JP5170608B2 - アフラトキシン生産阻害剤、及びそれを用いたアフラトキシン汚染防除方法 - Google Patents

Description

本発明は、ジオクタチン、及びその誘導体を有効成分とするアフラトキシン生産阻害剤、及びその製造方法、並びに前記アフラトキシン生産阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法に関する。

カビの二次代謝物には、有用な化合物が含まれる一方、マイコトキシンと呼ばれる毒性を示す化合物も多い。現在、マイコトキシンによる農作物の汚染は、世界的に深刻な問題となっており、安全な食糧を安定して得るために、マイコトキシン汚染防除の手段が求められている。

マイコトキシンによる農作物の汚染のうち、最も深刻な問題となっているのが、アフラトキシンによる農作物の汚染である。アフラトキシンは、既知の天然物質中で最も強い発ガン性を有することが知られており、また、通常の調理方法等では分解されない化合物であることから、農作物汚染の規制値が１０ｐｐｂ程度と低く設けられている。このため、アフラトキシンで汚染された農作物を破棄することによる損害額も高額にのぼっている。
アフラトキシンの主な生産菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ａ． ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓであり、熱帯及び亜熱帯の環境下で、トウモロコシやピーナッツ等の農作物に感染して、アフラトキシンを生産することが知られている（非特許文献１及び２参照）。熱帯及び亜熱帯以外の気候の地域においても、近年の地球温暖化現象による気候変動により、汚染地域の拡大が懸念されている。

従来から、アフラトキシン汚染防除の取組みとして、アフラトキシン生産菌のゲノム解析や生産に関与する遺伝子の同定等の基礎研究や、感染に抵抗性を有する品種の取得、アフラトキシン非生産菌との競合による汚染の軽減等の実用研究が行われている。しかしながら、アフラトキシン汚染防除の効果的かつ抜本的な方法は、未だ確立されていない。

アフラトキシン汚染防除方法としては、例えば、アフラトキシン生産菌の生育を阻害する抗カビ剤を使用する方法が考えられるが、強力な抗カビ剤は安全性に問題があり、また、該抗カビ剤の耐性菌の蔓延をひきおこす可能性がある。
一方、アフラトキシンは二次代謝物であるため、その産生を阻害しても生産菌の生育には影響を与えないと考えられることから、アフラトキシン生産のみを特異的に阻害する薬剤を利用することができれば、有効な汚染防除方法になりうると考えられる。

そこで、アフラトキシン生産を阻害する物質の探索が行なわれた結果、有機リン系の殺虫剤であるｄｉｃｈｌｏｒｖｏｓや、メラニン生合成系酵素を阻害するｔｒｉｃｙｃｌａｚｏｌｅに、アフラトキシン生産阻害活性が見出された（非特許文献３参照）。しかしながら、これらの化合物はアフラトキシン生産阻害活性が弱く、また該化合物自体の安全性に問題があることに加え、阻害活性の選択性に問題があることから実用化には至っていない。

このように、耐性菌の蔓延をひきおこすことなく、アフラトキシン生産のみを特異的に阻害する作用を有する化合物が求められており、探索の結果いくつかの化合物も見出されている（特許文献１及び２参照）が、安全性が高く、かつ実用性の高いアフラトキシン生産阻害剤としては、未だ満足なものが見出されていないのが現状である。

特開平９−２４１１６７号公報 特開平１１−７９９１１号公報 Council for Agricultural Science and Technology.,"Mycotoxins: Risks in Plant, Animal, and Human Systems", CAST, Ames, Iowa, USA, 2003 宇田川俊一，田端節子，中里光男："マイコトキシン"，中央法規，２００２ L.L. Zaika and R.L. Buchanan, J. Food. Prot., 50, 691(1987)

本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明は、アフラトキシン生産を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン生産阻害剤、及びその効率的な製造方法、並びに前記アフラトキシン生産阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、以下の知見を得た。即ち、アフラトキシン生産を特異的に阻害する物質の探索を行ったところ、公知の生理活性物質であるジオクタチンが、アフラトキシン生産菌の生育を阻害することなく、アフラトキシン生産を阻害するという知見である。
ジオクタチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＡ−２５８１の培養物から単離された化合物であり、毒性が低く、その生理活性としては、ジペプチジルアミノペプチダーゼII（ＤＰＰII）を阻害することによる免疫抑制活性が知られている。
しかしながら、アフラトキシン生産阻害能を有することは全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
さらに、ジオクタチンには不斉炭素が含まれており、異性体が存在しうるが、ジオクタチン生産菌の培養物から単離された天然型ジオクタチンの立体構造は知られておらず、該天然型ジオクタチンの立体構造、及びその立体構造を有するジオクタチンの製造方法もまた、本発明者らの新たな知見である。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ｉ）で表されるジオクタチン、及びその誘導体のいずれかを有効成分とすることを特徴とするアフラトキシン生産阻害剤である。
ただし、前記構造式（Ｉ）中、Ｒは水素、及びメチル基のいずれかを表す。
＜２＞ ジオクタチンが、下記構造式（Ｉａ）で表されるジオクタチンＡである前記＜１＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤である。
＜３＞ ジオクタチンが、下記構造式（II）で表されるジオクタチンＡである前記＜１＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤である。
＜４＞ ジオクタチンが、下記構造式（III）で表されるジオクタチンＢである前記＜１＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤である。

＜５＞ ストレプトミセス属に属するジオクタチン生産菌を培養し、得られた培養物から、遠心液液分配クロマトグラフィーによりジオクタチンを分離・精製する工程を含むことを特徴とするアフラトキシン生産阻害剤の製造方法である。
＜６＞ ジオクタチン生産菌が、放線菌ストレプトミセス属ｓｐ．ＳＡ−２５８１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＡ−２５８１）である前記＜５＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤の製造方法である。

＜７＞ 前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載のジオクタチンを化学合成により合成する工程を含むことを特徴とするアフラトキシン生産阻害剤の製造方法である。
＜８＞ 前記＜３＞に記載のジオクタチンを、トレオニン、Ｓ体の３−アミノオクタン酸、及びＳ体の３−アミノ−２−メチルオクタン酸を用いて合成する前記＜７＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤の製造方法である。
＜９＞ 前記＜４＞に記載のジオクタチンを、トレオニン、及びＳ体の３−アミノオクタン酸を用いて合成する前記＜７＞に記載のアフラトキシン生産阻害剤の製造方法である。

＜１０＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のアフラトキシン生産阻害剤を用い、アフラトキシン生産菌によるアフラトキシン生産を阻害することを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法である。
＜１１＞ アフラトキシン生産阻害剤を、農作物に投与し、該農作物に感染したアフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を阻害する前記＜１０＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。
＜１２＞ 農作物が、穀類、ナッツ類、香辛料、及び豆類から選択される少なくともいずれかである前記＜１１＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。
＜１３＞ アフラトキシン生産阻害剤を、植物体に塗布し、該植物体に感染したアフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を抑制する前記＜１０＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。

本発明によると、従来における問題を解決することができ、アフラトキシン生産を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン生産阻害剤、及びその効率的な製造方法、並びに前記アフラトキシン生産阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法を提供することができる。

（アフラトキシン生産阻害剤）
本発明のアフラトキシン生産阻害剤は、下記構造式（Ｉ）で表されるジオクタチン、及びその誘導体のいずれかを有効成分とする。

前記構造式（Ｉ）中、Ｒは水素、及びメチル基のいずれかを表す。
前記構造式（Ｉ）で表されるジオクタチンのうち、前記Ｒがメチル基であるものがジオクタチンＡであり、前記Ｒが水素であるものがジオクタチンＢである。

前記構造式（Ｉ）で表されるジオクタチンは、立体異性体が存在するが、前記ジオクタチン生産菌の培養物から得られた天然物由来の化合物の立体構造（以下、「天然型の立体構造」という）であるものが好ましい。
前記天然型の立体構造のジオクタチンとしては、下記構造式（II）で表されるジオクタチンＡ、及び下記構造式（III）で表されるジオクタチンＢが挙げられ、これらの中でも下記構造式（II）で表されるジオクタチンＡが好ましい。

＜ジオクタチン＞
本発明のアフラトキシン生産阻害剤の有効成分である前記ジオクタチンの物理化学的性状としては、以下の通りである。化合物が前記ジオクタチンであるか否かは、適宜選択した各種の分析方法により、例えば、下記の物理化学的性状を示すか否かにより確認することができる。

−ジオクタチンＡ−
（１）外観は、白色粉末状である。
（２）融点は、２６３〜２６５℃である。
（３）二次イオン分析法（ＳＩＭＳ）による質量は、３９８（Ｍ＋１）^＋である。
（４）分子式は、Ｃ_２１Ｈ_３９Ｎ_３Ｏ_４であり、分子量は、３９７．６である。
（５）比旋光度は、−３．５°（ｃ１，ＡｃＯＨ）である。
（６）１０％（Ｖ／Ｖ）の０．１Ｎ塩酸水を含むアセトニトリル中で測定した紫外部吸収極大波長は、２２４ｎｍ（ｌｏｇ εは、３．７７）である。
（７）赤外部吸収極大の波長（ｃｍ^−１、ＫＢｒ錠）は、３３３０、３１８０、２９９０、２９７０、２９００、２１６０、１６７０、１５７０、１５４０、１４１５、１３８５、１３３０、１１６０、１０６０、１０００、８７５、８１０、７３０である。なお、スペクトルを図１に示す。
（８）ジオクタチンＡ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルは、図３に示す通りである。
（９）ジオクタチンＡ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の１００ＭＨｚ^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルは、下記表１に示す通りである。
（１０）酸性メタノール、酸性エタノール、酸性アセトニトリル、酸性ジメチルスルホキシド、及び酢酸に可溶であり、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシドに難溶であり、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、及びエチルエーテルに不溶である。
（１１）中性の両性物質である。
（１２）薄層クロマトグラフィーとして、シリカゲル６０プレート（Ａｒｔ．５７１５、メルク社製）、及び展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：酢酸＝１０：３：１（容量比）を用いて展開したときのＲｆ値は、０．５０である。
（１３）高速液体クロマトグラフィーとして、Ａｌｌｉａｎｃｅ(Ｗａｔｅｒｓ社製)のシステムにおいて、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ_１８ ＵＧ１２０、直径４．６ｍｍ×１００ｍｍ(Ｓｈｉｓｅｉｄｏ社製)を用い、カラム温度を４０℃に設定し、移動相のＡ液を０．１％のトリフルオロ酢酸を含む２０％メタノール水、Ｂ液を０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１００％メタノールとし、（Ａ液）：（Ｂ液）＝１００：０の混合溶媒から、（Ａ液）：（Ｂ液）＝２０：８０の混合溶媒になるまで、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで、１５分間のグラジエントをかけて流し、ＵＶ２２０ｎｍでモニターしたとき、保持時間１０．８分にピークを確認することができる。

−ジオクタチンＢ−
（１）外観は、白色粉末状である。
（２）融点は、２５１〜２５２℃である。
（３）二次イオン分析法（ＳＩＭＳ）による質量は、３８４（Ｍ＋１）^＋である。
（４）分子式は、Ｃ_２０Ｈ_３７Ｎ_３Ｏ_４であり、分子量は、３８３．５である。
（５）比旋光度は、＋１５．０°（ｃ１，ＡｃＯＨ）である。
（６）１０％（Ｖ／Ｖ）の０．１Ｎ塩酸水を含むアセトニトリル中で測定した紫外部吸収極大波長は、２２４ｎｍ（ｌｏｇ εは、３．７９）である。
（７）赤外部吸収極大の波長（ｃｍ^−１、ＫＢｒ錠）は、３３００、３１５０、２９７０、２９５０、２８７０、２１５０、１６６０、１５６０、１５４０、１４０５、１３８０、１３２０、１１８０、１１５５、１１２０、１０２０、９８０、８７０、７９５、７３０である。なお、スペクトルを図２に示す。
（８）ジオクタチンＢ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルは、図４に示す通りである。
（９）ジオクタチンＢ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の１００ＭＨｚ^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルは、下記表１に示す通りである。
（１０）酸性メタノール、酸性エタノール、酸性アセトニトリル、酸性ジメチルスルホキシド、及び酢酸に可溶であり、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシドに難溶であり、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、及びエチルエーテルに不溶である。
（１１）中性の両性物質である。
（１２）薄層クロマトグラフィーとして、シリカゲル６０プレート（Ａｒｔ．５７１５、メルク社製）、及び展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：酢酸＝１０：３：１（容量比）を用いて展開したときのＲｆ値は、０．６４である。

表１中、ｓは一重線を、ｄは二重線を、ｔは三重線を、ｑは四重線をそれぞれ表す。
なお、内部基準はテトラメチルシランである。

前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ジオクタチンのカルボキシル基における薬学的に許容できる陽イオンとの塩、及び前記ジオクタチンのアミノ基における薬学的に許容できる陰イオンとの塩等が挙げられる。
前記陽イオンとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、及びカルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等が挙げられ、前記陰イオンとしては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。
前記塩は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記アフラトキシン生産阻害剤の有効成分である前記ジオクタチンは、毒性の低い物質であり、マウスに対する急性毒性試験では、マウス腹腔内にジオクタチンＡの２５０ｍｇ／ｋｇを投与しても、ジオクタチンＢの２５０ｍｇ／ｋｇを投与しても死亡例は認められないことが確認されている。

前記アフラトキシン生産阻害剤としては、前記ジオクタチン及びその誘導体（以下、「ジオクタチン化合物」という）を有効成分として含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した担体等のその他の成分を含んでいてもよい。
前記アフラトキシン生産阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、医薬品や農園芸用製剤に用いられる公知の担体を用いて製剤化したものが挙げられ、例えば、固形剤、粉末剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、ゲル剤、クリーム剤、及びスプレー剤等が挙げられる。

（アフラトキシン生産阻害剤の製造方法）
前記アフラトキシン生産阻害剤の製造方法としては、ジオクタチンを調製する工程を含み、必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
前記ジオクタチンを調製する工程としては、ジオクタチン生産菌の培養物から分離精製する第一の態様、及びジオクタチンを化学合成により合成する第二の態様が挙げられる。
前記第一の態様及び前記第二の態様のいずれかの方法により得られたジオクタチン化合物は、本発明のアフラトキシン生産阻害剤としてそのまま使用してもよく、その他の工程において適宜他の成分を添加するなどして本発明のアフラトキシン生産阻害剤を調製してもよい。

＜ジオクタチンの調製＞
＜＜第一の態様＞＞
前記ジオクタチンを調製する第一の態様は、ストレプトミセス属に属する前記ジオクタチン生産菌を培養し、得られた培養物から、ジオクタチンを分離・精製する工程である。

−ジオクタチン生産菌−
前記ジオクタチン生産菌としては、前記ジオクタチンの産生能を有すること以外は、特に制限はなく、適宜選択することができるが、菌糸幅１μｍ内外の放線菌であり、光学顕微鏡下では放線菌の気菌糸上の胞子鎖はオープン・スパイラル（ｏｐｅｎ ｓｐｉｒａｌ）であり、電子顕微鏡下では桿状の胞子が観察され、胞子表面は平滑であり、細胞壁の構成成分としては、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメリン酸が検出され、電子顕微鏡下においても胞子嚢やその他の特徴的な構造は認められないという菌学的性質を有するストレプトミセス属がより好ましく、該ストレプトミセス属の中でも、ストレプトミセス・エスピーがより好ましく、ＳＡ−２５８１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＡ−２５８１）が特に好ましい。

前記ＳＡ−２５８１株の各種培地における生育状態、及び培養性状は、下記表２に示すとおりである。なお、以下の色の記載について、かっこ内に示す標準は、コンテイナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアルを用いた。評価は、２７℃において２週間培養後に行った。

また、前記ＳＡ−２５８１株の生理学的性状は、下記表３に示すとおりであり、糖の資化性能の有無は、下記表４に示すとおりである。判定は、それぞれ２７℃において２週間培養後に行った。

−培養物の調製−
前記ジオクタチン生産菌を培養し、前記培養物を得る方法としては、前記ジオクタチン生産菌を、少なくとも栄養源を含有する培地に接種し、好気的に発育させる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ジオクタチン産生菌は、自然界から常法によって分離することにより入手してもよい。

前記栄養源としては、放線菌の栄養源として使用しうるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの水解物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源；グリセリン、シュークロース、デンプン、グルコース、ガラクトース、マンノース、糖みつ等の炭水化物；脂肪等の炭素源；食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩、などが挙げられる。
また、前記培地中の成分として、前記栄養源の他、例えば、微量の金属塩、消泡剤としての動物油、植物油、鉱物油等を添加することもできる。
これらのものは前記ジオクタチン生産菌が利用し、前記ジオクタチンの生産に役立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。

培養方法としては、斜面（スラント）培養、平板（プレート）培養などの固体（寒天）培養や、液体培養のいずれであってもよいが、前記ジオクタチンを大量に生産させる観点から、液体培養が好ましい。前記液体培養としては、振とう培養、静置培養、攪拌培養のいずれであってもよいが、振とう培養が好ましく、回転振とう培養がより好ましい。なお、大量培養を行う場合には、発酵槽等を用いて培養を行ってもよい。

培養温度としては、前記ジオクタチン生産菌が発育し、前記ジオクタチンを生産する範囲であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５〜３４℃が好ましく、２５〜３０℃がより好ましい。

培養日数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、７〜９日程度で前記ジオクタチン生産菌が十分な量に増殖し、前記ジオクタチンが十分な量産生される。なお、前記ジオクタチンが十分な量産生されたかについては、例えば、培養液上清のブタノール抽出液を乾固しメタノールで６倍に濃縮した液を、前記高速液体クロマトグラフィーで分析することにより判断することができる。

−ジオクタチンの分離・精製−
前記ジオクタチンの分離・精製方法としては、前記培養物（菌体、及び培養液）から、例えば、溶媒を用いた溶剤抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用した吸着分離法、ゲル濾過、向流分配を利用したクロマトグラフィー、遠心液液分配クロマトグラフィー等により前記ジオクタチンを分離する方法が挙げられ、これらの１種、又は２種以上の方法を組合せて行うことができるが、少なくとも遠心液液分配クロマトグラフィー法を用いて分離・精製を行うことが好ましい。

−−遠心液液分配クロマトグラフィー−−
前記遠心液液分配クロマトグラフィーによる前記ジオクタチンの分離・精製としては、例えば、遠心場において、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の上層、及び下層を充填した分配セル内に、培養液から得た抽出物を濃縮乾固して得た油状の残渣を含む試料を注入し、溶解性の差によって分離させることにより行なわれることが好ましい。

前記培養液から抽出物を得る方法としては、例えば、ｐＨ２以下でブタノールなどの水不混和性の有機溶剤で抽出する方法、ダイヤイオンＨＰ−２０などの有機吸着剤に吸着させた後、酸性含水メタノール、酸性含水アセトンなどで溶出する方法等が挙げられる。
前記菌体から抽出物を得る方法としては、例えば、前記菌体を酸性含水メタノール、酸性含水アセトン等の有機溶剤で抽出する方法等が挙げられる。

遠心液液分配クロマトグラフィーを用いた分離・精製工程の例は以下のとおりである。
分配セル中に固定相（クロロホルム：メタノール：０．０１７Ｍアンモニア水＝５：６：４（容量比）の下層）を充填し、分配セルを回転させ、移動相（クロロホルム：メタノール：０．０１７Ｍアンモニア水＝５：６：４（容量比）の上層）を流す。前記分配セル出口から前記移動相が流出し、セルの内圧が一定したところに、前記培養液から得た前記抽出物を濃縮乾固して前記移動相で溶解して調製した試料を注入する。前記移動相を流し続け、溶解性の差により前記ジオクタチンを含む１次精製物を分離し、回収する。次に、該１次精製物にｐＨ３になるまで１Ｍ塩酸を添加し、前記ジオクタチンの塩酸塩を含む試料を調製する。
続いて、前記分配セル中に固定相（クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の上層）を充填し、前記分配セルを回転させ、移動相（クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の下層）を流す。前記分配セル出口から移動相が流出し、セルの内圧が一定したところに、前記ジオクタチンの塩酸塩を含む１次精製物を注入する。移動相を流し続け、溶解性の差により２次精製物を分離し、回収する。得られた前記２次精製物を水洗した後、アセトンで洗浄することにより、ジオクタチン塩酸塩を純品として得ることができる。

得られた前記２次精製物をさらに精製する方法としては、例えば、蒸留、液抽出、減圧濃縮、再沈殿、結晶化等が挙げられ、これらは１種単独で行ってもよく、２種以上の方法を組合せて行ってもよい。

＜＜第二の態様＞＞
前記ジオクタチンを調製する第二の態様は、化学合成により前記天然型の立体構造のジオクタチンを合成する工程であり、前記ジオクタチンを合成する方法としては、前記構造式（II）及び前記構造式（III）で表される立体構造を有するジオクタチンを合成可能な方法である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

なお、前記天然型の立体構造のジオクタチンが得られたことは、旋光度及びＮＭＲスペクトルの少なくともいずれかが、前記第一の態様で得られるジオクタチン一致することにより確認することができる。また、ＤＰＰII阻害活性を評価することにより、確認することもできる。

−ジオクタチンの合成−
前記ジオクタチンＡ及び前記ジオクタチンＢに含まれているデヒドロブチリン（２−アミノ−２−ブテン酸）は、ペプチド中でのみ安定に存在し、これを含むペプチドは、トレオニンを含むペプチドの脱水反応によって合成することができる。
前記ジオクタチンＡは、３−アミノオクタン酸、３−アミノ−２−メチルオクタン酸、及びトレオニンからペプチドを合成し、前記ジオクタチンＢは、３−アミノオクタン酸、及びトレオニンからペプチドを合成し、適宜トレオニンの脱水反応を行い、最後に保護基を除去することによって合成することができる。

前記トレオニンとしては、Ｄ体、Ｌ体、及びＤＬ体のいずれであってもよく、メチルエステル塩酸塩などの誘導体であってもよい。また、前記トレオニンは市販品であってもよく、該市販品としては、入手コストの観点からＬ−トレオニンが好ましい。

以下、合成方法の一例を説明する。

（１）ジオクタチンＢの調製
前記天然型の立体構造のジオクタチンＢは、原料としてトレオニン（threonine）、及びＳ体の３−アミノオクタン酸を用いて合成することができる。
（Ｓ）−３−アミノオクタン酸は、Ｓ−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミンのアニオンを２−オクテン酸のエステルにマイケル付加をさせ、生じた付加体アニオンを塩化アンモンでクエンチすることにより３−アミノオクタン酸のＳ体の前駆体が得られ、これを水素化分解することにより（Ｓ）−３−アミノオクタン酸 エチルエステルが得られ、さらにこれを加水分解することにより、（Ｓ）−３−アミノオクタン酸を得ることができる。
さらに、Ｂｏｃ２Ｏと反応させることにより、Ｓ体のＢｏｃ−３−アミノオクタン酸を得ることができる。

まず、Ｌ−トレオニン メチルエステル塩酸塩と、上記のようにして得たＳ体のＢｏｃ−３−アミノオクタン酸を縮合し、ジペプチド（Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−Ｌ−トレオニン メチルエステル）を得る。
得られた前記ジペプチドを脱水反応に処し、Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸メチルエステルを調製する。

前記脱水反応は、酸塩化物と塩基のいずれを用いても良いが、例えば、塩化メタンスルフォニルとトリエチルアミンとの組合せが好ましい。
また、反応に用いられる溶媒としては、非水溶媒で原料を溶解できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、塩化メチレン及びエタノールを含まないクロロホルムが好ましい。

次いで、前記Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸メチルエステルのＢｏｃ基を除去し、再度Ｓ体のＢｏｃ−３−アミノオクタン酸を縮合して保護トリペプチドを得る。前記Ｂｏｃ基を除去する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、用いられる試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、４Ｍ塩酸・ジオキサン等が挙げられる。
最後にＮ末端のＢｏｃ基と、Ｃ末端のメチルエステルとを順次除去することにより、天然型の立体構造のジオクタチンＢが得られる。

上記の方法によりトレオニン及びＳ体の３−アミノオクタン酸を原料として合成することにより得られる立体構造の明らかなジオクタチンＢは、前記ジオクタチン生産菌の培養物から得た天然のジオクタチンＢと、ｎｍｒスペクトル及び旋光度が一致するため、前記天然のジオクタチンＢと同じ立体構造であると考えられ、前記天然のジオクタチンＢと同様に優れたアフラトキシン生産阻害活性を有する。

（２）ジオクタチンＡの調製
前記天然型の立体構造のジオクタチンＡは、原料としてトレオニン、Ｓ体の３−アミノオクタン酸、及びＳ体の３−アミノ−２−メチルオクタン酸を用いて合成することができる。
Ｓ体の３−アミノ−２−メチルオクタン酸は、Ｓ−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミンのアニオンを２−オクテン酸のエステルにマイケル付加をさせ、生じた付加体アニオンをヨウ化メチルでクエンチすることにより立体異性体２種類の前駆体が得られ、これを混合物のまま加水素分解することにより３−アミノ−２−メチルオクタン酸 エチルエステルが得られ、さらにこれらを加水分解することにより、３−アミノ−２−メチルオクタン酸の（２Ｓ,３Ｓ）及び（２Ｒ,３Ｓ）体の混合物が得られる。得られた前記混合物は、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーで分離することが出来る。例えば、Ｄｏｗｅｘ５０カラムからピリジン・酢酸緩衝液で早く溶出した異性体と遅く溶出した異性体とでは、１Ｈ−ＮＭＲでメチル基シグナルのケミカルシフトが異なるため、両者が分離したことが確認できる。
これらをそれぞれＢｏｃ化することにより、２種類のＳ体のＢｏｃ−３−アミノ−２−メチルオクタン酸を得ることができる。

前記（１）ジオクタチンＢの調製と同様にして、脱水ジペプチド、Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸メチルエステルを合成し、２回目の縮合反応をＢｏｃ−３−アミノオクタン酸の代わりにＳ体のＢｏｃ−３−アミノ−２−メチルオクタン酸を用いて行い保護トリペプチドとし、最後に両末端の保護基を除去してすることにより、ジオクタチンＡが得られる。
これらの中で、Ｓ体の３−アミノオクタン酸とＳ体の３−アミノ−２−メチルオクタン酸のうちイオン交換樹脂クロマトグラフィーで遅く溶出される方を用いて合成したものは、前記ジオクタチン生産菌の培養物から得た天然のジオクタチンＡと旋光度及びＮＭＲスペクトルが一致する。このことから、前記天然のジオクタチンＡの３−アミノ−２−メチルオクタン酸の３位の立体構造は、Ｓであることがわかる。

上記の方法によりトレオニン、Ｓ体の３−アミノオクタン酸、及びＳ体の３−アミノ−２−メチルオクタン酸を原料として合成して得た天然型の立体構造のジオクタチンＡは、前記ジオクタチン生産菌の培養物から得た天然のジオクタチンＡと同様、優れたアフラトキシン生産阻害活性を有し、２位のエピマーを含むジオクタチンＡの立体異性体はアフラトキシン生産阻害活性が劣る。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、例えば、前記ジオクタチン化合物を公知の薬理的に許容される担体、賦型剤、希釈剤等と混合し、所望の剤型に製剤化する工程等が挙げられる。

本発明のアフラトキシン生産阻害剤の製造方法により製造した本発明のアフラトキシン生産阻害剤は、後述するアフラトキシン汚染防除方法に好適に使用される。

（アフラトキシン汚染防除方法）
本発明のアフラトキシン汚染防除方法は、前記本発明のアフラトキシン生産阻害剤を用い、アフラトキシン生産菌によるアフラトキシン生産を阻害する方法であり、前記アフラトキシン生産菌が付着乃至感染した対象物に対し、前記アフラトキシン生産阻害剤を投与する方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記対象物としては、例えば、植物体、農作物などが挙げられ、前記農作物としては、例えば、トウモロコシ、コメ、ソバ、ハトムギ等の穀類、ピーナッツ、ピスタチオナッツ、ブラジルナッツ等のナッツ類、ナツメグ、唐辛子、パプリカ等の香辛料、及びコーヒー豆等の豆類などが挙げられる。

前記アフラトキシン生産菌が付着乃至感染した対象物に対し、前記アフラトキシン生産阻害剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、通常の農業製剤の剤型に製剤化し、前記アフラトキシン生産菌が付着乃至感染した対象物に対して、塗布、噴霧等を行う方法が挙げられる。

前記アフラトキシン汚染防除方法に用いられる、前記アフラトキシン生産阻害剤中の前記ジオクタチン化合物の濃度としては、前記アフラトキシン生産菌の種類や繁殖の程度に応じて適宜調整されるが、例えば、１０〜５０，０００ｐｐｍが好ましく、１００〜５，０００ｐｐｍがより好ましい。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
＜アフラトキシン生産阻害剤の製造（１）＞
寒天斜面培地で培養した放線菌ストレプトミセス属ｓｐ．ＳＡ−２５８１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＡ−２５８１）株よりグリセロール２％、ファルマメディア（トレイダーズ・オイル・ミル社製）１．５％からなる液体培地（ｐＨ７．４）を１００ｍＬずつ分注したワッフル付き三角フラスコに１白金耳ずつ接種し、２７℃、３日間振とう培養した。これを種培養として、滅菌した前記液体培地１２Ｌを入れたジャー培養器１基に４００ｍＬ接種し、２７℃、通気１２Ｌ／分、かくはん２００回転／分の条件で、９日間培養した。消泡剤は、必要に応じてプロナール５０２（信越化学工業社製）を適宜加えた。得られた培養液を遠心分離し、培養ろ液と菌体とを分別した。

遠心分離して得た前記培養ろ液１１Ｌ（７．９×１０^５ユニットのジペプチジルペプチダーゼII（ＤＰＰII）阻害物質を含む）を、５００ｍＬのダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）のカラムにかけ、水２Ｌを流した後、０．１Ｍの塩酸水を５０％（容量比）含むアセトン溶液２．５Ｌで溶出した。
得られた溶出液２．４Ｌに６Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて中和した後、減圧濃縮してアセトン及び水を留去し、シロップ状濃縮液を得た。

前記培養ろ液に由来するシロップ状濃縮液を、遠心液液分配クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：０．０１７Ｍアンモニア水＝５：６：４（容量比）の上昇法）により活性分画を分離した。具体的には、分配セル中に固定相（クロロホルム：メタノール：０．０１７Ｍアンモニア水＝５：６：４（容量比）の下層）を充填し、分配セルを回転させ、移動相（クロロホルム：メタノール：０．０１７Ｍアンモニア水＝５：６：４（容量比）の上層）を流した後、前記分配セル出口から前記移動相が流出し、セルの内圧が一定したところに、前記シロップ状濃縮液を移動層で溶解した試料を注入し、移動相を流し続け、活性分画を回収した。回収した２つの活性分画のうち、後から溶出された活性分画（ジオクタチンＡ）を集め、減圧下に濃縮乾固して、ジオクタチンＡの１次精製物を得た。

前記ジオクタチンＡの１次精製物を、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の上層溶液に溶解させた後、この溶液に、ｐＨが３になるまで１Ｍ塩酸を添加し、前記アフラトキシン生産阻害剤としての前記ジオクタチンＡ塩酸塩を含む試料を調製した。

前記ジオクタチンＡ塩酸塩を含む溶液を、遠心液液分配クロマトグラフィーにより、クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の下降法によって分離し、活性分画を回収した。具体的には、分配セル中に固定相（クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の上層）を充填し、前記分配セルを回転させ、移動相（クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４（容量比）の下層）を流し、前記分配セル出口から移動相が流出し、セルの内圧が一定したところに、前記ジオクタチンＡ塩酸塩を含む試料を注入した。前記移動相を流し続け、２次精製物を分離し、回収した。
得られた前記２次精製物を減圧濃縮し、得られた析出物をろ過して水洗した後、さらにアセトンで洗浄し、乾燥させることにより、前記アフラトキシン生産阻害剤としての前記ジオクタチンＡ塩酸塩の純品２２ｍｇを得た。
収率をＤＰＰII阻害活性から求めた結果、ジオクタチンＡの収率は１４．５％であった。

（比較製造例１）
＜アフラトキシン生産阻害剤の製造＞
実施例１のアフラトキシン生産阻害剤の調製において、前記培養ろ液に由来するシロップ状濃縮液を、ブタノールで抽出し、水洗した後、１Ｍのアンモニア水を添加して中和し、減圧濃縮した。得られた濃縮液を塩酸酸性メタノールに溶解し、１Ｍアンモニア水を添加して中和し、沈殿物を析出させた。得られた前記沈殿物をろ過により集めて水洗し、減圧下で乾燥して祖粉末を得た。これにメタノールを添加し、２０％塩酸を滴下して溶解した後、シリカゲルを添加し、減圧下に濃縮乾固した。次に、これをシリカゲルを充填したカラムにかけ、混合溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１００：３０：１（容量比））で溶出し、活性分画を回収した。回収した２つの活性分画のうち、後から溶出された活性分画（ジオクタチンＡ）を集め、減圧下に濃縮乾固して、ジオクタチンＡの１次精製物を得た。これを塩酸酸性メタノールに溶解し、１Ｍアンモニア水を滴下することにより、活性分画を析出させ、これをろ過により集めて水洗した後、減圧乾燥し、ジオクタチンＡ塩酸塩の純品を得た。
遠心液液分配クロマトグラフィーによらない比較参考例１のジオクタチンＡの収率を、実施例１と同様にして評価したところ、収率は５．５％であり、遠心液液分配クロマトグラフィーを用いた本発明のアフラトキシン生産阻害剤による実施例１の収率に対して約１／３と低かった。

（実施例２）
＜アフラトキシン生産阻害の評価（１）＞
−アフラトキシン生産菌の胞子懸濁液の調製−
アフラトキシン生産菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ ＮＲＲＬ２９９９を、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地、日水製薬社製）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、０．０１％のＴｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ社製）水溶液に懸濁して胞子懸濁液を調製した。
前記胞子懸濁液の希釈液を、ＰＤＡ培地上に塗布して２日間培養した後、出現したコロニー数を懸濁液中の胞子数とした。

−アフラトキシン生産阻害剤活性の測定−
ＰＤ培地（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｍＬを１００ｍＬの三角フラスコに仕込み、オートクレーブした後、実施例１で調製したアフラトキシン生産阻害剤（ジオクタチンＡ塩酸塩）を、０〜５μｇ／ｍＬ（０〜２６μＭ）となるように無菌的に添加した。なお、前記アフラトキシン生産阻害剤は、メタノール−塩酸（容量比＝１００：０．００９）溶液２０μＬとして添加した。
前記三角フラスコに、前記アフラトキシン生産菌の胞子懸濁液を、１０μＬ（１．９×１０^４ＣＦＵ）ずつ植菌し、これを、２７℃で５日間静置培養した。その後、培養液をガーゼでろ過し、菌体と培養上清とをそれぞれ回収した。
アフラトキシンの含まれる培養上清７ｍＬを、クロロホルム７ｍＬで３回抽出し、得られたクロロホルム層をあわせてエバポレータで濃縮した。濃縮された残渣を、テトラヒドロフラン−１Ｍ酢酸（容量比＝２０：８０）溶液１ｍＬに溶解し、ＨＰＬＣカラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−２、直径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、Ｎａｃａｌａｉ製）を用い、移動層としてテトラヒドロフラン−水（容量比＝２０：８０）を用い、流速１．０ｍＬ／分、検出波長３６５ｎｍでＨＰＬＣ分析を行い、アフラトキシン量を定量した。アフラトキシン量は、アフラトキシンＢ_１及びＢ_２のピーク面積をそれぞれ算出し、これらの合計値とした。結果を表５に示す。

−アフラトキシン生産菌の生育の評価−
前記アフラトキシン生産阻害活性の測定において、ろ過した菌体を、ろ過に用いた前記ガーゼとともに、乾いた脱脂綿４ｇを底につめた遠心管（５０ｍＬ）に入れ、８００ｇで５分間遠心分離を行った後、菌体と前記ガーゼの合計重量、及び前記ガーゼのみの重量を測定した。測定された菌体と前記ガーゼの合計重量、から前記ガーゼのみの重量を差し引いた値を菌体重量とし、該菌体重量から前記アフラトキシン生産菌の生育を評価した。結果を表５に示す。

＊１：アフラトキシンＢ_１、Ｂ_２の合計量である。
＊２：培養液１０ｍＬあたりの重量に換算した値である。

表５から、本発明のアフラトキシン生産阻害剤である前記ジオクタチン化合物は、濃度依存的にアフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を阻害し、その阻害活性はＩＣ_５０値が０．１７μｇ／ｍＬ（０．４３μＭ）と強いものであることがわかった。一方、アフラトキシン生産菌の菌体重量は、前記アフラトキシン生産阻害剤を、アフラトキシン生産がほぼ完全に抑えられる５μｇ／ｍＬ(１３μＭ)添加した場合であっても、無添加の場合との差異が認められず、生育を抑制しないことが明らかになった。これらの結果から、前記アフラトキシン生産阻害剤は、アフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を特異的に阻害することがわかった。

（比較例１）
前記ジオクタチン化合物は、ＤＰＰII阻害剤として知られている。そこで、ラット由来の他のＤＰＰIIの強力な阻害剤として知られるＯｒｎ‐Ｐｉｐ（比較例１）、及びＤａｂ‐Ｐｉｐ（比較例２）について、それぞれ実施例１と同様にして、アフラトキシン生産阻害活性、及びアフラトキシン生産菌の生育の評価を行った。
この結果、Ｏｒｎ‐Ｐｉｐ、及びＤａｂ‐Ｐｉｐのいずれも、前記アフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を、２０μｇ／ｍＬ（５０μＭ）の高濃度添加した場合においても全く阻害しなかった。一方、同濃度でのアフラトキシン生産菌の生育阻害は観察されなかった。

（実施例３）
生ピーナッツ１粒（約０．６ｇ）をバイアル（直径１６．５ｍｍ×高さ４０ｍｍ）に入れ、蒸留水０．５ｍＬを加えたものを用意し、ここに実施例１で調製したジオクタチンＡを添加した。前記ジオクタチンＡの濃度は、前記生ピーナッツ及び蒸留水の合計重量（約１．１ｇ）に対し、１０μｇ／ｇ又は３０μｇ／ｇとなるように調製した前記ジオクタチンＡのメタノール−塩酸（１００：０．９）溶液として添加した。前記ジオクタチンＡ無添加のコントロールとしては、メタノール−塩酸（１００：０．９）溶液９μＬを添加した。

前記各バイアルの開口部をアルミホイルで覆い、１２０℃で１５分間オートクレーブした後、実施例１と同様にして調製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ ＮＲＲＬ２９９９の胞子懸濁液を、前記バイアル１個につき１０μＬ(１．９×１０^４ＣＦＵ)ずつ植菌した。これらを２７℃で４日間静置培養したところ、前記各バイアル内の前記ピーナッツの表面はカビの菌糸で完全に覆われていた。なお、カビの成育状況は前記ジオクタチンＡの添加の有無によらず良好であった。

表面にカビが成育した前記各ピーナッツを、クロロホルム５ｍＬを添加してスパーテルでよく潰した。前記ピーナッツの破砕物をろ過により除き、得られたクロロホルム溶液を濃縮した後、残渣にテトラヒドロフラン−１Ｍ酢酸（２０：８０）溶液５ｍＬを加え、ＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−２、直径４．６ｍｍ、１５０ｍｍ（ナカライ社製）、移動層：テトラヒドロフラン−水（２０：８０）、流速：１．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ３６５ｎｍ）にて分析した。アフラトキシンＢ_１、及びアフラトキシンＢ_２の量を、ピーク面積よりそれぞれ算出し、それらを合計したものをアフラトキシン量とした。
前記ジオクタチンＡの添加量と、前記アフラトキシン量とから、前記ジオクタチンＡのアフラトキシン生産に対する阻害活性を求めた。結果を表６に示す。

※１：約１．１ｇ
※２：アフラトキシンＢ_１、及びアフラトキシンＢ_２の合計生産量
※３：ｎ＝３の平均値
※４：ｎ＝２の平均値

表６の結果から、アフラトキシン生産量は、ジオクタチンＡを添加しなかった場合に比べ、ジオクタチンＡを１０μｇ／ｇ添加した場合には１／１０以下に低下し、ジオクタチンＡを３０μｇ／ｇ添加した場合には１／１００程度まで低下することがわかった。このことからジオクタチンＡは、アフラトキシン生産菌の生育に影響を与えることなく、アフラトキシン生産を特異的かつ効果的に阻害することが明らかになった。

（実施例４）
＜アフラトキシン生産阻害剤の製造（２）＞
以下の方法により、天然型の立体構造のジオクタチンＢを合成した。
＜＜〔１〕（Ｓ）−３−アミノオクタン酸の合成＞＞
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミン １０ｍＬを、１５０ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解し、ドライアイス−アセトンで冷却し、窒素気流下でブチルリチウム１．６Ｍヘキサン溶液２８ｍＬを滴下した。ドライアイス−アセトン冷却下３０分攪拌した後、２−オクテン酸エチルエステル５．２ｍＬをテトラヒドロフラン２０ｍＬに溶かした溶液を滴下し、さらに２時間ドライアイス−アセトン冷却下に攪拌した。
次に、塩化アンモンの飽和水溶液４０ｍＬを加えて攪拌し、得られた反応液をロータリーエバポレーターで濃縮して大半のテトラヒドロフランを留去した後、クロロホルムで２回抽出を行った。クロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮すると付加体と過剰にあったＳ−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミンの混合物が得られ、これをヘキサンに溶解し、ヘキサンで充填した２００ｍＬのシリカゲルカラムに注入し、ヘキサン、次いでヘキサン−エーテル５０：３で展開し、ＵＶ吸収でモニターして最初に出てくるＵＶ吸収を示す分画を集めて濃縮し、６．２ｇの付加体を得た。

得られた前記付加体を、水１６ｍＬ、酢酸４ｍＬ、及びメタノール８０ｍＬの混合液にとかし、１０％水酸化パラジウム−炭素８８０ｍｇを加え、水素圧４０ｐｓｉで１６時間還元し、３−アミノオクタン酸エチルエステルとした。触媒を濾過して除き、残渣を濃縮した後、４Ｎ塩酸６０ｍＬを加えて８０℃１６時間加水分解した。
反応液を濃縮し、大部分の塩酸を除去した後、水に溶かしてイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０（Ｈ型）１００ｍＬカラムに吸着させ、水洗後、２Ｎアンモニア水で溶出した。
得られた溶出液を分画し、ニンヒドリン反応陽性の分画を集め濃縮乾固した結果、１．９ｇの（Ｓ）−３−アミノオクタン酸が無色固体として得られた。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２１ ＋２９．１ （ｃ＝１、Ｈ_２Ｏ）
文献値：［α］_Ｄ ^２１＋３１．１ （ｃ＝１．１１、Ｈ_２Ｏ）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３４巻４５５−４５６頁（１９９５年）
NMR (D2O)400MHz 0.7(3H,t)1.1〜1.3(6H,m)1.5(2H,q)2.25(1H,q)2.4(1H,q)3.3(1H,m)

＜＜〔２〕（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタン酸の合成＞＞
前記〔１〕で得た（Ｓ）−３−アミノオクタン酸９３０ｍｇを、水５．８４ｍＬ、ジオキサン５．８４ｍＬに溶解し、１ＭＮａＯＨ５．８４ｍＬとＢｏｃ２Ｏ １４０７ｍｇの５．８４ｍＬジオキサン溶液を氷冷攪拌下に交互に加えた。室温で１時間攪拌後減圧濃縮し、５％ＫＨＳＯ４水溶液でｐＨを３にして、酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を水洗後無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して残渣を１夜冷蔵すると固化させて、（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタン酸を得た。収量は１４７２ｍｇであった。分析値を以下に示す。

¹H NMR(CDCl3,600MHz) δ0.87(3H,t-like,J=6.9Hz,H-8),1.22-1.37(6H,m),1.43(9H,Boc),1.51(2H,q,H-4),2.55(2H,m,H-2),3.89(1H,mH-3)

＜＜〔３〕（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−Ｌ−トレオニン メチルエステルの合成＞＞
前記〔２〕で得た（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタン酸 ５８０ｍｇ、Ｌ−トレオニン メチルエステル塩酸塩４２０ｍｇ、Ｂｏｐ試薬１０８９ｍｇ、ＨＯＢｔ３３３ｍｇを脱水ＤＭＦ４．５ｍＬに溶解し、氷冷攪拌下トリエチルアミン０．９７ｍＬを加え３０分氷冷下攪拌後、室温で１夜攪拌した。得られた反応液に７０ｍＬの酢酸エチルを加え、１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル−ヘキサンで結晶化させて（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−Ｌ−トレオニン メチルエステルを得た。収量は５４４ｍｇであった。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２１ ＝−１４．８ （ｃ＝０．５、クロロホルムーメタノール１：１）
ｎｍｒ CDCl3 400MHz
0.9(3H,t),1.2(threonine−Me、3H,d)1.25−1.6(10H,m),1.45(Boc,9H,s)

＜＜〔４〕（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルの合成＞＞
前記〔３〕で得た（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−Ｌ−トレオニン メチルエステル５０８ｍｇを塩化メチレン１４ｍＬに溶解し、塩化メタンスルフォニル１９５ｍｇを加えた。さらに氷冷攪拌下トリエチルアミン０．９９ｍＬを滴下した。１夜室温で攪拌した後、酢酸エチル７０ｍＬを加え、１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して４６８ｍｇの固体（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルを得た。分析値を以下に示す。

¹H NMR(CDCl3,600MHz) δ0.86(3H,t-like,J=7.0Hz,H-8),1.42(9H,s,Boc),1.21-1.38(6H,m,H-5,6,7),1.55(2H,m,H-4),1.76(3H d,J=7.3Hz CH3-CH=),2.48-2.61(2H,mH-2),3.75(3H s COOCH3) 3.83-3.91(1H,m,H-3),7.1(1H q,J=7.2 CH3-CH=)

＜＜〔５〕（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルの合成＞＞
前記〔４〕で得た（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステル２１５．８ｍｇを４Ｍ塩酸・ジオキサン４ｍＬに溶解し、室温１時間反応させＢｏｃ基を除去する。反応液を減圧濃縮乾固し、これに前記〔３〕（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタン酸で得た１７２．７ｍｇ、Ｂｏｐ試薬２９７ｍｇ、ＨＯＢｔ８２．８ｍｇを加え、脱水ＤＭＦ２ｍＬ、塩化メチレン ３ｍＬに溶解し、氷冷攪拌下トリエチルアミン０．２８ｍＬを加え３０分後から室温で１夜攪拌した。得られた反応液はゲル化するが、これにクロロホルム７０ｍＬ加えて溶解し、１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して３９９ｍｇの粗生成物を得た。
前記粗生成物を少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填した４０ｍＬのシリカゲルカラムに注ぎ、クロロホルム、次いでクロロホルム：メタノール ４０：１で展開しＵＶ吸収をモニターして目的物を含む分画を集めて減圧濃縮し、２８４ｍｇの（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルを得た。分析値を以下に示す。

¹H NMR(CDCl3,600MHz) δ0.90(6H,t-like,J=6.8Hz,H-8),1.43(9H,s,Boc),1.31(12H,m,H-5,6,7),1.55(4H,m,H-4),1.75(3H d,J=7.4Hz CH3-CH=),2.31(2H,m H-2),3.75(3H s COOCH3) 3.83-3.91(2H,m,H-3),6.76(1H q,J=7.2 CH3-CH=)

＜＜〔６〕ジオクタチンＢの合成＞＞
前記〔５〕で得た（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステル１７８．３ｍｇを、１２ｍＬのメタノールに溶解し、水酸化リチウムの１Ｍ水溶液１．４３３ｍＬを加えて１夜室温で攪拌した。１Ｍ塩酸１．４４３ｍＬを加えて中和し、減圧濃縮して乾固した。これにＴＦＡ５ｍＬを加えて室温１時間反応させ、次に減圧濃縮した。残渣をメタノール９ｍＬに溶解し２Ｍアンモニア水で中和して室温で１夜静置するとジオクタチンＢが析出し、これを濾過して５４．６ｍｇを得た。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２５＝＋１４．６ （ｃ＝１、ＡｃＯＨ）
文献値：＋１５．０
ｎｍｒ（３．４ｍｇに２Ｎ塩酸２滴を加えてメタノールに溶解後減圧濃縮乾固、残渣を６ｄＤＭＳＯに溶解して測定した）
¹H NMR(DMSO,400MHz) δ0.85(3H t J=7.0),0.87(3H t J=7.0),1.25(16H,m),1.49(2H,m)1.64(3H d,J=7.0 CH3-CH=),2.36(2H,m)2.41(2H,m),3.23(1H,d like,J=3.3Hz)3.36(1H m),6.50(1H,q J=7.0Hz,CH3-CH=)
¹³C NMR(D₂O,400MHz) δ168.75,168.40,165.46,131.41,128.50,48.12,46.08,40.50,37.26,33.47,31.85,31.00,30.88,24.92,23.92,21.91,21.74,13.80,13.72,13.42

（実施例５）
＜アフラトキシン生産阻害剤の製造（３）＞
以下の方法により、天然型の立体構造のジオクタチンＡを合成した。
＜＜〔１〕（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸の合成＞＞
Ｓ−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミン １０ｍＬを１５０ｍＬの脱水テトラヒドロフランに溶解し、ドライアイス−アセトンで冷却し、窒素気流下でブチルリチウム１．６Ｍヘキサン溶液２８ｍＬを滴下した。ドライアイス−アセトン冷却下３０分攪拌し、次に２−オクテン酸エチルエステル５．２ｍＬをテトラヒドロフラン２０ｍＬに溶かした溶液を滴下し、さらに２時間ドライアイス−アセトン冷却下に攪拌する。
次いでヨウ化メチル１６．７５ｇを滴下し、遮光して１時間冷却下攪拌した後、ドライアイス−アセトン浴を外して室温で１夜攪拌した。
得られた反応液をロータリーエバポレーターで濃縮して大半のテトラヒドロフランを留去した後、蒸クロロホルムで２回抽出した。クロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮して、付加体と過剰のＳ−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエチルアミンの混合物を得た。これをヘキサンに溶解し、２００ｍＬのヘキサンで充填したシリカゲルカラムに注入し、ヘキサン、次いでヘキサン−エーテル５０：３で展開しＵＶ吸収でモニターし、最初に出てくるＵＶ吸収を示す分画を集めて濃縮して６．９２ｇの付加体を得た。

得られた前記付加体を、水１６ｍＬ、酢酸４ｍＬ、及びメタノール８０ｍＬの混合液にとかし、１０％水酸化パラジウムー炭素９８８ｍｇを加え水素圧４５ｐｓｉで１６時間還元して、（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸エチルエステルを得た。触媒を濾過して除き、残渣を濃縮した後４Ｎ塩酸６０ｍＬを加えて８０℃１６時間加水分解した。
得られた反応液を濃縮して大部分の塩酸を除去した後、水に溶かしてイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０（Ｈ型）１００ｍＬカラムに吸着させ、水洗後、２Ｎアンモニア水で溶出した。溶出液を分画し、ニンヒドリン反応陽性の分画を集め濃縮乾固して３．７２ｇの（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸の立体異性体混合物が淡黄色の粘重な油状物質として得られた。

＜＜〔２〕（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸の立体異性体混合物の分離＞＞
前記〔１〕の粗（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸混合物を水２００ｍＬ、酢酸２ｍＬの混液に溶かしピリジン・酢酸緩衝液（ピリジン３２ｍＬ、酢酸６０ｍＬを水で１Ｌにする）で平衡化したＤｏｗｅｘ５０Ｗｘ４（２００−４００メッシュ）の１９ｍｍ径、高さ１１３ｃｍのカラムに注ぎ、同じ緩衝液で展開して１５ｇ毎に分画した。溶出液分画をニンヒドリン呈色で分析して陽性の分画５９〜６８、６９〜７２、及び７３〜８０をそれぞれ減圧濃縮乾固して３４７ｍｇ、１２３ｍｇ、２８９ｍｇの無色〜淡黄色固体を得た。それぞれを重水に溶かしｎｍｒを測定した。分画５９〜６８と７３〜８０とはそれぞれ異なり６９〜７２はそれらの混合物であった。

前記分画５９〜６８から得られた物質（以後（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸１型と呼ぶ）の分析値を以下に示す。
ｎｍｒ（Ｄ２Ｏ） δ ０．７３（３Ｈ，ｍ），１．１（３Ｈ，ｄ），１．１５〜１．３（６Ｈ，ｍ）１．５１（２Ｈ，ｍ），２．４７（２Ｈ，ｍ），３．２（１Ｈ，ｑ）

前記分画７３〜８０から得られた物質（以後（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸２型と呼ぶ）の分析値を以下に示す。
[α]²⁵ _D +5.28 (c1.05,MeOH)
ESI MS m/z 174.15[M+H]^+
1H NMR(D₂O,600MHz) δ0.90(3H,t-like,J=7.8Hz,H-8),1.19(3H,d,J=7.6Hz,H-9),1.34(4H,m,H-6,7),1.39(1H,m,H-5a),1.44(1H,m,H-5b),1.66(2H,m,H-4),2.60(1H,dq,J=5.2,7.6Hz,H-2),3.43(1H,dt,J=7.4,5.2Hz,H-3)
¹³C NMR(D₂O,600MHz)δ14.7,15.8,21.0,35.0,45.6,56.1,185.1

＜＜〔３〕Ｂｏｃ−（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸２型の合成＞＞
前記〔２〕で得た（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸２型４２０ｍｇを水２．１ｍＬ、ジオキサン２．１ｍＬに溶解し、１ＭＮａＯＨ２．１ｍＬとＢｏｃ_­２Ｏ ５０４ｍｇの２．１ｍＬジオキサン溶液を氷冷攪拌下に交互に加えた。室温で１時間攪拌後減圧濃縮し、５％ＫＨＳＯ４水溶液でｐＨを３にして、酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を水洗後無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して残渣を１夜冷蔵すると固化し、Ｂｏｃ−（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタン酸２型を得た。収量は２３８ｍｇであった。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２５＝−１４．５８ （ｃ＝１、ＥｔＯＡｃ）
¹H NMR(CDCl3,600MHz) δ0.88(3H,t,J=6.9),1.17(3H,d,J=7.2Hz),1.31(6H,m),1.44(9H,s)Boc,1.51(2H,m)4-CH2,2.68(1H,br s)2-CH2,3.80(1H,br,s)3-CH-NHBoc,4.74(1H,br,s)NH,

＜＜〔４〕Ｂｏｃ−（３Ｓ）−３Ｓ−３−アミノ−２−メチルオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルの合成＞＞
実施例５の前記〔４〕で得た（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルを、４Ｍ塩酸・ジオキサン６ｍＬに溶解し室温１時間反応させ、Ｂｏｃ基を除去した。反応液を減圧濃縮乾固し、これに３１４．７ｍｇ、前記〔３〕で得た（３Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ−２−メチルオクタン酸２型 ２６４ｍｇ、Ｂｏｐ試薬４３１ｍｇ、ＨＯＢｔ１３２．６ｍｇを加え、脱水ＤＭＦ３ｍＬ、塩化メチレン ４ｍＬに溶解し、氷冷攪拌下トリエチルアミン０．４０８ｍＬを加えた。
氷冷攪拌下攪拌３０分後から室温で１夜攪拌した。得られた反応液はゲル化するがこれにクロロホルム１００ｍＬ加えて溶解し、１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮すると９５６．４ｍｇの粗生成物を得た。これを少量のクロロホルムに溶解しクロロホルムで充填した４０ｍＬのシリカゲルカラムに注ぎ、クロロホルム、次いでクロロホルム：メタノール ３０：１で展開しＵＶ吸収をモニターして目的物を含む分画を集め、減圧濃縮して４１３．９ｍｇのＢｏｃ−（３Ｓ）−３Ｓ−３−アミノ−２−メチルオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステルを得た。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２５＝−０．９ （ｃ＝１、メタノール）
¹H NMR(4d-MeOH,400MHz) δ0.89(3H,t-like,J=6.9Hz),0.90(3H,t-like,J=6.5Hz),1.09(3H,d,J=7.0Hz,CH3-CH-CO,H-9),1.31(10H,m,),1.75(3H,d,CH3-CH=),1.43(9H,s,Boc),2.26(1H,m),2.48(2H,m),3.63(1H,m),3.73(3H,s,COOCH3),4.21(1H,m)6.76(1H,q,J=7.1CH3-CH=)

＜＜〔５〕ジオクタチンＡの合成＞＞
前記〔４〕で得たＢｏｃ−（３Ｓ）−３−アミノ−２−メチルオクタノイル−（Ｓ）−３−アミノオクタノイル−２−アミノ−２−ブテン酸 メチルエステル４１３．９ｍｇをメタノール４０ｍＬに溶解し水酸化リチウムの１Ｍ水溶液３．９１６ｍＬを加えて１夜室温で攪拌した。１Ｍ塩酸３．９１６ｍＬを加えて中和し、減圧濃縮して乾固した。これにＴＦＡ１０ｍＬを加えて室温１時間反応させ、再び減圧濃縮した。残渣をメタノール２０ｍＬに溶解し２Ｍアンモニア水で中和して室温で１夜静置するとジオクタチンＡが析出し、これを濾過して１０１．９ｍｇを得た。分析値を以下に示す。

［α］_Ｄ ^２５＝−２．２ （ｃ＝１、ＡｃＯＨ）
ｎｍｒ（５．５ｍｇを１Ｍ塩酸２０μＬを含むメタノール１ｍＬに溶解後蒸発乾固したものを６ｄ−ＤＭＳＯに溶解して測定した）
¹H NMR(DMSO,400MHz) δ0.84(3H,t-like,J=6.7Hz),0.87(3H,t-like,J=6.8Hz),1.06(3H,m,CH3-CH-CO,),1.24(10H,m,),1.63(3H,d,J=7.1Hz,CH3-CH=),2.35(2H,m),2.54(1H,m),3.16(1H,m),3.41(2H,m)4.06(1H,br s.),6.49(1H,q,J=7.1 CH3-CH=)
¹³C NMR(DMSO,400MHz) δ172.8,168.7,165.5,131.3,128.5,52.4,46.0,40.7,40.4,33.5,31.0,31.0,30.7,24.9,23.6,21.9,21.8,13.8,13.7,13.7,13.5

（実施例６）
＜アフラトキシン生産阻害の評価（２）＞
実施例４で合成したジオクタチンＢ、及び実施例５で合成したジオクタチンＡについて、アフラトキシン生産阻害活性を評価した。
アフラトキシン生産菌の胞子懸濁液は、実施例２と同様にして調製した。

−アフラトキシン生産阻害剤活性の測定−
オートクレーブしたＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社製）１ｍＬに各アフラトキシン生産阻害剤を、０〜２０μｇ／ｍＬとなるように無菌的に添加したものに、前記アフラトキシン生産菌の胞子懸濁液を、１０μＬ（１．９×１０^４ＣＦＵ）ずつ植菌し、これを、２７℃で３日間静置培養した。その際、培養容器として２４ウェルプレート（IWAKI製）を使用し、各アフラトキシン生産阻害剤は、メタノール−塩酸（容量比＝１００：０．００９）溶液２０μＬとして添加した。
得られた各培養液５０μＬを蒸留水で１０００倍希釈し、希釈液５０μＬに含まれるアフラトキシン（アフラトキシンB₁,B₂,G₁,G₂の合計）量を市販のELISAキット（RIDASCREEN FAST Aflatoxin, r-biopharm社製）で定量した。実験は三連で行い、各濃度の阻害剤を添加して得られた培養液３サンプルに含まれるアフラトキシン量の平均（Ｂ）、無添加の場合のアフラトキシン量（Ａ）より阻害％[(（Ａ）−（Ｂ）)／（Ａ）×１００]を算出した。得られた各濃度での阻害％をもとに表に示したＩＣ_５０値（５０％阻害濃度）を計算した。結果を表７に示す。

表７の結果から、合成により得た天然型の立体構造のジオクタチンからなるアフラトキシン生産阻害剤は、優れたアフラトキシン生産阻害活性を示すことがわかった。

本発明のアフラトキシン生産阻害剤は、アフラトキシン生産を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高いため、アフラトキシン生産菌が付着乃至感染した各種対象物に投与することにより、簡便にアフラトキシン生産を阻害することができ、本発明のアフラトキシン汚染防除方法に好適に用いられ、特に、植物体、及び農作物に対するアフラトキシン汚染防除方法に好適である。

図１は、ジオクタチンＡの臭化カリウム錠による赤外部吸収スペクトルのチャートであり、横軸に波数（ｃｍ^−１）、縦軸に透過率（％）を示す。 図２は、ジオクタチンＢの臭化カリウム錠による赤外部吸収スペクトルのチャートであり、横軸に波数（ｃｍ^−１）、縦軸に透過率（％）を示す。 図３は、ジオクタチンＡ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートであり、横軸に化学シフト（ｐｐｍ）を表す。内部標準は、テトラメチルシランである。 図４は、ジオクタチンＢ塩酸塩の重水素化ジメチルスルホキシド中の４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートであり、横軸に化学シフト（ｐｐｍ）を表す。内部標準は、テトラメチルシランである。

Claims (6)

1. 下記構造式（Ｉ）で表されるジオクタチン、及びその塩の少なくともいずれかを有効成分とし、前記塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩の少なくともいずれかであることを特徴とするアフラトキシン生産阻害剤。
   ただし、前記構造式（Ｉ）中、Ｒは水素、及びメチル基のいずれかを表す。
2. ジオクタチンが、下記構造式（ＩＩ）で表されるジオクタチンＡである請求項１に記載のアフラトキシン生産阻害剤。
   
3. ジオクタチンが、下記構造式（ＩＩＩ）で表されるジオクタチンＢである請求項１に記載のアフラトキシン生産阻害剤。
   
4. 下記構造式（ＩＩ）で表されるジオクタチンＡ及び下記構造式（ＩＩＩ）で表されるジオクタチンＢのいずれかを化学合成により合成する工程を含むアフラトキシン生産阻害剤の製造方法であって、
   前記ジオクタチンＡが、３−アミノオクタン酸、３−アミノ−２−メチルオクタン酸、及びトレオニンからペプチドＡを合成し、前記ペプチドＡを脱水反応することにより合成され、
   前記ジオクタチンＢが、３−アミノオクタン酸及びトレオニンからペプチドＢを合成し、前記ペプチドＢを脱水反応することにより合成されることを特徴とするアフラトキシン生産阻害剤の製造方法。
   
5. 請求項１から３のいずれかに記載のアフラトキシン生産阻害剤を用い、アフラトキシン生産菌によるアフラトキシン生産を阻害することを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法。
6. アフラトキシン生産阻害剤を、農作物に投与し、該農作物に感染したアフラトキシン生産菌のアフラトキシン生産を阻害する請求項５に記載のアフラトキシン汚染防除方法。