JP5147452B2

JP5147452B2 - 磁気バイオセンサーを利用した標的物質検出方法及びキット

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Publication number: JP5147452B2
Application number: JP2008044422A
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Inventors: 数理中浜
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Description

本発明は、検体液中の標的物質を磁気検出する方法に関する。

近年の高齢化社会や生活習慣病の蔓延などの社会事情を背景に、病気の早期発見・早期治療を可能にする高感度、且つ定量性の高い免疫検査システムへのニーズが高まりつつある。このような免疫検査システムの候補として磁気バイオセンサーが挙げられる。磁気バイオセンサーとは、検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーを磁気検出することにより、検体液中の標的物質を検出する検査システムである。

磁気バイオセンサーに関する報告例として、特許文献１記載のＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）や特許文献２記載のホール効果素子、特許文献３記載の磁気抵抗効果素子、特許文献４記載の磁気インピーダンス素子などが開示されている。

高感度、且つ定量性に優れる磁気バイオセンサーを達成するためには、以下のような特性を有する磁性マーカーを開発することが求められている。すなわち、（１）サイズが小さく単分散性に優れること、（２）磁性マーカー毎の飽和磁化が大きい（磁性体含有率が高い）こと、及び（３）分散安定性に優れること、である。（１）の特性に関しては、磁気バイオセンサーにおける標的物質の定量性の向上に関係する。また、（２）の特性に関しては、標的物質の検出感度の向上に関係し、（３）の特性に関しては、標的物質の定量性の向上に関係する。

しかしながら多くの場合、上記した３つの特性はトレードオフの関係にあり、すべてを満足する磁性マーカーを製造することは難しい。このような背景のもと、比較的分子設計や選択の自由度が高い高分子化合物のような非磁性物質と、磁性体から構成される磁性マーカーが開示されている。例えば、特許文献５では、ミニエマルション重合法を利用することによって磁性マーカーを得る手法が開示されている。また、非特許文献１では、ソープフリー乳化重合法を利用することによって磁性マーカーを得る手法が開示されている。さらに、非特許文献２では、ゲル粒子を鋳型にして磁性体を合成することによって磁性マーカーを得る手法が開示されている。
特開２００１−０３３４５５号公報ＷＯ０３−０６７２５８号公報米国特許５９８１２９７号明細書特開平１０‐２３４６９４号公報特開２００４−０９９８４４号公報第１４回高分子ミクロスフェア討論会講演要旨集ｐ１４５ Colloid Polymer Science, (2006), No.284, p1443-p1451

しかしながら、これらの磁性マーカーを適用した磁気バイオセンサーでは、高感度の検出を達成するには飽和磁化の大きさが十分でない点が問題となる。磁性マーカー毎の磁性体含有率を増加させることにより、磁性マーカーの飽和磁化を増大させることが可能であるが、そのようにすると上述したトレードオフの関係により、単分散性や分散安定性が低下するため、磁気バイオセンサーの定量性が損なわれてしまう。

本発明の目的は、上記問題点に鑑みてなされたもので、磁性マーカーの単分散性や分散安定性を保ちつつ、磁気バイオセンサーの検出感度、及び定量性を向上させる検出方法、及びキットを提供することである。

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、検出部の表面近傍に結合されたゲル粒子を鋳型にして磁性体を合成することによって磁性マーカーを得、さらに前記磁性マーカーを磁気検出することによって、高感度、且つ定量性に優れる磁気バイオセンサーを達成可能なことを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明の第１の発明は、磁性マーカーの有無または数量を検知することにより検体液中の標的物質の有無または濃度を検出する方法であって、
（１）検体液中の標的物質を、センシング素子に固定されている第一の標的物質捕捉部材、及び、ゲル粒子に固定されている第二の標的物質捕捉部材に反応させ、前記標的物質を介して前記第一の標的物質捕捉部材と第二の標的物質捕捉体部材とを結合させることにより、前記ゲル粒子を前記センシング素子上に保持する工程と、
（２）前記センシング素子上に保持された前記ゲル粒子に磁性体前駆体を接触させ、該ゲル粒子と該ゲル粒子中に存在する該磁性体前駆体とからなる磁性マーカー前駆体を調製する工程と、
（３）前記ゲル粒子に保持された前記磁性体前駆体から磁性体を合成し、該ゲル粒子と該ゲル粒子中に存在する該磁性体とからなる磁性マーカーを調製する工程と、
（４）前記磁性マーカーの有無または数量をセンシング素子により検知する工程と、
を有すること特徴とする検出方法に関するものである。

また、本発明の第２の発明は、検体液中の標的物質を磁気検出するためのキットであって、
第一の標的物質捕捉部材を固定したセンシング素子と、
第二の標的物質捕捉部材を固定したゲル粒子と、
磁性体前駆体と、
を備えることを特徴とするキットに関するものである。

本発明によれば、検体液中の標的物質を磁気検出する磁気バイオセンサーの検出感度、及び定量性を向上させるための検出方法を提供することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の検出方法は、磁気マーカーを検知することにより検体液中の標的物質を検出する方法であって、
（１）検体液中の標的物質を、センシング素子に固定されている第一の標的物質捕捉部材、及び、ゲル粒子に固定されている第二の標的物質捕捉部材に反応させ、標的物質を介して第一の標的物質捕捉部材と第二の標的物質捕捉体部材とを結合させることにより、ゲル粒子をセンシング素子上に保持する工程と、
（２）工程（１）の複合体の形成によりセンシング素子上に保持されたゲル粒子に磁性体前駆体を接触させ、ゲル粒子に磁性体前駆体を保持させる工程と、
（３）ゲル粒子に保持された磁性体前駆体から磁性体を合成し、磁性体を含有するゲル粒子からなる磁気マーカーを調製する工程と、
（４）前記磁気マーカーをセンシング素子により検知する工程と、
を有すること特徴とする検出方法に関するものである。

上記（１）の工程において、標的物質と第一の標的物質捕捉部材との反応、あるいは標的物質と第二の標的物質捕捉部材との反応の順序には特に制限はなく、一方を先に他方を後にして、それぞれの反応を行ってもよいし、あるいは、両方の反応を重複（一部重複も含む）して行ってもよい。

すなわち、第一の態様として、上記（１）の工程は、
（１−i）検体液中の標的物質を、前記第一の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
（１−ii）前記第一の標的物質捕捉部材と結合した前記標的物質を、前記第二の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
を有することができる。

また、第二の態様として、上記（１）の工程は、
（１−i）検体液中の標的物質を、前記第二の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
（１−ii）前記第二の標的物質捕捉部材と結合した前記標的物質を、前記第一の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
を有することができる。

図1に示す模式図に、上記第一の態様における詳細な実施形態を示す。図1において、センシング素子３に結合（固定）した第一の標的物質捕捉部材２と、標的物質１を検体液中で反応させた後、ゲル粒子５に結合（固定）した第二の標的物質捕捉部材４を捕捉物質１と反応させる。次に、検体液に磁性体前駆体６を投入して、ゲル粒子５に磁性体前駆体６を吸収させる。さらに、磁性体前駆体６から磁性体７を合成して、ゲル粒子５と磁性体７から構成される磁性マーカー８を得る。最後に、磁性マーカー８をセンシング素子３によって磁気検出する。

高感度、且つ定量性に優れる磁気バイオセンサーを達成するためには、以下のような特性を有する磁性マーカーを開発することが求められている。
１．サイズが小さく単分散性に優れていること
２．磁性マーカー毎の飽和磁化が大きい（磁性体含有率が高い）こと
３．分散安定性に優れていること
しかしながら一般に、上記した３つの特性はトレードオフの関係にあり、すべてを満足する磁性マーカーを製造することは難しい。例えば、飽和磁化を大きくするためには、磁性マーカー毎の磁性体含有率を増大させる必要があるが、このような試みは磁性マーカーの単分散性や分散安定性を低下させるため、磁気バイオセンサーの検出感度や定量性を損ねる可能性がある。

一方、本発明における検出方法では、ゲル粒子をセンシング素子に結合した状態で、ゲル粒子を鋳型にして磁性体を合成することによって磁性マーカーを得るため、磁性マーカー毎の磁性体含有率を増大させた場合においても、その分散安定性を考慮する必要がなく、磁気バイオセンサーの検出感度を向上させることができる。また、あらかじめサイズ均一性の高いゲル粒子を用いる場合には、単分散性に優れる磁性マーカーを得ることができるため、磁気バイオセンサーの定量性を向上させることが可能となる。

図２に示す模式図に、上記第二の態様における詳細な実施形態を示す。図２において、標的物質１とゲル粒子５に結合した第二の標的物質捕捉部材４を検体液中で反応させた後、センシング素子３に結合した第一の標的物質捕捉部材２と、第二の標的物質捕捉物質４に結合した標的物質１とを反応させる。次に、検体液に磁性体前駆体６を投入して、ゲル粒子５に磁性体前駆体６を吸収させる。さらに、磁性体前駆体６から磁性体７を合成して、ゲル粒子５と磁性体７から構成される磁性マーカー８を得る。最後に、磁性マーカー８をセンシング素子３によって磁気検出する。
第二の態様の検出方法においても、第一の態様の検出方法と同様の効果が得られる。

本発明の検体液中の標的物質を磁気検出するためのキットは、以下の（１）から（３）の材料を少なくとも備える。
（１）第一の標的物質捕捉部材を固定したセンシング素子
（２）第二の標的物質捕捉部材を固定したゲル粒子
（３）磁性体前駆体
磁性体前駆体としては、反応させる液体中において相互作用によりゲル粒子に吸収され、保持されるものを用いる。

＜ゲル粒子＞
本発明におけるゲル粒子は、ハイドロゲル粒子であることが好ましい。一般にハイドロゲルとは、三次元的に架橋された高分子網目が多量の水を含有して膨潤した状態であると定義されるが、本発明においてはより広義に、多量の水を含有する親水性高分子の会合体を意味するものとする。
本発明のゲル粒子は、後述する磁性体前駆体を検体液等の反応を行う液体中で吸収する能力を有する。そのためには、ゲル粒子と磁性体前駆体とには、何らかの相互作用が働く必要がある。相互作用として、例えば、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合等の従来公知の相互作用を適用することが可能であり、特に静電相互作用である場合に本発明の目的を良好に達成することができる。

ゲル粒子と磁性体前駆体とに静電相互作用を働かせるためには、磁性体前駆体が正に帯電する場合にはゲル粒子は負電荷を、磁性体前駆体が負に帯電する場合にはゲル粒子は正電荷を有する。
ゲル粒子に負電荷を付与する方法として、例えば、カルボキシル基やスルホン酸基、リン酸基など水溶液中で解離して負電荷を示す荷電性官能基をゲル粒子に担持させる方法がある。一方、ゲル粒子に正電荷を付与するための方法として、アミン類など水溶液中で解離して正電荷を示す荷電性官能基をゲル粒子に担持させる。ただし、本発明における荷電性官能基は、これらに限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲において、如何なる荷電性官能基をも適用することができる。

定量性に優れる磁気バイオセンサーを達成するためには、磁性マーカーが可能な限り単分散性に優れることが必要である。そこで本発明において、磁性マーカーの鋳型となるゲル粒子にも単分散性が要求される。具体的にはゲル粒子の重量平均粒子径（Dｗ）と数平均粒子径（Dn）の比（Dw/Dn）が１．１以下であることが好ましい。

ゲル粒子のDwは特に制限しないが、５０ｎｍ以上で３００ｎｍ未満であることが好ましい。Dｗが５０ｎｍより小さい場合には、ゲル粒子を鋳型に合成される磁性マーカー毎の飽和磁化が十分な大きさを示さないため、磁気バイオセンサーにおいて十分な検出感度を得ることができない。また、Dｗが３００ｎｍ以上である場合には、ゲル粒子の運動性が低下するため、磁気バイオセンサーにおいて検出速度が著しく低下する懸念が生じる。

また、本発明ゲル粒子は、平均アスペクト比（長径/短径）を１．０から１．５の範囲、より好ましくは１．０から１．２の範囲として、真球性を高めたものとするのが好ましい。このような真球状のゲル粒子は、例えば液体に分散させて用いる場合に良好な流動性を示すため有利である。

＜磁性体、及び磁性体前駆体＞
本発明における磁性体は目的に応じて任意に選択できるが、磁性体に５０００エールステッドの強い磁場をかけた後、ゼロ磁場に戻したときの磁化（残留磁化）が５０００エールステッドの磁場をかけたときの磁化（飽和磁化）の１／３以下となる磁性体が好ましい。このような磁性体として、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属、若しくはそれらの合金などが挙げられる。

磁気バイオセンサーにおいては、飽和磁化の高い磁性マーカーが要求される傾向にあるため、これらのうちバルク状態で強磁性体に分類されるものが好ましい。こうした観点からすると、より好ましくはフェライト類であり、特にはＦｅ₃Ｏ₄（マグネタイト）が好ましい。ただし本発明の目的を達成可能な範囲において磁性体の種類は限定されない。

また、本発明における磁性体前駆体は、例えば上記したような磁性体を得るための合成原料となる物質であり、上記磁性体の少なくとも一部を構成する。

磁性体前駆体は、検体液などの反応を行う液体に投入し、センシング素子に保持されたゲル粒子に接触させることで、ゲル粒子に吸収されるため、ゲル粒子と、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合等の相互作用を有する必要がある。ゲル粒子が負電荷を有する場合は、静電気相互作用を働かせるために、磁性体前駆体は、反応を行う液体中で正に帯電するものを用いることが好ましい。例えば、上記磁性体の材料として挙げた鉄、マンガン、コバルトなどの金属では、反応を行う液体中で溶解して金属陽イオンとなる金属塩を好適に用いることができる。

磁性体前駆体が水溶性である場合により好ましく本発明を実施することが可能である。磁性体前駆体から磁性体を合成する方法は、磁性体、及び磁性体の前駆体の組み合わせにより選択される従来公知の合成手法を適用することができる。

＜標的物質捕捉部材＞
本発明における標的物質捕捉部材とは、検体液中の標的物質の選択に係わる物質であり、例えば、検体液中の標的物質と選択的に直接反応する物質（いわゆるレセプター）、又は標的物質の反応に係わる物質（例えば、標的物質の反応に選択的に触媒作用をもたらす物質）等が含まれる。また、この捕捉部材は、検出の有無や程度の表示に係わる機能、例えば、レセプターが放出する物質や残余の物質と反応し発色する機能等を兼ねるものであってもよい。本発明に使用される標的物質捕捉部材には、酵素、糖鎖、触媒、抗体、抗体断片、抗原、核酸などが挙げられるがこれに限る物ではない。

標的物質捕捉部材はセンシング素子およびゲル粒子のそれぞれが備えており、センシング素子が備えるものを第一の標的物質捕捉部材とし、ゲル粒子が備えるものを第二の標的物質捕捉部材とする。第一の標的物質捕捉部材と第二の標的物質捕捉部材とは、標的物質を介して結合することができるものであればよく、好ましくは、それぞれが空間的に標的物質の異なる領域を捕捉することにより形成されることが好ましい。

＜標的物質＞
本発明の標的物質とは、検出対象となる物質であり、標的物質捕捉部材と選択的に直接反応する物質、標的物質捕捉部材の反応に係わる物質（例えば、標的物質捕捉部材の反応に選択的に触媒作用をもたらす物質）等である。標的物質は生体物質に限るものではなく、またそのサイズも限定されるものではない。ただし標的物質が、糖、蛋白質、アミノ酸、抗体、抗原や疑似抗原、ビタミン、核酸などの生物に含有される生体物質、及び、その関連物質や人工的に合成された擬似生体物質である場合に、本発明の目的を良好に達成することができる。

＜標的物質捕捉部材のゲル粒子への結合方法＞
本発明において、標的物質捕捉部材の標的物質への結合能を阻害することのない限りにおいて、ゲル粒子への標的物質捕捉部材の結合される位置や結合方法は特に限定されない。例えば、標的物質捕捉部材がタンパク質である場合、そのカルボキシル末端または／及びアミノ末端や、標的物質捕捉部材の機能を阻害しない限りにおいてはランダムな位置にてゲル粒子と結合することができる。また、捕捉部材のゲル粒子への結合方法の一例としては、の物理吸着や化学結合などの方法が挙げられる。

標的物質捕捉部材のゲル粒子への物理吸着は、ゲル粒子と標的物質捕捉部材を混合しておくことで非特異的に吸着させることが可能であり、操作の簡便性という点で好ましい。一方、標的物質捕捉部材のゲル粒子への結合方法として、共有結合のような化学結合を利用することもできる。前記化学結合は物理吸着に比べ結合が強固であるため好ましい。ゲル粒子に標的物質捕捉部材を共有結合的に固定する方法としては、例えば、標的物質捕捉部材がタンパク質である場合、タンパク質配列中に含まれるアミノ酸が持つアミノ基と、ゲル粒子に荷電性官能基として付与されたカルボキシル基とを、従来公知の方法で反応させる方法などがある。

＜磁性マーカー＞
本発明における磁性マーカーは、ゲル粒子と磁性体から構成される複合粒子である。本発明におけるゲル粒子、及び磁性体については上記の通りである。

＜検出方式＞
本発明の磁気バイオセンサーを用いた検出方式は、センサー素子の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無または数量を検知することにより、検体液中の標的物質の有無または濃度を検出することができる磁気的検出方式であれば、如何なる方法でもよい。中でも、磁界効果を利用する方式が好ましく、特に、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、磁気インピーダンス素子、フラックスゲート素子、超電導量子干渉計素子が好適に用いることができる。

（実施例１）ゲル粒子Ａの作製
第二の標的物質捕捉物質として抗リゾチーム抗体を結合したゲル粒子Ａを合成する。
＜ゲル粒子の合成＞
0.2gのN-イソプロピルアクリルアミド、2.2gのグリシジルメタクリレート、0.06gのメチレンビスアクリルアミドを100gの蒸留水に溶解させ、窒素バブリングにより３０分間の窒素置換を行う。この混合液を70℃に昇温した後、0.06gの2,2-アゾビス（2-アミノプロパン）ハイドロクロライド（以下V-50）を投入して重合することでゲル粒子を得る。遠心分離法により精製した後、DLS８０００（大塚電子）にて評価したところ、Dwが１８２ｎｍ、Dw/Dnが１．０３であることが確認される。
＜カルボキシル基の付加＞
メルカプト酢酸水溶液に上記ゲル粒子を添加して、室温、pH9にて20時間反応し、カルボキシル基を有するゲル粒子を得る。遠心分離法により精製した後、DLS8000（大塚電子）にて評価したところ、Dwが２３５ｎｍ、Dw/Dnが１．０３であることを確認する。
＜抗リゾチーム抗体の固定＞
上記ゲル粒子を、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩と、ヒドロキシコハク酸イミドを溶解させた水溶液に分散させ、さらにリン酸緩衝液に溶解させた抗リゾチーム（Rabbit-Poly）を加えることにより、ゲル粒子のカルボキシル基と抗リゾチーム（Rabbit-Poly）のアミノ基を反応させる。これにより、抗リゾチーム（Rabbit-Poly）を結合したゲル粒子Ａを得る。
（実施例２）ゲル粒子Ｂの作製
荷電性官能基としてスルホン酸基を有し、第二の標的物質捕捉物質として抗リゾチーム抗体を結合したゲル粒子Ｂを合成する。
＜ゲル粒子の合成＞
実施例１と同様にしてゲル粒子を合成する。
＜スルホン酸基およびカルボキシル基の付加＞
３-メルカプト-1-プロパンスルホン酸ナトリウムとメルカプト酢酸を溶解させた水溶液に上記ゲル粒子を添加して、室温、pH9にて20時間反応し、スルホン酸基およびカルボキシル基を付加したゲル粒子を得る。遠心分離法により精製した後、DLS8000（大塚電子）にて評価したところ、Dwが２７２ｎｍ、Dw/Dnが１．０4であることを確認する。
＜抗リゾチーム抗体の固定＞
上記ゲル粒子を、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩と、ヒドロキシコハク酸イミドを溶解させた水溶液に分散させ、さらにリン酸緩衝液に溶解させた抗リゾチーム（Rabbit-Poly）を加えることにより、ゲル粒子のカルボキシル基と抗リゾチーム（Rabbit-Poly）のアミノ基を反応させる。これにより、スルホン酸基を有し、抗リゾチーム（Rabbit-Poly）を結合したゲル粒子Ｂを得る。

（実施例３）センシング素子の作製
第一の標的物質捕捉部材を結合したセンシング素子を有するセンシングデバイスは以下のようにして作製する。なお、本実施例では検出方式として磁気抵抗効果素子を用いる。

本実施例の磁気抵抗効果素子は次のプロセスで作製する。シリコンウエハ211上にTa(30nm)/PtMn(20nm)/CoFe(2nm)/Ru(0.8nm)/CoFe(2nm)/AlOx(1.6nm)/CoFe(3nm)/Ru(5nm)/Au(5nm)からなる磁気抵抗効果膜212を成膜する（図３(a)）。センシング素子215およびリファレンス素子216とする領域にレジストマスクパターン213および214を形成し、反応性イオンエッチングによりセンシング素子215およびリファレンス素子216の周りをエッチングする。センシング素子215とリファレンス素子216は同一の形状のものとする。エッチングはAlOx膜で止まるようにコントロールし、AlOx膜より下の金属膜は残し、下部電極として機能させる（図3(b)）。エッチング後にSiN絶縁膜（14nm）217を成膜し、層間絶縁膜とする(図3(c))。センシング素子215およびリファレンス素子216上部の絶縁膜を、ポリッシングによって研磨し、その後レジストマスクパターン213と214を溶剤で溶かすことによって、センシング素子215およびリファレンス素子216上部を開口する（図３(d)）。上部電極を形成する為に、レジストマスクパターン218を形成し、その後Au(20nm)219を成膜する（図3(e)）。溶剤を用いて不要なAu膜とレジストマスクパターンをリフトオフし、上部電極を形成する（図３(f)）。さらにセンシング素子上部以外の電極表面を非固定化膜で覆うために、レジストマスクパターンを形成した後にSiN(20nm)220を成膜し、リフトオフを行う（図３(g)）。

センシング素子215とリファレンス素子216は電気的に並列に接続され、同じ大きさの電圧が印加されるようにする。センシング素子215に流れる電流と、リファレンス素子216に流れる電流をそれぞれI/V変換器221および222によって電圧値に変換し、その電圧の差を差動アンプ223によって出力し、抗原（標的物質）の有無や数を検出する（図４参照）。

本実施例では、一つのセンシング素子によるセンシングデバイスとしたが、複数のセンシング素子を配置し、選択トランジスターによって順次センシング素子を切り替えることによって、各センサー素子の検出信号を取得し、多数の抗原（標的物質）あるいは多種の抗原（標的物質）を検出することも可能である。

次に、センシング素子215（図３ではＡｕ膜219表面）に第一の標的物質捕捉体として抗リゾチーム（Mouse-Mono）を結合する。まず、１０-カルボキシ-１-デカンチオールのエタノール溶液を検出領域に塗布する。この操作により、Ａｕ膜表面にカルボキシル基が露出される。次に、Ｎ-ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液と１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶液を同様に塗布する。これらの操作により、Ａｕ膜表面にスクシンイミド基が露出することになる。前記スクシンイミド基と抗リゾチーム（Mouse-Mono）のアミノ基を反応させることで、第一の標的物質捕捉部材をセンシング素子215に結合することができる。尚、Ａｕ膜表面上の未反応のスクシンイミド基は、塩酸ヒドロキシルアミンを添加して脱離させてもよい。

（実施例４）ニワトリ卵白リゾチームの検出（ゲル粒子Ａ）
本実施例では、標的物質としてニワトリ卵白リゾチーム（HEL）を、第一の標的物質捕捉部材として抗リゾチーム（Mouse-Mono）を、第二の標的物質捕捉部材として抗リゾチーム（Rabbit-Poly）を用い、実施例１で作製するゲル粒子Ａを鋳型にして磁性体を合成することによって得られる磁性マーカーを磁気検出する。

以下の手順に従って実験操作を行う。
１．HELを含有するリン酸緩衝液に実施例３で作製するセンシングデバイスを浸す。
２．未反応のHELをリン酸緩衝液で洗浄する。
３．ゲル粒子Ａを分散させたリン酸緩衝液にセンシングデバイスを浸す。
４．未反応のゲル粒子Ａをリン酸緩衝液で洗浄する。
５．センシングデバイスを蒸留水に浸す。
６．センシングデバイスを塩化鉄（II）水溶液に浸し、鉄イオンをゲル粒子Ａに吸収させる。
７．過剰な鉄イオンを水で洗浄する。
８．NaOH水溶液にてｐH９に調製し、マグネタイトを合成する。

上記操作によって、HELが抗リゾチーム（Mouse−Mono）と抗リゾチーム（Rabbit−Poly）によって捕捉され、さらにゲル粒子Ａを鋳型にして磁性体を合成することによって、磁性マーカーが図２に示すようにセンシング素子に結合される。この磁性マーカーの有無を磁気検出することによって、標的物質であるHELの検出が可能となる。また、センシング素子に結合された複数の磁性マーカーは、単分散性に優れるため、その数を検出することによって、検体液中に含まれるHELを定量することができる。

（実施例５）ニワトリ卵白リゾチームの検出（ゲル粒子Ｂ）
磁性体を合成する鋳型として、実施例２で作製するゲル粒子Ｂを用いる磁性マーカーを作製する以外は、実施例４と同様にしてニワトリ卵白リゾチームを検出する。

本発明の第1の発明に基づく検出方法を示す模式図である。本発明の第２の発明に基づく検出方法を示す模式図である。本発明の実施例に用いる磁気抵抗素子の作製プロセスを説明する模式図である。本発明の実施例に用いる検出回路の模式図である。

符号の説明

1 標的物質
2 第一の標的物質捕捉部材
3 センシング素子
4 第二の標的物質捕捉部材
5 ゲル粒子
6 磁性体前駆体
7 磁性体
8 磁性マーカー
２１１シリコン基板
２１２磁気抵抗効果素子
２１３レジストマスクパターン
２１４レジストマスクパターン
２１５センシング素子（磁気抵抗効果素子）
２１６リファレンス素子（磁気抵抗効果素子）
２１７ SiN絶縁膜（層間絶縁膜）
２１８レジストマスクパターン
２１９ Au膜
２２０ SiN膜（非固定化膜）
２２１ I/V変換器
２２２ I/V変換器
２２３差動アンプ
２２４ DC電源

Claims

磁性マーカーの有無または数量を検知することにより検体液中の標的物質の有無または濃度を検出する方法であって、
（１）検体液中の標的物質を、センシング素子に固定されている第一の標的物質捕捉部材、及び、ゲル粒子に固定されている第二の標的物質捕捉部材に反応させ、前記標的物質を介して前記第一の標的物質捕捉部材と第二の標的物質捕捉体部材とを結合させることにより、前記ゲル粒子を前記センシング素子上に保持する工程と、
（２）前記センシング素子上に保持された前記ゲル粒子に磁性体前駆体を接触させ、該ゲル粒子と該ゲル粒子中に存在する該磁性体前駆体とからなる磁性マーカー前駆体を調製する工程と、
（３）前記ゲル粒子に保持された前記磁性体前駆体から磁性体を合成し、該ゲル粒子と該ゲル粒子中に存在する該磁性体とからなる磁性マーカーを調製する工程と、
（４）前記磁性マーカーの有無または数量をセンシング素子により検知する工程と、
を有すること特徴とする検出方法。
前記工程（１）が、
（１−i）検体液中の標的物質を、前記第一の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
（１−ii）前記第一の標的物質捕捉部材と結合した前記標的物質を、前記第二の標的物質
捕捉部材に反応させる工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
前記工程（１）が、
（１−i）検体液中の標的物質を、前記第二の標的物質捕捉部材に反応させる工程と、
（１−ii）前記第二の標的物質捕捉部材と結合した前記標的物質を、前記第一の標的物質
捕捉部材に反応させる工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
前記ゲル粒子がハイドロゲル粒子である請求項１から３の何れかに記載の検出方法。
前記ゲル粒子が荷電性官能基を含有する請求項１から４の何れかに記載の検出方法。
前記荷電性官能基がカルボキシル基、または、スルホン酸基である請求項５に記載の検出方法。
前記ゲル粒子の重量平均粒子径が５０ｎｍ以上３００ｎｍ未満である請求項１乃至６のいずれかに記載の検出方法。
検体液中の標的物質を磁気検出するためのキットであって、
第一の標的物質捕捉部材を固定したセンシング素子と、
第二の標的物質捕捉部材を固定したゲル粒子と、
磁性体前駆体と、
を備えることを特徴とするキット。