JP5162447B2 - アデノウイルスの同定に用いる組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、分子量および塩基組成分析によりアデノウイルスの迅速な同定および定量化のための組成物、キット、ならびに方法を提供する。
本発明は、DARPA/SPO契約4400044016および4400076514における米国政府支援でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
扁桃摘出術中に除去された小児のアデノイド組織由来、および熱性疾患を有する軍隊入隊者由来の細胞系を確立しようと試みた研究者により1953年に最初に単離され、アデノウイルスは急性上気道感染症のよくある原因である。アデノウイルスは天然において広範囲に存在し、トリ、多くの哺乳動物、およびヒトに感染する。2属、アビアデノウイルス(トリ)およびマストアデノウイルス(哺乳動物)がある。以下を含む哺乳動物のアデノウイルスのいくつかの亜群がある:亜群A(血清型12、18、および31)、亜群B(血清型3、7、11、14、21、34、および35)、亜群C(血清型1、2、5、および6)、亜群D(血清型8〜10、13、15、17、19、20、22〜30、32、33、および36〜39)、亜群E(血清型4)、ならびに亜群F〜G(血清型40および41)。
発明は、分子量および塩基組成分析によりアデノウイルスの迅速な同定および定量化のための組成物、キット、ならびに方法を提供する。
本明細書に用いられる場合、「存在量」という用語は量を指す。量は、当業者に周知である「コピー数」、「pfuまたはプレート形成単位」のような分子生物学において一般的である濃度に関して記載されうる。濃度は、既知の標準に対してでありうる、または絶対でありうる。
A. 生物因子同定単位複製配列
本発明は、生物因子同定単位複製配列を用いて未知の生物因子の検出および同定のための方法を提供する。プライマーは、生物因子由来の核酸の保存配列領域にハイブリダイズするように選択され、可変配列領域をくるめて、生物因子同定単位複製配列を生じ、その生物因子同定単位複製配列は増幅されることができ、かつ分子量測定を受け入れられる。分子量は、その後、生物因子の予想されるアイデンティティの予備的知識の必要性なしに生物因子を一意的に同定するための手段を提供する。増幅産物の分子量または対応する塩基組成シグネチャーは、その後、分子量または塩基組成シグネチャーのデータベースに対して一致させられる。分析された増幅産物の実験的に決定された分子量または塩基組成が、既知の生物因子同定単位複製配列の既知の分子量または塩基組成と比較されて、実験的に決定された分子量または塩基組成が、既知の生物因子同定単位複製配列のうちの1つの分子量または塩基組成と同じである場合、一致が得られる。または、実験的に決定された分子量または塩基組成は、既知の生物因子同定単位複製配列の分子量または塩基組成の実験誤差内にあり、なお一致として分類される場合もある。場合によっては、同一出願による、全体として参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第11/073,362号に記載されたモデルのように一致モデルの確率を用いて一致がまた分類されうる。さらになお、方法は、迅速な並列多重分析に適用されることができ、その結果は三角測量同定ストラテジーに用いられうる。本方法は、高速処理能力を提供し、生物因子の検出および同定のために増幅された標的配列の核酸シーケンシングを必要としない。
いくつかの態様において、プライマーは、介在可変領域に隣接する、生物因子同定単位複製配列の保存配列領域に結合し、各個々の生物因子を区別するのに十分な可変性を提供しかつ分子量分析を受け入れられる増幅産物を生じるように設計される。いくつかの態様において、高度に保存された配列領域は、約80〜100%、または約90〜100%、または約95〜100%同一性、または約99〜100%同一性を示す。所与の増幅産物の分子量は、可変領域の可変性によって、それが得られた生物因子を同定する手段を提供する。従って、プライマーの設計は、所与の生物因子のアイデンティティを決定するための十分な可変性を有する可変領域の選択を含む。いくつかの態様において、生物因子同定単位複製配列は、生物因子のアイデンティティに特異的である。
いくつかの態様において、所与の生物因子同定単位複製配列の分子量は、質量分析により測定される。質量分析は、いくつかの利点をもち、それらのうちで重要なことは、電荷に対する質量比(m/z)の幅広い範囲に渡って多くの分子ピークを分離する(および単離する)能力により特徴付けられる高いバンド幅である。従って、質量分析は、あらゆる増幅産物がその分子量により同定されるため、放射性または蛍光標識の必要性なしに、本質的に並列検出スキームである。質量分析における技術の現状は、材料のフェムトモル未満の量が容易に分析されて、試料の分子含有量についての情報を提供することができるほどである。材料の分子量の正確な評価は、試料の分子量が数百であろうが、10万原子質量単位(amu)またはダルトンを超えようがに関わらず、迅速に得られうる。
インテリジェントプライマーを用いて得られた増幅産物の分子量は生物因子の同定のための手段を提供し、分子量データの塩基組成シグネチャーへの変換は特定の分析に有用である。本明細書に用いられる場合、「塩基組成」は生物因子同定単位複製配列の分子量から決定される各核酸塩基(A、T、C、およびG)の正確な数である。いくつかの態様において、塩基組成は、特定の生物体のインデックスを提供する。塩基組成は、既知の生物因子同定単位複製配列の既知の配列から計算することができる、および所与の生物因子同定単位複製配列の分子量を測定し、続いて許容できる実験誤差内で測定された分子量と一致するすべての可能な塩基組成を決定することにより実験的に決定することができる。以下の例は、炭疽菌(Bacillus anthracis)の16S rRNAの1337位に始まる46-mer増幅産物の実験的に得られた分子量からの塩基組成の決定を例証する。増幅産物のフォワード鎖およびリバース鎖は、それぞれ、14208Daおよび14079Daの分子量と測定されている。炭疽菌産物についてのフォワード鎖およびリバース鎖の分子量から導かれる予想される塩基組成は表1に列挙されている。
場合によっては、単一の生物因子同定単位複製配列の分子量のみは、所与の生物因子をあいまいでなく同定するのに十分な分解能を提供しない。生物因子の同定のための複数の生物因子同定単位複製配列の使用は、本明細書では「三角測量同定」と呼ばれる。三角測量同定は、複数のハウスキーピング遺伝子内で選択された複数の生物因子同定単位複製配列の分子量を測定することにより遂行される。この工程は、偽陰性および偽陽性信号を低減させるために用いられ、雑種または操作された生物因子の起源の再構築を可能にする。例えば、炭疽菌ゲノムからの予想されるシグネチャーの非存在下における炭疽菌に特有の3部分からなる毒素遺伝子(Bowen et al., J. Appl. Microbiol., 1999, 87, 270-278)の同定は、遺伝子改変事象を示唆するものと思われる。
本発明のいくつかの態様において、感染性生物体の遺伝子のコドン内の1つまたは複数のヌクレオチド置換は、コドン塩基組成分析により決定されうる生物体に薬剤耐性を与える。生物体は細菌、ウイルス、真菌、または原生動物でありうる。
いくつかの態様において、未知の生物因子のアイデンティティおよび量は、図2に示された過程を用いて測定されうる。プライマー(500)および較正ポリヌクレオチド(505)の既知量を、未知の生物因子の核酸を含む試料に添加する。試料中の全核酸を、その後、増幅反応に供し(510)、増幅産物を得る。増幅産物の分子量を測定し(515)、そこから、分子量および存在量データを得る。生物因子同定単位複製配列の分子量(520)は、その同定のための手段を提供し(525)、較正ポリヌクレオチドから得られた較正単位複製配列の分子量(530)はその同定の手段を提供する(535)。生物因子同定単位複製配列の存在量データを記録し(540)、較正データについての存在量データを記録し(545)、それらの両方を、試料中の未知の生物因子の量を決定する計算に用いる(550)。
本発明の他の態様において、プライマー対は、アデノウイルスの安定でかつ高度に保存された領域内の生物因子同定単位複製配列を産生する。高度に保存された領域の中に含まれるプライミング領域により限定される単位複製配列の特徴付けの利点は、領域がプライマー認識の点を通り越して進化するだろうことが、その場合、増幅段階のプライマーハイブリダイゼーションが失敗するだろうが、低い確率であることである。そのようなプライマーセットは、従って、広範囲調査型プライマーとして有用である。本発明のもう一つの態様において、インテリジェントプライマーは、上記の安定した領域より急速に進化する領域において生物因子同定単位複製配列を産生する。進化するゲノム領域に対応する生物因子同定単位複製配列を特徴付けることの利点は、それが、出現する株変異体を区別するために有用であることである。
本発明はまた、本明細書に記載された方法を行うためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、生物因子由来の標的ポリヌクレオチドに増幅反応を行って生物因子同定単位複製配列を形成するための1つまたは複数のプライマー対の十分な量を含みうる。いくつかの態様において、キットは、1個から50個までのプライマー対、1個から20個までのプライマー対、1個から10個までのプライマー対、または2個から5個までのプライマー対を含みうる。いくつかの態様において、キットは、表2に列挙された1つまたは複数のプライマー対を含みうる。
実施例1:アデノウイルスについての生物因子同定単位複製配列を限定するプライマーの設計および確証
A. プライマー設計の一般的な工程
アデノウイルス同定単位複製配列を限定するプライマーの設計について、一連のアデノウイルスゲノムセグメント配列を取得し、整列させ、PCRプライマー対が約45〜約150ヌクレオチド長の産物を増幅し、かつそれらの分子量または塩基組成により亜群および/または個々の血清型をお互いに区別する領域についてスキャンした。図1に示された典型的な工程は、この型の分析に用いられる。
最初のプライマー設計は、アデノウイルスヘキソン遺伝子のセグメントを代表する生物因子同定単位複製配列を産生しうるプライマー対の設計から始めた。これらのプライマー対は、すべてのアデノウイルス株の一般的な検出から特定の血清型の同定に及ぶ様々な仕事を実行するように設計された。いくつかの態様において、塩基組成は最終的な分析産物であるため、増幅された領域が十分な変異(1つの塩基変化またはそれ以上)を有するとの条件で、1つのプライマー対が多くの血清型を同定するために用いられうる。試験段階の終わりに、2つのプライマー対試験セットを選択した。これらの2つのプライマー対(プライマー対番号:943(SEQ ID NO: 61:122)769(SEQ ID NO: 26:121))は、塩基組成がアデノウイルスの存在を明確に示し、かつ、たいていの場合、同時に、存在するアデノウイルス種の血清型についての診断となる単位複製配列を産生する。2つのプライマー対が存在するアデノウイルスの血清型を明確に同定できない場合、プライマー対番号1113(SEQ ID NO: 38:82)、1117(SEQ ID NO: 63:95)、1119(SEQ ID NO: 19:93)、1121(SEQ ID NO: 54:113)、1124(SEQ ID NO: 36:98)、および1126(SEQ ID NO: 16:106)のいずれかまたは全部のような他のプライマーが、情報を決定するために用いられうる。
試料を、Naval Health Research Center Respiratory Disease Laboratory, San Diegoにより行われたIRB認可研究中の軍隊兵舎から採集した。環境的試料は、8つの場所から採取され、表面スワブならびにドライフィルターユニット空気回収および電子空気収集機により収集された空気試料を含んだ。臨床的調査は、当業者に周知である標準臨床プロトコールを用いて喉、血清、および手スワブから1,700個の臨床試料を得ることにより行われた。
試料を、Qiagen QIAmp Virus BioRobot MDx Kitを用いてウイルスゲノム材料を得るように処理した。結果として生じたゲノム材料をEppendorfサーマルサイクラーを用いて増幅し、単位複製配列を、Bruker Daltonics MicroTOF装置上で特徴付けした。結果として生じたデータを、GenXソフトウェア(SAIC, San Diego, CAおよびIbis, Carlsbad, CA)を用いて分析した。
磁気ビーズに連結されたイオン交換樹脂での核酸の溶液捕獲について、BioCloneアミン末端化超常磁性ビーズの2.5mg/mL懸濁液の25μlを、約10pMの典型的なPCR増幅産物を含む25〜50μlのPCR(またはRT-PCR)反応物へ添加した。上記懸濁液を、約5分間、ボルテックスまたはピペッティングをすることにより混合し、その後、磁気選別機を用いた後に液体を除去した。結合したPCR増幅産物を含むビーズを、その後、50mM重炭酸アンモニウム/50%MeOHまたは100mM重炭酸アンモニウム/50%MeOHで3回、洗浄し、続いて、50%MeOHでもう3回洗浄した。結合したPCR単位複製配列を、ペプチド較正標準を含む、25mMピペリジン、25mMイミダゾール、35%MeOHの溶液で溶出した。
EST-FTICR質量分析計は、能動的に遮蔽された7テスラ超電導磁石を用いるBruker Daltonics (Billerica, MA) Apex II 70eエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計に基づいている。能動遮蔽は、超電導磁石からのフリンジ磁界の大部分を比較的小さな体積に拘束する。従って、CRTモニター、ロボット部品、および他の電子機器のような漂遊磁界により悪影響を受ける可能性がある構成要素が、FTICR分光計と極めて接近して作動できる。パルスシーケンス制御およびデータ収集の全局面は、Windows NT 4.0オペレーティングシステム下でBrukerのXmassソフトウェアを実行する600 MHz Pentium IIデータステーションにおいて行われた。試料アリコート、典型的には15μlを、FTICRデータステーションにより作動されるCTC HTS PAL自動試料採取装置(LEAP Technologies, Carrboro, NC)を用いて96ウェルマイクロタイタープレートから直接的に抽出した。試料を、ESI源へ100μl/時間の流速を供給する流体工学ハンドリングシステムと一体化した10μl試料ループへ直接的に注入した。ガラス脱溶媒キャピラリーの金属化末端から約1.5cmに位置した軸外の接地エレクトロスプレープローブを用いる改変Analytica(Branford, CT)源におけるエレクトロスプレーイオン化によってイオンが形成された。ガラスキャピラリーの大気圧末端に、データ収集中にESI針に対して6000Vでバイアスをかけた。脱溶媒過程を促進するために乾性N2の逆流を用いた。イオンを、それらが質量分析されるトラップイオンセルへの注入の前に、rf-オンリー(rf-only)六重極、スキマーコーン、およびゲート電極で構成される外部イオン貯蔵室に蓄積した。99%より大きいイオン化デューティサイクルは、イオン検出中に同時に外部イオン貯蔵室にイオンを蓄積することにより達成された。各検出事象は、2.3秒間に渡ってデジタル化された1Mのデータ点からなった。信号対雑音比(S/N)を向上させるために、32個のスキャンを、74秒間の総データ収集時間の間、同時付加した。
4つの天然核酸塩基の分子量(A=313.058、G=329.052、C=289.046、T=304.046−表4参照)は比較的狭い分子量範囲を有するため、塩基組成の割当におけるしつこいあいまい性の源泉は、以下のように生じうる:異なる塩基組成を有する2つの核酸鎖は、2つの鎖間の塩基組成の違いがC⇔T(+15.000)と組み合わせられたG⇔A(-15.994)である場合、約1Daの差を有しうる。例えば、A27G30C21T21の塩基組成を有する1つの99-mer核酸鎖は、30779.058の理論的分子量を有し、一方、A26G31C22T20の塩基組成を有するもう一つの99-mer核酸鎖は30780.052の理論的分子量を有する。分子量における1Da差は、分子量測定の実験誤差の範囲内である可能性があり、従って、4つの天然核酸塩基の比較的狭い分子量範囲は、不確実性因子を負わせる。
この一連の実験の目的は、アデノウイルスの環境的存在と軍人における結果として生じる疾患の間の時間的関係、および無症候性運搬の評価を確立することにより軍事施設内のアデノウイルスの伝播を調査することであった。軍事施設において、アデノウイルスは、冬の間、呼吸器疾患の72%の原因であることが測定されている。アデノウイルスは、軍事施設において新兵の間で急速に広がることが知られており、発生は、50〜80%発病率を生じる。
Claims (17)
- SEQ ID NO:26と少なくとも95%配列同一性を有する24〜26核酸塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーと、SEQ ID NO:121と少なくとも95%配列同一性を有する25〜27核酸塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む組成物であって、前記プライマーは、アデノウイルス科の亜群及び血清型を同定することができるプライマー対を形成する、組成物。
- プライマーの一方または両方が少なくとも1つの修飾核酸塩基を含む、請求項1記載の組成物。
- 修飾核酸塩基が5-プロピニルウラシルまたは5-プロピニルシトシンである、請求項2記載の組成物。
- プライマーの一方または両方が少なくとも1つのユニバーサル核酸塩基を含む、請求項1記載の組成物。
- ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項4記載の組成物。
- プライマーの一方または両方が5'末端上に非鋳型性T残基をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- プライマーの一方または両方が少なくとも1つの非鋳型タグを含む、請求項1記載の組成物。
- プライマーの一方または両方が少なくとも1つの分子量改変タグを含む、請求項1記載の組成物。
- 請求項1記載の組成物を含むキット。
- 17〜30核酸塩基の長さであり、かつSEQ ID NO: 61:122、38:82、36:95、19:93、54:113、36:98、および16:106により表されるプライマー対の群由来の対応する要素と95%〜100%配列同一性を有する、1つまたは複数のプライマー対をさらに含む、請求項9記載のキット。
- 少なくとも1つの較正ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項9記載のキット。
- 磁気ビーズに連結された少なくとも1つの陰イオン交換官能基をさらに含む、請求項9記載のキット。
- 以下の段階を含む、試料中のアデノウイルスの同定のための方法:
増幅産物を得るために請求項1記載の組成物を用いて該アデノウイルス由来の核酸を増幅する段階;
該増幅産物の分子量を測定する段階;
任意で、該分子量から該増幅産物の塩基組成を決定する段階;および
該分子量または塩基組成を、既知のアデノウイルス同定単位複製配列の分子量または塩基組成の複数と比較する段階であって、該分子量または塩基組成と該複数の分子量または塩基組成の要素との一致により、該アデノウイルスが同定される段階。 - 試料が生物学的産物である、請求項13記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中のアデノウイルスの存在または非存在を決定する方法:
増幅産物を得るために請求項1記載の組成物を用いて該試料由来の核酸を増幅する段階;
該増幅産物の分子量を測定する段階;
任意で、該分子量から該増幅産物の塩基組成を決定する段階;および
該増幅産物の該分子量または塩基組成を、1つまたは複数の既知のアデノウイルス同定単位複製配列の既知の分子量または塩基組成と比較する段階であって、該増幅産物の該分子量または塩基組成と1つまたは複数の既知のアデノウイルス同定単位複製配列の分子量または塩基組成との一致により、該試料中の該アデノウイルスの存在が示される段階。 - 試料が生物学的産物を含む、請求項15記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中の未知のアデノウイルスの量の測定のための方法:
該試料を請求項1記載の組成物および較正配列を含む較正ポリヌクレオチドの既知量と接触させる段階;
アデノウイルス同定単位複製配列を含む第一増幅産物、および較正単位複製配列を含む第二増幅産物を得るために、該試料中の該未知アデノウイルス由来の核酸および該較正ポリヌクレオチド由来の核酸を請求項1記載の組成物で同時に増幅させる段階;
該アデノウイルス同定単位複製配列および該較正単位複製配列について分子量および存在量を測定する段階;ならびに
分子量に基づいて該アデノウイルス同定単位複製配列と該較正単位複製配列を区別する段階であって、アデノウイルス同定単位複製配列存在量と較正単位複製配列存在量との比較により、該試料中のアデノウイルスの量が示される段階。
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