JP5132621B2 - 核酸定量法、及び核酸定量装置 - Google Patents
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Description
[トータルRNA濃度(μg/mL)]
=A(260)×40×10/光路長(mm)・・・式(1)
但し、トータルRNAの定量は、公知の方法を制限なく使用することができる。なお、二本鎖DNA濃度を求める場合には、上記式(1)の定数40を50に、一本差DNAの場合には、定数40を33に変更することにより求めることができる。
[実施例]
<標準曲線の作成実験>
(工程1−1)siRNA(キアゲン社)を投与していないマウスを屠殺後、肝臓を摘出し、その重量を測定した。測定後、トータルRNA抽出用のフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するQIAzol組織溶解液(キアゲン社製)を、肝臓100mgあたり7mL加えた。そして、その重量を測定後、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
[トータルRNA濃度(μg/mL)]
=A(260)×40×10/光路長(mm)×[a]・・・式(2)
[抽出・カラム精製前の標識siRNA量]
=D×([siRNA溶出液の示す蛍光強度]^E)・・・式(3)
なお、D、Eはグラフソフト(Delta Graph ver.5)を用いて算出した。
(工程a−1)陽性荷電ポリマーPolyMag(OZ Biosciences社, フランス)(8.3μL)と、陰性荷電をもつ蛍光標識核酸であるAlexa Fluoro(登録商標)488によって標識されたsiRNAAll Stars Negative Control(標識siRNA)を室温(20℃)で混合し、5分間放置した。静電結合により得られたPolyMag/標識siRNA複合体の全量を、BALB/cマウスの尾静脈に投与した。
(工程d−1)各臓器に集積(分布)した標識siRNA量は、下記の式(4)により算出される。ここで、C(mg)は、工程b−2による破砕及び懸濁処理後の0.7mLのサンプル重量を示す。また、B(mg)は、当該破砕及び懸濁処理前の各臓器重量A(mg)と、各臓器に加えた組織溶解液の重量との和である。本実施例においては、臓器25mgあたりに組織溶解を0.7mL加えているので、以下の式(5)により求めることができる。さらに、1/[b]は、工程b−4の工程でサンプルの希釈率を示す。
[各臓器に集積(分布)した標識siRNA量]
=[抽出・カラム精製前の標識siRNA量]×[B(mg)/C(mg)]×[b]
・・・式(4)
B(mg)=A(mg)+A(mg)/25(mg)×0.7×[組織溶解液の比重]
・・・式(5)
工程b−1において、各臓器の重量はA(mg)であったので、各臓器に分布した臓器単位重量(例えば、臓器1mg)あたりのsiRNA重量比は、下記の式(6)により算出される。
[各臓器に分布した臓器単位重量あたりのsiRNA重量比]
=[各臓器に集積(分布)した標識siRNA量]/A(mg)・・・式(6)
<標準曲線(内部標準用)の作成実験>
(工程2−1)Alexa Fluoro(登録商標)647によって標識されたsiRNAAll Stars Negative Control(以降、「対比用標識siRNA」とも称する)の原液をRNA分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ1.5mL容のマイクロチューブ(エッペンドルフ製)内で、10.8ng、32.4ng、97.2ng、291.6ng、874.8ngの対比用標識siRNAを含む50μLの希釈系列を作製した。なお、対比用標識siRNAとは、前述したとおり、標識する蛍光色素の種類のみが標識核酸と異なるものであって、結合されている核酸は同一(遺伝子配列は同一)のものを云う。
[対比用標識siRNA量]
=F×([対比用標識siRNA溶液の示す蛍光強度]^G) ・・・式(7)
なお、F、Gは前記のグラフソフトを用いて算出した。
(工程3−1)Alexa Fluoro(登録商標)488によって標識されたsiRNAAll Stars Negative Control(以降、「標識siRNA」とも称する)の原液をRNA分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ1.5mL容のマイクロチューブ(エッペンドルフ製)内で、0ng(純水のみ)、10.8ng、32.4ng、97.2ng、291.6ng、874.8ngの標識siRNAを含む50μLの希釈系列を作製した。
8nmで蛍光強度を測定し記録した。
[標識siRNA量]=H×([標識siRNA溶液の示す蛍光強度]^I)
・・・式(8)
なお、H、Iは前記のグラフソフトを用いて算出した。
(工程2a−1)陽性荷電ポリマーPolyMag(8.3μL)と、陰性荷電をもつ標識siRNAを室温で混合し、5分間放置した。静電結合により得られたPolyMag/標識siRNA複合体の全量を、BALB/cマウスの尾静脈に投与した。
[最終的なsiRNA回収率:E']=D'(ng)/291.6(ng)・・式(9)
実験では、回収率は23.2%と計算された。
工程3−3による破砕及び懸濁処理後の0.7mLのサンプル重量はC'(m
g)、工程3−2による各臓器重量と、各臓器に加えた組織溶解液の重量の和はB'
(mg)である。B'(mg)は、臓器25mgあたりに組織溶解液を0.7mL加えているので、上記式(5)と同様にして求めることができる。さらに、工程3−3で算出した式(8)、及び工程2d−1で求めた上記式(9)より、臓器に集積(分布)した標識siRNA量は下記の式(10)により算出される。
[各臓器に集積(分布)した標識siRNA量]
=[抽出・精製前の標識siRNA量]×[B'(mg)/C'(mg)]/E'
・・・式(10)
実験では、当該siRNA量は2183ngと計算された。
工程3−2において、各臓器の重量はA'(mg)であったので、各臓器に分布した臓器単位重量(例えば、臓器1mg)あたりのsiRNA重量比は、下記の式(11)により算出される。
[各臓器に分布した臓器単位重量あたりのsiRNA重量比]
=[各臓器に集積(分布)した標識siRNA量]/A'(mg)・・・式(11)
実験では、当該siRNA量は1.980×0−6と計算された。
実施例2により求めた式(9)、式(10)、式(11)により得た実験値は、実施例1と概ね近似した数値であることを確認した。
3 カラム
10 サンプル
11 最上層
12 中間層
13 下層
20 サンプル
30 トータルRNA溶液
Claims (9)
- 蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物(ヒトを除く)に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程(a)と、
前記生物(ヒトを除く)の体内に分布した、若しくは前記細胞に取り込まれた前記標識核酸を、生物(ヒトを除く)由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程(b)と、
前記工程(b)により得た精製物の蛍光強度を測定する工程(c)と、
前記工程(c)の測定値に対し、前記工程(b)中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う工程(d)と
を備える核酸の定量法。 - 前記核酸は、塩基が10以上、100以下の低分子の核酸であることを特徴とする請求項1に記載の核酸の定量法。
- 前記核酸は、siRNA又はmiRNAであることを特徴とする請求項1又は2に記載の核酸の定量法。
- 前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程(b)の抽出前、及び精製後それぞれにおいて、前記工程(c)と同様に蛍光強度を測定して前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸の定量法。 - 前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程(b)の前記抽出及び精製後において、前記工程(c)と同様に蛍光強度を測定し、前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸の定量法。 - 前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該サンプルに対して前記工程(b)の精製を実施する前後それぞれにおいて、前記工程(c)と同様に蛍光強度を測定して前記精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸の定量法。 - 前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程(b)の抽出前に前記サンプルを所定量加え、
前記抽出を実施する前と、前記精製を実施した後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程(c)と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記抽出及び精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸の定量法。 - 前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程(b)の精製前に前記サンプルを所定量加え、
前記精製を実施する前後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程(c)と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸の定量法。 - 蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物(ヒトを除く)に投与して生物(ヒトを除く)の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた前記標識核酸を、生物(ヒトを除く)由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製するサンプル調製手段と、
前記サンプル調製手段により得た精製物の蛍光強度を測定する測定手段と、
前記測定手段により得た測定値に対し、前記サンプル調製手段中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う手段と
を備える核酸の定量装置。
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