JP5194212B2 - 血清プロテオミクスシステムと関連する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2006年12月26日に出願された米国仮出願第60/877,209号の利益を主張する。この出願は、参照することにより全体が本明細書中に組み込まれる。
本発明を説明及びクレームする際には、以下の定義に従って以下の用語が使用される。
本発明の実施形態は、生物サンプルからペプチドを単離及び同定するための技術を提供する。その技術の多くはサンプルからスクリーニング及び単離されるペプチドの数を非常に増加させ、同定及び配列決定されるペプチドのサイズを非常に大きくするために利用される。一般的に、本発明の1つの実施形態には、ペプチドの分離、ペプチド量について医学的、科学的に意味のある定量的な差の同定、及びペプチドの配列決定と同定が含まれる。ペプチドの分離、同定及び配列決定について本明細書に記載された技術は、単なる例示であることに注意すべきであり、本発明の範囲は制限されるべきでない。
以下の実施例で使用される試料は、Maternal Fetal Medicine Units Network(MFMU)で実施された多施設試験の一部として収集されたものである。サンプルは自然早産のバイオマーカーであるペプチドを同定するために解析された。多様な人種と民族の妊娠期間24週までの単胎妊娠の女性約3000人を米国内の10施設に登録した。試験された女性はその後出産した。選択された特定のタンパク質を測定するために血清試料を妊娠期間24週と28週で収集した。
2倍量のHPLC分析グレードのアセトニトリル(400μL)を200μLの血清に加え、5秒間強くボルテックスし、室温で30分間放置した。実施例1のサンプルをIEC Micromax RF遠心機(Thermo Fisher Scientific,ウォルサム,MA)を用いて、12,000rpm、室温で10分間遠心した。分取した上清(550μL以下)を300μLのHPLC分析グレードの水を含む遠心チューブに移した。Labconco CentriVap Concentrator(Labconco Corporation,カンザスシティ,MO)で200μL以下に凍結乾燥した溶液を混合するためにそのサンプルを軽くボルテックスした。溶液からアセトニトリルを完全除去するために凍結乾燥の補助の前に等量の水を加えた。アセトニトリルは、タンパク濃度を測定するために用いるアッセイで混合できないのでこの操作が必要である。上清のタンパク濃度は、取扱説明書に従ってBio‐Rad社のマイクロタイタープレートタンパクアッセイを用いて測定した。4μgのタンパクを含む溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、乾燥近くまで凍結乾燥した。サンプルをHPLCグレードの水で20μLにし、20μLの88%蟻酸を用いて酸性化した。
実施例2で入手したサンプルを分画するためにキャピラリー液体クロマトグラフィー(cCL)を実施した。cLCには1mm(16.2μL)のマイクロボアガードカラム(Upchurch Scientific,オークハーバー,WA)及び内部に取り付けた15cm×250μm(内径(i.d))キャピラリーカラムを使用した。ガードカラムは乾燥充填され、キャピラリーカラムはPOROS Rl逆相媒体(Applied Biosystems,フレーミングハム,MA)を用いてスラリー充填された。カラム平衡化とクロマト分離は、水相(98%HPLCグレードH2O、2%アセトニトリル、0.1%蟻酸)及び有機相(2%HPLC H2O、98%アセトニトリル、0.1%蟻酸)を用いて実施された。分離は、95%水相で3分間のカラム平衡化をした後、1分間あたり2.75%の勾配で有機相を60%まで増加させ、そして、1分間あたり7%の勾配で有機相を95%濃度まで増加させた。より多くのサンプルの疎水性成分を溶出させるために95%有機相で7分間勾配を保持し、5分以上かけて、95%水相に戻し、カラムを平衡化するために2分間この濃度で保持した。図1は、このcLCの溶媒勾配溶出プロファイルを示す。すべての分離が5μL/minの流速で実施された。クロマトグラフィーは、FAMOSオートサンプラーを装備したLC Packings Ultimate Capillary HPLC pump system(Dionex Corporation,サニーベール,CA)を用い、QSTAR(商標)マススペクトル(Applied Biosystems,フォスターシティ,CA)に搭載されたAnalyst QS(商標)ソフトウェアによって制御した。
マススペクトルのキャリブレーションは、内因性ではない合成ペプチドである[Glu1]‐フィブリノペプチドB(Sigma,セントルイス,MO)を用いて、サンプルを流す前に毎日実行した。必要に応じて、信号雑音比を最適化して感度が最大になるように設定を調整した。
異なった日や異なったカラムで流したサンプルは溶出時間が異なることがあるので、溶出時間を均一化するためにピークアライメント作業をおこなった。クロマトグラムの最も有益な部分を通して約2分間隔で溶出される比較的多量の10個の内因性分子種が見つかった。抽出イオンクロマトグラム(XIC)機能は、所望のm/z範囲の溶出を視覚化するために使用された。10個の内因性分子種のそれぞれのXIC範囲を表3に示す。更に、クロマトグラム溶出時間アラインメントに用いられる個々の分子種の溶出プロファイルを図2A及び図2Bに示す。Gaussian Smooth機能を5回の各XICの平滑化に使用し、正確な溶出時間を決めるためのアライメントリファレンスピークの中心の位置を確実にした。すべての試料の溶出時間をアライメントした。そして、それぞれの試料についてこれらのアライメントリファレンスピークの溶出時間を決定した。次いで、これらの各溶出時間を、質量分析装置の設定選択機能を用いて2分幅の中心として使用した。ショースペクトル機能は、その2分幅のすべての1秒マススペクトルから1個の平均されたマススペクトルを作成するために使用された。その後、ソフトウェアは、サンプルグループ間の違いを視覚的に調べるために、異なった試料による同じ2分間隔の溶出のスペクトルを重ねるために使用した。
Q‐Star(q‐TOF)質量分析装置をサポートするソフトウェアプログラムであるAnalyst(商標)は、16の個々の液体クロマトグラムの稼動を編集し、同様の溶出時間で稼働中のマススペクトルの比較を行うことができる。20分間以上溶出する実施例5で記載したように、10個の2分幅を定めたことでデータファイルサイズを扱いやすくした。その2分幅をまた実施例5に記載のようにアライメントした。通常、多くのペプチド種が存在していることから、選ばれた10個の2分溶出間隔のうち分析されるべき1番目が、2番目の2分幅であった。ペプチドは、1個のピーク又は質量電荷比1によって分かれるピークではなく、むしろ質量電荷比1未満によって分かれる個々のピークと共に、Gaussian型のピークのはっきりとしたクラスターとして現れる多価状態の特徴的な外観によって同定された。ひとつのグループの8名の被験体と、別のグループの8名の被験体とを含むグループを色でコード化して重ね合わせた。次にデータを目視で調べ、1つの色が強く出る分子種を記録した。この過程を追加の8症例と8対照例で繰り返した。更に検討すべき化合物については、データセットの少なくとも3分の2で、グループAとグループBの間と同じ位の見かけ上の差が認められることを必要とした。
MS‐MSキャリブレーションは、内因性ではない合成ペプチドである[Glu1]‐フィブリノペプチドB(Sigma,セントルイス,MO)を用いて、サンプルを流す前に毎日実行した。必要に応じて、信号雑音比を最適化して感度が最大になるように設定を調整した。
実施例7に記載したm/z676.7のピークは、12.7〜13.7分でcLCシステムから溶出した。対象ピークと同じm/z範囲内にピークを有し、異なる溶出時間と荷電状態である分子種が認められた。これらの他の分子種の断片化を避けるために、m/z値70〜2000でのMS‐MS断片化データの収集は12.7分で開始し13.7分で終了した。1分の幅で60のスペクトルを収集できることから、1つのスペクトルは毎秒取った。MCA機能により、収集した60MS‐MSスペクトルすべての集計が可能となった。提供されたこれらの合計スペクトルは大幅にシグナルを増幅し、ノイズを減少させた。回転している衝突エネルギーにはMCAの機能を使うことができないので、0.5μgのサンプルは27、30、35及び40の衝突エネルギーの設定で4回実施した。異なった衝突エネルギーの使用により、断片化パターンにおいてより良好な配列カバー率となった。加えたデータの特徴は、これら4つのMCAスペクトルを一緒に集計するために使用され、その結果、ペプチド配列のほとんどにおいて良好な断片化カバー率で単一のMS‐MSスペクトルとなった。このスペクトルの閾値を手動で1.5に設定し、そのデータをセントロイドとした。セントロイドデータの閾値を3.0に設定した後に、そのデータリストをExcel(商標)に転送した。ソフトウェアが正しく荷電状態を割り当てたことを確認するために、スペクトルを目視で点検し、転送したデータリストと比較した。修正後、すべての分子種が+1の質量を持つようにそのデータリストについて式(I)を用いて変換した。
+1質量=m/z値*電荷−(電荷−1)・・・(I)
REPTYPE=Peptide
BEGIN IONS
PEPMASS=676.6
tab delimited data list (m/z intensity)
END IONS
中性ペプチドのモノアイソトピック質量Mr(計算値):2026.9901
イオンスコア:52
期待値:0.86
一致(太字):最も強度な156のピークを用いた50/150のフラグメントイオン
m/z676.6のピークのように、実施例7に記載したm/z856.8のピークが1分の時間幅内に溶出した。m/z856.8のピークと同じm/z範囲には、他の分子種は認められなかったので、断片化データを収集するためにより広い時間幅を使用できた。衝突エネルギー(CE)40で開始した1.5分の幅を用い、その後、CE38、CE42及びCE45で2分の幅を用いた。実施例8に記載のようにMS‐MS断片化データはm/z70〜2000で収集された。しかしながら、サンプル容量に限りがあったため、CE40、CE42及びCE45では0.5μgを用いたが、CE38では0.4μgしか使用できなかった。これらの4つのMCAスペクトルを一緒に加えるために「追加データ」の特徴を使用し、ペプチド配列のほとんどをカバーする良好な断片化カバー率で単一のMS‐MSスペクトルが得られた。スペクトルを一度平滑化した後、このスペクトルの閾値を手動で2.0に設定し、そのデータをセントロイドとした。セントロイドデータの閾値を3.0に設定した後に、そのデータリストをExcel(商標)に転送した。ソフトウェアが正しく荷電状態を割り当てたことを確認するために、スペクトルを目視で点検し、転送したデータリストと比較した。修正後、すべての種が、リストされた+1質量を持つように式(I)を用いて手動でデータリストを変換した。不明確な電荷のピークはそのまま残した。修正したこのリストを未修正のリストに追加し、対応する強度の質量リストをタブ区切りのテキストファイルとして転送した。テキストファイルを以下のフォーマットに編集した。
REPTYPE=Peptide
BEGIN IONS
PEPMASS=856.8
tab delimited data list (m/z intensity)
END IONS
中性ペプチドのモノアイソトピック質量Mr(計算値):4279.1245
イオンスコア:0
期待値:3.8e+04
一致(太字):最も強度な274のピークを用いた47/424のフラグメントイオン
太字のピークはペプチド配列との一致を表す。このペプチドのアミノ酸配列は「nvhsagaagsrmnfrpgvlssrqlglpgppdvpdhaayhpf」(SEQ ID:NO2)であった。
実施例7に記載したm/z860.0のピークが1分の時間幅内に溶出した。対象となるこのピークと同じm/z範囲内に他の種が認められなかったため、断片化データを収集するためにより広い時間幅を使用できた。衝突エネルギー(CE)40で開始した2分の幅を用い、その後、CE38、CE42及びCE45で3分の幅を用いた。実施例8及び9のようにMS‐MS断片化データはm/z70〜2000で収集された。サンプル容量に限りがあったため、それぞれの4回の実施のために0.25μgのタンパク質を注入し、この分子種の断片化試験を行った。「追加データ」の特性はこれらの4つのMCAスペクトルを一緒に集計するために使用され、ペプチド配列のほとんどをカバーする良好な断片化カバー率で単一のMS‐MSスペクトルが得られた。この分子種の断片化はm/z856.7と同様に見えたので、2つのスペクトルを重ね合わせたところ、図4及び5に示すように多くの断片に+16m/zの質量シフトが認められた。図5の破線ピークはm/z857.8からの断片化ピークであり、実線ピークはm/z860.0からのピークである。16m/zシフトを示すピークのすべてが配列中の1個のメチオニンのC末端側であり、一方、シフトを示さないピークのすべてがメチオニンのN末端側であった。このことは、m/z860.0の分子種が、そのメチオニンで酸化されるか、そうでなければ、アミノ酸配列がm/z857.8のピークと一致していることを強く示唆する。従って、このペプチドのアミノ酸配列は「nvhsagaagsrm(0)nfrpgvlssrqlglpgppdvpdhaayhpf」(SEQ ID:NO3)である。ここでm(O)は酸化されたメチオニンを表す。
Claims (19)
- 異なった生物サンプルの複数のマススペクトルを比較し、非生物学的ばらつきを補正した後に量的に異なった質量イオンの位置を特定し、ペプチド同定の対象とする1つ以上のペプチドを生物サンプルから単離して配列を決定する方法であって、
複数の溶出物を形成する複数の生物サンプルをそれぞれ分画すること;
複数の溶出時間で複数の溶出物それぞれの複数のマススペクトルを得ること;
生物サンプル間で量的に異なっている対象の分子イオンピークを見つけること;
生物サンプル間でほぼ一致する内因性リファレンス分子、及び対象ピークに実質的に類似する溶出時間と質量対電荷比を有する内因性リファレンス分子に対応するマススペクトルリファレンスピークを同定すること;
内因性リファレンス分子のマススペクトルピークに対して対象ピークを正規化することによって、複数の溶出物間における各生物サンプルの非生物学的ばらつきを補正すること;
同時に生じる複数の衝突エネルギーそれぞれを使用し、シングル累積娘フラグメントマススペクトルを形成するために平均化は行わずに複数のフラグメントイオンマススペクトルを集計する衝突誘起フラグメンテーションを検討すること;及び、
シングル・アライメントされたマススペクトル中の対象ピークに対応するペプチドを同定するために用いられるアミノ酸配列決定データを確立するための娘フラグメントマススペクトルを使用すること、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記生物サンプルが血液血清サンプルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 複数の溶出物がそれぞれ1つ以上のマススペクトル溶出時間アライメントピークを含む複数の内因性アライメント分子に対応する複数のマススペクトル中の複数のマススペクトル溶出時間アライメントピークを同定すること;及び
複数のマススペクトル溶出時間アライメントピークの少なくとも一部をアライメントすることによって複数のマススペクトルの少なくとも一部をアライメントすること、
を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 複数のマススペクトルのアライメントが、マススペクトルアライメントピークをリファレンスとして用いた視覚的な複数のマススペクトルのアライメントを更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記内因性アライメント分子が、複数の生物サンプルそれぞれにおいて実質的に同一の存在量であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 複数の生物サンプルをそれぞれ分画することが、キャピラリー液体クロマトグラフィーによって生物サンプルをそれぞれ分画することを更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- シングルマススペクトル中の対象ピークに対応するペプチドの同定が、
少なくとも部分的にペプチドを単離するために、対象ピークに関係するペプチドを含むひとつ以上の生物サンプルを分画すること;
ペプチドのマススペクトルを得ること;
複数の離散的衝突エネルギーそれぞれについて複数のペプチドフラグメントを形成するために、1の離散時間において複数の離散的衝突エネルギーでペプチドを衝突室中に加速すること;
複数の離散的衝突エネルギーそれぞれについて複数のペプチド断片から複数の断片化マススペクトルを得ること;
それぞれの離散的衝突エネルギーからのひとつの離散的衝突エネルギーマススペクトル、及び複数の離散的衝突エネルギーマススペクトルを形成するために、複数の離散的衝突エネルギーそれぞれからの複数の断片化マススペクトルを集計すること;
ペプチドの最終的なマススペクトルを形成するために、複数の離散的衝突エネルギーマススペクトルを集計すること;
最終的なマススペクトルからペプチドに対応するアミノ酸配列を同定すること、
を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記離散時間が、ペプチドの溶出時間とほぼ等しいことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記離散時間が、ペプチドの溶出時間以上であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記離散時間が、ペプチドの溶出時間未満であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記離散時間が、30秒〜3分であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記内因性リファレンス分子が、複数の生物サンプルそれぞれにおいて実質的に典型的な存在量であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ペプチドの配列決定の方法であって、
少なくとも部分的にペプチドを単離するために対象ペプチドを含む生物サンプルを分画すること;
ペプチドのマススペクトルを得ること;
複数の離散的衝突エネルギーそれぞれについて複数のペプチドフラグメントを形成するために、1の離散時間において複数の離散衝突エネルギーでペプチドを衝突室中に加速すること;
複数の離散的衝突エネルギーそれぞれについて複数のペプチド断片から複数の断片化マススペクトルを得ること;
それぞれの離散的衝突エネルギーからのひとつの離散的衝突エネルギーマススペクトル、及び複数の離散的衝突エネルギーマススペクトルを形成するために、複数の離散的衝突エネルギーそれぞれからの複数の断片化マススペクトルを集計すること;
ペプチドの最終的なマススペクトルを形成するために、複数の離散的衝突エネルギーマススペクトルを集計すること;
最終的なマススペクトルからペプチドに対応するアミノ酸配列を同定すること、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記離散時間が、ペプチドの溶出時間とほぼ等しいことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記離散時間が、ペプチドの溶出時間以上であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記離散時間が、30秒〜3分であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記離散的衝突エネルギーが、3以上の離散的衝突エネルギーであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記離散的衝突エネルギーが、5以上の離散的衝突エネルギーであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記離散的衝突エネルギーが、7以上の離散的衝突エネルギーであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
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