JP5199519B2 - ヌクレオシド類縁体又はその塩、オリゴヌクレオチド類縁体、遺伝子発現抑制剤、及び遺伝子検出用核酸プローブ - Google Patents
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Description
本発明のヌクレオシド類縁体又はその塩は、下記一般式(1)〜(9)であることを特徴とする。(但し、R1、R2、R3は、同一又は異なる基であり、それぞれが、水素原子、核酸合成における官能基の保護基、及びリン酸基からなる群より選択される。)
核酸合成における保護基で保護されたリン酸基の具体的な例としては、例えば2−クロロフェニルリン酸基、4−クロロフェニルリン酸基などを挙げることができる。
X2におけるアルキル基としては、炭素数が1〜5であるアルキル基、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
又、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、式(1a)〜(10a)で表される構造を一つ以上構成成分として含むオリゴヌクレオチド類縁体であることを特徴とする。(但し、Arは、芳香族炭化水素基又は多環芳香族炭化水素基のいずれかである。)
X2におけるアルキル基としては、炭素数が1〜5であるアルキル基、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
さらに、上記一般式(1a)〜(10a)、(11a)中、ヌクレオシドの糖部に相当する部分は開環型であり、三重結合を備えている。糖部開環型ヌクレオシドで構成されているオリゴヌクレオチド誘導体としては、例えばグリコール核酸(GNA)がある。GNAは、リン酸ジエステル結合によってグリセロール単位を繰り返す構造を備えている。(S)−GNAは、ゴーシュ効果によって(S)−GNAの二重鎖が安定化されていることが知られている。したがって、類似した構造を含む式(1a)〜(10a)、(11a)を一つ以上構成成分として含むオリゴヌクレオチド類似体において、そのオリゴヌクレオチド類縁体の二重鎖の安定性は向上することが期待される。さらに、式(1a)〜(10a)、(11a)は不飽和結合を備えているので、二重鎖を形成しているオリゴヌクレオチド間においてスタッキング相互作用が働き、構造が固定されることから、二重鎖形成におけるエントロピーのロスは減少する。その結果、二重鎖が熱力学的に安定になることが期待される。
遺伝子発現抑制剤とは、DNAあるいはmRNAに働きかけその複製、転写、翻訳の過程を阻害する分子のことである。
遺伝子検出用核酸プローブとは、DNAあるいはmRNAを可視化し検出するための短鎖のDNAあるいはRNA分子である。
本明細書においてはいくつかの略語を使用するので、まず、以下に本明細書中で使用する略語について、その一覧を示す。
BF3EOEt:ボロン トリフルオリド エーテレイト(Boron trifluoride etherate)
THF:テトラヒドロフラン(tetrahydrofuran)
EtOAc:酢酸エチル
TBDMSCl:tert−ブチルジメチルシリル クロリド(tert−Butyldimethylsilyl chloride)
Pd(PPh3):テトラキス(トリフェニルフォスフィン)パラジウム(Tetrakis(triphenylphosphine)palladium)
TEA:トリエチルアミン(triethyamine)
TBAF:テトラ−ブチルアンモニウム−フルオリド(Tetra−n−butylammonium fluoride)
PdCl2(PPh3)2:ビス(トリフェニルフォスフィン)パラジウム(II) クロリド(Bis(triphenylphosphine)palladium(II) chloride)
TsCl:p−トルエンスルホニル クロリド(p−toluenesulfonyl chloride)
DMAP:N,N−ジメチル−4−アミノピリジン(N,N−dimethyl−4−aminopyridine)
DMTrCl:ジメトキシトリフェニルメチル クロリド(dimethoxytriphenylmethyl chloride)
DIPEA:N,N−ジイソプロピルエチルアミン(N,N−diisopropylethylamine)
アミダイト試薬,i−Pr2NP(Cl):OCE2−シアノエチルジイソプロピルクロロ−ホスホロアミダイト(2−cyanoethyldiisopropylchloro−phosphoramidite)
DMF−DMA:N,N−ジメトキシホルムアミド ジメチルアセタール(N,N−Dimethylformamide dimethyl acetal)
CPG:コントロール ポア グラス(controlled−pore glass)
WSC:水溶性カルボジイミド(water soluble carbidiimide)
X−phos:2−ジシクロヘキシルホスフィノー2’,4’,6’−トリイソプロピルビフェニル(2−Dicyclohexylphosphino−2’,4’,6’−triisopropylbiphenyl)
NaHCO3 aq.:炭酸水素ナトリウム水溶液
NaCl aq.:塩化ナトリウム水溶液
NMR:核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
CDCl3:重クロロホルム
Tm:融解温度(melting temperature)
[ヌクレオシド類縁体及びヌクレオシド類縁体の合成方法の概略]
次に、本発明のヌクレオシド類縁体及びヌクレオシド類縁体の合成方法について概略を説明する。
ヌクレオシド類縁体(1)を、下記[化5]に示す合成法1を用いて合成した。
(R)−グリシドール(glycidol)(2.7ml、40.5mmol)(13a)にイミダゾール(imidazole)(6.6g、97.2mmol)、DMF(75ml)を加えて攪拌し、そこにTBDPSCl(12.6ml,48.6mmol)を加え0℃で一晩反応させた。翌日、薄層クロマトグラフイー(Thin−Layer Chromatography:TLC)(以下、TLCと称する。)にて原料のスポットの消失を確認した後、生成物を酢酸エチルと蒸留水で抽出し、有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空エバポレーターで溶媒をとばし、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=50:1)にて単離精製し、化合物(13b)(S)−tert−ブチル(オキシラン−2−イルメトキシ)ジフェニルシラン((S)−tert−butyl(oxiran−2−ylmethoxy)diphenylsilane):(4.5664g,15mmol,37%)を無色透明な液体として得た。
〔1.2〕合成法1中の合成ルート(b)
アルゴン雰囲気下にて50mlの梨型フラスコに化合物(13b)(2.5268g,8.0mmol)を加え、THF(10ml)で溶解させた。(A)アルゴン雰囲気下にて50mlのナスフラスコにTMS−acetylene(1.656ml,12.0mmol),THF(10ml),n−BuLi(7.2288ml,12.0mmol),BF3・OEt2(1.5968ml,13.0mmol)の順番で加え、最後に溶液(A)を加え−78°Cで一晩反応させた。翌日TLCにて原料のスポットの消失を確認した後、緩衝剤としてNH4Cl(20ml)を加えて反応を止め、生成物を酢酸エチルと蒸留水で抽出し、有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空エバポレーターで減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=20:1)にて単離精製し、化合物(13c):(S)−1−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)−5−(トリメチルシリル)ペント−4−イン−2−オル((S)−1−(tert−butyldiphenylsilyloxy)−5−(trimethylsilyl)pent−4−yn−2−ol)(2.2177g,5.4mol,67%)を無色透明な液体として得た。
〔1.3〕合成法1中の合成ルート(c)
アルゴン雰囲気下にて50mlの梨型フラスコにイミダゾール(imidazole)(1.103g,16.2mmol)、DMF(25ml)、TBDMSCl(1.238g,8.01mmol)を加えて攪拌した。攪拌後、得られた溶液を溶液(B)とした。アルゴン雰囲気下にて50mlのナスフラスコに化合物(13c)(2.2177g,5.4mmol)とDMF(25ml)を加え攪拌し、そこに溶液(B)を加え、一晩反応させた。翌日TLCにて原料のスポットの消失を確認した後、生成物を酢酸エチルと蒸留水で抽出し、有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空エバポレーターで減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=20:1)にて単離精製し、化合物(13d):(S)−2,2,3,3,9,9−ヘキサメチル−8,8−ジフェニル−5−(3−(トリメチルシリル)プロプ−2−イニル)−4,7−ジオキサー3,8−ジシリラデカン((S)−2,2,3,3,9,9−hexamethyl−8,8−diphenyl−5−(3−(trimethylsilyl)prop−2−ynyl)−4,7−dioxa−3,8−disiladecane)(1.7713g,3.8mmol,62%)をうす黄色の液体として得た。
〔1.4〕合成法1中の合成ルート(d)
アルゴン雰囲気下にて化合物(13d)(1.7713g,3.37mmol)をドライ(dry) MeOH(35ml)で溶かし、CH3ONa(2.37ml,4.39mmol)と反応させた。常温で約1時間反応させTLCにて原料のスポットの消失を確認した後、生成物を酢酸エチルと蒸留水で抽出し、有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空エバポレーターで減圧濃縮し化合物(13e):(S)−2,2,3,3,9,9−ヘキサメチル−8,8−ジフェニル−5−(プロプ−2−イニル)−4,7−ジオキサ−3,8−ジシラデカン((S)−2,2,3,3,9,9−hexamethyl−8,8−diphenyl−5−(prop−2−ynyl)−4,7−dioxa−3,8−disiladecane)(1.4488g,3.2mmol 95%)を無色透明な液体として得た。
〔1.5〕合成法1中の合成ルート(e)
化合物(22)(0.70g,2.78mmol)と化合物(13e)(1.93g,1.2eq.)をDMF(27.8ml)に溶解させた。Pd(PPh3)4(0.16g,0.05eq.),とCuI(0.053g,0.1eq.)を加えて攪拌し、TEA(0.97ml,2.5eq.)を加えて40℃で反応させた。一晩攪拌後、反応液をEtOAcを用いてセライトろ過した。ろ過後、ろ液をEtOAc、H2Oで抽出し有機層を回収した。有機層を、NaHCO3 aq.、NaCl aq.で洗浄した後、真空エバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカの使用、溶出溶媒はCHCl3:CH3OH=100:1)で分離精製しカップリング体(23):(S)−5−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)−1−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン((S)−5−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)−1−methylpyrimidine−2,4(1H,3H)−dione)(収量:1.62g)を得た。
〔1.6〕合成法1中の合成ルート(f)
カップリング体(23)(1.62g,2.78mmol)をTHF(11.2ml)に溶解し、1mol/l TBAF(5.88ml,2.1eq.)を加えて一晩攪拌した。TLCで反応の終了を確認し、減圧濃縮した。その後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカ、CHCl3のみ〜CHCl3:MeOH=15:1)で分離精製し、ヌクレオシド類縁体(1)(収量:0.33g、収率:52.2%)を得た。
[実施例2]
〔2〕[ヌクレオシド類縁体(3):(S)−5−(6−アミノピリジン−3−イル)ペント−4−イン−1,2−ジオール((S)−5−(6−aminopyridin−3−yl)pent−4−yne−1,2−diol)の合成]
ヌクレオシド類縁体(3)を、下記[化6]に示す合成法2を用いて合成した。
糖部(13e)(0.76g,3.45mmol)と塩基部(28)(1.87g,1.3eq.)をフラスコに加えDMF(35.0ml)に溶解した。Pd(PPh3)4(0.40g,0.1eq.)、CuI(0.13g,0.2eq)を加えて攪拌し、TEA(1.20ml,2.5eq.)を加えて45℃で反応させた。一晩攪拌後、反応液をEtOAcでセライトろ過した。ろ過後、ろ液をEtOAc、H2Oで抽出し有機層を回収した。有機層を、NaHCO3aq.、NaClaq.で洗浄した後、真空エバポレーターで濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカゲルの使用、溶出溶媒はCHCl3)で分離精製し、カップリング体(29):(S)−5−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)pent−1−イニル)ピリジン−2−アミン((S)−5−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)pyridin−2−amine)(収量:1.35g、収率:71.5%)を得た。
カップリング体(29)(1.0g,1.73mmol)をTHF(17.3ml)に溶解し、1mol/l TBAF(3.6ml,2.1eq.)を加えて一晩攪拌した。その後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカゲルの使用、溶出溶媒はCHCl3:MeOH=1:0〜)で分離精製し、ヌクレオシド類縁体(3)(収量:0.47g)を得た。
〔3〕[ヌクレオシド類縁体(5):(S)−2−アミノ−5−(4,5−ジヒドロキシペント−1−イニル)ピリミジン−4(1H)−オン((S)−2−amino−5−(4,5−dihydroxypent−1−ynyl)pyrimidin−4(1H)−one)の合成]
ヌクレオシド類縁体(5)を、下記[化7]に示す合成法3を用いて合成した。
アルゴン雰囲気下で化合物(16):5−ヨード−1,3−ジメチルウラシル(5−iodo−1,3−dimethyluracil)(0.5g,1.88mmol),PdCl2(PPh3)2(10.99mg,0.01566mmol),CuI(5.965mg,0.03132mmol),化合物(13e)(0.71g,1.566mmol),DMF(10ml)の順番でフラスコに加え17h攪拌した。反応の完結を確認後、反応物を酢酸エチルと蒸留水で抽出し、有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を真空エバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒はクロロホルム:メタノール=100:1)にて単離精製し、化合物(17):(S)−5−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)−1,3−ジメチルピリジン−2,4(1H,3H)−ジオン((S)−5−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)−1,3−dimethylpyrimidine−2,4(1H,3H)−dione)(収量:0.4715g、0.8mmol、収率:51%、黄色の液体)を得た。
〔3.2〕合成法3中の合成ルート(b)
アルゴン雰囲気下でグアニジン塩酸塩(24.8g,0.2596mol)とナトリウムエトキシド(12.37g,0.182mol)をドライ(dry)エタノール(100ml)に溶かし,40分間攪拌した後、セライトろ過を行った。ろ液をエバポレーターで減圧濃縮しオイルを得た。得られたオイルを2径ナスフラスコに移した。2径ナスフラスコにジムロートを装着した。2径ナスフラスコに、化合物17(1.534g,2.60mmol)をドライ(dry) エタノール(100ml)で溶かした物を加え、オイルバスで96℃に保ち1.5h攪拌した。反応終了後、反応液を真空エバポレーターで減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=100:1)にて単離精製し、化合物(18):(S)−2−アミノ−5−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)pent−1−イニル)ピリミジン−4(1H)−オン((S)−2−amino−5−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)pyrimidin−4(1H)−one)(0.813g,1.45mmol,56%,黄色の液体)を得た。
アルゴン雰囲気下で化合物(18)(0.793g,1.41mmol)をドライ(dry) MeOH(40ml)に溶かし、そこに12mol/l HCl(0.353ml,4.23mmol)を加え、オイルバスで60℃に保ち、4時間攪拌した。反応後、真空エバポレーターで減圧濃縮しヌクレオシド類縁体(5)を得た。ヌクレオシド類縁体(5)は、後処理をせず、そのまま次の反応をかけた。
〔4〕[ヌクレオシド類縁体(10):(S)−5−(アントラセン−9−イル)ペント−4−イン−1,2−ジオール((S)−5−(anthracen−9−yl)pent−4−yne−1,2−diol)の合成]
ヌクレオシド類縁体(10)を、下記[化8]に示す合成法4を用いて合成した。
化合物(13e)(0.86g,1.89mmol)を入れたフラスコにPdCl2(CH3CN)2(19.6mg,75.6μmol),X−Phos(108mg,227μmol)、Cs2CO3(1.60g,4.92mmol)、9−クロロ アントラセン(9−chloro anthracene)(1.21g,5.6mmol)を順に入れ、アセトニトリル(15ml)を加えて溶解させ、90℃で反応させた。オーバーナイト(Over night)で反応後、酢酸エチルとH2Oで抽出した。水層を集め、再度、酢酸エチルとH2Oで抽出した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。(b)得られた残渣をTHF(15ml)に溶解させ、TBAF(7.1ml,7.11mmol)を入れ、攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製し、溶出液を減圧留去しヌクレオシド類縁体(10)(収量0.14g、収率26%、褐色固体)を得た。
[実施例5]
〔5〕[ヌクレオシド類縁体(11):(S)−5−(4−(3−(トリフルオロメチル)−3H−ジアジリン−3−イル)フェニル)ペント−4−イン−1,2−ジオール((S)−5−(4−(3−(trifluoromethyl)−3H−diazirin−3−yl)phenyl)pent−4−yne−1,2−diol)の合成]
ヌクレオシド類縁体(11)を、下記[化9]に示す合成法5を用いて合成した。
アルゴン雰囲気下にて、十分に乾燥させた化合物(33):4’−ヨード−2,2,2−トリフルオロアセトフェノン(4’−iodo−2,2,2−trifluoroacetophenone)(0.18g,0.60mmol)をフラスコに入れPdCl2(PPh3)2 (0.017g,0.024mmol,0.04eq.)とCuI(0.009g,0.048mmol,0.08eq.)を加え、DMF(3ml)に溶解させた。このフラスコに十分に乾燥させた化合物(13e)(0.30g,0.66mmol,1.1eq.)をDMF(3ml)に溶解させたものと、TEA(0.25ml,1.8mmol,3.0eq.)を加え、80°Cで攪拌し、反応を開始させた。一晩攪拌後、反応の終了を確認した後、反応液をセライトろ過し、揮発性のものを減圧除去した。得られた残渣を酢酸エチルとH2Oで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=100:1)で精製し、化合物(34):(S)−1−(4−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)フェニル)−2,2,2−トリフルオロエタノン((S)−1−(4−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)phenyl)−2,2,2−trifluoroetanone)を(0.19g,0.29mmol,50%,褐色のオイル状)得た。
〔5.2〕合成法5中の合成ルート(b)
アルゴン雰囲気化、化合物(34)(0.19g,0.2mmol)とHONH2・HCl(0.040g,0.58mmol,2.0eq.)をフラスコに加え、ドライ(dry) EtOH(3ml)とドライ(dry) ピリジン(pyridine)(3ml)に溶解させ、60°Cで攪拌し反応を開始させた。一晩反応後、反応物をクロロメタンと蒸留水で抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を適量のCH2Cl2に溶解させ、そのフラスコにTEA(0.24ml,1.7mmol,4.0eq.)とTsCl(0.083g,0.44mmol,1.5eq.)を加え、触媒としてDMAPを少量添加し、室温下で反応を開始させた。一晩反応後、揮発性のものを減圧除去し、得られた残渣をクロロホルムとH2Oで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=100:1)で精製し、化合物(35):(S)−1−(4−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)フェニル)−2,2,2−トリフルオロエタノン O−トシル オキシム((S)−1−(4−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)phenyl)−2,2,2−trifluoroethanone O−tosyl oxime)(0.11g,0.13mmol,48%,白色固体)を得た。
〔5.3〕合成法5中の合成ルート(c)
アルゴン雰囲気下にて、封管を−78°Cに冷却した後、その封管に化合物(34)(0.11g,0.13mmol)を入れ、THF(4ml)を加え、溶解させた。そこにNH3 gasを適量吹き込み、密封し、常温にて2日間攪拌した。−78°Cに冷却した後、開封し、再び常温に戻し、過剰なNH3 gasを揮発させた。揮発性の溶媒を真空エバポレーターにより減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=9:1)で精製し、化合物(36):(S)−3−(4−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)ジアジリン((S)−3−(4−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)phenyl)−3−(trifluoromethyl)diaziridine)(0.79g,2.95mmol,80%,褐色のオイル)を得た。
〔5.4〕合成法5中の合成ルート(d)
アルゴン雰囲気下で化合物(36)(0.51g,0.80mmol)をドライ(dry) MeOH(16ml)に溶解させた。遮光条件下でTEA(0.30ml,2.0mmol,2.5eq.)とI2(0.22g,0.88mmol,1.1eq.)を加え、反応を開始させた。30分後、原料の消失を確認した後、反応物をジエチルエーテルとチオ硫酸ナトリウムで抽出した。有機層を回収し、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=40:1)で精製し、化合物(37):(S)−3−(4−(4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(tert−ブチルジフェニルシリルオキシ)ペント−1−イニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−3H−ジアジリン((S)−3−(4−(4−(tert−butyldimethylsilyloxy)−5−(tert−butyldiphenylsilyloxy)pent−1−ynyl)phenyl)−3−(trifluoromethyl)−3H−diazirine)(0.48g,0.75mmol,93%,無色の結晶)を得た。
〔5.5〕合成法5中の合成ルート(e)
アルゴン雰囲気下、化合物(37)(0.44g,0.68mmol)をフラスコに入れ、THF(13.6ml)を加えて溶解させ、1.0mol/l TBAF(1.42ml,1.42mmol,2.1eq.)を加えて室温で反応を開始させた。2時間後、原料の消失を確認した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=50:1)で精製し、ヌクレオシド類縁体(11)(0.18g,0.64mmol,94%,無色の結晶)を得た。
[実施例6]
〔6〕[ヌクレオシド類縁体(1)のアミダイト体(25):(S)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−5−(1−メチル−2,4−ジオキソ−1,2,3,4−テトラヒドロピリミジン−5−イル)ペント−4−イン−2−イル 2−シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−5−(1−methyl−2,4−dioxo−1,2,3,4−tetrahydropyrimidin−5−yl)pent−4−yn−2−yl 2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)の合成]
アミダイト体(25)は、下記[化10]に示す合成法6を用いて合成した。
ヌクレオシド類縁体(1)(0.33g,1.47mmol)をフラスコに入れ、ピリジン(pyridine)(7.25ml)を加えて溶解させ、DMTrCl(0.54g,1.1eq.)加えて攪拌した。2時間後、TLCで原料の消失を確認した。EtOAc、H2Oで抽出し、有機層を回収した。有機層を、NaHCO3aq.、NaClaq.で洗浄し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカ、CHCl3〜CHCl3:MeOH=100:1)で分離精製し、化合物(24):(S)−5−(5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−4−ヒドロキシペント−1−イニル)−1−メチル ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン((S)−5−(5−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−4−hydroxypent−1−ynyl)−1−methyl pyrimidine−2,4(1H,3H)−dione)(収量:0.33g 収率:43.7%)を得た。
化合物(24)(0.23g,0.44mmol)をフラスコに入れ、アルゴン雰囲気下で、ドライ(dry) THF 2.2mlに溶解させ、DIPEA(0.39ml,2.20mmol,5.0eq.)、アミダイト試薬(0.20ml,0.88mmol,2.0eq.)を加え攪拌した。30分後、TLCで反応の終了を確認した後、CHCl3で抽出し有機層を回収した。有機層を、NaHCO3 aq.、NaCl aq.で洗浄し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc:Hexan=1:3)で精製し、アミダイト体(25)(収量0.20g、収率63.7% 31P NMR(100MHz)δ:149.1)を得た。
〔7〕[ヌクレオシド類縁体(3)のアミダイト体(32):(S)−N’−(5−(5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−4−ヒドロキシペント−1−イニル)ピリジン−2−イル)−N,N−ジメチルホルムイミドアミド 2−シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−N’−(5−(5−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−4−hydroxypent−1−ynyl)pyridin−2−yl)−N,N−dimethylformimidamide 2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)の合成]
アミダイト(32)は、下記[化11]に示す合成法7を用いて合成した。
ヌクレオシド類縁体(3)(0.47g,1.73mmol)をフラスコに入れ、DMF(17.3ml)を加えて溶解し、DMF−DMA(1.15ml、5.0eq.)を加えて45°Cで一晩攪拌した。その後、溶媒を減圧留去した後、化合物(30):(S)−N’−(5−(4,5−ジヒドロキシペント−1−イニル)ピリジン−2−イル)−N,N−ジメチルホルムイミドアミド((S)−N’−(5−(4,5−dihydroxypent−1−ynyl)pyridin−2−yl)−N,N−dimethylformimidamide)を得た。
化合物(30)(1.73mmol)をフラスコに入れ、ピリジン(pyridine)(25ml)に溶解し、DMTrCl(0.64g,1.1eq.)を加えて5時間半攪拌した。EtOAc、H2Oで抽出し、NaHCO3aq.、NaClaq.で洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、化合物(31):(S)−N’−(5−(5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−4−ヒドロキシペント−1−イニル)ピリジン−2−イル)−N,N−ジメチルホルムイミドアミド((S)−N’−(5−(5−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−4−hydroxypent−1−ynyl)pyridin−2−yl)−N,N−dimethylformimidamide)を得た。
化合物(31)をアミダイト体(25)の合成方法と同様な方法を用いて、アミダイト体(32)を得た。
〔8〕[ヌクレオシド類縁体(5)のアミダイト体(21):(S)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−5−(2−((E)−(ジメチルアミノ)メチレンアミノ)−4−オキソ−1,4−ジヒドロピリミジン−5−イル)ペント−4−イン−2−イル 2−シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−5−(2−((E)−(dimethylamino)methyleneamino)−4−oxo−1,4−dihydropyrimidin−5−yl)pent−4−yn−2−yl 2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)の合成]
アミダイト(21)を下記[化12]に示す合成法8を用いて合成した。
アルゴン雰囲気下で前記ヌクレオシド類縁体(5)(0.29g,1.41mmol)をフラスコに入れ、ドライ(dry) DMF(14ml)に溶かした。そこにN,N−ジメチルホルムアミド ジメチルアセタール(N,N−dimethylformamid dimethylacetal)(1.12ml,8.46mmol)を加え、オイルバスで40°Cに保ち、約5時間攪拌した。反応液を、真空エバポレーターで減圧濃縮し、化合物(19)を得た。化合物(19):(S,E)−N’−(5−(4,5−ジヒドロキシペント−1−イニル)−4−オキソ−1,4−ジヒドロピリミジン−2−イル)−N,N−ジメチルホルムイミドアミド((S,E)−N’−(5−(4,5−dihydroxypent−1−ynyl)−4−oxo−1,4−dihydropyrimidin−2−yl)−N,N−dimethylformimidamide)は、後処理せずにそのまま次の反応に使用された。
化合物(19)(0.37g,1.41mmol)をフラスコに入れ、アルゴン雰囲気下でドライ(dry)ピリジン(pridine)(10ml)に溶かし、そこにDMTrCl(0.62g)を加え、約5時間攪拌した。反応液を、真空エバポレーターで減圧濃縮し、化合物(20):(S,E)−N’−(5−(5−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−4−ヒドロキシペント−1−イニル)−4−オキソ−1,4−ジヒドロピリミジン−2−イル)−N,N−ジメチルホルムイミドアミド((S,E)−N’−(5−(5−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−4−hydroxypent−1−ynyl)−4−oxo−1,4−dihydropyrimidin−2−yl)−N,N−dimethylformimidamide)を得た。化合物(20)は、後処理せずにそのまま次の反応に使用された。
アルゴン雰囲気下で化合物(20)(0.1952g,0.344mmol)をフラスコに入れ、THF(1.72ml,0.2mol/l)に溶解させた。次に、DIPEA(0.36ml,2.06mmol,6eq)を加えて攪拌し、i−Pr2NP(Cl)OCE(0.15ml,2.06mmol,2eq)を滴下しながら加えた。1時間後、反応液にクロロホルムを加え有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチルのみ)で単離精製し、溶媒留去することで、黄色結晶のアミダイト体(21)を得た。
〔9〕[ヌクレオシド類縁体(10)のアミダイト体(102):(S)−5−(アントラセン−9−イル)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペント−4−イン−2−イル 2−シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−5−(anthrasen−9−yl)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)pent−4−yn−2−yl 2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)の合成]
アミダイト(101)を下記[化13]に示す合成法9を用いて合成した。
ヌクレオシド類縁体(10)(0.14g,0.49mmol)をフラスコに入れ、ピリジン(pyridine)(2ml)に溶解させ、DMTrCl(0.19g,0.55mmol)を入れ、攪拌した。1時間後、メタノール(1ml)を加えて反応を停止した。反応液を酢酸エチル、水、NaHCO3で分液し有機層を回収した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)で精製し、溶媒を減圧留去し化合物(101):(S)−5−(アントラセン−9−イル)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペント−4−イン−2−オル((S)−5−(anthrasen−9−yl)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)pent−4−yn−2−ol)(オレンジ色の泡状物質、収量は0.28g(収率98%))を得た。
〔9.2〕合成法9中の合成ルート(b)
化合物(101)(0.26g,0.46mmol)をフラスコに入れ、THF(2.3ml)に溶解させ、DIPEA(0.4ml)、アミダイト試薬(0.21ml)を加え、室温で攪拌した。45分攪拌後、クロロホルムで抽出し有機層を回収した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製し化合物(102):(S)−5−(アントラセン−9−イル)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペント−4−イン−2−イル 2−シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−5−(anthrasen−9−yl)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)pent−4−yn−2−yl 2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)を(オレンジ泡状物質、収量は0.28g(収量78%))得た。
[実施例10]
〔10〕[ヌクレオシド類縁体(11)のアミダイト体(39):(S)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−5−(4−(3−(トリフルオロメチル)−3H−ジアジリン−3−イル)フェニル)ペント−4−イン−2−イル シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト((S)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−5−(4−(3−(trifluoromethyl)−3H−diazirin−3−yl)phenyl)pent−4−yn−2−yl cyanomethyl diisopropylphosphoramidite)の合成]
アミダイト体(39)を下記[化14]に示す合成法10を用いて合成した。
アルゴン雰囲気下にてヌクレオシド類縁体(11)(0.36g,1.26mmol)をフラスコに入れpyridine(7.2ml)に溶解させ、DMTrCl(0.47g,1.38mmol,1.1eq.)を氷冷下にて少量ずつ加えた。5時間後、sat NaHCO3、sat NaClで抽出、洗浄を行い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、化合物(38):(S)−1−(ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−5−(4−(3−(トリフルオロメチル)−3H−ジアジリン−3−イル)フェニル)ペント−4−イン−2−オル((S)−1−(bis(4−methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)−5−(4−(3−(trifluoromethyl)−3H−diazirin−3−yl)phenyl)pent−4−yn−2−ol)(0.73g,1.24mmol,98%,黄色の結晶)を得た。
〔10.2〕合成法10中の合成ルート(b)
化合物(38)(0.73g,1.24mmol)をフラスコに入れ、Ar雰囲気下でTHF(6.2ml,0.2mol/l)に溶解させた。DIPEA(1.08ml,6.19mmol,5.0eq.)を加えて攪拌し、i−Pr2NP(Cl)OCE(0.55ml,2.48mmol,2.0eq.)を滴下した。1時間後、クロロホルムを加え、sat NaHCO3、sat NaClで抽出、洗浄を行い有機層を回収した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)で単離精製し、溶媒を減圧留去することで、アミダイト体(39)(0.77g,0.98mmol,79%,黄色のオイル状)を得た。
[実施例11]
〔11〕[CPG樹脂連結型ヌクレオシド類縁体(27)の合成]
CPG樹脂連結型ヌクレオシド類縁体(27)を下記[化15]に示す合成法11を用いて合成した。
化合物(24)(90mg,0.17mmol)とDMAP(0.42mg,0.02eq)をフラスコに入れピリジン(pyridine)(1.7ml)に溶解し、無水コハク酸(succinic anhydride)(50mg,3.0eq)を加えてAr雰囲気下、室温にて攪拌した。78時間攪拌後、原料が残っていたため、DMAPを少量追加して攪拌した。翌日に反応を止め、反応液を抽出し有機層を回収した。有機層を真空エバポレーターで減圧濃縮し、スクシニル体(26)を得た。
スクシニル体(26)(113.2mg,0.18mmol)をフラスコに入れ、DMF(4.5ml,0.01mol/l)に溶解させ、CPG樹脂(0.38g,1.0eq.)、WSC(34.6mg,4.0eq.,0.18mmol)を素早く加えて、3日間振とうした。その後、CPG樹脂をpyridineで洗浄して、引き続き前記スクシニル体(26)と結合しなかった樹脂のキャッピング作業を行った。0.1mol/l DMAP in pyridine(15ml)に洗浄した樹脂を加え、一晩振とうした。反応溶液が褐色になっているのを確認し、反応を終了させた。反応終了後、pyridene、EtOH、CH3CNの順に樹脂を洗浄し、CPG樹脂連結型ヌクレオシド類縁体(27)(活性:38.9μmol/g)を得た。
[ヌクレオシド類縁体(1)のε値の算出。]
ヌクレオシド類縁体(1)のε値を次に示す方法で算出した。
各ヌクレオシド類縁体のアミダイト体や各CPG樹脂連結型ヌクレオシド類縁体を使用して、以下に述べるホスホロアミダイト固相合成法によって、オリゴヌクレオチド類縁体を合成した。
[ホスホロアミダイト固相合成法]
オリゴヌクレオチド類縁体の合成は、1μmolスケールで行った。3400DNA自動合成機を用いた。normalホスホロアミダイトは0.1mol/l、合成したアナログ体のアミダイトは0.12mol/lになるようにMeCNに溶解し、RNA protocolで合成した。オリゴヌクレオチドの5’末端はDMTr基を除去した状態で合成を終了した。Arガスを通じてCPG樹脂を乾燥させた。オリゴヌクレオチドが結合したCPG樹脂をサンプルストックチューブに移し、(NH4OH:EtOH=3:1)を加え室温で12h、振とうすることによりCPG樹脂の除去を行った。反応溶液をエッペンドルフチューブに移し、減圧下乾固させた。さらに、残渣にTBAFを加え、12h室温で振とうすることによる脱保護処理を行った。反応溶液を0.1mol/l TEAABuf.30mlに希釈し、その溶液をC18 逆相カラムクロマトグラフィー(Sep−Pak)により粗精製した。残渣にloading solution(90%formamide in 1×TBE)200μlを加え20%PAGEにより目的のオリゴヌクレオチドを分離した。目的のオリゴヌクレオチドのバンドを切り出し、0.1mol/l TEAA、0.1mol/l EDTA水溶液15mlを加え、一晩振とうさせた。この濾液をC−18 逆相カラムクロマトグラフィー(Sep−Pak)により精製した。オリゴヌクレオチドは、H2O 1mLに溶かし、その希釈液の260nmにおける吸光度を測定し、その収量を求めた。精製したオリゴヌクレオチドは、30pmol分を乾固し、3μlの滅菌水に溶解させ、3μl のマトリックス溶液と、よく混和させた後、プレートにサンプルをアプライした。サンプルが乾固した後、MALDI−TOF/MSで構造の確認を行った。
poly TaはMALDI−TOFMSでのメインピークは2820.1のNa付加体である。
[Tm値の算出1]
合成した前記オリゴヌクレオチド類縁体において、相補DNA及びRNAとの二重鎖の安定性を熱変性法にてTm値を算出し、天然型二重鎖と比較した(Δ℃)。
測定条件:5−85℃、サンプル濃度12μmol/l、bufferは10mmol/l NaPhosphate、100mmol/l NaCl。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体の配列、分子量の計算値(caluculated)、及びMALDI−TOF/MSの測定結果(observed)を[表4]に示す。
[Tm値の算出2]
Tm測定の結果を[図2]及び[表5]に示す。
測定条件:20−100℃、サンプル濃度は3μmol/l、bufferは、10mmol/l NaPhosphate、100mmol/l NaCl。
[Tm値の算出3]
Tm測定の結果を[図3]及び[表6]に示す。
合成したオリゴヌクレオチド類縁体の配列、分子量の計算値(caluculated)、及びMALDI−TOF/MSの測定結果(observed)を[表7]に示す。
miR199aはHCV(Hepatitis C virus:C型肝炎ウイルス)を標的とする配列を含む。そこで、糖部開環型ヌクレオシド類縁体がmiRNAへ応用できるか、ガイド鎖選択性を向上するために利用できるかについて検証する。使用したヌクレオシド類縁体(1):アナログTaは、1〜2つ導入してもTm値は減少する。そのため、miR199aへの導入は鎖につき一つが限界であると考える。又、psi199a5p vectorとpsi199a3p vectorの違いによってその遺伝子発現抑制能に違いが生じる。特にpsi199a3p vectorを用いたときに発現抑制が大きい理由には、5’末端にアデノシンが存在するためRISCを形成しやすいこと、miR199a5pにはバルジアウト部位が2カ所存在し、二本鎖から1本鎖への解離を容易にすること、miR199a3pの5’末端側の方をAU塩基対が多く含み、逆にmiR199a5pの5’末端側の方は主にGC塩基対が存在することから、その熱力的安定性に偏りが生じたことなどが考えられる。
[miRNA199aの遺伝子発現抑制能の検証]
HCVに標的配列を持つmiR199a3p、5pの様々な部位のUをヌクレオシド類縁体(1):アナログTa([表9]中ではYと記載。)と置換した。ヌクレオシド類縁体(1)によるmiRNA199aの修飾部位特異的な遺伝子発現抑制能の変化を検証した。
糖部開環型ヌクレオシド類縁体(1):アナログTaを構成成分として含むmiRNAの遺伝子発現抑制能は、miRNAの修飾部位によって特異性を有することが明らかとなった。miRNA<2>はどちらのベクターを用いても、あまり発現抑制しなかった。miRNA<4>、<5>は3’末端側にアナログTaを導入することで不安定化することによって、その逆鎖の5’末端側を不安定化してガイド鎖として取り込ませる。そのため、発現抑制能が天然よりも向上し、逆鎖による発現抑制を抑えることができると考えられる。又、バルジアウト部位に修飾を持つmiRNA<3>も天然以上の発現抑制能を持つがその逆鎖もある程度発現を抑制してしまう。miRNA<6>はmiRNA<4>、<5>と同様の理由から多少の鎖の選択性が見られるが、その程度は小さい。miRNA<7>、<8>も天然と同程度の発現抑制を示すが、その逆鎖による発現抑制も多少ある。以上の結果から、5’末端側に修飾体を導入して不安定化するよりも3’末端側に修飾体を導入し、その逆鎖をRISCに取り込まれるようにした方が、発現抑制能を低下させることなく鎖の選択性を出すことができると考えられる。
[ヌクレアーゼ耐性の検証]
ヌクレオシド類縁体(1)を構成成分として含むmiRNAについて、へび毒ホスホジエステラーゼ(Snake venom phosphodiesterase:SVP)による安定性を検討した。ヌクレオシド類縁体(1)を構成成分として含むmiRNAは、3’−overhangのdT(チミジン)をヌクレオシド類縁体(1)に置換した一本鎖RNAである。前記ヌクレオシド類縁体(1)を構成成分として含むmiRNAは、時間依存的にSVPで処理された。反応停止後に、分解したRNA断片を電気泳動により解析した。
分解されずに残っているRNAを時間毎(右側より0min、1min、5min、10min、30min、1h、3h、6h)に示す。酵素反応中のRNA濃度は1μmol/lである。酵素反応系に使用した緩衝液は、酵素に適する緩衝液であれば制限はないが、トリス−塩酸緩衝液が使用された。一定時間経過後、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加え、100℃で2分間加熱することにより、反応を停止させた。反応後の反応液を、ゲル電気泳動で検証し、逆相高速液体クロマトグラフ(HPLC)を使用して分解されずに残っているRNAの残存率を測定した。
[miRNAの核酸プローブへの応用]
ヌクレオシド類縁体(11)を構成成分として含むmiRNAを使用して、ヌクレオシド類縁体(11)が光反応性残基であることを利用し、光照射によって相補鎖RNAを捕獲することができるか検証した。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
以下に合成したsiRNAの配列を示す。合成した一本鎖のsiRNAは、ヌクレオシド類縁体(1)を構成成分として含む21merのRNA、及びヌクレオシド類縁体(10)を構成成分として含む22merのRNAである。
[遺伝子発現抑制能の検証]
[表13]に開示されているsiRNA<1>、siRNA<2>、siRNA<6>、siRNA<7>及び、[表15]に開示されているsiRNAsense,siRNAantisenseについて遺伝子発現抑制能を検証した。
Claims (23)
- 下記一般式(1)〜(9)のいずれかで表されるヌクレオシド類縁体又はその塩。
- 前記R1は、水素原子、又は前記核酸合成における官能基である水酸基の保護基のいずれかである、
前記R2は、水素原子、前記核酸合成における官能基である水酸基の保護基、及びリン酸基からなる群より選択され、
前記R3は、水素原子、又は前記核酸合成における官能基であるアミノ基の保護基のいずれかである
ことを特徴とする請求項1に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記R1、R2が前記核酸合成における官能基である水酸基の保護基の場合、
前記核酸合成における官能基である水酸基の保護基は、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシ基、アリール基で置換されたメチル基、脂肪族で置換されたシリル基、及び芳香族で置換されたシリル基からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項2に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記脂肪族アシル基は、アセチル基であり、前記芳香族アシル基は、ベンゾイル基であり、前記アリール基で置換されたメチル基は、ベンジル基、p−メトキシベンジル基、4,4’−ジメトキシトリチル基、及び4−モノメトキシトリチル基からなる群より選択され、前記脂肪族で置換されたシリル基は、tert−ブチルジメチルシリル基であり、前記芳香族で置換されたシリル基は、tert−ブチルジフェニルシリル基である
ことを特徴とする請求項3に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記R3が前記核酸合成における官能基であるアミノ基の保護基の場合、
前記核酸合成における官能基であるアミノ基の保護基は、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシ基、アリール基で置換されたメチル基、脂肪族で置換されたシリル基、芳香族で置換されたシリル基、脂肪族で置換されたスルホニル基、芳香族で置換されたスルホニル基、カルボニル基、及びアミド基からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項2に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記脂肪族アシル基は、アセチル基であり、前記芳香族アシル基は、ベンゾイル基であり、前記アリール基で置換されたメチル基は、ベンジル基であり、前記脂肪族で置換されたシリル基は、tert−ブチルジメチルシリルであり、前記芳香族で置換されたシリル基は、tert−ブチルジフェニルシリルであり、前記芳香族で置換されたスルホニル基は、p−トルエンスルホニル基であり、前記カルボニル基は、tert−ブトキシカルボニル基、又はベンジルオキシカルボニル基のいずれかであり、前記アミド基は、ジメチルホルムアミド基、又はジメチルアセトアミド基のいずれかである
ことを特徴とする請求項5に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記リン酸基には、核酸合成における保護基で保護されたリン酸基、及び固層合成用活性化リン酸基を含む
ことを特徴とする請求項1に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記核酸合成における保護基で保護されたリン酸基は、2−クロロフェニルリン酸基、又は4−クロロフェニルリン酸基のいずれかである
ことを特徴とする請求項7に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記固層合成用活性化リン酸基は、−P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)2)、又は−P(OCH3)(N(CH(CH3)2)2)のいずれかである
ことを特徴とする請求項7に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 下記一般式(11)で表されるヌクレオシド類縁体又はその塩。
- 前記X2は、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びモノフルオロメチル基からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項10に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記R1は、水素原子、又は核酸合成における水酸基の保護基のいずれかであり、
前記R2は、水素原子、核酸合成における水酸基の保護基、及びリン酸基からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項10に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記リン酸基には、核酸合成における保護基で保護されたリン酸基、及び固層合成用活性化リン酸基を含む
ことを特徴とする請求項10に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記核酸合成における保護基で保護されたリン酸基は、2−クロロフェニルリン酸基、又は4−クロロフェニルリン酸基のいずれかである
ことを特徴とする請求項13に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 前記固層合成用活性化リン酸基は、−P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)2)、又は−P(OCH3)(N(CH(CH3)2)2)のいずれかである
ことを特徴とする請求項13に記載のヌクレオシド類縁体又はその塩。 - 式(1a)〜(10a)のいずれかで表される構造を一つ以上構成成分として含むオリゴヌクレオチド類縁体。
(但し、Arは、芳香族炭化水素基又は多環芳香族炭化水素基のいずれかである。)
- 一般式(11a)で表される構造を一つ以上構成成分として含むオリゴヌクレオチド類縁体。
- 前記X2は、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びモノフルオロメチル基からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項17に記載のオリゴヌクレオチド類縁体。 - 一本鎖であることを特徴とする請求項16、又は請求項17に記載のオリゴヌクレオチド類縁体。
- 相補的な配列を少なくとも一部含むオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成している
ことを特徴とする請求項16、又は請求項17に記載のオリゴヌクレオチド類縁体。 - 請求項16〜請求項20のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体を含有する
ことを特徴とする遺伝子発現抑制剤。 - 一般式(11a)で表される構造を一つ以上構成成分として含むオリゴヌクレオチド類縁体を含有する
ことを特徴とする遺伝子検出用核酸プローブ。
- 前記X2は、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びモノフルオロメチル基からなる群より選択されることを特徴とする請求項22に記載の遺伝子検出用核酸プローブ。
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