substance is added to the differentiated cells prepared in the step 1 in the medium, and then the differentiated cells are cultured in the presence of the chemical substance. The chemical substance is preferably added after being dissolved or suspended in a medium. As the medium, the same medium as used in Step 1 is preferably used. As a control, a group to which only a medium containing no chemical substance is added is used. The medium is preferably a solvent that dissolves the chemical substance.
The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
The culture period can be appropriately changed according to the type of cell used and the culture conditions. Usually, a certain period until the cell is saturated in the well (in the case of mouse 3T3 cells, preferably 3 to 3). 5 days).
As described above, setting the culture period is important for accurately detecting the influence of chemical substances on cells and predicting teratogenicity with high accuracy.
In the culture, the medium is preferably not changed.
工程（３）では、前記哺乳動物由来の分化細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット（例、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（同仁化学））等を用いて、行うことができる。
このようにして測定された生細胞数に基づく数値（例えば、細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＤＧを得ることができる。
In step (3), the number of living differentiated cells derived from the mammal is measured. The number of viable cells can be measured using, for example, a commercially available cell number measuring kit (eg, Cell Counting Kit 8 (Dojindo Laboratories)).
The inhibitory activity DG can be obtained as a numerical value based on the number of living cells thus measured (for example, a chemical substance concentration that inhibits cell growth by 50%).
「阻害活性ＳＧ」の測定
前記「阻害活性ＳＧ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること（工程１）、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化培養すること（工程２）、
前記幹細胞の細胞数を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
Measurement of “Inhibitory Activity SG” Specifically, the measurement of the “inhibitory activity SG” is, for example,
Preparing undifferentiated stem cells derived from mammals (step 1);
Differentiating and culturing the stem cells in the presence of a chemical substance (step 2),
Measuring the number of stem cells (step 3);
It is performed by the method including.
以下に、「阻害活性ＳＧ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により培養細胞を分散させ、哺乳動物由来の幹細胞を用意する。当該未分化維持培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の幹細胞の未分化維持培養に通常用いられる培地（例、牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地、マウスＥＳ細胞ではカルチセル無血清培地（ＥＳ細胞用）（大日本製薬）も使用可）を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５００〜２，０００の範囲内の所定の細胞数（好ましくは、１，０００個／ウェル）になるように播種する。
Hereinafter, a preferred embodiment of the measurement of “inhibitory activity SG” will be described.
In step 1, mammal-derived stem cells cultured while maintaining undifferentiation are dispersed by trypsin treatment or the like to prepare mammal-derived stem cells. As the medium used for the undifferentiated maintenance culture, a medium usually used for undifferentiated maintenance culture of stem cells derived from mammals (for example, DMEM medium containing fetal bovine serum, or a culture medium without serum for mouse ES cells (for ES cells)). (Dainippon Pharmaceutical) can also be used. The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
The cells are preferably seeded in a 96-well plate so as to have a predetermined number of cells (preferably 1,000 cells / well) within a range of 500 to 2,000 per well.
前記工程２では、培地中の前記工程１で用意した幹細胞に、化学物質を加え、次いで、前記幹細胞を前記化学物質の存在下で未分化維持培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程１で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を添加しない群を用いる。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％ ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間（マウスＥＳ細胞の場合は、好ましくは、３〜５日間）である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該維持培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
In the step 2, a chemical substance is added to the stem cells prepared in the step 1 in the medium, and then the stem cells are cultured in an undifferentiated state in the presence of the chemical substance. The chemical substance is preferably added after being dissolved or suspended in a medium. As the medium, the same medium as used in Step 1 is preferably used. As a control, a group to which no chemical substance is added is used.
The culture conditions may be those normally used for culturing mammalian cells. Examples thereof include 5% CO 2 and 37 ° C.
The culture period can be appropriately changed according to the type of cell used and the culture conditions, but usually a certain period until the cell is saturated in the well (in the case of mouse ES cells, preferably 3 to 5 days).
As described above, setting the culture period is important for accurately detecting the influence of chemical substances on cells and predicting teratogenicity with high accuracy.
In the maintenance culture, the medium is preferably not exchanged.
工程（３）では、前記哺乳動物由来の幹細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット（例、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（同仁化学））等を用いて、行うことができる。 In step (3), the number of living stem cells derived from the mammal is measured. The number of viable cells can be measured using, for example, a commercially available cell number measuring kit (eg, Cell Counting Kit 8 (Dojindo Laboratories)).
このようにして測定された生細胞数に基づく数値（例えば、細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＳＧを得ることができる。 The inhibitory activity SG can be obtained as a numerical value based on the number of living cells thus measured (for example, a chemical concentration that inhibits cell growth by 50%).
本発明の方法は、以下の考えに基づく。
胚・胎児の組織は癌細胞や成体の消化管粘膜、皮膚、骨髄等のように細胞増殖が盛んであるため、細胞毒性が強い化学物質に対して強い影響を受ける。したがって、抗がん剤のような化学物質の多くが催奇形作用を有することが知られている。本条件式では、ある一定の基準以下の阻害活性ＳＧまたはＤＧを有する場合は、催奇形性が陽性と予測する。
次いで、上記の基準で陰性と判定された化合物に対して、以下の概念から確立された基準を適用する。
阻害活性ＳＤは、胎児の発生および分化に対する毒性を、
阻害活性ＤＧは、親動物に対する毒性を、および
阻害活性ＳＧは、胎児の成長に対する毒性を、
それぞれ表していると仮定する。
この仮定に基づき、化学物質の、親動物に対する毒性を基準とする、胎児の発生および分化に対する相対毒性が高い場合には、化学物質の催奇形性が陽性であると予測する。
したがって、本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、
を更に有する。
また、本発明の方法は、上記の原理に基づき、好ましくは、催奇形性を陽性および陰性の２段階で判定する。
ただし、前記仮定は、単に、本発明を発明する契機になったものにすぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
The method of the present invention is based on the following idea.
Embryo and fetal tissues, such as cancer cells and adult gastrointestinal mucosa, skin, and bone marrow, are proliferating and are strongly influenced by highly cytotoxic chemicals. Therefore, it is known that many chemical substances such as anticancer agents have a teratogenic effect. In this conditional expression, when the inhibitory activity SG or DG is below a certain standard, teratogenicity is predicted to be positive.
Then, the criteria established from the following concept are applied to the compounds determined to be negative by the above criteria.
Inhibitory activity SD is toxic to fetal development and differentiation.
Inhibitory activity DG is toxic to the parent animal, and inhibitory activity SG is toxic to fetal growth.
Assume that each represents.
Based on this assumption, the teratogenicity of a chemical is predicted to be positive if the chemical is highly toxic to fetal development and differentiation relative to the toxicity to the parent animal.
Therefore, the method for predicting teratogenicity of a chemical substance of the present invention is as follows.
(2) comparing the inhibitory activity SG or DG with a preset reference value; and (3) comparing the inhibitory activity SD with the inhibitory activity DG.
It has further.
In the method of the present invention, preferably, teratogenicity is determined in two stages, positive and negative, based on the above principle.
However, the above assumption is merely an opportunity to invent the present invention, and the present invention is not limited to this.
本発明の方法において、具体的には、好ましくは、
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度である。
ここで、ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧの測定値、およびＳＤ／ＤＧの計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字２桁になるように四捨五入される。
In the method of the present invention, specifically, preferably,
The inhibitory activity SD is a chemical substance concentration at which the chemical substance inhibits differentiation of stem cells derived from mammals by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical substance concentration at which the chemical substance inhibits cell proliferation of differentiated cells derived from mammals by 50%, and the inhibitory activity SG is the cell growth of stem cells derived from mammals derived from mammals. The chemical concentration that inhibits 50%.
Here, when SD, DG, and SG satisfy conditional expression 1: SG or DG ≦ k1 (k1 represents a constant), or conditional expression 2: SD / DG ≦ k2 (k2 represents a constant). Is judged that the teratogenicity of the chemical substance is positive, otherwise it is judged that the teratogenicity of the chemical substance is negative.
As will be apparent to those skilled in the art, the measured values of SD, DG, and SG, and the calculated value of SD / DG are appropriately rounded off and applied to the conditional expression. Preferably, it is rounded off to 2 significant figures.
本発明の方法において、具体的には、より好ましくは、
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の心筋への分化を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ ＩＤ５０であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３ ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ ＩＣ５０である。
ここで、ＥＳ ＩＤ５０、３Ｔ３ ＩＣ５０、およびＥＳ ＩＣ５０が
条件式１：ＥＳ ＩＣ５０または３Ｔ３ ＩＣ５０≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＥＳ ＩＤ５０／３Ｔ３ ＩＣ５０≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、ＥＳ ＩＤ５０、３Ｔ３ ＩＣ５０、およびＥＳ ＩＣ５０の測定値、およびＥＳ ＩＤ５０／３Ｔ３ ＩＣ５０の計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字２桁になるように四捨五入される。
In the method of the present invention, specifically, more preferably,
The inhibitory activity SD is a chemical substance concentration ES ID 50 at which the chemical substance inhibits the differentiation of mouse ES cells into myocardium by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical concentration 3T3 IC 50 at which the chemical substance inhibits cell proliferation of mouse 3T3 cells by 50%, and the inhibitory activity SG is a chemical substance at which cell proliferation of mouse ES cells is 50% Inhibiting chemical concentration ES IC 50 .
Here, when ES ID 50 , 3T3 IC 50 , and ES IC 50 satisfy conditional expression 1: ES IC 50 or 3T3 IC 50 ≦ k1 (k1 represents a constant), or conditional expression 2: ES ID 50 / 3T3 When IC 50 ≦ k2 (k2 represents a constant) is satisfied, the teratogenicity of the chemical substance is determined to be positive, and otherwise, the teratogenicity of the chemical substance is determined to be negative. To do.
As will be apparent to those skilled in the art, the measured values of ES ID 50 , 3T3 IC 50 , and ES IC 50 and the calculated value of ES ID 50 / 3T3 IC 50 are rounded off as appropriate and applied to the conditional expression. Preferably, it is rounded off to 2 significant figures.
上記の条件式において、好ましくは、
ｋ１が０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が０．９〜１．１である。
また、上記の条件式において、より好ましくは、
ｋ１が０．１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が１．０である。
In the above conditional expression, preferably,
k1 is 0.01-1 μg / mL and k2 is 0.9-1.1.
In the above conditional expression, more preferably,
k1 is 0.1 μg / mL and k2 is 1.0.
以下に、本発明を実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１
（１）マウスＥＳ細胞の未分化培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりマウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｄ３株）を入手した。ＥＳ−Ｄ３株はマウスＬＩＦ（白血病阻害因子：ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びβ−メルカプトエタノールを添加した１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地あるいはカルチセル無血清培地（ステムセルサイエンス社）を用いて未分化維持培養を行った。ゼラチンコートされた６０ｍｍ接着系シャーレに３０万個の細胞を５ｍＬの培養液を用いて培養した。２日間に１回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が３日間になる場合は、細胞数を１０万個に減らした。
（２）マウス３Ｔ３細胞の培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりマウス３Ｔ３細胞（ＢＡＬＢ ３Ｔ３細胞株）を入手した。ＢＡＬＢ ３Ｔ３細胞株は、１０％の非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて維持培養を行った。６０ｍｍ接着系シャーレに３０万個の細胞を５ｍＬの培養液を用いて培養した。２日間に１回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が３日間になる場合は、細胞数を１０万個に減らした。
（３）マウスＥＳ細胞あるいはマウス３Ｔ３細胞を用いた細胞毒性試験
維持培養中の各細胞を０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させた後、９６ウェルプレートに１ｗｅｌｌ当り２０，０００個／ｍＬの細胞懸濁液を５０μＬ播種した。約２時間後に表１の化学物質を様々な濃度に含有した１５０μＬの培養液を添加し、実験を開始した。本実験で使用した培養液は、ＥＳ細胞はＬＩＦを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地、３Ｔ３細胞は維持培養と同じ培地とした。培養開始から培地交換を１度も行わずに、４日後にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（同仁化学）及びマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて対照及び化学物質添加群の細胞数（試薬の発光度して検出）を測定した。得られた結果から対照群の５０％相当の細胞増殖度を示す化学物質濃度を算出した。
（４）マウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化誘導試験
未分化で培養中のマウスＥＳ細胞を０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させた。ＬＩＦを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、１滴（２０μＬ）あたり約４００個の細胞を含むように、直径１０ｃｍシャーレの蓋に懸滴培養（本培養方法をハンギングドロップ法とも呼ぶ）により３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２〜３日間培養を行い、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成した。本培養から実験終了まで、化学物質添加群では、使用する各培地中の化合物濃度が同じになるように、各培地に表１の化学物質を加えた。胚様体は更に２〜３日間、非接着性６ｃｍシャーレ（グライナー社）で浮遊培養した後、懸滴培養開始から合計５日後に胚様体を接着系の２４ウェルプレートに１個ずつ計２４個移行した。そして、懸滴培養開始から合計１２日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。通常、対照群は接着させた２４個全てに収縮が認められることから、対照群の５０％相当の心筋分化度、すなわち２４個中１２個に収縮がみられる化学物質濃度を算出した。
（５）予測式を用いた判定
細胞毒性試験で得られた２つの指標（ＥＳ ＩＣ５０、３Ｔ３ ＩＣ５０）及び心筋細胞への分化誘導実験で得られた指標（ＥＳ ＩＤ５０）から、
ＥＳ ＩＤ５０、３Ｔ３ ＩＣ５０、およびＥＳ ＩＣ５０が
条件式１：ＥＳ ＩＣ５０または３Ｔ３ ＩＣ５０≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＥＳ ＩＤ５０／３Ｔ３ ＩＣ５０≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断した。
その結果、催奇形性を有する化合物と催奇形性を有さない化合物とを含む１０化合物の全てについて、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致した（表１）。
なお、ｎ＝１の結果ではあるが、非特許文献１の方法に従って本発明者が試験を行ったところでは、表中の１０化合物のうち、ペニシリンG ナトリウム、D-(+)-カンフル、フタル酸ジメチル、メトトレキサート水和物、ホウ酸においては、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致しなかった。
(1) Undifferentiated culture of mouse ES cells Mouse ES cells (ES-D3 strain) were obtained from ATCC (American Type Culture Collection). The ES-D3 strain uses a DMEM medium or a cartilel serum-free medium (Stem Cell Science) containing 15% inactivated fetal bovine serum supplemented with mouse LIF (leukemia inhibitory factor) and β-mercaptoethanol. Then, undifferentiated maintenance culture was performed. 300,000 cells were cultured in a gelatin-coated 60 mm adhesive petri dish using 5 mL of the culture solution. Passage is performed once every two days, but when the culture period is 3 days such as weekends, the number of cells was reduced to 100,000.
(2) Culture of mouse 3T3 cells Mouse 3T3 cells (BALB 3T3 cell line) were obtained from ATCC (American Type Culture Collection). The BALB 3T3 cell line was subjected to maintenance culture using a DMEM medium containing 10% inactivated fetal bovine serum. 300,000 cells were cultured in a 60 mm adhesive petri dish using 5 mL of the culture solution. Passage is performed once every two days, but when the culture period is 3 days such as weekends, the number of cells was reduced to 100,000.
(3) Cytotoxicity test using mouse ES cells or mouse 3T3 cells Each cell in maintenance culture was dispersed with 0.25% trypsin / 0.53 mM EDTA, and then 20 cells per well in a 96-well plate. 50 μL of a cell suspension of 1,000 cells / mL was seeded. About 2 hours later, 150 μL of a culture solution containing various concentrations of the chemical substances shown in Table 1 was added to start the experiment. The culture medium used in this experiment was a medium containing 15% inactivated fetal bovine serum containing no LIF in ES cells, and the same medium as that in maintenance culture in 3T3 cells. The cell number of the control and chemical addition groups (reagent luminescence intensity) was measured using Cell Counting Kit 8 (Dojin Chemical) and a microplate reader (Molecular Device) after 4 days without any medium change from the beginning of the culture. And detection). From the obtained results, the chemical substance concentration indicating the degree of cell proliferation equivalent to 50% of the control group was calculated.
(4) Differentiation induction test of mouse ES cells into cardiomyocytes Undifferentiated mouse ES cells in culture were dispersed using 0.25% trypsin / 0.53 mM EDTA. Using a medium containing 15% inactivated fetal bovine serum that does not contain LIF, suspension culture (main culture method) on a 10 cm diameter petri dish lid containing about 400 cells per drop (20 μL) Is also called a hanging drop method) and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 to 3 days to form embryoid bodies (embryoid bodies). From the main culture to the end of the experiment, in the chemical substance addition group, the chemical substances in Table 1 were added to each medium so that the compound concentrations in each medium used were the same. Embryoid bodies were further suspended in a non-adhesive 6 cm Petri dish (Gleiner) for 2 to 3 days, and after a total of 5 days from the beginning of hanging drop culture, embryoid bodies were placed one by one in a 24-well plate in an adhesive system. Migrated. Then, after a total of 12 days from the start of hanging drop culture, cardiomyocytes that repeatedly contract were confirmed under a microscope. Usually, in the control group, contraction was observed in all 24 adhered, so the myocardial differentiation degree equivalent to 50% of the control group, that is, the chemical substance concentration at which contraction was observed in 12 out of 24 was calculated.
(5) Judgment using prediction formula From the two indices (ES IC 50 , 3T3 IC 50 ) obtained in the cytotoxicity test and the index (ES ID 50 ) obtained in the differentiation induction experiment into cardiomyocytes,
When ES ID 50 , 3T3 IC 50 , and ES IC 50 satisfy conditional expression 1: ES IC 50 or 3T3 IC 50 ≦ k1 (k1 represents a constant), or conditional expression 2: ES ID 50 / 3T3 IC 50 ≦ When k2 (k2 represents a constant) was satisfied, it was determined that the teratogenicity of the chemical substance was positive, and in other cases, it was determined that the teratogenicity of the chemical substance was negative.
As a result, for all 10 compounds including a compound having teratogenicity and a compound not having teratogenicity, the prediction result of teratogenicity was consistent with the known knowledge of animal experiments regarding teratogenicity ( Table 1).
In addition, although it is a result of n = 1, when this inventor performed the test according to the method of nonpatent literature 1, penicillin G sodium, D-(+)-camphor, phthalate among ten compounds in a table | surface. In the case of dimethyl acid, methotrexate hydrate, and boric acid, the predicted results of teratogenicity did not match the known findings of animal experiments on teratogenicity.
本発明の方法は、農薬及び医薬の候補化合物等の化学物質の催奇形性の予測に利用することが出来る。 The method of the present invention can be used to predict the teratogenicity of chemical substances such as agricultural chemicals and pharmaceutical candidate compounds.
Claims (8)
（１）下記にそれぞれ定義される、（ａ）阻害活性ＳＤおよび阻害活性ＤＧ、または（ｂ）阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ及び阻害活性ＳＧを測定する工程、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、を有し、
前記阻害活性ＳＤは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦０．０１〜１μｇ／ｍＬを満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦０．９〜１．１を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると予測し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると予測する方法。 A method for predicting teratogenicity of a chemical substance,
(1) each of which is defined below, the step of measuring (a) inhibitory activity SD and inhibitory activity DG or (b) inhibiting activity SD,, inhibitory activity DG and inhibitory activity SG,
(2) comparing the inhibitory activity SG or DG with a preset reference value, and (3) comparing the inhibitory activity SD with the inhibitory activity DG,
The inhibitory activity SD is a chemical concentration at which the chemical substance inhibits differentiation of stem cells derived from mammals by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical concentration at which the chemical substance inhibits cell growth of differentiated cells derived from mammals by 50%, and the inhibitory activity SG is the cell growth of stem cells derived from mammals derived from mammals. A chemical concentration that inhibits 50%,
When the SD, DG, and SG satisfy the conditional expression 1: SG or DG ≦ 0.01 to 1 μg / mL, or the conditional expression 2: SD / DG ≦ 0.9 to 1.1, A method of predicting that the teratogenicity of a chemical substance is positive, and otherwise predicting that the teratogenicity of the chemical substance is negative.
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３ ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ ＩＣ５０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 The inhibitory activity SD is a chemical substance concentration ES ID 50 at which the chemical substance inhibits the differentiation of mouse ES cells into myocardium by 50%,
The inhibitory activity DG is a chemical concentration 3T3 IC 50 at which the chemical substance inhibits cell proliferation of mouse 3T3 cells by 50%, and the inhibitory activity SG is a chemical substance at which cell proliferation of mouse ES cells is 50% The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the chemical concentration to be inhibited is ES IC 50 .
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