JP5165320B2 - 骨再生能を有する骨補填材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン（Silanol Polyhedral Oligomeric Silsesquioxane）とアテロコラーゲンより成るゾル状またはゲル状の複合体を、骨欠損部に填入して骨再生を図ることができる、骨再生能を有する骨補填材の製造方法に関するものである。

骨折、抜歯窩および骨が著しく吸収された場合など、骨の再生を促進する生体材料として、一般にチタンなどの金属、ハイドロキシアパタイトなどの無機生体材料や、骨に含まれるマトリックスタンパクなどが使用されている。無機生体材料は、機械的強度が高いものの、生体で吸収されないため異物反応を起こすことなどの指摘がなされている。

骨を形成する骨芽細胞の細胞膜は、自らが分泌した骨マトリックスとは強固に結合し、骨形成を行う。生体を構成する物質ではない無機材料表面には、骨芽細胞と結合するタンパクがないために、無機材料と結合力が弱く、その表面に新生骨を合成しにくいなどの問題があることが指摘されている。

骨マトリックスタンパクの約９０％は、コラーゲンとオステオネクチンや骨燐タンパクなどの非コラーゲン性タンパクで構成されている。コラーゲンは骨マトリックスのフレームワークを構成しており、石灰化にも重要な役割を果たしており、また、コラーゲンは骨再生の足場 (Ｓｃａｆｆｏｌｄ)として使用されている。

コラーゲンは、新生骨の石灰化を促進することなどから、骨再生の足場として使用されているが、コラーゲンと骨組織に含まれる無機塩との複合体が、骨再生の足場として使用されていることが、下記の特許文献および非特許文献に開示されている。

下記特許文献および非特許文献に記載されたものは、いずれもコラーゲン線維にリン酸およびカルシュウムの結晶を沈着せしめたものである。すなわち、特許文献１には、コラーゲン−リン酸カルシウム複合体が開示され、また非特許文献１には、アパタイトとβ−リン酸三カルシウムの顆粒をコラーゲンと複合化した複合体が開示され、更に、非特許文献２には、ナノハイドロキシアパタイトをコラーゲン線維上に結晶化した複合体が開示されている。これらの骨補填材は、コラーゲンに骨組織が石灰化するために必要な無機塩を供給するための原料となるカルシウムイオンやリン酸イオンを供給し，更に、コラーゲンに機械的強度を与えるために、カルシウムとリン酸の化合物を加えたものである。

特開平７−１０１７０８号公報 Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ，７９，４９５−５０２，１９９７ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６，５２７６−５２８４，２００５

生体の骨再生を目的とした補填材は、骨芽細胞の分化やタンパク合成や無機塩の輸送能を刺激し、新生骨を形成した後に吸収される性質を持つことが望ましい。しかしながら、従来のコラーゲンのみを移植した場合では、高分子であるため異物反応を起こすことや、骨芽細胞への分化誘導能を持たないために、新生骨を形成するために長期間を要し、実際に臨床で応用するためには不都合な点が多いという課題があった。また、コラーゲンと無機塩などを複合体とした骨補填材は、生体に容易に吸収されにくいなどの欠点を持つという課題もあった。

また、前記特許文献１および非特許文献１に記載されたカルシウムとリン酸の化合物が、骨組織の石灰化に際して利用されたという事実はなく、また、非特許文献２に記載されたハイドロキシアパタイトは吸収されにくく、生体内に異物として残留するという課題があった。更に、前記いずれの複合体も、骨細胞との接着性が弱く、且つ骨組織の形成を促進する作用を有していないという課題があった。

本発明は、前記課題を解決すべくなされたもので、骨組織を形成する骨芽細胞に接着性を有すると共に、該骨芽細胞の分化を促進する作用を有するシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを、骨マトリックスの主成分であるコラーゲンの末端ペプチドを切断して、免疫反応性を低くしたアテロコラーゲンに被覆して複合体とした、シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲン複合体を、骨欠損部に填入することにより、骨再生を図ることができる骨再生能を有する骨補填材の製造方法を提供するものである。

本発明は、０．１〜４．５重量％のシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを溶解した有機溶媒溶液中にアテロコラーゲンを浸漬し、然る後、前記アテロコラーゲンを前記溶液中から取出して乾燥させ、前記シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンをアテロコラーゲンに被覆することにより、ゾル状またはゲル状のシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲン複合体とする骨再生能を有する骨補填材の製造方法を提供することにより、上記課題を解決した。

本発明は、骨組織を形成する骨芽細胞に接着性を有すると共に、該骨芽細胞の分化を促進する作用を有するシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを、骨マトリックスの主成分であるコラーゲンの末端ペプチドを切断して、免疫反応性を低くしたアテロコラーゲンに被覆して複合体とした、シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲン複合体とする骨再生能を有する骨補填材の製造方法であって、本発明方法によって得られた骨補填材は、本来骨が再生されないラットの頭頂骨において骨形成能がみられたので、当然人間においても同様の骨形成能を有するものであり、整形外科や歯科の臨床における骨折の治療、顎骨やその他の部位で骨量が減少した時の骨補填材として使用できるものである。また、歯科材用インプラントおよび人工関節の骨補填材としても使用可能である。

本発明は、骨芽細胞の分化を促進する作用を有するシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを、免疫反応を起こしやすいコラーゲン分子の末端ペプチドを切断することにより、通常のコラーゲンよりは免疫反応性が低く、且つ生体の免疫反応を起こしにくいアテロコラーゲンに被覆して、ゾル状またはゲル状のシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲンの複合体を作成し、該複合体を骨欠損部に填入することにより、骨再生を図ることができる骨再生能を有する骨補填材の製造方法に関するものである。

以下、本発明の実施例を図面に基づいて詳細に説明する。本発明骨再生能を有する骨補填材の製造方法の主材となる、多面体オリゴマーシルセスキオキサンは、現在複数のアメリカの会社によって開発され、販売されている。そして本発明においては、特に限定する必要はないが、好ましくは、１９９１年にアメリカ軍によって開発され、１９９８年にアメリカのハイブリッドプラスチックス（Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ）社より、商品名「ＰＯＳＳ」として販売されている多面体オリゴマーシルセスキオキサンを使用することが推奨される。そして、本発明においては、前記ハイブリッドプラスチックス社製の多面体オリゴマーシルセスキオキサン（以下、「ＰＯＳＳ」と略称する）を使用するものとして説明する。

前記ＰＯＳＳは、粒径１ｎｍ程度で、図１の立体構造図に示すように、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉを骨格とした三次元カゴ状構造をした化合物で、ＰＯＳＳのカゴ状構造物の一部のＳｉ−Ｏの酸素部分が、コラーゲンと結合し、露出した官能基Ｒは骨芽細胞と接着する性質を兼ね備えている。

一方、前記ＰＯＳＳのケイ素は様々な物質と置換することが可能で、ＰＯＳＳはアルコールＰＯＳＳ、フェノールＰＯＳＳ、アミンＰＯＳＳ、クロロシランＰＯＳＳ、ハロゲンＰＯＳＳ、エポキシドＰＯＳＳ、エステルＰＯＳＳ、フルオロアルキルＰＯＳＳ、ハロゲン化物ＰＯＳＳ、イソシアン酸塩ＰＯＳＳ、メタクリル酸ＰＯＳＳ、アクリレイトＰＯＳＳ、分子無水ケイ酸ＰＯＳＳ、ニトリルＰＯＳＳ、ノルボルネニールＰＯＳＳ、オレフィンＰＯＳＳ、フォスフィンＰＯＳＳ、ポリマーＰＯＳＳ、シランＰＯＳＳ、シラノールＰＯＳＳ、スチレンＰＯＳＳおよびチオールＰＯＳＳに分類されている。

また、ＰＯＳＳは、無機物（シリコンベース）と有機物（炭素ベース）の双方の特徴を兼ね備えており、このハイブリッド（有機・無機）構造により、既存のポリマー材料の機械特性、耐熱性、光学特性、ガス透過性、難燃性、耐薬品性、細胞接着性等を向上させるという劇的な効果が現れる。

そして、本発明者は、種々テストの結果、前記分類中、ＰＯＳＳのケイ素がシラノールに置換されたシラノールＰＯＳＳを、本発明で採用した。前記本発明で採用するシラノールＰＯＳＳは、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を持ち、生体材料として開発されたもので、低分子であるために生体と異物反応が弱いことが特徴である。シラノールＰＯＳＳの一部の官能基はコラーゲンと結合し、残りの官能基はフリーで線維芽細胞や骨芽細胞に接着する作用を有する。そこで本発明者は、シラノールＰＯＳＳと骨芽細胞の細胞接着性を検証する目的で、以下の実験を行った。

すなわち、直径５ｍｍ・厚さ１ｍｍのチタンディスクを、１重量%シラノールＰＯＳＳを溶解した塩化メチレンより成る有機溶媒溶液に浸漬し、然る後、前記チタンディスクを前記溶液から取出して乾燥させ、シラノールＰＯＳＳ被覆チタンディスクを作成した。次に、ヒト骨芽細胞系細胞を前記シラノールＰＯＳＳ被覆チタンディスク表面に培養を行った。一方、比較のため、ヒト骨芽細胞系細胞を、シラノールＰＯＳＳ溶液に浸漬していない未処理のチタンディスク上に培養した。そして、前記各培養２週間目の蛍光免疫組織化学における写真を図２に示す。図２のａは、シラノールＰＯＳＳを処理していないチタンディスク表面に骨芽系細胞を培養して２週間目の蛍光免疫組織化学における写真。図２のｂは、シラノールＰＯＳＳを処理したチタンディスク表面に骨芽系細胞を培養して２週間目の蛍光免疫組織化学における写真である。

図２の写真から、骨芽系細胞の分化の初期段階ではコラーゲンを発現し、成熟した骨芽細胞に分化をすると、オステオカルシンを多く発現する。培養後２週間目では、シラノールＰＯＳＳを処理したチタンディスクに培養した骨芽細胞系細胞は、シラノールＰＯＳＳを処理しないコラーゲンよりも、オステオカルシンを発現する細胞が多く見られる。これは、シラノールＰＯＳＳが、骨芽細胞の分化を促進したことを示すものである。なお、写真の各色中、青色：細胞の核、赤色：コラーゲンを発現している細胞、緑色：オステオカルシンを発現している細胞、黄色：コラーゲンとオステオカルシンの両方を発現している細胞、をそれぞれ示している。

そして、図２の写真から、前記各培養の結果、未処理のチタンディスク表面よりも、前記シラノールＰＯＳＳを処理したチタンディスク表面の方が、培養細胞が骨芽細胞に分化する割合が高いことを立証することができた。

前記シラノールＰＯＳＳ・チタンディスク表面における培養細胞が、骨芽細胞に分化する割合が高いということは、シラノールＰＯＳＳが約１から２ｎｍのナノサイズの分子で、フリーの官能基の３次元的構造が、骨芽細胞の細胞膜と立体的に適合することによってアンカーリング効果を有し、骨芽細胞と接着する性質を持っていることと、接着した骨芽細胞が分化するために必要な環境を供与する作用があることに起因しているものと推測される。

そこで、本発明者は、前記特性を有するシラノールＰＯＳＳをアテロコラーゲンに被覆して複合体とすれば、骨再生が可能ではないかと判断し、特に限定する必要はないが、好ましくは０．１〜４．５重量％、特に好ましくは０．１〜３．０重量％のシラノールＰＯＳＳを溶解した、塩化メチレン、あるいはエタノール等の有機溶媒溶液中にアテロコラーゲンを浸漬し、然る後、前記アテロコラーゲンを前記溶液中から取出した後、特に限定する必要はないが、好ましくは、濾紙にて余剰の溶液を吸着し、風乾等の乾燥方法により乾燥させ、シラノールＰＯＳＳをアテロコラーゲンに被覆したシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を作成した。なお、５重量％以上のシラノールＰＯＳＳを溶解した塩化メチレン、あるいはエタノール等の有機溶媒溶液中にアテロコラーゲンを浸漬すると、前記アテロコラーゲンの乾燥後に大型の結晶が生じ、生体に異物反応を起こす度合いが高くなるので、本発明には採用できない。

そして、頭頂骨に骨欠損が起きた場合は、骨の再生が行われないことは広く知られているが、本発明者は、本発明製造方法によって得られたシラノールＰＯＳＳをアテロコラーゲンに被覆して複合体としたシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を用いれば、骨再生が可能ではないかと考え、前記シラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を、頭頂骨では骨の再生が行われないラットの骨欠損部に填入して、骨再生能の実験を行った。実験の要領は下記の通りである。

体重１００ｇのラットを用い、麻酔下で該ラットの頭部の皮膚に切開を加え、頭頂骨を露出した。歯科用のダイヤモンドディスクで、生理食塩水を滴下しながら、直径約５ｍｍの円形の骨欠損を形成した。その後、前記骨欠損部に、０．１重量％シラノールＰＯＳＳを溶解した塩化メチレンより成る有機溶媒溶液中に、０．００２gのウシ１型および３型アテロコラーゲンを浸漬し、然る後、前記アテロコラーゲンを前記溶液中から取出した後、濾紙にて余剰の溶液を吸着し、風乾して乾燥させ、該シラノールＰＯＳＳをアテロコラーゲンに被覆して複合体としたシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を填入し、経時的に骨欠損部の組織学的変化を光学顕微鏡下で観察した。なお、前記実験においては、有機溶媒溶液として、塩化メチレンを使用したが、エタノールであってもよく、その他、前記塩化メチレンやエタノールと同一作用を有する有機溶媒溶液の使用が可能である。

前記複合体を骨欠損部に填入した実験結果を、経時的に撮影した光学顕微鏡写真と、対照実験の光学顕微鏡写真とを図３に示す。填入４日目では、シラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体周囲(矢印)には、結合組織細胞が集積した(図３のａ)。填入１週間目では、填入したアテロコラーゲン線維は解離し、且つ解離したスペースには、骨芽細胞の前駆細胞が多く見られる(矢印)(図３のｂ)。填入２週間目では、骨欠損部中央部には骨組織(矢印)が形成され(図３のｃ)、填入３週間目では、骨欠損部には大量の海面骨(矢印)が形成されている(図３のｄ)。更に、填入４週間目では、海面骨は緻密骨(矢印)によって置換された(図３のｅ)。

一方、対照実験において、アテロコラーゲンのみを骨欠損部に填入したものでは、填入後４週間目においても骨欠損部の周囲から少量の海面骨が形成されたに過ぎなかった(図３のｆ)。また、写真として提出していないが、前記複合体を填入しなかったものでは、４週間目においても、骨欠損部には新生骨は全く見られなかった。

以上のことから、骨を形成する骨芽細胞と接着し、分化を促進する作用を有するシラノールＰＯＳＳと、骨を形成する原料となるアテロコラーゲンとの複合体であるシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体は，本来骨再生がされないラットの頭頂骨においても骨再生能があることが確認された。そして、前記実験はラットについてのものであるが、当然人間においても同様の効果があるものと考えられる。

なお、前記実験においては、ゲル状のシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を用いたが、ゾル状のシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を骨欠損部に填入した場合、体温により加温されて、ゲル状のシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体となるので、ゾル状またはゲル状のシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体はいずれも本発明骨再生能を有する骨補填材として採用できる。

更に、一度作成したシラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体を中性緩衝液でゲル状にしたものを作成し、前記ラットの骨欠損部に填入しても、前記と同様の作用を持つことを検証した。

また、実験は行っていないが、末端ペプチドを切断されていない通常のコラーゲンは、骨マトリックスタンパクの主成分であり、且つ骨形成が行われる際に、骨マトリックスの原材料として骨芽細胞に吸収され、再合成されるという特性を有しているので、該特性を有するウシ２型と、４から３０型アテロコラーゲンおよびコラーゲンを、前記アテロコラーゲンの代わりに使用して、シラノールＰＯＳＳ・コラーゲン複合体としても、前記シラノールＰＯＳＳ・アテロコラーゲン複合体と、ほぼ同一の作用を有するものであると考えられる。また、ヒト、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、モルモットおよびヤギの同型アテロコラーゲンおよびコラーゲンも、ほぼ同一の作用を有するものであると推測される。

多面体オリゴマーシルセスキオキサンの立体構造図である。 シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを溶解した有機溶媒溶液に浸漬して処理したチタンディスクと、前記溶液に浸漬処理していないチタンディスクを、ヒト骨芽細胞系細胞と共に培養した比較実験の結果を示す写真である。 シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲン複合体を、およびアテロコラーゲンのみを、それぞれ使用したラットの骨再生実験の結果を示す写真である。

Claims (3)

1. ０．１〜４．５重量％のシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンを溶解した有機溶媒溶液中にアテロコラーゲンを浸漬し、然る後、前記アテロコラーゲンを前記溶液中から取出して乾燥させ、前記シラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサンをアテロコラーゲンに被覆することにより、ゾル状またはゲル状のシラノール多面体オリゴマーシルセスキオキサン・アテロコラーゲン複合体とすることを特徴とする骨再生能を有する骨補填材の製造方法。
2. 請求項１記載の骨再生能を有する骨補填材の製造方法において、アテロコラーゲンが、１から３０型のいずれかである骨再生能を有する骨補填材の製造方法。
   
3. 請求項１記載の骨再生能を有する骨補填材の製造方法において、アテロコラーゲンが、ヒト、ウシ、ブタ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジおよびヤギと同型のアテロコラーゲンである骨再生能を有する骨補填材の製造方法。