JP5170976B2 - タンパク質複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の抗癌タンパク質ワクチンは、分子中にシステイン残基を2個以上有する癌特異的タンパク質抗原を疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させることによって製剤化される。
本発明において、タンパク質抗原はスルホ化されたまま疎水化多糖類等に包埋してよいが、疎水化多糖類に包埋する直前に還元してもよく、或いは疎水化多糖類に包埋させた後に還元することが出来る。この還元方法に関しては2mM以上の2-メルカプトエタノール、ジチオスライトール、システインなどを作用することで達成できる。
本発明において使用すべき高分子キャリアは、リポソーム、疎水化多糖類、イスコマトリックス等癌特異的タンパク抗原の疎水性部分を包埋してナノゲル形成性を有するものである限り、任意の高分子キャリアを特に制限なく使用可能である。
(式中、Rはアルキル基またはステロール残基を示し;mは0または1を示し;nは任意の正の整数を示す)で表されるものを挙げることができる。ここで、アルキル基又はステロール残基としては好ましくは上記のものを用いることができ、nは好ましくは1〜8である。なお、疎水化多糖類としては、特開平7−97333号公報に記載されたようなリンカーを介して結合したものであってもよい。
より具体的には、本発明においては、下記のような疎水化多糖類(A)を用いることが好ましい。
(2)CHM(コレステロール疎水化マンナン)
(3)ISCOMATRIX
本発明において、上記した疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させるべき癌特異的タンパク質抗原としては、その分子中にシステイン残基を2個以上有する癌細胞に特異的に発現するタンパク質抗原を用いる。
本発明においては、上記の癌特異的タンパク質抗原として、例えば、以下のものが好適に使用可能である。
(2)組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌精巣抗原
例えば、MAGE−Al,MAGE−A2,MAGE−A3,MAGE−A4,MAGE−A5,MAGE−A6,MAGE−A7,MAGE−A8,MAGE−A9,MAGE−A10,MAGE−A11,MAGE−A12,MAGE−B1,MAGE−B2,MAGE−B3,MAGE−B4,MAGE−C1,MAGE−C2のMAGEファミリーから1ないし複数選択された癌精巣抗原;
疎水化多糖類と抗原との複合体は、尿素等の変性剤存在下に疎水化多糖類と抗原とを室温で混合した後に、限外ろ過またはゲルクロマトグラフ法で変性剤を除去することにより製造することができる(Nishikawa,Macromolecules,27,pp.7654−7659,1994)。或いは変性剤なしでも疎水化多糖類と抗原とを50−60℃で混合するだけでも製造可能である。このようにして得られた疎水化多糖類と抗原との複合体は、そのまま本発明のワクチン製剤として用いることができるが、必要に応じて常法に従ってろ過滅菌等の操作を施すことも可能である。
本発明により製造可能なワクチン製剤は、他の公知のワクチン製剤等と同様に、その所定量を動物に投与することによって該動物を免疫することができ、同様にしてワクチン製剤の力価を評価することができる。本発明のワクチン製剤の投与経路は皮下または皮内注射が一般的である。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては抗原として50〜1500μg/回程度好ましくは100〜600μg/回の量を目安とし、投与は3〜30回行うのが適当である。また、GM−CSF、IL−2、CpGやOK−432のごとき免疫賦活剤を併用することも効果的である。
組換え大腸菌の調製は一般的なプラスミドにCTAのDNAを組み込むことで達成される。CTAのDNA配列は公知であり(米国特許第5342774号等)、バイオ製造業者にとって容易に達成できる。
システイン残基の修飾法の1例として、スルホ化を例として説明する。
スルホ化したタンパク抗原の純度は逆相HPLCまたは電気泳動でチェックすることが出来る。この安定性は、例えば中性緩衝液中で60℃、10分間加熱しても電気泳動で1バンドであることで確認できる。スルホ化保護をしていない場合には重合体・多量体と考えられる高分子のバンドが増加してくる。(後述実施例 に対応する電気泳動パターンを参照)
包埋方法の1例として、CHPを用いる場合について説明する。
CHPに包埋させる方法は、それ自体は既に公知の方法(例えば、WO98/0650公報)を使用することができる。この包埋方法の概略は、6〜8M尿素または6Mグアニジンなどの変性剤溶液にCHPを溶解させ、もしくはCHPを水または緩衝剤溶液に溶解させて、タンパク質1に対して重量比10-20倍量のCHPを混合し、限外ろ過またはゲルろ過などの方法で製剤処方緩衝液に交換し、必要に応じて無菌ろ過処理する方法である。GHPの溶解は常温で十分であるが、加温下に行っても差し支えない。CHPの分子量は、50−100kdが望ましい。また、CHPは、例えば日本油脂株式会社から市販されている。
本発明の疎水化多糖類(A)と、タンパク抗原(B)との複合体の粒度分布は粒度分布計(DRI)を用いて確認することが出来る。(実施例 図8参照)
包埋は、GPC(ゲル浸透クロマトグラフィー;例えば、後述する「CHP包埋化」の記載を参照)によりチェックすることができる。GPCチャートにおいて、CHPおよび癌特異的抗原タンパク質それぞれのピークが、包埋により完全にCHPピークの位置に移動することで、この「包埋」を確認することが出来る。本発明において、この「包埋」の収率は95%以上であることが望ましく、更には99%以上が好ましい。
上記したような包埋の確認方法(GPC)を利用して、本発明において「コレステリル多糖−抗原分子」の組合せを探索するためのスクリーニングテストに使用することができる。このようなスクリーニングにおいては、「包埋」の収率を求めることができる。本発明においては、この「包埋」の収率は95%以上であることが望ましく、更には99%以上が好ましい。
包埋後の抗原活性を検定する方法は種々あり得るが、例えばin vitroで、抗原提示細胞とキラーまたはヘルパーT細胞を組み合わせた実験系で測定できる。すなわち、包埋タンパク質抗原を例えば樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込ませ、その抗原提示細胞によるキラーT細胞の活性化を、インターフェロンγを測定対象とするELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay)やELISPOT法(Enzyme-linked-ImmunoSPOT)で確認することができる。こうした実験系では、抗原活性を観測することが可能である。
本発明の包埋タンパク質抗原は、ワクチンとして使用することができる。このワクチンは、いわゆる「抗原医薬」であるため、通常は、いわゆる「抗体医薬」より、一桁以上少ない量で免疫の効果を得ることができる。
本発明において、好適なワクチンの態様は、以下の通りである。(1)組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌特異的タンパク質抗原(以下「SH抗原」という)に亜硫酸塩、テトラチオン酸塩を作用させて得られるスルホ化組み換え癌特異的タンパク質抗原(以下「スルホ化抗原」という)を精製し、スルホ化リコンビナント癌精巣抗原を疎水化多糖類に包埋させたCHP−スルホ化抗原ワクチン。
(1)His−Tag−MAGE−A4の組み込みとシードストックの調製
下記配列:
Forward primer: 5’-GGATCCATGTCTTCTGAGCAGAAGAGT-3’
Reverse primer: 5’-AAGCTTCTCATGCTCAGACTCCCTC-3’
抗生物質不含LB培地 10Lに対してMAGE−A4MCB を5 mL接種した。37℃、250rpm、1vvmで6-15時間前培養を行い、LB培地200Lに対して前培養液を10L接種し、30℃、60rpm、1vvmで培養を開始した。OD600が約1になったらIPTGを終濃度0.3mmol/Lで添加し、誘導を開始し、DO制御は攪拌により約60%(約4.5ppm)以上に保持して、誘導開始から5hr後、培養を終了した。
デュラポア PVDF GVPP 0.22μm(Vスクリーン)0.5 m2の平膜(Millipore)を用いて、使用菌体濃縮(約6-10倍)後、同量の20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)バッファーを3回以上添加し、菌体洗浄を行い、菌体を湿重量で800g、20Lの菌体スラリー液を得た。菌体は冷蔵または冷凍で保存した。
M: 分子量マーカー; PC: 陽性対照; CS: 培養上清; S: 上清; P: 沈殿
(アフィニティカラムクロマト)
Ni-NTAカラム(QIAGEN Ni-NT agarose、25cm径、約4L)を用いて破砕ろ液からMAGE−A4たん白を分離した。次の通りステップ溶出にて実施する。 ( 流速56cm/h )
上記濃縮液に終濃度 8Mになるように 尿素を添加20mM Tris-HCl (pH 8.0) を用いてメスアップしながら溶解した後、終濃度で60mMテトラチオン酸二水和物と300mM亜硫酸ナトリウム を順に加え 室温で一晩撹拌した。反応液を10mM リン酸ナトリウムバッファー 8mol/L 尿素(pH 8.0)で平衡化したSephadex G-25 Coarse(GEヘルスケア) 25cm径 約12Lに通してバッファーを交換した。
実施例1の反応を8M尿素の代わりに6Mグアニジン存在下でも行ってみた。
結果は、図3(粗精製His−Tag MAGE−A4とそのスルホ化保護体の非還元SDS−PAGE)に示すように8M尿素の場合も6Mグアニジンの場合も一つのバンド(49kd)に収束した。
実施例1で得た「粗精製His−Tag−MAGE−A4」を用いて、以下の実施例3〜実施例8の実験を行った。
(陰イオンクロマト)
10mM リン酸ナトリウムバッファー 8mol/L 尿素(pH 8.0)で平衡化したDEAE Sepharose Fast Flow 13cm径 約2L(GEヘルスケア)にてさらに精製した。カラム操作は以下の通り、グラジエント溶出で行った。流速は、アプライおよび洗浄25cm/h、その他75cm/hにて実施した。
(ハイドロキシアパタイトカラムクロマト)
ペリコン2 ウルトラセルPLCGC 10K 0.1m2×1枚の平膜(Millipore)を用いてDEAE溶出プール液を約3mg/mLまで濃縮し、濃縮後 6倍量以上の1/2 D-PBS 8mol/L 尿素にてバッファー交換脱塩を行った。これを1/2 D-PBS 8mol/L 尿素 で平衡化したHA ULTROGEL 10cm径 約3L (ポール)に載せ更に精製した。
(CHP包埋化)
こうして得られたスルホ化保護His−Tag−MAGE−A4に重量比12倍のCHP 60Tまたは100T(日本油脂社製)を6M尿素存在下、または6M尿素+2‐メルカプトエタノール(2ME)存在下に混合した。これを一度緩衝液で希釈した後、限外ろ過によって濃縮・希釈を繰り返すことによって緩衝液交換とともに過剰の試薬を除去した。得られた原液を無菌ろ過した後にバイアルに分注しワクチン製剤とした。
(ワクチン効果の確認)
こうして得られたCHP−His−Tag−MAGE−A4ワクチンの免疫活性を以下のようにELISPOT法を用いて確認した。
(サイズ分布の測定)
包埋生成物のサイズ分布を測定した。測定条件は、以下の表5に示す通りである。
Claims (7)
- 分子中にシステイン残基を2個以上有する癌精巣抗原を疎水化多糖と複合体化させる癌精巣抗原と疎水化多糖の複合体の製造方法であって;
前記癌精巣抗原のシステイン残基をスルホ化して精製し、
精製された癌精巣抗原を疎水化多糖と複合体化した後、
該複合体を還元することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。 - 前記スルホ化が、癌精巣抗原にチオ硫酸塩とテトラチオン酸塩を作用させて、該癌精巣抗原のチオール基をスルホ化させて保護する請求項1に記載のタンパク質複合体の製造方法。
- 前記精製をクロマトグラフィーで行う請求項1に記載のタンパク質複合体の製造方法。
- 前記癌精巣抗原が、リコンビナント癌精巣抗原である請求項1に記載のタンパク質複合体の製造方法。
- 前記リコンビナント癌精巣抗原が、MAGE Al,MAGE A2,MAGE A3,MAGE A4,MAGE A5,MAGE A6,MAGE A7,MAGE A8,MAGE A9,MAGE A10,MAGE A11,MAGE A12,MAGE B1,MAGE B2,MAGE B3,MAGE B4,MAGE C1,MAGE C2のMAGE ファミリーから1ないし複数選択されたCTAである請求項4に記載のタンパク質複合体の製造方法。
- 前記リコンビナント癌精巣抗原が、NY−ESO−1、LAGE ファミリー、GAGE ファミリー、SAGE ファミリー、XAGE ファミリーから1ないし複数選択された癌精巣抗原(CTA)である請求項4に記載のタンパク質複合体の製造方法。
- 前記リコンビナント癌精巣抗原が、His−Tagを付加したHis−Tag−CTAである請求項4または5に記載のタンパク質複合体の製造方法。
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