JP5144249B2 - 汚染の測定 - Google Patents
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Description
本発明の目的は、資料中の微生物および他の汚染物質の存在を決定するための、迅速で、信頼性があり、多用途でロバストな方法を提供することにより、従来技術における多くの上述した問題点および短所に対処することにある。
本発明は、代わりに、ろ過またはろ過に類似した方法によって有効な微生物の濃縮工程を行えば、上述した培養工程を完全に除外することができるという驚くべき実証に基づいている。このことは従来技術に対して2つの主要な利点を意味する。というのは、これが1)感度を増し、したがって検出時間を著しく減少させ、2)たとえば消光または自己蛍光によって蛍光検出に干渉するか、または培養培地に由来する交差反応によって免疫検出に干渉するかもしれない、試料中の化合物または粒子を除去するからである。
汚染物質は、典型的には細菌;真菌、たとえば糸状菌およびイースト;藻類;原生動物;細菌からの胞子;真菌胞子;および花粉、ならびにこれらのフラグメントからなる群より選択される。これらの汚染物質のすべてが病原性であるわけでないが、ある環境でのそれらの存在は非常に望ましくなく有害でさえあることは指摘するまでもないであろう。産業的な発酵における汚染微生物の存在は多くのうちの一例であり、この場合には汚染物質の存在による経済的および実際的な影響は大きいが、食品製造およびそれらの価値が美的特徴に帰する製品の製造においても汚染物質は経済的損失の原因になり得る。
本発明は、工程cの後に、定量的または定性的に液体ビヒクル中の検出可能な成分を検出し、成分の検出を試料中の汚染物質の量または存在に相関させることを伴うさらなる工程d)を有していてもよい。
汚染物質が、工程aの前または工程bに、信号を増強させる影響を受けることが有利であろう。これは、その後の検出における全体の感度を増加させるか、特定の種類の汚染物質のその後の検出を有利にするか、または特定の種類の汚染物質の検出を減少させる。
−培地を、イースト、真菌または微生物に対する選択的な物質にさらす(これはある種の汚染物質の検出を有利にする効果をもつ)、および/または
−培地を、微生物に対する非選択的な成長促進剤にさらす(全体の汚染物質の数がそれによって増加/増殖するため一般的な促進効果もある。しかし、このオプションは、試料中の生育可能な微生物の「真の」数を反映しなければならない場合には避けるべきである)、および/または
−培地を、細胞の酵素を抽出できる物質にさらす(これは工程bにおける基質の変換も促進するので第1の選択肢に匹敵する)。
本発明は、培地中の汚染物質の測定のためのキットも想定している。このキットは、
−フィルターの流入側に汚染物質を保持するのに十分小さいポアサイズをもつフィルターを有する少なくとも1つの無菌フィルター機器と、
−既知容量の培地を、フィルターを通過させる手段(たとえばシリンジ)と、
−汚染物質との相互作用時に検出可能な成分を放出する少なくとも1つの試薬(検出可能な成分の量は、試薬と相互作用した汚染物質の量と相関できる)(たとえば上で教示した基質)と、
−a)既知容量の培地を得て、それを無菌フィルター機器を通過させ、b)フィルターの流入側を試薬と接触させ、c)試薬を、フィルターの流入側にあるであろう汚染物質と相互作用させ、d)検出可能な成分を定量的に検出するための工程を記載した説明書と
を有する。
材料と方法
使用した培地
R2A寒天(g/リットル):イースト抽出物0.5;プロテオースペプトン0.5;カゼイン加水分解物0.5;グルコース0.5;可溶性スターチ0.5;ピルビン酸ナトリウム3;リン酸水素二カリウム0.3;硫酸マグネシウム0.05;寒天−寒天12.0。
別に記述していなければ、全ての薬品はメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツから入手した。
培養可能な細菌の計数、ヘテロトロピックプレートカウント(HPC)を、飲料水中においてヨーロッパ規格DS/EN ISO6222に従って実施した。試料を、酸リンス/オートクレーブにかけたブルーキャップボトルに移し、5℃で保管してから分析した。全ての試料をサンプリングから4−5時間以内に分析した。ある容量の未処理試験試料およびペプトン希釈試験試料をペトリ皿に入れた。その後、15−20mlの溶融イースト抽出物培地を加え、穏やかに回転して注意深く混合した。その後、培地をセットした。プレートを22±2℃で68±4時間および36±2℃で44±4時間、転化およびインキュベートした。結果を、コロニー形成ユニットの数/ミリリットル水試料(cfu/ml)として示した。
全体の細菌カウントを、アクリジンオレンジ直接カウント(AODC)を用いて得た。分割試料をブラックNucleporeポリカーボネート0.2ミクロンポアサイズのフィルターにより最大150mmHgでろ過した。その後、フィルターを2容量の8ml緩衝液(クエン酸−リン酸、pH5.2)で洗った。次に、フィルターをアクリジンオレンジ(最終濃度0.02%)で3分間ステインした後、3mlの無菌化Milli−Q水で2回洗い、顕微鏡スライド上に載せた。フィルターをエピ蛍光顕微鏡を用いて分析した。各々のスライドについて、少なくとも10の顕微鏡フィールドを観察し、フィルターあたり少なくとも400個の細胞をカウントした。細菌の数を、細菌細胞の数/ml試験試料として計算した。
液体試験試料を、0.22μm express 33mm無菌Millexシリンジ駆動フィルターユニット(Millpore社、ベドフォード、マサチューセッツ州、アメリカ)を通してろ過する。再使用可能なプラスチックシリンジを用い、次に、フィルターユニットを酵素基質を含む適切な緩衝液で飽和する。フィルターを固定時間インキュベートする。その後、インキュベーション混合物を、2mlのpH10.6のグリシン−NaOH緩衝液を用いて洗い流すか、または再使用可能なプラスチックシリンジを用いて空気圧をかけることによってフィルターユニットから直接に得る。分割試料をピペットで収集し、10×10mmのプラスチック蛍光キュベット(サーシュテット、ドイツ)または100マイクロリッターのキュベット(ターナーバイオシステムズ、アメリカ)へそれぞれ移す。蛍光出力を、カスタマイズしたMycoMeter蛍光分析計(ターナーバイオシステムズ、アメリカ)により、365nmの励起波長および465nmの発酵波長で測定する。酵素活性を、4−メチルウンベリフェリル誘導体の酵素分解時に放出される蛍光団である4−メチルウンベリフェロンによって生じる蛍光として示す。活性を、蛍光単位/時間単位/mlとして示す。
飲料水希釈シリーズ中における、APase活性と細菌数との間の線形性
飲料水をMycoMeter実験室の蛇口からサンプリングし、イースト抽出物を加えて125mg/lの最終濃度にした。その後、試料を室温でインキュベートした。細菌の成長を、分光光度計でOD620測定によりモニターした。細菌の成長が後期log段階(OD=0.04)に達したときに、ヘテロトロピックプレートカウント(HPC)の測定のためにサンプリングした。飲料水の分割試料を、ろ過しオートクレーブにかけた飲料水で100、250、500、750および1000倍に希釈した。その後、アルカリ性ホスファターゼ(APase)活性を、上記の材料および方法のセクションで説明した標準的な手法により、各々の希釈液について3度測定した。
微量のイースト抽出物を添加した飲料水試料中のインキュベーション時間によるAPase活性の線形な増加
飲料水をMycoMeter実験室の蛇口からサンプリングし、イースト抽出物を加えて125mg/lの最終濃度にした。その後、試料を室温でインキュベートした。細菌の成長を、分光光度計でOD620測定によりモニターした。細菌の成長が後期log段階(OD=0.04)に達したときに、材料および方法のセクションで説明した標準的な手法に従ってAPase活性の測定のために水をサンプリングした。飲料水試料を、ろ過しオートクレーブにかけた飲料水で100倍に希釈した。その後、15、30、45および60分というインキュベーション時間を変えて、APase活性を3度測定した。図2はAPase活性対インキュベーション時間の散布図を示す。結果は、インキュベーション時間とAPase活性との間の線形な関係を示している。また、結果は、試料を基質分子と接触させる時間を単純に増加することによって、本方法の感度を増すことができることを示している。
飲料温水中における、APase活性と培養可能な細菌の見積もったコロニー形成ユニットとの間の相関
水試料を、1年間の期間にわたって、病院内の6つの水出口から得た。24時間以内に、水試料をAPase活性について分析した。材料および方法のセクションで説明したデンマーク規格DSF5984に従って、商業的な研究所によってHPCカウントを行った。図3はAPase活性とHPCの散布図を示す。結果は、飲料温水中におけるAPase活性とHPCとの間の正の線形な相関(r=0.93、p<0.001)を示している。
飲料水中における、APase活性と培養可能な細菌の見積もったコロニー形成ユニットとの間の相関
試料を、個人住宅、ビジネスおよび公共建物を含む飲料水系の範囲から得た。サンプリングの2−12時間以内に分析を行った。上記の材料および方法のセクションで説明した標準的な手法に従って、培養可能な細菌の計数とAPase活性の測定を行った。図4は飲料水試料中における、APase活性とHPCの散布図を示す。結果は、APase活性とHPCとの間の正の線形な相関(r=0.85、p<0.001)を示している。
飲料温水中における、APase活性とアクリジンオレンジ直接カウント(AODC)との間の相関
試料を、個人住宅、ビジネスおよび公共建物を含む飲料水系の範囲から得た。サンプリングの24時間以内に分析を行った。材料および方法のセクションで説明したように、AODCを行った。図5は飲料温水中における、APase活性とAODCの散布図を示す。結果は、APase活性とAODCとの間の強い正の線形な相関(r=0.78、p<0.001)を示している。
N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性と真菌胞子バイオマスとの間の線形性
真菌Penicillium communeを用いた寒天培養(麦芽抽出物寒天)により、真菌胞子の懸濁液を調製した。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]汚染物質を含むことが疑わしい培地のための試料調製方法であって、a)既知容量の前記培地を、フィルターを通して流入側から流出側へ通過させることによって、フィルターの流入側で汚染物質を濃縮し、b)フィルターの流入側を、汚染物質との相互作用により各々検出可能な成分を生じる少なくとも1つの基質を含む液体ビヒクルに接触させ、c)フィルターの流入側で、検出可能な成分を液体ビヒクル中で検出させるのに十分なある時間の間、基質を汚染物質と相互作用させることを含む方法。
[2]工程の前に、培地を、汚染物質を保持しないがより大きな粒子を保持するプレフィルターに通す[1]に記載の方法。
[3]前記汚染物質は、細菌;真菌類、たとえば糸状菌およびイースト;藻類;原生動物;細菌からの胞子;真菌胞子;ならびに花粉およびその断片からなる群より選択される[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記培地は液体培地である[1]ないし[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記液体培地は、環境水、飲料水、温水、工業水、工程水、その場での洗浄水、固体材料の液体抽出物、懸濁化または可溶化表面の試料、ならびに液体工業製品たとえば化粧品、医薬品、および食品からなる群より選択される[4]に記載の方法。
[6]前記液体培地の粘度を、工程aの前に下げる[4]または[5]に記載の方法。
[7]前記粘度を、希釈または化学薬品たとえば溶解促進剤もしくは洗剤による処理によって下げる[6]に記載の方法。
[8]前記培地は気体培地である[1]ないし[3]のいずれかに記載の方法。
[9]前記気体培地は、空気、たとえば無菌施設からの空気、層流空気流機器もしくは環境の空気である[8]に記載の方法。
[10]前記フィルターは、培地中の実質的に全ての汚染物質を保持するのに十分小さいポアサイズを有する[1]ないし[9]のいずれかに記載の方法。
[11]前記フィルターは、検出可能な成分を、フィルターを通過させるのに十分大きいポアサイズを有する[10]に記載の方法。
[12]前記ポアサイズは最大で20μmである[11]に記載の方法。
[13]前記ポアサイズは少なくとも0.1μmである[11]または[12]に記載の方法。
[14]少なくとも1つの基質は、汚染物質に特異的な酵素によって開裂することにより、検出可能な成分を生成する[1]ないし[13]のいずれかに記載の方法。
[15]前記酵素は、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、スルファターゼ、ヌクレアーゼおよびフォスファターゼたとえばアルカリフォスファターゼからなる群より選択される[14]に記載の方法。
[16]前記酵素は、微生物によって構造的に表現される[14]または[15]に記載の方法。
[17]少なくとも1つの基質は、検出可能な成分として青色、緑色および赤色蛍光生成物を生成する蛍光発生基質または発色基質である[14]ないし[16]のいずれかに記載の方法。
[18]少なくとも1つの基質は、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート ジナトリウム塩;9h−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)ホスフェート アンモニウム塩;フルオレセインジホスフェート テトラアンモニウム塩;メチルウンベリフェリル誘導体たとえば6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート、4−メチルウンベリフェリルホスフェート ジクロロヘキシルアンモニウム塩三水和物、4−メチルウンベリフェリルホスフェート遊離酸;4−メチルウンベリフェリルホスフェート ジリチウム塩、4−メチルウンベリフェリルホスフェート−β−N−アセチルグルコサミニド、およびトリフルオロメチルウンベリフェリルホスフェート;4−ニトロフェニルホスフェートの塩;ならびにルソルフィンホスフェートからなる群より選択される[14]ないし[17]のいずれかに記載の方法。
[19]前記検出可能な成分は、最大で100ピコモル、好ましくは最大で50ピコモル、より好ましくは最大で20ピコモル、さらにより好ましくは最大で10ピコモル、最も好ましくは最大で1ピコモルの量で検出可能である[14]ないし[18]のいずれかに記載の方法。
[20]合わせて1つの単一測定信号値になる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも2つの基質を用いる[1]ないし[19]のいずれかに記載の方法。
[21]区別できる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも2つの基質を用いる[1]ないし[20]のいずれかに記載の方法。
[22]前記汚染物質が生育可能な微生物である[1]ないし[21]のいずれかに記載の方法。
[23]前記液体ビヒクル中の基質の量は、検出可能な成分の生成速度を制限しない[1]ないし[22]のいずれかに記載の方法。
[24]検出可能な成分の生成速度は、既知容量の基質中の汚染物質の量の関数である[23]に記載の方法。
[25]前記関数は線形である[24]に記載の方法。
[26]いくつかの異なる既知容量の基質を、各々、工程aにおいてフィルターを通過させ、少なくとも1つの容量が好適な数の汚染物質を含むようにする[1]ないし[25]のいずれかに記載の方法。
[27]前記フィルターは、クローズドな無菌フィルター機器の一部である[1]ないし[26]のいずれかに記載の方法。
[28]前記クローズドな無菌フィルター機器は、使い捨てできる[27]に記載の方法。
[29]前記クローズドな無菌フィルター機器は、フィルターおよびフィルターハウジングを1つの不可逆的にクロ−ズドな構造ユニットに一体化する[27]または[28]に記載の方法。
[30]前記クローズドな無菌フィルター機器の最長の断面軸は、10cmの長さを超えない[27]ないし[29]のいずれかに記載の方法。
[31]工程cにおける相互作用を、基質と汚染物質との接触を遮断することによって停止する[1]ないし[30]のいずれかに記載の方法。
[32]前記遮断を、前記フィルター機器から前記液体ビヒクルを排出させ、一方で汚染物質をフィルター機器に保持させることによって得る[31]に記載の方法。
[33]前記液体ビヒクルを、フィルターの流入側から流出側の方向に、前記フィルター機器から排出させる[32]に記載の方法。
[34]排出を、フィルターの流入側に高い圧力をかけるか、またはフィルターの流出側に低い圧力をかけることによって得る[33]に記載の方法。
[35]工程cにおける相互作用をフィルター上で停止するか、または相互作用を停止しない[1]ないし[30]のいずれかに記載の方法。
[36]工程cの後に、定量的または定性的に前記液体ビヒクル中の検出可能な成分を検出し、成分の検出を試料中の汚染物質の量または存在に相関させることを伴う工程d)を有する[1]ないし[35]のいずれかに記載の方法。
[37]工程dにおける検出を、検出可能な成分の蛍光特性を測定することによって行う[36]に記載の方法。
[38]工程dにおける蛍光を、液体ビヒクルで直接測定し、液体ビヒクルと汚染物質との接触を遮断しない[37]に記載の方法。
[39]工程dにおける相関は、標準状態での汚染物質の量と検出可能な成分の量との関係を表す、予め決定された標準曲線の使用を含む[36]ないし[38]のいずれかに記載の方法。
[40]検出をマイクロタイターシステムで行う[36]ないし[39]のいずれかに記載の方法。
[41]汚染物質は、工程aの前または工程bにおいて、信号を増強させる影響を受ける[1]ないし[40]のいずれかに記載の方法。
[42]信号を増強させる影響は、その後の検出における全体の感度を増加させるか、特定の種類の汚染物質のその後の検出を有利にするか、特定の種類の汚染物質の検出を減少させる[41]に記載の方法。
[43]信号を増強させる影響は、酵素促進物質、選択的な温度または温度範囲、選択的なpH、選択的な塩濃度、非選択的な成長促進剤、および選択的な成長促進物質から選択される[41]に記載の方法。
[44]工程aの前に培地のインキュベーションを行う[1]ないし[43]のいずれかに記載の方法。
[45]前記インキュベーションは、−物質を誘導し、それによって検出可能な成分の検出を促進する、酵素による処理、および/または−培地を、イースト、真菌または微生物に対する選択的な物質にさらす、および/または−培地を、微生物に対する非選択的な成長促進剤にさらす、および/または−培地を、細胞の酵素を抽出できる物質にさらす
ことを伴う[44]に記載の方法。
[46]培地中の汚染物質の測定のためのキットであって、−フィルターの流入側に汚染物質を保持するのに十分小さいポアサイズをもつフィルターを有する少なくとも1つの無菌フィルター機器と、−既知容量の培地を、フィルターを通過させる手段と、−汚染物質との相互作用時に検出可能な成分を放出する少なくとも1つの試薬(検出可能な成分の量は、試薬と相互作用した汚染物質の量と相関できる)と、−a)既知容量の培地を得て、それを無菌フィルター機器を通過させ、b)フィルターの流入側を試薬と接触させ、c)試薬を、フィルターの流入側にあるであろう汚染物質と相互作用させ、d)検出可能な成分を定量的に検出するための工程を記載した説明書とを有するキット。
[47]機器に保持された汚染物質と、汚染物質に接触したときに検出可能な成分を放出する基質との間の反応のための反応容器としての、クローズドな無菌フィルター機器の使用方法。
Claims (50)
- 汚染物質を含むことが疑わしい培地中の汚染物質を検出する方法であって、以下の連続工程:a)既知容量の前記培地を、フィルター機器中においてフィルターを通して流入側から流出側へ通過させることによって、フィルター機器中においてフィルターの流入側で汚染物質を濃縮する工程と、b)フィルター機器中においてフィルターの流入側を少なくとも1つの基質を含む液体ビヒクルに接触させる工程であって、前記少なくとも1つの基質が汚染物質中に存在する酵素との相互作用により検出可能な成分を生じさせる工程と、c)フィルター機器中においてフィルターの流入側で、検出可能な成分を液体ビヒクル中で検出させるのに十分なある時間間隔の間、基質を汚染物質と相互作用させる工程と、d)液体ビヒクルを、この液体を押し通すことによって、フィルターの流入側からフィルターの流出側に排出させる工程と、e)工程d)で排出された液体ビヒクル中の検出可能な成分を定量的または定性的に検出し、成分の検出を試料中の汚染物質の量または存在に相関させる工程とを含む方法。
- 工程aの前に、培地を、汚染物質を保持しないがより大きな粒子を保持するプレフィルターに通す請求項1に記載の方法。
- 前記汚染物質は、細菌;真菌類;藻類;原生動物;細菌からの胞子;真菌胞子;ならびに花粉およびその断片からなる群より選択される請求項1または2に記載の方法。
- 前記真菌は、糸状菌およびイーストから選択される請求項3に記載の方法。
- 前記培地は液体培地である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記液体培地は、環境水、飲料水、温水、工業水、工程水、その場での洗浄水、固体材料の液体抽出物、懸濁化または可溶化表面の試料、および液体工業製品からなる群より選択される請求項5に記載の方法。
- 前記液体培地は液体工業製品であり、前記液体工業製品は化粧品、医薬品、および食品から選択される請求項6に記載の方法。
- 前記液体培地の粘度を、工程aの前に下げる請求項5ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粘度を、希釈または化学薬品による処理によって下げる請求項8に記載の方法。
- 前記化学薬品は溶解促進剤および洗剤から選択される請求項9に記載の方法。
- 前記培地は気体培地である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記気体培地は空気である請求項11に記載の方法。
- 前記空気は、無菌施設からの空気、層流空気流機器からの空気および環境の空気から選択されるものである請求項12に記載の方法。
- 前記フィルターは、培地中の全ての汚染物質を保持するのに十分小さいポアサイズを有する請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィルターは、検出可能な成分にこのフィルターを通過させるのに十分大きいポアサイズを有する請求項14に記載の方法。
- 前記ポアサイズは最大で20μmである請求項15に記載の方法。
- 前記ポアサイズは少なくとも0.1μmである請求項15または16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基質は、汚染物質に存在する酵素によって開裂することにより、検出可能な成分を生成する請求項1ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素は、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、スルファターゼ、ヌクレアーゼおよびフォスファターゼからなる群より選択される請求項18に記載の方法。
- 前記酵素はフォスファターゼであり、前記フォスファターゼはアルカリフォスファターゼである請求項19に記載の方法。
- 前記酵素は、微生物によって構成的に発現される請求項18または19に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基質は、検出可能な成分として青色、緑色および赤色の蛍光生成物または発光生成物をそれぞれ生成する蛍光発生基質または発色基質である請求項18ないし20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基質は、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート ジナトリウム塩;9h−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)ホスフェート アンモニウム塩;フルオレセインジホスフェート テトラアンモニウム塩;メチルウンベリフェリル誘導体;4−ニトロフェニルホスフェートの塩;ならびにルソルフィンホスフェートからなる群より選択される請求項18ないし22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記メチルウンベリフェリル誘導体は、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート、4−メチルウンベリフェリルホスフェート ジクロロヘキシルアンモニウム塩三水和物、4−メチルウンベリフェリルホスフェート遊離酸、4−メチルウンベリフェリルホスフェート ジリチウム塩、4−メチルウンベリフェリル−β−N−アセチルグルコサミニド、およびトリフルオロメチルウンベリフェリルホスフェートから選択されるものである請求項23に記載の方法。
- 前記検出可能な成分は、最大で100ピコモルの量で検出可能である請求項18ないし24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な成分は、最大で50ピコモルの量で検出可能である請求項25に記載の方法。
- 前記検出可能な成分は、最大で20ピコモルの量で検出可能である請求項25に記載の方法。
- 前記検出可能な成分は、最大で10ピコモルの量で検出可能である請求項25に記載の方法。
- 前記検出可能な成分は、最大で1ピコモルの量で検出可能である請求項25に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基質は、合わせて1つの単一測定信号値になる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも2つの基質を含む請求項1ないし29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基質は、区別できる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも2つの基質を含む請求項1ないし29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記汚染物質が生育可能な微生物である請求項1ないし31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記液体ビヒクル中の基質の量は、前記検出可能な成分の生成速度を制限しない請求項1ないし32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な成分の前記生成速度は、既知容量の培地中の汚染物質の量の関数である請求項33に記載の方法。
- 前記関数は線形である請求項34に記載の方法。
- いくつかの異なる既知容量の培地を、各々、工程aにおいてフィルターを通過させ、少なくとも1つの容量が好適な数の汚染物質を含むようにする請求項1ないし35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィルターは、クローズドな無菌フィルター機器の一部である請求項1ないし36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クローズドな無菌フィルター機器は使い捨てできる請求項37に記載の方法。
- 前記クローズドな無菌フィルター機器は、フィルターおよびフィルターハウジングを1つの不可逆的にクロ−ズドな構造ユニットに一体化する請求項37または38に記載の方法。
- 前記クローズドな無菌フィルター機器の最長の断面軸は、10cmの長さを超えない請求項37ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 排出を、フィルターの流入側に高い圧力をかけるか、またはフィルターの流出側に低い圧力をかけることによって得る請求項1ないし40のいずれか1項に記載の方法。
- 工程eにおける検出を、検出可能な成分の蛍光特性を測定することによって行う請求項1ないし41のいずれか1項に記載の方法。
- 工程eにおける相関は、標準状態での汚染物質の量と検出可能な成分の量との関係を表す、予め決定された標準曲線の使用を含む請求項1ないし42のいずれか1項に記載の方法。
- 検出をマイクロタイターシステムで行う請求項1ないし43のいずれか1項に記載の方法。
- 汚染物質は、工程aの前または工程bにおいて、信号を増強させる影響を受け、前記信号を増強させる影響は、酵素促進物質、選択的な温度または温度範囲、選択的なpH、選択的な塩濃度、非選択的な成長促進剤、および選択的な成長促進物質から選択されるものである請求項1ないし44のいずれか1項に記載の方法。
- 信号を増強させる影響は、その後の検出における全体の感度を増加させるか、特定の種類の汚染物質のその後の検出を有利にするか、特定の種類の汚染物質の検出を減少させる請求項45に記載の方法。
- 工程aの前に培地のインキュベーションを行う請求項1ないし46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベーションは、
−物質を誘導し、それによって検出可能な成分の検出を促進する、酵素による処理、
−培地を、イースト、真菌または微生物に対する選択的な物質にさらすこと、
−培地を、微生物に対する非選択的な成長促進剤にさらすこと、および
−培地を、細胞の酵素を抽出できる物質にさらすこと
からなる群より選択される少なくとも1つを伴う請求項47に記載の方法。 - 工程cにおいて、フィルターの流入側で、5分ないし24時間の時間間隔の間、基質を汚染物質と相互作用させる請求項1ないし48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記間隔は20分ないし12時間である請求項49に記載の方法。
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