JP5171037B2 - マイクロアレイを用いた発現プロファイリング - Google Patents
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Description
本発明は、2003年9月10日付け米国仮特許出願第60/502,108号明細書及び2004年1月21日付け米国仮特許出願第60/538,283号明細書の優先権及び利益を請求するものである。
トーマス(Thomas)ら(Molecular Pharmacology(2001年)、60号(6);1189−1194頁 ファントフィア(van’t Vear)ら(Nature(2002年)415号;530−536頁
該発明は、遺伝子発現プロファイリングのためのさまざまな新規の組成物及び方法を提供している。本書で教示されている発明は、マイクロアレイ技術を、1つの試料中の転写物の全て又は1サブセットを増幅する汎用プライマ、遺伝子特異的プライマ及びRNA試料中の転写物のサブセットを増幅するための技術と組合わせている。該発明の一部の実施形態は、RNA試料増幅産物内にバーコード配列を取込み、かくして「包括的アレイ」及び包括的標識付きプローブの使用(及び再利用)を可能にする強力な手段を追加する。該発明の組成物及び方法は同様に、多数の増幅されたRNA試料の同時分析をも可能にする。該発明の新規の組成物及び方法は同様に、増幅されたRNA試料を全体的に標識する必要性を無くするという点からみても、魅力的である潜在的なコスト節約を表わす。
本発明について詳述する前に、本発明が特定のデバイス又は生物学的システムに制限されず、これらは当然変動し得るということを理解すべきである。同様に、本書で使用する専門用語は特定の実施形態を記述することのみを目的としたものであり、制限の意図がないということも理解された。この明細書及び添付の特許請求の範囲中で使用される通り、「a」、「an」、「the」という単数形態は、内容が明らかに相反する意味を与えているのでないかぎり、複数の指示対象を内含する。かくして、例えば「a probe」に対する言及には、同一の複数のプローブ分子も含まれ;「cells」には、複数の細胞を含むあらゆる形態の細胞が含まれる、といったようになる。
本書に記述されているのは、マイクロアレイ分析のための試料の調製に付随するコスト及び感度の主たる問題を克服する方法にある。標準的実施形態においては、記述されている発明は、例えば生物試料からの選択されたRNA転写物セットを増幅するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)を使用している。マイクロアレイ分析に適している検出可能な部分(例えば蛍光標識)は、現行の大部分の増幅方法と異なり、増幅反応中に取込まれ、増幅及び標識を単一の1段階プロセスに転換させる。
標準マイクロアレイプロトコルにおいては、mRNA集団は逆転写によりcDNAに転換され、例えばcy3又はcy5といったような蛍光染料で全体的に標識される。該標識ステップは、染料標識されたdNTPを用いた逆転写反応又は逆転写ステップの間に取込まれたアミノ−dUTPにカップリングする化学的に活性化された染料を用いた後逆転写の一部として実施される。標識された産物はこのとき、取込まれていない染料から精製され、次にアレイ上に置かれ、異なる遺伝子配列がその相補的プローブにハイブリッド形成できるようになる。標準的プロトコルでは、出発材料として例えば100μg〜1mgの全RNAといった大量のRNAが必要となる。RNA出発材料の使用量を少なくするために、付加的な全体的増幅ステップが頻繁に実施される。全体的増幅方法の例としては、BDバイオサインス・クローンテック(BD Biosciences−Clontech)(Palo Alto、カリフォルニア州)社製のSMART(商標)技術、NuGEN(商標)テクノロジーズ(NuGENTM Technologies,Inc.)(San Carlos、カリフォルニア州)社製のオベーション(Ovation)(商標)増幅技術及びアルクチュラス(Arcturus,Inc.)(Mountain View、カリフォルニア州)社製のRiboAmp(商標)RNA増幅キットが含まれる。全体的増幅ステップは、該方法に付加的なコストを追加する。例えば、数十ngの全RNAから増幅する能力をもつ全体的増幅方法についての表示価格は、試料1個あたり100〜200ドルである。このコストは、試料1個あたりの使用試薬の標識に関する50ドル〜100ドルに追加されるものである。これとは対照的に、UP−rtPCR反応の実施のための試薬は、試料1個あたり1〜3ドルの間である。
UP−rtPCRプロセスのその他の実施形態には、UP−rtPCRプロセスの間に取込まれ得る付加的な核酸「バーコード」配列を含み入れるべくキメラ遺伝子特異的プライマを修飾することが関与する。このような実施形態においては、増幅すべき遺伝子の各々は、バーコード配列に連結される。試料に添加されるバーコード配列は、試料特異的(例えば多数の試料が同時に分析される場合)でも又は遺伝子特異的(各遺伝子は異なるバーコードを受ける)でもあり得る。代替的には、UP−rtPCRプロセス中、遺伝子の任意の特定のサブセットが同じバーコードを受け取ることができる。試料又は遺伝子識別のためのバーコード戦略を利用するさまざまな実施形態が図3及び4に例示されている。本書の図中に例示されている実施形態は、単なる一例として役立つように意図されている。該発明を本書で例示されているいずれかの特定のバーコードスキームに制限することは、意図されていない。該発明の記述を読んだ上で、当業者にはさまざまな実施形態が明らかになると思われ、これらは全て特許請求対象の発明の範囲に包含される。
一部の実施形態においては、増幅されるべき異なる遺伝子転写物の各々は、各々の遺伝子の特異的で一意的なバーコード配列を取込むことができる。これらの配列はその後、マイクロアレイ(すなわち付着部分)とのハイブリダイゼーション点として使用可能であり、ここで、該マイクロアレイは、異なるバーコード配列の各々に対し相補的である複数のオリゴヌクレオチドプローブを含有する。このプロセスの利点は、プライマセット内及びマイクロアレイ上の両方でバーコード配列の包括的セットを利用でき、異なる遺伝子の発現プロファイル(発現パターンと同義である)を監視するべく何度もくり返し使用可能な包括的マイクロアレイを作り出す機会を提供するという点にある。
標識付きバーコードプローブというのは、標識を有するオリゴヌクレオチド配列である。一定の与えられた実験セットについて、各々ユニークオリゴヌクレオチド配列を伴う複数のバーコードプローブを調製することができ、ここで、各々のユニーク配列は、(例えばその吸光/発光特性によって一意的に同定され得る蛍光標識で異なるプローブを標識することによって)異なる標識と結びつけられる。代替的には、図5Bに示されているように、遺伝子特異的配列と相補的な第1のサブ配列(又はセグメント)及びバーコードを含む第2のサブ配列を有する連結用オリゴヌクレオチドを、標識付きバーコードプローブを用いて検出することができる。
スクリーニング方法の1実施形態は、物理的アレイ内の異なる空間的にアレイ化された場所に対し異なる増幅済み産物を誘導するための包括アレイの使用を包含している。例えば分析すべき異なるRNA又は核酸試料の各々は、特定の試料中の全ての産物が1つのバーコードで標識されるすなわち、試料1で増幅された産物がバーコード1を含み、試料2で増幅された産物がバーコード2を含み、試料3で増幅された産物がバーコード3を含むといったような形で増幅される。別々の反応の中で増幅される試料1、2、3などをプールし、その後包括アレイに同時ハイブリッド形成することができ、ここで包括アレイ内の空間的位置1はバーコード1に相補的なオリゴヌクレオチドを有し、包括アレイ内の空間的位置2は、バーコード2に相補的なオリゴヌクレオチドを有し、包括アレイ内の空間的位置3は、バーコード3に相補的なオリゴヌクレオチドを有する、等々。該方法は、ハイブリダイゼーションに先立ち試料を精製又は単離する必要性が全く無く全体的プロセスを単純化するという点で、試料1、2、3などの直接的スポッティングに比べて著しい利点を提供する。
遺伝子発現及び核酸検出のためのマイクロアレイタイプの検定の使用における有意なコストが1つ以上の標識を含むオリゴヌクレオチドの合成と結びつけられる。コストを削減するために、一部の実施形態は、包括プローブセットを利用しており、ここで該プローブはバーコード配列を含んでいる(図5A及び5Bを参照のこと)。これらのバーコードプローブ配列は、(i)増幅の間に増幅済み遺伝子又は核酸産物内に取込まれているか又は(ii)ハイブリダイゼーションを介してバーコード取込み用染料標識付き包括プローブを結びつけるために仲介又は連結用オリゴヌクレオチドを利用するバーコード配列に対し相補的なものにされている。
本発明の方法において使用するための発現済みRNA試料は、一定数の生物学的供給源から得られる。生物試料は、原核生物又は真核生物のいずれかに由来し得る。例えば、発現済みRNA試料は、動物、植物、酵素、真菌、細菌及びウイルス及び/又はウイルス感染した細胞といった生物学的供給源から得ることができる。任意には、発現済みRNA試料は、化合物ライブラリの1つ以上のメンバーで処理された細胞から収集可能である。本発明の状況下での生物試料は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスタ、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒト、及び非哺乳動物脊椎動物、例えば両生類、例えばカエル、ヒキガエル、及び魚例えばゼブラフィッシュ及びその他の科学的に有利な種、ならびに非脊椎動物種例えば線虫及び昆虫例えばショウジョウバエ(Drosophila)を含む。該発明は、任意の特定の生体又は細胞型からのRNA試料に制限されるように意図されていない。
発現済みRNA試料は、一定数の周知の手順のいずれかを用いて生物試料から単離される。例えば、RNAを安定化するため任意には付加的な成分を含有するグアニジウムベースの溶解緩衝液の中で生物試料を溶解させることができる。本発明の一部の実施形態においては、溶解緩衝液は同様に、細胞培養からのRNAの回収及び安定性を監視するための対照として精製済みRNAを含有する。対照RNA種として使用するための精製されたRNA鋳型の例としては、プロメガコーポレーション(Promega Corporation)(Madison、ウイスコンシン州)からのカナマイシン陽性対照RNA、及びギブコ/ライフテクノロジー(Gibco/Life Technologies)(Rockville、メリーランド州)からの7.5kbのポリ(A)−テールドRNAが含まれる。溶解物を直ちに使用することも、又は例えば−80℃で凍結保存することもできる。
本発明の一部の実施形態においては、RNA試料から誘導された核酸は、論理的又は空間的にアレイ化された核酸プローブ(例えば固体支持体上に固定化された核酸プローブ)を含むアレイ、又はアレイのアレイに対して適用される。発現済みRNA試料を例えばガラスマイクロアレイスライドの表面上で直接アレイ(又はアレイのアレイ)に適用することが可能であるが、一般には、安定性を改善し取扱いを容易にするため、発現済みRNA試料に対応するDNA産物を利用することが望ましい。一部のケースでは、例えばサンブルック、アウスベルなどの中で記述されているような確立した手順に従って行なわれた試料中の発現済みRNAの逆転写により生成されたcDNA産物が検定される。より標準的には、発現済みRNA試料に対応するDNA産物は、検定の感度及びダイナミックレンジを改善するべく検定に暴露する前に増幅される。
本発明の方法の1実施形態には、ターゲット特異的(例えば遺伝子特異的)及び汎用プライマの組合せ利用により可能となるさまざまなPCR多重化戦略の使用が関与する。これらの手順は、1つ以上の発現済みRNA種に対応する1本鎖又は2本鎖DNA鋳型の逆転写とそれに続くPCRにおける増幅が関与するRT−PCR検定に対する変形形態である。多重PCR戦略に関する付加的な詳細は、例えばローレイン(Loehrein)らによるPCT国際公開第01/55454号パンフレット及びチェンシック(Chenchik)らに対する米国特許第5,962,271号明細書の中に見出される。
プライマ長及び配列の変動は、プライマがそのターゲットにアニールし複製をプライミングする効率に対し大きな衝撃をもち得る。各産物が独特のプライマ対により増幅される標準的な多重化反応においては、増幅された産物の相対量は、アニーリング効率の差に起因してターゲットの相対量から有意に改変され得る。ターゲット特異的プライマ及び汎用プライマの使用を統合する本発明の方法の実施形態は、この偏向を無くし、相対的mRNAレベルを正確に反映する増幅産物を産生する。
多重反応に含み入れられるターゲットセットは一般に全て、遺伝子発現の計量が正確になるように用いられる検出プラットフォームのダイナミックレンジ内のシグナル強度を生み出す。一部の実施形態では、多重検定の中に高度に発現された遺伝子(すなわち、その他の遺伝子よりもさらに高度に発現されている遺伝子)を内含することが望ましい又は必要である可能性がある。しかしながら、高度に発現された遺伝子は、この遺伝子のそのシグナルが減衰されない場合、非常に低いレベルで発現されたその他の遺伝子についての計量と干渉する可能性がある。当業者であれば、全て該発明と共に使用できるものであるこの技術的問題を回避するためのさまざまな方法が存在することを充分に承知している。多重増幅反応の中に高度に転写された遺伝子を取込むという技術的問題を扱うための何らかの特別な戦略に該発明を制限することは意図されていない。
汚染物質及び塩の存在に起因して、アレイ上への被着に先立ち、発現済みRNA試料(例えばrtPCR産物)に対応する核酸の集団を「精製する」ことが望ましい場合が多い。PCR産物といったような核酸を精製することに対する数多くのアプローチが存在しているが、主要な2つの高速大量処理アプローチは、マイクロタイタープレートフォーマットにおけるろ過及び磁気ビーズの捕捉及び洗浄である。例えば、本発明の状況下では、ミリポア・モンタージュ(Millipore Montage)PCR96DNA精製プレート(及びこのプレートの匹敵する384ウエルバージョン)が有利に利用される。使用プロトコルには、PCR産物の単一の1ステップ真空ろ過と溶出が関与しており、ビオメック・マルチメック(Biomek Multimek)システムといったような自動化されたシステムと互換性がある。代替的には、磁気ビーズの捕捉及び洗浄アプローチを自動プラットフォームのために適合させることができる。該発明の核酸(例えば増幅済みrtPCR産物)を精製するためにいずれかの特定の技術に該発明を制限することは意図されていない。当業者であれば、全て該発明と共に使用できる、核酸精製用のさまざまな代替的技術を充分に承知している。
RNA、cDNA又は増幅産物(例えば増幅済みrtPCR産物)のいずれであろうと、発現済みRNA試料に対応する核酸セットが、一般に、核酸プローブの固定化され、空間的又は論理的にアレイ化された集合(一般にアレイ又はマイクロアレイと呼ばれる)に適用(すなわちハイブリッド形成)され、ここで該アレイは、発現済みRNA試料(又はその増幅産物)のセットのメンバーに相補的である核酸プローブを含んでいる。核酸アレイを用いた高速大量処理発現分析を実施するための数多くの技術的プラットフォームが利用可能である。共通のアレイフォーマットは、液相及び固相の両方のアレイを含んでいる。例えば、核酸のハイブリダイゼーションなどのための液相アレイを利用する検定は、マルチウエル又はマイクロタイタープレート内で実施可能である。96、384又は1536ウエルを伴うマイクロタイタープレートが広く利用可能であり、さらに数多くのウエル、例えば3456及び9600のウエルを使用することもできる。一般に、マイクロタイタープレートの選択は、試料調製及び分析に用いられるロボット利用の取扱い及び投入システムなどの方法及び機器により決定される。システム例としては、例えば、ベックマン−クールター(Beckman−Coulter Inc)(Fullerton、カリフォルニア州)製のORCA(商標)システム及びザイマーク(Zymark Corporation)(Hopkinton、マサチューセッツ州)製のザイメイト(Zymate)システムが含まれる。
分析のために選択される複数のプローブ(例えば遺伝子セット又は遺伝子産物)は、例えば既知の科学的文献を再考することによってか又は実証的研究を実施することにより選択可能である。1実施形態においては、プローブは、(a)生物試料内で検出可能なレベルで発現されておりかつ(b)1つ以上のメンバー組成物に対する暴露の結果として変化する確率の高い遺伝子(又は遺伝子産物)の中から選択される。2つのタイプの遺伝子(又はそのそれぞれの遺伝子産物)が標準的に遺伝的応答プロファイルの生成中に監視される。すなわち、経験的応答者である遺伝子(すなわちマーカー遺伝子)と問題の経路又は疾病部域に関与するものとして知られているか又は疑いがもたれている遺伝子(すなわち疾病関連遺伝子)である。任意には、化合物又は化学物質セット内の少なくとも1つの組成物による影響を受けるものとして知られている1つ以上の遺伝子が監視される(例えば正の対照)。
発現済みRNA試料内の遺伝子発現プロファイルは、定性的及び定量的測定のいずれか(又は両方)により評価可能である。(RNA又はタンパク質産物としての)遺伝子発現を評価するための上述の技術のうちのいくつかは、事実上大部分が定性的であるデータを生み出す。すなわち、該方法は、発現の量的面に関して有意な情報を提供することなく全く異なる様式に発現を分類する発現の差異を検出する。例えば、候補遺伝子の発現の有無すなわち発現のオン/オフプロファイルを検出する場合、その技術は定性的技術として記述することができる。代替的には、定性的技術は、遺伝子産物の異なる対立遺伝子又は変異体の存在(及び/又は不在)を測定する。
発現されたRNA産物に対応する核酸アレイの産生の後、1組のプローブについて発現が評価される。セット内のプローブの各々は、独自の確定されたポリヌクレオチド配列から成る。プローブセットの異なるメンバーは、関係するポリヌクレオチド配列又は無関係のポリヌクレオチド配列のいずれでもあり得、一般に、疾病関連遺伝子又はターゲットと結びつけられたポリヌクレオチド配列に対応する。往々にして、確定配列プローブは合成オリゴヌクレオチドであるが、例えばcDNAプローブで、制御断片、増幅産物などといった代替的合成プローブも同様に適している。該複数の確定配列プローブのハイブリダイゼーションは、単一の反応混合物(ハイブリダイゼーション混合物)内で発生する。
本発明の方法においては、各々確定配列のものでありかつ各々が異なる検出可能なシグナルを発生させる能力をもつ多数のプローブは、同時に、すなわち単一の反応において、核酸アレイに対しハイブリッド形成される。1つの有利な実施形態においては、プローブは各々異なる蛍光発色団で標識されている。蛍光標識は、共有結合により付着されるか、非共有結合的に挿入されてよく、又、エネルギー転移標識であってもよい。その他の有用な標識としては、増幅産物内に取込まれ検出のための反応の後に放出されるマス標識、化学発光標識、電気化学及び赤外線標識、同位体誘導体、ナノ結晶、又は適切な酵素反応によって検出されるさまざまな酵素連結又は基板連結された標識のいずれかが含まれる。
核酸アレイに対する確定配列プローブのハイブリダイゼーションの後、アレイの核酸とプローブ間のハイブリダイゼーションが検出され、かつ/又は検出され任意には定量化される。本発明の方法の一部の実施形態は、産物の直接的検出を可能にする。その他の実施形態は、1つ以上のプローブと結びつけられた標識を介して反応産物を検出する。
本発明の方法は、細胞(例えば培養中の細胞系)、例えば組織又は生体といったような生物系において1つ以上の生理学的プロセスに対する生理学的効果を有する化学物質などの化合物を同定する目的で有利に利用される。1つの有利な実施形態においては、化学物質又は化合物ライブラリが本発明の方法に従ってスクリーニングされる。本発明の1つの有利な利用分野は、潜在的な治療上の利用分野例えば疾病状態又は身体条件の予防又は治療に関係する生理学的、代謝的又は遺伝的経路に関連する活性をもつ作用物質を同定する目的での大きい化合物ライブラリのスクリーニングにある。代替的な実施形態には、1つの疾病状態に関係しない生物学的系に対する効果をもつ作用物質などの治療薬の同定以外の目的で化合物について化合物ライブラリをスクリーニングすることが含まれる。標準的には、培養中の細胞系の試料といったような生物試料が、化学物質又は化合物ライブラリのメンバーに対し暴露されるか又はこれにより処理される例えばこれと接触させられる。暴露の後、発現済みRNA試料が各々の処理済み試料から回収され、本書で記述されている通りに分析される。標準的には、例えば各々化合物ライブラリの異なるメンバーで処理されてきた同じ細胞系の集団に各々対応する多数の試料などの、生物試料から誘導された多数の発現済みRNA試料が、例えばガラスマイクロアレイスライド上に空間的にアレイ化され、例えば問題の生化学経路の化合物をコードする遺伝子に対応する複数の問題のプローブにハイブリッド形成される。通常は、各々が組成物ライブラリの1つ(又はそれ以上)のメンバーに暴露されている細胞系の試料(集団)に対応する約100(又は200又は500)から数千までのいずれかの数、例えば約10,000、約20,000個の異なる発現済みRNA試料が、本発明の方法に従ってアレイ化され分析される。
本発明は同様に、遺伝子発現を評価するための統合型システムを提供している。該統合型システムは標準的には、例えば細胞系、組織、器官生検、生体などの多数の生物学的供給源又は生物試料から誘導された複数の発現済みRNA産物に対応する核酸試料を組込んだ、ガラススライド上で組織されたマイクロアレイなどの論理的又は空間的アレイを含んでいる。任意には、該統合型システムは、例えば最も一般的には多重ウエル平板例えば96、384、768又は1536ウエル平板(VWRサイエンティフィックプロダクツ(Scientific Products)、West Chester、ペンシルバニア州といったさまざまな供給業者から入手可能)の中で細胞培養といった機能を提供するこのような生物試料の調製及び収集のためのさまざまなコンポーネントを内含することができる。例えば試料及び試薬のピペット採取、液体送り出し、時限インキュベーション、及び検出器内のマイクロプレートの最終的読取りなどのプロセス全体を自動化するためのコンポーネント及びシステムが市販されており、本発明のシステムの状況下で利用可能である(例えばザイマーク(Zymark Corp.)、Hopkinton、マサチューセッツ州;エアー・テクニカル・インダストリーズ(Air Technical Industries)、Mentor、オハイオ州;ベックマン・インスツルメント(Beckman Instruments,Inc.)、Fullerton、カリフォルニア州;プレシジョン・システムズ(Precision Systems,Inc.)、Natick、マサチューセッツ州、など)を参照のこと)。これらの設定可能なシステムは、高い処理能力及び高速始動ならびに高度の柔軟性及びカスタマイズ化を提供する。同様にして、アレイ及びアレイ読取り装置が、例えばアフィメトリックス(Affymetrix)、PEバイオシステム(PE Biosystems)その他からの入手可能である。
さらなる態様においては、本発明は、本書で記述されている通りの遺伝子発現の分析のための方法、組成物及びシステムを実施するキットを提供している。例えば、本発明のキットは、例えば化合物ライブラリのメンバーで処理された試料といった生物試料から得た発現済みRNA試料に各々対応している複数の異なる核酸試料が上に被着された1つ以上のマイクロアレイスライド(又は代替的マイクロアレイフォーマット)を含み得る。キットは同様に複数の標識されたプローブを内含することもできる。代替的には、キットは、プローブとして適した複数のポリヌクレオチド配列、及び内含されたポリヌクレオチド配列又は医師の裁量でその他のポリヌクレオチド配列をカストマイズするのに適した選択された標識を含むことができる。一般に、少なくとも1つの内含されたポリヌクレオチド配列は対照配列、例えばβ−アクチン、「ハウスキーピング」遺伝子などに対応する。標識の例としては、核酸プライマ自体に連結されるフルオロフォア、染料、放射性標識、酵素タグなどが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
多重汎用プライマ駆動のPCRを用いたRNAターゲットの増幅
全RNAを、RNA単離キット(RNeasy)(登録商標)、キアゲン(Qiagen);Valencia、カリフォルニア州)を用いて培養細胞から得た。20ngの単離RNAを次にまずは逆転写反応で、そして続いてPCR増幅中で使用した。これらの反応条件は以下の通りであった。
逆転写試薬
反応体積:20μL
遺伝子特異的逆プライマ濃度:0.05μM(各プライマ)
緩衝液条件:1×PCR緩衝液II(10mMのトリス−HCl、pH8.3:50mMのKCl)
MgCl2:2.5mM
dNTP:1mM
DTT:0.01M
RNase阻害物質:0.1U
MMLV逆転写酵素:1U
サーマルサイクラ条件
48℃ 1分
37℃ 5分
42℃ 60分
95℃ 5分
4℃ 終了
PCR試薬
反応体積:20μL
使用されたcDNAの量:10μL(20中)
キメラ遺伝子特異的、汎用順方向プライマ濃度:0.02uM(各プライマ)
緩衝液条件:1×PCR緩衝液II(l0mMトリス−HCl、pH8.3;50mM KCl)
MgCl2:7mM
dNTP’s:0.3mM
汎用順方向プライマ濃度:1μM(蛍光染料;例えばCy3又はCy5で標識された)
汎用逆方向プライマ濃度:1μM
Taqポリメラーゼ:2.5U
サーマルサイクラ条件
95℃ 10分
94℃ 30秒
55℃ 30秒
68℃ 1分
ステップ2−4を35サイクル反復する
4℃ 終了
オリゴヌクレオチドプローブを、凍結乾燥状態で受取り、これを無菌水中で100μMの原液となるまで希釈した。各オリゴヌクレオチドプローブを96ウエルの平板フォーマット内で10μMの作業原液になるまで希釈した。10μLのDMSO及び10μLの10μMのオリゴヌクレオチドプローブを384ウエル平板の各ウエル中にピペット採取し、ピペットで混合した。スポッティングピンがウエル中に浸漬する予定のウエルの底面/中心に50%のDMSO/オリゴヌクレオチドプローブ溶液が確実に入るようにするため、平板をカウンタトップ上で軽くたたく。
メーカー(キアゲン又はプロメガ)の指示事項に従って螢光標識されたPCR産物を精製し、水中に溶出させ、1倍のハイブリダイゼーション緩衝液(4×SSC、0.02%Tween−20)及び90%のグリセロールと5:39:6の比率で混合した。その後95℃で5分間ハイブリダイゼーション混合物を加熱してUP−rtPCR産物を変性させ、氷上で30秒間スナップ冷却した。多数のUP−rtPCR反応をこれらのステップ中にプールした。
ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイをまず最初に低ストリンジェンシーの緩衝液(1×SSC及び0.2%SDS)中で55℃で30分間、そして次に高ストリンジェンシーの緩衝液(0.1×SSC及び0.2%SDS)中で55℃で3分間洗浄した。マイクロアレイを次に水で洗浄し、走査の準備として乾燥させた。
メーカーにより推奨された標準プロトコルを用いて、マイクロアレイ走査計器(例えばアクソン・インスツルメンツ(Axon Instruments)、Union City、カリフォルニア州、ジーンピックス(GenePix)(登録商標)マイクロアレイスキャナ(microarray scanner)を使用して走査を実施した。その後データを例えばジーンスプリング(GeneSpring)(登録商標)(Silicon Genetics, Redwood City、カリフォルニア州)といったマイクロアレイデータ分析ソフトウェアパッケージ内にインポートした。
Claims (8)
- 2つ以上の遺伝子発現プロファイルを決定する方法において、
2つ以上の生物試料から複数のRNA試料を提供するステップ;
少なくとも1つの汎用プライマと、前記汎用プライマと相同な汎用プライミング配列を含む第1の配列部分、対象遺伝子に相補的な第2の配列部分、及びバーコード配列を含む第3の配列部分を有する少なくとも1対のキメラ遺伝子特異的バーコード化プライマとを用いて、2つ以上の生物試料の各々から前記RNAを増幅し、かくして2以上のバーコード化PCR産物を生成するステップ;
複数の遺伝子発現産物を表す複数の核酸を含むアレイを提供するステップであって、前記複数の核酸の各々が前記アレイ内の別々の離れた物理的場所に位置づけされ、前記複数の核酸のうち少なくとも1つの核酸が、前記2以上のバーコード化PCR産物が有するバーコード配列に相補的であるステップ;
前記アレイに対し前記2以上のバーコード化PCR産物をハイブリッド形成するステップであって、前記バーコード配列を含む第3の配列部分が、前記アレイに存在する前記バーコード配列に相補的な核酸にハイブリッド形成するステップ;
前記アレイを洗浄すると共に、未結合バーコード化PCR産物を除去するステップ;及び
前記アレイ内の選択された場所にハイブリッド形成されたバーコード化PCR産物の量を検出し、定量し、かくして2つ以上の生物試料の各々についての前記遺伝子発現プロファイルを決定するステップ、
を含んで成る方法。 - 前記RNA試料を提供するステップが、細胞培養又は患者からの組織試料からRNAを得るステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA試料を提供するステップがさらに対照RNA配列を提供するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの汎用プライマが検出可能な部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記汎用プライマが前記PCR産物の生成に先立って又は前記PCR産物を生成した後に標識される、請求項4に記載の方法。
- 前記アレイがマイクロアレイ、ドットブロットアレイ又は規則配列アレイを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アレイを提供するステップが、核酸の2次元アレイ又は核酸の3次元アレイを提供するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な部分が蛍光標識を含む、請求項4に記載の方法。
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