JP5145771B2 - リポ蛋白中のビタミンe類の分析方法及び分析装置 - Google Patents
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Description
(2)Feki Mら、Clin Chem、46、p1401(2000)(非特許文献2);健常人に比べ冠動脈疾患患者は、LDL中のαトコフェロール/コレステロールが低値となる。
(4)Salonen JTら、BMJ、311、p1124(1995)(非特許文献6);健常人に比べ糖尿病患者は、αトコフェロール/コレステロールが低値となる。
(5)Reunanen Aら、Eur J Clin Nutr、52(2)、p89(1998)(非特許文献7);αトコフェロールが低下すると、糖尿病を発症するリスクが高くなる。
(6)Sobczak Aら、J chromarogr、730、p265(1999)(非特許文献8);健常人に比べ糖尿病患者は、αおよびγトコフェロールが高くなる。
(7)Mayer−Davis EJら、Diabetes Care、25、p2172(2002)(非特許文献9);糖尿病患者は糖尿病を呈しない患者に比べ、αトコフェロールが低値となる。
(8)Ohrvall Mら、J Intern. Med、239、p111(1996)(非特許文献10);健常人に比べ冠動脈疾患患者は、γトコフェロールが低値となるが、αトコフェロールに有意な変化はない。また、αトコフェロール/γトコフェロール比が高値となる。
(1)リポ蛋白を含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポ蛋白を分離し、分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンE類を遊離させ、次いで遊離したビタミンE類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリポ蛋白中のビタミンE類の分析方法。
(2)前記前処理液は、イオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で10から50%となる有機溶媒と0.2から6.0%となる界面活性剤を含むものであることを特徴とする(1)の分析方法。
(3)前記前処理液は、更にイオン交換クロマトグラフで分離したリポ蛋白と反応させる段階で50から150mmol/Lとなるカオトロピックイオンを含むものであることを特徴とする(1)又は(2)の分析方法。
(4)一定量の試料を採取する試料導入部、イオン交換カラムを備えるイオン交換クロマトグラフ部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混合部、逆相カラムを備える逆相クロマトグラフ部、逆相クロマトグラフ部からの溶出液について検出を行う検出部、及び、試料導入部で採取した試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部、試薬を送液する送液部、イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合された液を送液する送液部、及び、逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置。
(6)超低比重型リポ蛋白(VLDL)中のγトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、(5)の方法。
(8)超低比重型リポ蛋白(VLDL)コレステロール値が健常人の平均値に比べ低い場合において、超低比重型リポ蛋白(VLDL)中のγトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定する、(7)の方法。
(10)低比重型リポ蛋白(LDL)中のαトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、(9)の方法。
(12)低比重型リポ蛋白(LDL)中のαトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の病態を有しないと判定する、(11)の方法。
(14)超低比重型リポ蛋白(VLDL)中のαトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、(13)の方法。
(16)超低比重型リポ蛋白(VLDL)コレステロール値が健常人の平均値に比べ低い場合において、超低比重型リポ蛋白(VLDL)中のαトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定する、(15)の方法。
(18)血液中のγトコフェロール/αトコフェロール比の値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定する、(17)の方法。
以下の構成の分析装置(図4)を作製した。
イオン交換クロマトグラフ用カラム1;DEAE−NPR(商品名、東ソー(株)製)、4.6mmID×35mmを2本直列に連結
試料導入部2;AS−8020(商品名、東ソー(株)製)
混合装置3;スタティックミキサーC(商品名、東ソー(株)製)
送液ポンプ4及び5;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
溶離液A6;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na、pH7.5
溶離液B7;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na+過塩素酸ナトリウム 300mmol/L、pH7.5
イオン交換クロマトグラフの流速;0.5ml/min
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
;0分から0.05分は溶離液B10%、溶離液A90%
;0.05分から5分は溶離液B38%、溶離液A62%
;5分から11分は溶離液B44%、溶離液A56%
;11分から16分は溶離液B49%、溶離液A51%
;16分から21分は溶離液B56%、溶離液A44%
;21分から29分は溶離液B100%、溶離液A0%
;29分から40分は溶離液B10%、溶離液A90%
分離に要した時間;45分/検体
以下の構成の分析装置(図11)を作製し、前処理液の有機溶媒、界面活性剤、カオトロピックイオンについて試験を行った。
試料導入部2;AS−8020(商品名、東ソー(株)製)
検出器14;FS−8020(商品名、東ソー(株)製蛍光検出器)、励起波長298nm、蛍光波長325nm
送液ポンプ16及び17;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
溶離液C18;30% エタノール+25mmol/L 硝酸アンモニウム
溶離液D19;85% エタノール+25mmol/l 硝酸アンモニウム
流速;1.0ml/min
溶出条件;0分から5分は溶離液C0%、溶離液D100%
;5分から10分は溶離液C0%、溶離液D100%から溶離液C100%、
溶離液D0%にリニアグラディエント
;10分から33分は溶離液C100%、溶離液D0%
;33分から35分は溶離液C100%、溶離液D0%から溶離液C0%、溶離液D100%にリニアグラディエント
;35から45分は溶離液C0%、溶離液D100%
分離に要した時間;45分/検体
高脂血症を呈した者から、インフォームドコンセントを得て採取した血清(総コレステロール値242mg/dL、中性脂肪421mg/dL)の20μLを実施例1の装置に供し、下記のとおり各リポ蛋白の溶出画分を取得してリポ蛋白質の分離を試験した。
LDL画分;8〜13分のフラクション
IDL画分;13〜19分のフラクション
VLDL画分;19〜24分のフラクション
Chylomicron(以下、CMと記す。)画分;24〜30分のフラクション
高脂血症を呈した者から、インフォームドコンセントを得て採取した血清(総コレステロール値203mg/dL、中性脂肪215mg/dL)の20μLを下記の装置(図4に示した実施例1の装置構成と同じとし、溶離液組成および溶出条件を変更した)に供し、試料導入時から34分まで2分間ごとに17本の溶出画分を取得し、実施例3の装置及び方法により各リポ蛋白中のγトコフェロール、αトコフェロールを分析した。また、それぞれのフラクションのコレステロール濃度をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含んだ酵素液(コレステロールEテスト、商品名、和光純薬(株)製)で測定した。
試料導入部2;AS−8020(商品名、東ソー(株)製)
混合装置3;スタティックミキサーC(商品名、東ソー(株)製)
送液ポンプ4及び5;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
溶離液A;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na+100mmol/L チオシアン酸ナトリウム、pH7.5
溶離液B;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na+100mmol/L チオシアン酸ナトリウム+500mmol/L 硝酸ナトリウム、pH7.5
イオン交換クロマトグラフの流速;0.5ml/min
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
;0分から24分は溶離液B10%、溶離液A90%から溶離液B50%、溶離液A50%へのリニアグラディエント
;20分から25分は溶離液B50%、溶離液A50%
;25分から30分は溶離液B100%、溶離液A0%
;30分から40分は溶離液B10%、溶離液A90%
図1に示した本発明の分析装置として、具体的に以下の装置を作製した。高脂血症を呈した者からインフォームドコンセントを得て採取した血清(総コレステロール値203mg/dL、中性脂肪215mg/dL)の20μLをこの装置に供し、ビタミンE類を分析した。なお、本例では一回の試料導入により各リポ蛋白中のビタミンE類を測定するのではなく、合計5回の試料導入を行うことにより、各一つのリポ蛋白中のビタミンE類を分析したものである。
試料導入部2;AS−8020(商品名、東ソー(株)製)
混合装置3;スタティックミキサーC(商品名、東ソー(株)製)
送液ポンプ4及び5;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
溶離液A6;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na、pH7.5
溶離液B7;50mmol/L トリス+1mmol/L EDTA2Na+過塩素酸ナトリウム 300mmol/L、pH7.5
イオン交換クロマトグラフの流速;0.5ml/min
イオン交換クロマトグラフの溶出条件
;0分から0.05分は溶離液B10%、溶離液A90%
;0.05分から5分は溶離液B38%、溶離液A62%
;5分から11分は溶離液B44%、溶離液A56%
;11分から16分は溶離液B49%、溶離液A51%
;16分から21分は溶離液B56%、溶離液A44%
;21分から29分は溶離液B100%、溶離液A0%
;29分から40分は溶離液B10%、溶離液A90%
送液ポンプ8;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
前処理液9;100mmol/L SDS+50% エタノール
混合装置10;スタティックミキサーB(商品名、東ソー(株)製)
前処理液の流速;0.25ml/min
六方切り替えバルブ11;6方電磁弁
切り替えのタイミング(OFFからONへの流路の切り替え)
;HDL溶出画分については7分から2分間
;LDL溶出画分については11分から2分間
;IDL溶出画分については17分から2分間
;VLDL溶出画分については22分から2分間
;CM溶出画分については27分から2分間
サンプルループ12の容量;1.5ml容量
逆相クロマトグラフ用カラム13;ODS−80Ts(商品名、東ソー(株)製)、4.6mmIDx150mm
検出器14;FS−8020(商品名、東ソー(株)製蛍光検出器)、励起波長298nm、蛍光波長325nm
検出器15;EC−8020(商品名、東ソー(株)製アンペロメトリック電気化学検出器、印加電圧600mV)
送液ポンプ16及び17;DP−8020(商品名、東ソー(株)製)
溶離液C18;30% エタノール+25mmol/L 硝酸アンモニウム
溶離液D19;85% エタノール+25mmol/l 硝酸アンモニウム
逆相クロマトグラフの流速;1.0ml/min
逆相クロマトグラフの溶出条件
;当初は溶離液C100%、D0%
;切り替えバルブ11がONになってから5分後に溶離液C100%、D0%に変更
;切り替えバルブ11がONになってから34分後に溶離液C0%、D100%に変更
分析時間;46分/検体
前処理液の組成を50mmol/L 過塩素酸ナトリウム+1% Triton X−100+75% エタノールとした以外は、実施例5と同一の装置及び方法にて分析を行った。HDL溶出画分の分析結果を図34及び35に、LDL溶出画分の分析結果を図36及び37に、IDL溶出画分の分析結果を図38及び39に、VLDL溶出画分の分析結果を図40及び41に、そしてCM溶出画分の分析結果を図42及び43に示す。なお、各図は、偶数番号が電気化学検出のクロマトグラム、奇数番号が蛍光検出のクロマトグラムを示す。各図から明らかなように、各リポ蛋白の画分でγトコフェロールとαトコフェロールが良好に検出された。
17例の健常人(Healthy)、20例の糖尿病患者(Diabetes)、17例の心筋梗塞患者(AMI)の血清中のHDL、LDL、IDL、VLDL、Chylomicron中のαおよびγトコフェロールを実施例3に記載した方法で測定した。また、イオン交換クロマトグラフィー法(Hirowatari Yら、J Lipid Res、44、p1404(2003)(非特許文献12))により、別に各リポ蛋白のコレステロールを測定し、コレステロール当りのαおよびγトコフェロールを算出した。
Claims (1)
- 超低比重型リポ蛋白(VLDL)中のγトコフェロール/コレステロール値が、健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病を有しないと判定する、糖尿病の判定方法。
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