JP5156017B2 - イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法 - Google Patents
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Description
また、本明細書において「工程」とは、本工程の所期の作用が達成される段階を意味し、複数の段階が時間的に同時に進行する場合など、他の工程と明確にできない場合も、本明細書における工程の概念に含まれる。
本明細書において「vvm」とは、1分間で、液容量の何倍の通気をするかということを示すものであり、例えば、10リッターの培養液に対して、2vvmの通気を行ったとは、毎分20リッターの通気を行ったということを意味するものである。
以下、本発明について説明する。
本発明のイソプロピルアルコール生産細菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産しうるイソプロピルアルコール生産細菌である。
本発明における植物由来原料としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等を好ましく用いることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ(Faecalibacterium prausnitzii)等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス(Coprococcus)属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli:大腸菌)等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)細菌、ズーグロア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)等のズーグロア属細菌、ガルス・ガルス(Gallus gallus)等のガルス属、リゾビウム種(Rhizobium sp.)細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)等のブラディリゾビウム属細菌、ラタス・ノルベギカス(Rattus norvegicus)等のラタス属細菌、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等のカンジダ属細菌、サス・スクロファ(Sus scrofa)等のサス属細菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)等のストレプトマイセス属細菌、ヘリアンサス・アンス(Helianthus annuus)等のヘリアンサス属細菌、ボス・ターラス(Bos taurus)等のボス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、上述した本発明のイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含む。
これにより、他のアルコール類を副生せずに高い純度でイソプロピルアルコールを生産することができる。このため本発明によれば、副生アルコールを分離するための複雑な工程を必要とせずに、簡便に効率よくイソプロピルアルコールを生産することができる。
窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、硝酸体窒素、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。
ポリペプトンは蛋白質を酵素や酸で加水分解したもので、その窒素源は、例えば、日本製薬(株)によるポリペプトンLotO586Aの分析値により僅かながらアンモニア性窒素が生じる例があるものの、全て蛋白質に由来するものであるといえる。ポリペプトンの成分としては、ポリペプトンの全質量に対して、全窒素量12.5質量%〜14.5質量%、アミノ窒素5.0質量%〜6.5質量%、強熱残留物4.0質量%〜7.0質量%、乾燥ロス3.5質量%〜5.5質量%のものが例示される。培地中では通常0.02〜2%(w/w)の範囲で使用され、好ましくは0.1〜1%(w/w)の範囲で使用される。
コーンスティープリカーはとうもろこしの浸漬工程で溶出した可溶性成分と乳酸発酵で生成した成分を含む浸漬液を濃縮したもので、Microbiol. Mol. Biol. Rev., Dec 1948; Vol.12: pp297 - 311.によると、成分としては、コーンスティープリカー全質量に対して、水分45質量%〜55質量%、全窒素量2.7質量%〜4.5質量%、アミノ窒素1.0質量%〜1.8質量%、揮発性窒素0.15質量%〜0.40質量%、還元糖分0.1質量%〜11.0質量%、乳酸5質量%〜15質量%、灰分9質量%〜10質量%、揮発性酸類0.1質量%〜0.3質量%、二酸化硫黄0.009質量%〜0.015質量%のものが例示される。上記成分によれば揮発性窒素として水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物が最大0.40%(w/w)含まれる可能性があるが、もし仮にこの全てがアンモニウムイオンだったとしても、コーンスティープリカーを2%含む培地中ではアンモニウムイオンの含有量は0.008%にしかならない。コーンスティープリカーは培地中では通常0.1〜20%(w/w)の範囲で使用され、好ましくは0.5〜7%(w/w)の範囲で使用される。
酵母エキスはアミノ酸およびその重合体、核酸、ビタミン、有機酸、無機塩からなることが開示されており、BD(Becton, Dickinson and Company)社の酵母エキス分析データ(Catalog#211929、211931、211930)によれば、無機塩としてはカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、クロライド、硫酸、燐酸からなるものが記載されており、アンモニウムイオンを生じうる化合物の記載はない。成分としては、酵母エキス全質量に対して、全窒素量11.4質量%、アミノ窒素6.9質量%、灰分13.1質量%、乾燥ロス1.0質量%、塩化ナトリウム0.2質量%、全無機塩10.5質量%のものが例示される。
本発明に使用される培地としては、水性媒体を基本とする液体培地や、寒天等の固相を基本とする固体培地を挙げることができるが、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。液体培地を構成する水性媒体としては、蒸留水、緩衝液等、通常用いられるものを使用することができる。
前記不活性ガスとしては、N2ガスや、希ガス(例えば、Ar、He、Ne、Kr、又はXe)を、用いることができ、中でも、取り扱いの観点から、N2ガス又はArガスが好ましく、N2ガスがより好ましい。
イソプロピルアルコールと捕捉液との接触は、イソプロピルアルコールが捕捉液に溶解するのに充分な時間行えばよい。イソプロピルアルコールの捕捉液への溶解は水又は上述したような有機溶媒であれば長時間になることはなく、通常2時間程度であれば充分である。
イソプロピルアルコールの捕捉液への溶解を促進させるために、混合物から分離した気体状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを、捕捉液中に直接注入することが好ましい。この注入によりバブリングが生じて、混合物へのイソプロピルアルコールの溶解速度を促進させることができる。
イソプロピルアルコールの液化は、気化又は飛沫化したイソプロピルアルコールの状態を液化することができる方法であればよく、例えばイソプロピルアルコールの相変化に充分な程度の冷却を挙げることができる。このような冷却方法としては、空冷、または冷却した水もしくはアルコール類を用いる方法を挙げることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
生産装置10は、培養槽12とトラップ槽40とを備えており、培養槽12とトラップ槽40とは連結管30で連結されている。培養槽12及びトラップ槽40は、内部の雰囲気が槽の外部へ漏れ出ないように密閉可能とされている。
なお、連結管30には、積極的に連結管30の内部を冷却する冷却器が備えられていてもよい。これにより連結管30を気体が通過する際に、気体を積極的に液化することができる。
本生産装置10の培養槽12に、イソプロピルアルコール生産細菌Bと植物由来原料Mを含む混合物14を、混合物14の液面が注入管16の端部よりも充分に上となる位置まで注入する。攪拌装置20のモータ部22の電源をオンにして、攪拌部24を所定の回転数で回転させる。なお、培養槽12に予め所定量の培地を収容しておき、適温に調整しておいてから、所定の合計量となるように混合物14を添加してもよい。
連結管30を通過する際に、排気中のイソプロピルアルコールの一部は冷やされて液化する。
また、本実施形態の生産装置10に、混合物14又はイソプロピルアルコール生産細菌を培養槽12へ連続的に投入するための投入部や排出部を設けてもよい。これにより、イソプロピルアルコールの連続的な生産が可能となる。
また、本発明の好ましい実施形態では、より精製されたイソプロピルアルコールを連続的に且つ簡便に生産することができる。
[実施例1]
<クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
クロストリジウム属細菌のイソプロピルアルコール生成酵素4種のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼはGenBank accession number AE001437に記載のゲノム配列の相補鎖3005963〜3007364に記載されている。またCoAトランスフェラーゼはGenBank accession number X72831に、アセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。さらにこれら4種の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列は、上記チオラーゼの塩基配列中に存在するチオラーゼプロモーターの配列を使用することができる。
<エシェリヒア・コリpIPA/B株、エシェリヒア・コリB野生株によるイソプロピルアルコール生産>
前培養として14mL容量のプラスチックチューブ(FALCON社製 2057)にアンピシリン0.1g/L、グルコース2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を5mL入れ、実施例1において得られたエシェリヒア・コリpIPA/B株を植菌し、一晩、培養温度37℃、120rpmで振とう培養を行った。またアンピシリンを含まない以外は同様の培地組成並びに培養条件でエシェリヒア・コリB野生株を振とう培養した。各々の前培養液全量を、アンピシリン0.1g/L、グルコース20g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を60mL入れた300mL容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度120rpm、培養温度37℃で行った。培養開始48時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノール、アセトンの蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表1に示す。エシェリヒア・コリpIPA/B株において、培養48時間後で2.1g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpIPA/B株によるイソプロピルアルコール生産(1)>
本実施例では、図1に示される生産装置10を用いて処理を行った。培養槽12には1リットル容のものを使用し、トラップ槽40には500mL容のものを使用した。培養槽12、トラップ槽40、注入管16、連結管30、排出管44は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽40には、トラップ液42としての水(トラップ水)が400mLの量で注入されている。
<エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2324131〜2325315に記載されている。またCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322781に記載されている。これらと共に実施例1記載のクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
なおエシェリヒア・コリMG1655株、Clostridium acetobutylicum ATCC824、エシェリシア・コリB株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(1)>
実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、前培養として三角フラスコに入れたアンピシリン0.1g/Lを含むLB Broth, Miller培養液25mLを用い、実施例4において得られたエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株を接種して、16時間、培養温度35℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養液全量を、グルコース50g/L、アデカノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液475mLを入れた1L培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度500rpm、培養温度35℃で行い、24wt/wt%水酸化ナトリウム溶液を用いて培養液のpHを7.0にコントロールした。培養開始から24時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。培養24時間後で5.5g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また48時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は5.0g/Lであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mLに変更)中の合算値である。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(2)>
実施例5と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、1L培養槽での培養において表3に示す組成の培地475mLを用いた。この時の硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.04質量%である。また50wt/wt%のグルコース水溶液を10g/L/時間の流速で添加した。その結果、培養24時間後で7.4g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また48時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は6.2g/Lであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(3)>
実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、1L培養槽での培養において30時間後に(NH4)2SO4を0.2質量%(2g/L)追加した。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量%の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.08質量%である。その結果、培養24時間後で7.2g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また48時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は13.4g/Lであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。硫酸アンモニウムといった窒素源を適当量加えることで生産性が向上することが示された。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(4)>
実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、1L培養槽での培養における培地組成の内、(NH4)2SO4の量を0.4質量%(4g/L)とした。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.08質量%である。その結果、培養24時間後で11.6g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。硫酸アンモニウムといった窒素源を適当量加えることで生産速度が向上することが示された。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(5)>
実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、1L培養槽での培養における培地組成の内、(NH4)2SO4の量を0.5質量%(5g/L)とした。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.11質量%である。その結果、培養24時間後で11.2g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また55時間後には21.3g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(6)>
実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、pH調整剤は12.5質量%のアンモニア水を使用した。その結果、培養24時間後で13.3g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また55時間後には28.4g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。培養55時間後までに添加した12.5質量%アンモニア水の質量は69.0gであり、本実施例におけるアンモニア水由来の窒素原子の質量%の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.73質量%である。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産(7)>
実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、1L培養槽での培養における培地組成の内、ポリペプトン2g/Lにかわりコーンスティープリカー(日本食品化工製)を20g/L加え、(NH4)2SO4の量を5g/Lとした。その結果、培養24時間後で10.9g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また55時間後には17.8g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量%の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.11質量%である。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。培地栄養源として幅広い成分を利用できることが示された。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpIPA/B株によるイソプロピルアルコール生産(2)>
実施例3と同様な条件で、1L培養槽を使用したpIPA/B株のイソプロピルアルコール培養検討を行った。ただし、培養開始時に(NH4)2SO4を0.5%(5g/L)添加した。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時の培養培地全質量に対して0.11質量%である。その結果、培養48時間後で4.5g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。
<蒸留法による培養液からのイソプロピルアルコールの回収>
蒸留に供する培養液として、実施例3の方法に準じてpIPA/B株を培養し、培養液180gを得た。これを培養液Aとした。培養液A178.6gを200mL容量のナスフラスコに入れ、オイルバスで攪拌しながら加温し、定法に従って単蒸留を行った。培養液Aの各工程における塔頂温度と液量を表4に示す。蒸留前の培養液と蒸留により分取した液及び残液の中に含まれるイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの含有量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表5に示す。本実施例にかかるpIPA/B株を培養した培養液からは、塔頂温度99.1〜99.5℃で含有するイソプロピルアルコールの殆ど全てを回収することができた。この時、分取した液からブタノール及びエタノールは検出されなかった。
特開昭61−67493号公報に記載のクロストリジウム・sp.172CY−02株の培養液組成を模し、LB Broth,Miller培養液にn−ブタノール9.9g/L、エタノール0.6g/L、イソプロピルアルコール7.2g/Lを加えた培養液を180g調製し、これを比較培養液Bとした。比較培養液B177.9gを200mL容量のナスフラスコに入れ、オイルバスで攪拌しながら加温し、定法に従って単蒸留を行った。比較培養液Bの各工程における塔頂温度と液量を表4に示す。蒸留前の液と蒸留により分取した液及び残液の中に含まれるイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの含有量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表5に示す。比較培養液Bでは、3種の混合アルコール成分のうち特にイソプロピルアルコールとブタノールが同じ留出挙動を示し、イソプロピルアルコールのみを分離して回収することはできなかった。
本実施例では、図1に示される生産装置10を用いて処理を行った。培養槽12には1リットル容のものを使用し、トラップ槽40には500mL容のものを使用した。培養槽12、トラップ槽40、注入管16、連結管30、排出管44は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽40には、トラップ液42としての水(トラップ水)が400mLの量で注入されている。
次いで、注入管16から、空気を0.5L/min(1vvm)の速度でイソプロピルアルコール水溶液に注入し、処理を開始した。培養槽12からの排気は、トラップ槽40中のトラップ液42にバブリングさせた。トラップ槽40からの排気は装置系外の空気中に放出した。処理開始から0,2,4,8,24時間後に培養槽12内の処理液とトラップ槽40内のトラップ液42を各々サンプリングし、HPLC測定によりサンプル中のイソプロピルアルコールの蓄積量を測定した。なお、HPLC測定は、信和化工社製、ULTRON PS−80H(8.0mm ID、300mm L)を用い、溶離液として0.1% HClO4を用い、流速を1.0mL/min、カラム温度を50℃とし、検出器は示差屈折率検出器(RI)を用いて行った。結果を表6に示す。
従って、培養槽12内での通気培養の排気をトラップ槽40内のトラップ液42にバブリングさせることにより、処理液中のイソプロピルアルコールを処理液から分離して、トラップ液42に溶解させることが可能であるとわかった。
<イソプロピルアルコールの生産>
本実施例では、実施例3で使用したものと同一の生産装置10を用いてイソプロピルアルコールを生産した。なお、トラップ槽40には、トラップ液42としての水(トラップ水)が400mLの量で注入されている。
次いで、注入管16から、空気を0.5L/min(1vvm)の速度で培養液中に注入して通気培養を開始した。培養槽12からの排気は、トラップ槽40中のトラップ液42にバブリングさせた。
培養開始から23時間経過した時点で、培養槽内に0.5g/Lのグルコース溶液を20mL添加した。
培養開始から0、7、23、30、47、及び52時間後に、培養槽12中の処理後の培養液とトラップ槽40中の処理後のトラップ液42とをサンプリングした。サンプリングした培養液については、遠心操作を行うことによって、培養液中の菌体等固形物を除いた。
更に、培養開始47時間後の培養液及びトラップ水について、HPLC測定したときに検出されたピークの数、Rt時間(Retention time;保持時間)及び化合物名を、培養液について表8、トラップ水について表9にそれぞれ示す。
また、培養開始から47時間後の培養液については、グルコースと酢酸の他に、夾雑物と推測される11個のピークが確認されたが、このときのトラップ水について、イソプロピルアルコールに相当するピーク以外のピークはなかった。従って、本生産方法によれば、培養槽12からの排気をトラップ液42にバブリングさせることにより、夾雑物とイソプロアルコールとを容易に分離することができることがわかった。
<チオラーゼ遺伝子欠失pIPAプラスミドの構築及び該プラスミド形質転換体の構築>
実施例1に記載のプラスミドpIPAからチオラーゼ遺伝子を取り除いたプラスミドpIPAΔthioを作製した。
pIPAからチオラーゼプロモーターを単離するために、pIPAをテンプレートに用いてTTT GAA TTC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(配列番号21)、及びTTT TCT AGA TCT AAC TAA CCT CCT AAA TTT TGA TAC GGG(配列番号22)によりPCR法で増幅し、得られたフラグメントを制限酵素EcoRIとKpnIで消化することで約240bpのチオラーゼプロモーターフラグメントを得た。
実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産試験を行った。前培養として、試験管にアンピシリン0.1g/L、グルコース2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を4mL入れ、エシェリヒア・コリpIPAΔthio/B株を接種して、18時間、培養温度37℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養液全量を、グルコース20g/L、アデカノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液500mLを入れた1L培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度500rpm、培養温度37℃で行い、12.5%アンモニア溶液を用いて培養液のpHを7.0にコントロールした。また、培養開始から72時間目までに0.5g/mL濃度のグルコースを20mL添加した。培養開始から経時的に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結果を表10に示す。なお、表10中のイソプロピルアルコール量は、培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。
<チオラーゼ遺伝子及びCoAトランスフェラーゼ欠失pIPAプラスミドの構築及び該プラスミド形質転換体の構築>
実施例1に記載のプラスミドpIPAからチオラーゼ遺伝子とCoAトランスフェラーゼを取り除いたプラスミドpIPAΔthioΔctfABを作製した。
実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産試験を行った。前培養として、試験管にアンピシリン0.1g/L、グルコース2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を4mL入れ、エシェリヒア・コリpIPAΔthioΔctfAB/B株を接種して、18時間、培養温度37℃、120rpmで培養を行った。前培養液全量を、グルコース20g/L、アデカノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液500mLを入れた1L培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度500rpm、培養温度37℃で行い、12.5%アンモニア溶液を用いて培養液のpHを7.0にコントロールした。また、培養開始から72時間目までに0.5g/mL濃度のグルコースを20mL添加した。
<glyAプロモーターを用いたエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
実施例4のGAPDHプロモーターに代わり、エシェリヒア・コリ由来のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子(glyA)プロモーターを用いた。
エシェリヒア・コリのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number V00283 に記載されている。このプロモーターを用い、イソプロピルアルコールの生産に必要な遺伝子群を発現させることができる。
このプラスミドpGly-Iaaaをエシェリシア・コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGly-Iaaa/B株を得た。
<gadAプロモーターを用いたエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築>
実施例4のGAPDHプロモーターに代わり、エシェリヒア・コリ由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼA遺伝子(gadA)プロモーターを用いた。
エシェリヒア・コリのグルタミン酸デカルボキシラーゼAのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、グルタミン酸デカルボキシラーゼAをコードする遺伝子はGenBank accession number M84024に記載されている。このプロモーターを用い、イソプロピルアルコールの生産に必要な遺伝子群を発現させることができる。
このプラスミドpGad-Iaaaをエシェリシア・コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpGad-Iaaa/B株を得た。
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGly-Iaaa/B株およびpGad-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産>
実施例5と同様に1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGly-Iaaa/B株およびpGad-Iaaaによるイソプロピルアルコール生産検討を行った。その結果、培養24時間後でpGly-Iaaa/B株では3.1g/L、pGad-Iaaa/B株では2.6g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。
[実施例19]
<通気量1vvm又は2vvmでpGAP−Iaaa/B株を培養したときのイソプロピルアルコールの生産性>
本実施例では、実施例5で使用したものとトラップ槽の容量を除いて同一の生産装置10を2台用いてイソプロピルアルコールを生産した。なお、それぞれのトラップ槽40は2000mL容量であり、トラップ液42としての水(トラップ水)が2000mLの量で注入されている。
その結果、培養24時間後で、通気量1vvmでは5.5g/L、2vvmでは3.3g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。トラップ水中のイソプロピルアルコール量は、水中のイソプロピルアルコール濃度を4倍し培養液量相当に換算して算出した。
<通気量1vvm又は0.75vvmでpIPA/B株を培養したときのイソプロピルアルコールの生産性>
実施例3と同様にpIPA/B株の培養検討を行った。ただし、グルコースは40g/Lとし、pH調整剤はアンモニア水を用いた。なお、それぞれのトラップ槽40は500mL容量であり、トラップ液42としての水(トラップ水)が500mLの量で注入されている。気体は空気を用い、通気量は1vvm又は0.75vvmとした。その結果、培養54時間後で、通気量1vvmでは2.8g/L、0.75vvmでは2.8g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。
本発明により得られたイソプロピルアルコールは、種々の用途に利用することができ、例えばプロピレンの製造原料として好適に使用することができる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (11)
- アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌であり、
前記細菌は大腸菌(Escherichia coli)であり、
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性はクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性はクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、エシェリヒア・コリ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、
前記酵素遺伝子はグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータに連結されている当該イソプロピルアルコール生産細菌。 - アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌であり、
前記細菌は大腸菌(Escherichia coli)であり、
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性はクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性はクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、
前記酵素遺伝子はチオラーゼプロモータに連結されている当該イソプロピルアルコール生産細菌。 - 請求項1又は請求項2に記載のイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
- 前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に、窒素を含む化合物を更に添加する請求項3に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
- 前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物に、水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物を、窒素原子の合計の質量%として混合物中の培養開始時の培養培地の全質量に対して0.04%〜10.6%(w/w)の量となるよう添加する請求項3に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
- 前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産細菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを回収する回収工程と
を含む請求項3記載のイソプロピルアルコールの生産方法。 - 前記気体が、酸素を含む気体である請求項6に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
- 前記気体の供給量が、0.02vvm〜2.0vvmである請求項6記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
- 前記気体の供給量が、0.1vvm〜1.5vvmである請求項6記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
- 前記回収工程が、前記培養工程で得られた培養物から蒸散したイソプロピルアルコールを、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と接触させることを含む請求項6〜請求項9のいずれか1項に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
- 前記回収工程が、前記蒸散したイソプロピルアルコールを液化してから前記捕捉液と接触させることを含む請求項6〜請求項10のいずれか1項に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
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