JP5181172B2 - 培養重層上皮シートの作製方法 - Google Patents
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Description
培養の対象とする上皮系細胞がヒト細胞である場合、3T3などヒト以外の細胞を対象ヒト細胞の培養液中に存在させない技術、例えば、上皮系細胞を重層化する際、上皮細胞を多孔膜上に置き、支持細胞(フィーダー細胞)を含む培養液を、多孔膜を通して供給し、上皮細胞にフィーダー細胞を接触させずに培養する方法(特許文献1)が提案されている。
一方、MCDB培地にウシ下垂体抽出を添加することで、フィーダー細胞なしに表皮細胞の培養できることが報告されている(非特許文献1)
他方、上皮系細胞をシート状に増殖させるためには、足場となる支持体(スキャホールド)が必要である。羊膜の上皮を脱細胞化したものを、スキャホールドとして利用する技術が知られている。例えば、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞を播種し支持細胞の共存下で培養し、口腔粘膜上皮細胞が重層化した後、その最表層を空気に接触させ分化誘導する。次いで羊膜上に口腔粘膜上皮細胞層が形成された角膜上皮様のシートを得る(特許文献2)。(1)乾燥状態である(2)上皮層を有しない(3)使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持した基底膜を有する、角膜上皮様シートの作製方法であって、(a)角膜上皮細胞又は角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞を支持細胞の共存下で培養する、(b)前記細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させる工程を含む方法(特許文献3)など。また、プロネクチンFなどの細胞接着シグナルを現す特定のポリペプチドを結合させた羊膜を使用し、無血清培地で培養すれば、角膜上皮細胞を重層化できることが知られている(特許文献4)。
一方、ヒト羊膜自体をスキャホールドとして使用した場合、上記、特許文献4に記載されているように、羊膜自体を特殊加工する必要がある。
本発明は、異種動物の細胞を利用せず、さらには羊膜上皮の脱細胞処理あるいは羊膜自体の特殊加工を必要としない簡便な培養重層上皮シートの作製方法の開発を目的とする。
本発明者らは、この特定の乾燥処理により製造される乾燥羊膜それ自体を口腔上皮細胞培養のスキャホールドとして使用することで、フィーダー細胞を不要とし、さらに上皮細胞の重層化ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
人を含む動物の胎児を包む生羊膜を乾燥処理する際に、該生羊膜を乾燥する乾燥装置として、羊膜を載置した処理槽内を減圧状態とする減圧手段と、減圧状態の前記処理槽内に載置した羊膜を加温する加温手段と、前記処理槽内の減圧状態を大気圧方向に復圧する復圧手段とを具備する乾燥装置を用い、前記減圧手段によって減圧状態の処理槽内に載置した羊膜を、前記加温手段によって加温しつつ、その構成する基底膜及び結合組織が破壊されることのない温度に保持すべく、前記減圧手段によって処理槽内を減圧状態とする減圧操作と、前記復圧手段によって減圧状態の処理槽内を大気圧方向に復圧する復圧操作とを、交互に複数回繰り返して、前記処理槽内に載置した生羊膜を脱水乾燥する。
フィーダー細胞の無い状態での対象とする上皮の培養に使用する培地としては、例えば、Boyce & Hamの方法に準じて調製された無血清MCDB153培地が挙げられる。具体的には、上皮細胞増殖因子(EGF;Epidermal Growth Factor)、インシュリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、抗生物質、ウシ下垂体抽出物添加し、塩化カルシウムでカルシウム濃度を調整したMCDB153培地である。
重層化の際に用いる培養液として、例えば、ウシ血清(FCS)などの血清を添加または無添加のMCDB153培地が挙げられる。
参考例
(1)生羊膜の採取
予め同意を得た妊婦の帝王切開分娩で排出された胎盤を、直ちに無菌生理食塩水によって漿膜や血塊等を除去洗浄して生羊膜を採取した。採取した生羊膜は直ちに生理食塩水と共にスピッツ内に密閉して冷蔵保存した。
図1に示す乾燥装置を用いて生羊膜の乾燥を行った。この乾燥装置では、マイクロ波照射装置30としては、出力1.5KWのマグネトロンを用いた。また、遠赤外線ヒータ14の温度設定を50℃とし、遠赤外線を羊膜に対して乾燥開始から終了まで連続照射した。更に、処理槽10内に羊膜を載置していないとき、真空ポンプ18による最高減圧到達圧力を0.4kPaとなるように設定した。図1に示す乾燥装置によって先に採取した羊膜を乾燥する際に、シワにならないように広げた吸水紙としてのクッキングペーパー上に、スピッツから取り出した生羊膜(50g)をシワのないように広げ、これらをトレイ上に載置した。更に、このトレイを処理槽10内の回転テーブル12上に載置した後、回転テーブル12を回転した。この回転テーブル12は、乾燥開始から終了まで連続回転した。次いで、遠赤外線ヒータ14をONとして、真空ポンプ18を駆動すると共に電磁弁20を開けて処理槽10内を減圧する減圧操作を開始した。減圧開始から暫くすると減圧速度が低下してきたため、最高減圧到達圧力が0.90kPaに到達したとき、真空ポンプ18を停止すると共に電磁弁20を閉じ、電磁弁26を開いて、フィルター24によってゴミや細菌が濾過された空気を処理槽10内に導入する復圧操作を開始し、処理槽10内の圧力を4.53kPaに復圧した。復圧操作の開始と同時に、マイクロ波照射装置30としてのマグネトロンをONとしてマイクロ波を回転テーブル12上の羊膜に照射する加温操作を施した。
この乾燥終了は、第5回目の減圧操作による処理槽10内の最高減圧到達圧力と、処理槽10内に羊膜を載置していないときの最高減圧到達圧力とによって判断した。すなわち、第6回目の減圧操作の最高減圧到達圧力が0.40kPaに到達し、処理槽10内に羊膜を載置していないときの最高減圧到達圧力と等しくなったため、乾燥終了と判断した。乾燥を終了した乾燥羊膜は、処理槽10に載置した生羊膜50gに対して1gに脱水乾燥されており、乾燥剤が封入された滅菌パック中に滅菌・密閉して保存した。
得られた乾燥羊膜の両面を走査電子顕微鏡によって観察したところ、図2(a)〜(c)に示す様に、平坦で起伏、断裂に乏しく一定の構造を保持していた。また、この乾燥羊膜をリン酸緩衝液(PBS)に浸漬して再水和した羊膜を、通常の光学顕微鏡標本作成方法に準拠して作成した標本を、光学顕微鏡を用いて観察したところ、図3に示す様に、生羊膜と略同様に、上皮細胞(En)、結合組織(Ct)及び間葉系の細胞(矢印M)が認められた。
抜歯時に付着している歯肉を採取し、単離した口腔上皮細胞浮遊液を遠心分離(1200rpm, 6分間)後、細胞生存率・細胞数を計測し、細胞密度が1×105になるよう100mm径培養用ディッシュに播種した。
口腔上皮細胞の培養は、Boyce & Hamの方法(非特許文献1)に準じて調製した無血清MCDB153培地(EGF;5ng/ml, ヒドロコルチゾン;0.25μg/ml, Insulin-Transferrin-Selenium-A supplementTM;10ml/l, Antibiotic-Antimycotic solution TM;10ml/l, ウシ下垂体抽出物;6mg/dl, 塩化カルシウム;0.06mmol/lを添加したMCDB153培地)で、37℃、5%炭酸ガスインキュベーター中で行った。培地の交換は2日毎に行った。
継代は、細胞の密度が70〜80%コンフリエントになった状態で行った。
2〜3継代した口腔上皮細胞を、乾燥羊膜上に1×105/cm2の細胞密度にて播種した。無血清MCDB153培地のカルシウム濃度を1.8mmol/lに上げ、液相化培地にて培養し、細胞がコンフリエントになった時点(通常4〜5日間)で、1.8mmol/lMCDB153培地にウシ血清(FCS,最終5%の濃度) を添加し、気相化培地の環境下でさらに約3週間培養を継続した。
12 回転テーブル
14 遠赤外線ヒータ
16 モータ
18 真空ポンプ
20 電磁弁
22 減圧配管
24 フィルター
28 復圧配管
30 マイクロ波照射装置
Claims (2)
- 培養重層上皮シートの作製において、(a)無菌状態の乾燥大気中で保存できるように脱水乾燥されており、かつ水又は緩衝液に浸漬して再水和した羊膜には、生羊膜を構成する上皮細胞、基底膜、及び結合組織が保持されている乾燥羊膜を支持体(スキャホールド)として使用し、(b)対象とする口腔上皮細胞を支持細胞(フィーダー細胞)の無い状態で液相化培地で培養し、次いで(c)気相化培養で重層化させることを特徴とする培養重層上皮シートの作製方法。
- 乾燥羊膜が以下の乾燥処理方法によって製造されるものである請求項1記載の培養重層上皮シートの作製方法
乾燥処理方法:人を含む動物の胎児を包む生羊膜を乾燥処理する際に、該生羊膜を乾燥する乾燥装置として、羊膜を載置した処理槽内を減圧状態とする減圧手段と、減圧状態の前記処理槽内に載置した羊膜を加温する加温手段と、前記処理槽内の減圧状態を大気圧方向に復圧する復圧手段とを具備する乾燥装置を用い、前記減圧手段によって減圧状態の処理槽内に載置した羊膜を、前記加温手段によって加温しつつ、その構成する基底膜及び結合組織が破壊されることのない温度に保持すべく、前記減圧手段によって処理槽内を減圧状態とする減圧操作と、前記復圧手段によって減圧状態の処理槽内を大気圧方向に復圧する復圧操作とを、交互に複数回繰り返して、前記処理槽内に載置した生羊膜を脱水乾燥することを特徴とする羊膜の乾燥処理方法。
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