JP5129119B2 - 標識フリーバイオセンサおよび細胞 - Google Patents
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Description
(I.関連出願の説明)
本出願は、2005年4月5日に出願された「標識フリーバイオセンサおよび細胞」と称する米国特許出願第60/668,908号の優先権を主張し、その内容が参照によりここに引用される。
最終的に市場に新薬を出すための薬剤発見および開発プロセスは、複雑かつ高価なプロセスである。伝統的に、薬剤発見の初期では、親和性結合アッセイを利用し、それは一般に試験管内でなされ、関心のある標的効果について潜在的薬剤化合物の機能上の限られた情報を提供するものであった。
前臨床/臨床試験において細胞ベースのアッセイまたは動物モデルベースの確証アッセイで試験されるときに、これらの潜在的な前例試験の多くは失敗して高い消耗の結果となる。
近年、薬剤および生物技術業界において流行しているものは高内容スクリーニング技術を含む革新的な細胞ベースの技術である。
これらのアッセイ技術は、標的と化合物の相互作用の細胞現象上および機能上の運動の細胞ベースの情報を提供する。
得られたデータは、シグナル伝達経路、薬剤作用機構、効能、選択作用および細胞毒性上の情報を含む。
大部分の既存の細胞ベース技術は画像化に基づく検出のため蛍光性標識または発光標識の使用を必要とし、それらは一般に孤立性の細胞内の事象(例えば、Ca2+フラックス、cAMP生成および蓄積、標的転位、リポータ遺伝子生成、その他)を評価することに集点が当てられている。
細胞機能の複雑性のため、細胞応答は一般に多数シグナルの結合から生じ、そして、所定の単一細胞の応答またはシグナルに基づくアッセイ技術は薬物刺激に対する全体的に統合した細胞応答に関しての情報生成ができない傾向がある。
標識の使用または人工エンハンスメント(例えばトランスフェクションまたはRNAiノックアウト)またはリポータ遺伝子システムの使用は、たとえば、関心ある標的である実在の細胞生理を解明に有害方法である場合がある。
これらの理由のため、生体細胞上の分子の効果を分析可能とするため持続的要望があり、分析としてたとえば、分子が特定のシグナル伝達経路(例えばGタンパク質共役型受容体(GPCR)または上皮増殖因子受容体(EGFR))を遂行するかどうか、あるいは、分子によって細胞に増殖させるかまたは細胞死または停止発育が生じるどうか、がある。
標識フリーまたは標識無依存検出(LID)バイオセンサの使用は望ましい。なぜならバイオセンサがしばしば複雑な標識付加ストラテジおよび検出機構の必要性を回避するからである。
標識フリーバイオセンサは、高スループットスクリーニング方法に、より好適である。
シグナル伝達経路および細胞増殖および死の分析を含む細胞アッセイのいかなるタイプも実行する標識フリーバイオセンサを使用する方法とシステムが、開示される。
標識フリーバイオセンサおよび細胞でのそれらの使用に関する方法および組成物が、開示される。
(IV. 図面の簡単な説明)
添付の図面(これは中で取り入れられて、本明細書の部分を構成する)は、いくつかの実施例を例示して、記述と共に開示された組成物および方法を例示する。
図は、配列された角度測定システムを使用して、得られた約95%の細胞密集度を有する細胞培養の後における、5列の7センサの共鳴バンドの像を示した。
配列された角度測定システムは、各々がOWGセンサを照らすように光ビームアレーを生成する発光システムと、センサから反射光ビームからの全応答を受信する受信システムと、からなる。
このシステムは、マルチプレックスシステムから付着細胞の同時測定応答を可能とする。
もしセンサ列6×7または7×7を利用できなければ、本例のように5×7でも可能であり、光生成および受信システムによっていかなる構成も可能である。
これらの計測は、たとえば、約3秒の時間分解能でリアルタイムで実行できる。
破線の円は、細胞密度が光顕微鏡画像によって確認できるように、このセンサにわたって平坦でないことを示す。
示される例は光導波路グレーティングセンサであり、屈折率ns=1.50のガラス基質上の厚さdF(75ナノメートル)及び高屈折率(nF=2.36)を有するNb2O5の薄膜と、全体的な屈折率nA=1.37を有する導波薄膜上の細胞付着層と、屈折率約1.33(nc)を有する周囲の培地薄膜と、からなる。
OWGバイオセンサは、回折格子(グレーティング)によって導波路への光の共振結合に基づくエバネッセント波センサである。
レーザは角度を変化させて導波路を照らされ、そして、光は特定の角度(導波モードの実効屈折率(N)によって決定される角度)のみで、導波路に結合される。
リガンド起因性標的活性化は、標的への標的相互作用成分の加入、結果の標的複合体の運動、および細胞の細胞骨格構造の潜在的リモデリング(すなわち形態学的変化)を導く。
かかる運動または変化が細胞が培養されるOWGセンサ界面のまさしくその周辺で起こるときに、矢印によって指示したように、DMRシグナルは特定時間で発生して、リアルタイムでモニタされ得る。
付着細胞層内のリガンド起因性指向性質量再分布は実効屈折率の変化を導き、そして、順に、それは外部被結合光の角度シフトを結果として起こす。
図2bは、検知体積内で刺激作用によって媒介された垂直の質量再分布を検出するための3層構成を示す。
細胞の底一部は、多数の等間隔かつ同質の薄層からなるように観察され、各層がそれ自身の屈折率ni、タンパク質濃度Ci、距離Zi (センサ界面から離間した距離)を有する。
周期Lを有するグレーティングは、屈折率nFおよび厚さdFを有する導波薄膜によって包埋される。
導波薄膜は、屈折率nsを有する基質の上面に置かれる。
導波光はプレーナー型導波路を伝搬性するが、これは折れ線波として観察される。
検知体積内の横方向質量分布の不均質性は、所定モードの共鳴ピークの広幅化および平坦***を結果として起こす。
このいわゆる逆の対称性導波路構成において、これは概してガラス製の底支持体の有無にかかわらずナノ多孔質シリカの1−100ミクロン厚層で支えられる導波薄膜(例えばNb2O5)からなる。
ナノ多孔質シリカは約1.1の実効屈折率を有し、そして、シリカの屈折率はカバー培地の屈折率未満であり、そして、それは一般に我々の本発明の応用例の水溶液である。
角度測定システムを使用して得られるように、8nMのEGFに誘導される約95%密集度の典型的静止A431細胞の付着層の典型的な時間に依存する応答は、図6Aに示される。
図6Aのグラフに示すように、細胞内で刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態を定義する6つのパラメータには、1)全体的な動態(すなわち形状)と、2)応答の位相(例えば、この具体例において、正の指向性質量再分布(P−DMR)、ネット−ゼロ指向性質量再分布(ネット−ゼロDMR)、および、負の指向性質量再分布(N−DMR)の三位相がある)と、3)各位相の動態と、4)、P−およびN−DMR位相の合計持続期間と、5)P−およびN−DMR位相の総振幅と、6)P−からN−DMR位相への遷移時間tと、がある。
図6Bは、典型的共鳴ピーク(約90%密集度の典型的なA431細胞のTM0モードを使用して得られる)を示し、4つの付加パラメータ、7)ピーク位置、8)強度、9)形、そして、10)最大半減(PWHM)での幅いわゆる半値幅、を例示する。
図6Cは、典型的なA431細胞が約95%の密集度によって培養された複数のバイオセンサを有するバイオセンサ#5などのバイオセンサの典型的TM0共鳴性バンド像を示す。
データは、アレイ配列された角度測定システムを使用して得られ、5つの追加の特徴、11)バンド形、12)位置、13)強度、14)分配、そして、15)幅を例示する。
ここに開示されるように、これらのパラメータの全部がバイオセンサを使用しているいかなる細胞アッセイものいかなる所定の適用法のためにも、独立に、または一緒に使われ得る。
いかなるサブセットまたは組み合わせのパラメータの使用は、例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ(signature)や、EGF受容体ベースのアッセイための特定のシグニチャのような、特定アッセイのためのシグニチまたは特定アッセイ上の所定の変異を生成する。
(A) は、本発明のシステムを使用して並行して得られた、EGFの異なる濃度によって誘導された細胞応答の実時間動特性である。
EGFの終濃度は、グラフにおいて示される。
(B)はN−DMRシグナルの振幅であり、図7Aに示す遷移位相および端位相間の差分に基づくEGF濃度の関数として算出したものである。
典型的飽和曲線が得られた。
(C)は、EGF濃度の関数としての、P−DMRからN−DMRへ遷移現象のための時間tである。
(D)は、N−DMR現象の非線形回帰法を使用して得られ、EGF濃度の関数としてプロットされた値kである。
この図において、マーカーは指向性質量再分布現象若しくはシグナルを導くかまたは阻害する細胞の特定の標的またはシグナル伝達経路もしくは機能の活性化物質または不活性化物質であってもよい。
破線の矢印は、2つのステップが交換可能かまたは一緒に結合したことを示す。
ステップ804および806はここに議論される刺激性事象と考えられる。
細胞は、多数の細胞器官を含んでいる細胞原形質(概して10〜30μM)からなる。
最大の細胞器官は、大きさが3−10μmの間で概して変動する細胞核である。
細胞核はタンパク質で満たされ、そして、最も重要なものがクロマチンである。
ミトコンドリアは、0.5−1.5μmから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
他細胞成分は、小胞体(ER)(概して0.2−1μm)、リソソーム(lysomes)(概して0.2−0.5μm)、ペルオキシソーム(概して0.2−0.5μm)およびエンドソーム(概して約100nm)を含む。
これは、細胞検出のための変数である侵入深さの重要性を示し、特に細胞内部の運動またはDMR現象の探測のために重要である。
注:(1)この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。(2)得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。(3)1206はここに開示した刺激性事象と考えられる。
注:(1)この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。(2)得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。(3)1303および1304はここに開示した刺激性事象と考えられる。
このマイクロプレートは、多区画プレートであって、各ウェル(well)内で光学バイオセンサ包埋多区画を有する。
この96ウェルマイクロプレートにおいて、各ウェルは、4つの区画を含む。
各々の区画は、1つの基質包埋された導波路グレーティングを有し、細胞の単一のタイプまたは重要な標的のホストをつとめる。
4つの区画は内壁によって分離され、そして、内壁(好ましくは100ミクロン〜2ミリメータ間)の体高は各ウェルのそれら未満である(典型的には所定のマイクロプレートのもの体高)、そして、4つの区画を有する各ウェルは、たとえどんな異なる標的が各々の区画においてあることができても、細胞の多数の標的または多数タイプ上の1つの薬剤候補物質の効果を同時に検査するために用いることができる。
灰色のラインは、導波路グレーティング型バイオセンサを表す。
注:(1)この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。(2)得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。(3)1503、1504、1508および1509はここに開示した刺激性事象と考えられる。
ここに開示されるように、1706および1708は刺激性事象と考えられる。
注:
(1)このグラフに示される例は、他の細胞株CHOと比較すると取消細胞株A431のEGF−起因性DMR応答である;
(2)図に示す3つの異なる条件の下で培養された約95%密集度のA431細胞の付着層のEGF−起因性DMR応答は、20時間の0.1%のウシ胎児血清(FBS)で培養された約95%密集度のチャイニーズハムスター卵巣の付着層のそれと比較された。
EGF(32nM)の50μl 4倍溶液の添加の前に、100μl培地によってカバーされた細胞は、持続性のネット−ゼロ応答によって示されるように細胞が安定状態となるように、25μl標準ハンクス均衡塩類溶液(HBSS)が少なくとも二回15分分離して処理した。
(3)刺激性事象は、指向性質量再分布現象またはシグナルを導く特定の標的(EGFR)の活性化物質(すなわち同族リガンド、EGF)である。
そして、(4)A431細胞は、上皮増殖因子受容体(EGFR)(細胞につき約1,700,000コピー)を内生的に過剰発現する。
対照的に、CHOは内生的にEGFRを発現しない。
1801は、CHO細胞の出力データを表す。
1802は、20時間の0.1%のウシ胎仔血清(FCS)のA431細胞の出力データを表す。
1803は、10%のFCSのA431細胞の出力データを表す。
1804は、4時間の0.1%のFCSのA431細胞の出力データを表す。
ここに開示されるように、2006および2008は刺激性事象と考えられる。
ここに開示されるように、2212は刺激性事象と考えられる。
ここに開示されるように、2308は刺激性事象と考えられる。
2406および2408は、刺激性事象と考えられる。
2506、2508および2510は、刺激性事象と考えられる。
2606、2608および2610は、刺激性事象と考えられる。
図28(B)は、静止A431細胞のmβCD−誘導応答上の化合物(20nMのEGFまたは1000nMのH7)の効果を示す。
静止A431細胞は、mβCD溶液の導入の前に少なくとも40分間、対応する化合物によって前処理された。
20%のDMSOで、4つの現象、次のシグナルが観察される:
(A)DMSO溶液の導入の直後のバルク屈折率変化による大きい応答シグナル;
(B)おそらくウェル内の2つの流体の混合による小さい減少シグナル;
(C)おそらくDMSOが細胞内部で通してバイオ流体を交換するためによる、緩慢かつ安定に増加したシグナル;並びに、
(D)DMSOの高濃度毒性によって生じる細胞のタンパク質または他生体分子の減失による延長した減少されたシグナル。
観察された応答は、CHO細胞層上のそれらに対するものと同様であった。
結合モードは、横磁気波(TM0)モードである。
図31Bは、CHO細胞密集度の関数として、算出されプロットされたTM0モードを使用している最大半減(PWHM)でのピークの幅を示す。
図32Bは、DMSO(18%の終濃度を有する)の添加の後、異なる時間で記録された共鳴ピークスペクトルを示す。
右グラフの破線の矢印は、DMSO処理の後、25分の時点で共振ピークの広幅化および***を示す。
像は、緩衝液(カラム2)および18%のDMSO(カラム1)での25分処理の後、取られた。
像は、緩衝液(カラム2)およびDMSO(カラム1およびカラム3を図に示す)の異なる濃度での25分処理の後、取られた。
円は、CHO細胞上の約15%のDMSOの毒性に起因するピーク分割を示す。
細胞の異なる初期の接種数は、CHO細胞の増殖速度を研究するために用いる。
結合モードは、横磁気波(TM0)モードである。
図36Bは、CHO細胞の初期の接種数の関数として、TM0モードを使用して算出されプロットされた最大半減(PWHM)でのピーク幅を示す。
全センサのTM0モード共振像の形および位置は初期の接種細胞数に依存しているように観察され、CHO細胞の増殖速度が初期の接種細胞数に依存することを示した。
EGFRファミリの構成メンバは、細胞質のチロシンキナーゼドメイン、単一の膜貫通領域およびリガンド結合および受容体二量体化に関係している細胞外のドメインを含む。
EGFRに対するリガンドの結合は、ホモダイマの発生または他のファミリを有する受容体のヘテロダイマにを導く。
各ダイマの受容体複合体は、エフェクタタンパク質を含む異なるSrc相同2(SH2)を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める。
二量体化は、下流の細胞のシグナル伝達経路の多種多様アレーを始める自動的リン酸化(autophyosphorylation)の結果となる。
接着体タンパク質(Grb)を有する活性EGF−Rダイマー複合体は、解離因子(SOS)をグアニンヌクレオチドに結合した。
Grb−SOS複合体は、受容体のホスホチロシン部位に直接的にまたはShcを介して間接的に結合する。
これらのタンパク質相互作用はRasに近い接近にSOSをもたらし、Ras活性化を許容する。
その後、これはERKおよびJNKシグナル伝達経路を活性化して、すなわち、順番に、転写因子(例えばc−fos、AP−1およびElk−1)を活性化して、遺伝子形質発現を促進し、細胞増殖に貢献する。
EGF =上皮増殖因子、
EGFR =上皮増殖因子受容体、
Shc=src相同ドメインコンセンサス、
grb2 =生長因子受容体−境界タンパク質2、
SOS =哺乳動物 (son of sevenless)、
Raf=RasII活性化因子、
MEK=MAPキナーゼキナーゼ、
MAPK =マイトジェン活性タンパク質キナーゼ、
PI3K =ホスファチジルイノシトール3’キナーゼ、
PIP2 =フォスファチジルイノシトール3,4−ジホスフェート、
PIP3 =フォスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェート、
PLCγ=フォスフォリパーゼγ、
DAG =ジアシルグリセリン、
IP3 =イノシトール3,4,5トリホスフェート、
PKC =タンパク質キナーゼC))。
化合物の終濃度は、成長ホルモン(GH)、PD98059、PP1、ウオルトマニン(wortmannin)およびダイナミン(dynamin)抑制ペプチド(DIP)に対して、それぞれ、0.5μg/ml、0.1mM、1μM、0.1μMおよび50μMである。
(A) AG1478の異なる濃度を有する静止A431細胞の前処理は、32nMのEGFによって誘導された応答の供与量に依存している交互変化を示した。
(B)AG1478濃度の関数としてのN−DMRシグナルの振幅を示した。
EGFは、室温(22℃)で、A431細胞において、EGFR内部移行、細胞形態変化および指向性質量再分布を誘導した。
(A)8nMテトラメチルローダミン標識EGF(TMR−EGF)での染色と4℃の酸性液での界面−境界TMR−EGF除去との後の増殖A431(10%FBS)の蛍光像。
(B)TMR−EGFでの染色後のA431(0.1%のFBS)の蛍光像。
(C)染色と4℃の酸性液での界面−境界TMR−EGFを除去との後の静止A431(0.1%FBS) 蛍光像。
(D)示された時間の間で16nMのEGFで処理された静止A431細胞は、定着及びテキサス赤標識ファロイジン(Texas red-labeled phalloidin)染色の後、32倍拡大の蛍光−顕微鏡法を使用して、検査された。
使用した化合物濃度は、全化合物で10μMである。
使用する化合物濃度は、全ての化合物のための10μMである。
化合物添加の前に、HBSS緩衝液(インビトロジェン(Invitrogen))(「DIPなしで」と呼ぶ)、または、45分間、50μM濃度でのダイナミン抑制のペプチド(DIP)で細胞が予めインキュベートされる。
化合物添加の前に、HBSS緩衝液(インビトロジェン)(「DIPなしで」と呼ぶ)、または、45分間、50μM濃度でのダイナミン抑制のペプチド(DIP)で細胞が予めインキュベートされる。
化合物添加の前に、HBSS緩衝液(インビトロジェン)(「DIPなしで」と呼ぶ)、または、45分間、50μM濃度でのダイナミン抑制のペプチド(DIP)で細胞が予めインキュベートされる。
3つのGPCR作動薬、ブラジキニン(100nM)、カルバコール(10μM)およびクロニジン(1μM)は、EGF(8nM)により誘導されたものと比較すると、静止A431細胞の時間依存応答を誘導した。
(F) GPCR 作動薬−およびEGF−誘導応答上の10μM AG1478を有するA431の前処理。
GPCR作動薬−起因性EGFRトランスアクチベーションは、例えばタンパク質キナーゼC経路またはPI3K経路などの他機構を通ることもあり得る。
図61において示したように静止A431細胞のブラジキニン−起因性DMR応答はタンパク質キナーゼC経路を通ることもあり得る。
共鳴性導波路グレーティングバイオセンサでリアルタイムにモニタされたように、光学シグニチャは、静止A431細胞の底一部内で、動的質量再分布に関係する。
(a) Gq−タイプDMRシグナル、トロンビン(40ユニット/ml)によって例示される。
(b)Gs−タイプDMRシグナル、エピネフリン(25nM)によって例示される。
(c)Gi−タイプDMRシグナルa−MSH(ホルモンを刺激しているa−メラノサイト)(40nM)によって例示される。
(d)ニューロテンシン(40nM)によって例示されるように、ネットワーク−ゼロDMRシグナル。
作動薬溶液が導かれるときに、実線矢印(残りの図において同じ)は時間を示した。
HBSSでの細胞の前処理は正の制御として使われるだけだった。
用量依存動態力学的応答および対応する飽和曲線は、それぞれ、ATP (a, b), SLIGLR−アミド (c,d),トロンビン(e,f),およびSLIGKV−アミド (g,h)のためにプロットされた。
終濃度は、グラフにおいて示された。
用量依存動態力学的応答および対応する飽和曲線は、それぞれ、エピネフリン (a, b), アデノシンアミン cogener (ADCA) (c, d), およびNECA (e, f)のためにプロットされた。
スイッチングを視覚化するために、P−DMRシグナルの総振幅は、HTMT濃度(c)の関数として、プロットされた。
細胞を前処理するために用いたモジュレータは、ラトランキュリンA、サイトカラシンB、ファロイジンおよびノコダゾールを含み、各々10μMである。
媒介体(すなわちHBSS)だけによって前処理された細胞がコントロールとして使用された。
キナーゼ阻害物質は、GF109203x(10μM)およびKN−62(10μM)であった。
トリプシンでの処理に先行した後に、A431細胞は、トロンビン(a)、SFFLR−アミド(b)、SLIGKV−アミド(c)およびブラジキニン(d)によって刺激された。
他方、A431細胞は、トリプシンで刺激される前に、予めトロンビン(e)、SFFLR−アミド(f)、SLIGKV−アミド(g)およびブラジキニン(h)によって刺激された。
終濃度は、トロンビン、トリプシン、SFFLR−アミド、SLIGKV−アミドおよびブラジキニンで、それぞれ40ユニット/ml、200nM、20μM、20μMおよび100nMであった。
2つの刺激作用間の時間的間隔は約6分である。、実線矢印が溶液が加えられた時の時間(他図でも同じ)を示した。
トリプシンでの処理に先行した後に、A431細胞は、トロンビン(a)、SFFLR−アミド(b)、SLIGKV−アミド(c)およびブラジキニン(d)によって刺激された。
一方、A431細胞は、トリプシンによって刺激される前に予めトロンビン(e)、SFFLR−アミド(f)、SLIGKV−アミド(g)およびブラジキニン(h)によって刺激された。
終濃度は、トロンビン、トリプシン、SFFLR−アミド、SLIGKV−アミドおよびブラジキニンのため、それぞれ、40ユニット/ml、200nM、20μM、20μMおよび100nMであった。
2つの刺激作用間の時間的間隔は、約1時間であった。
比較において、αCD(α−シクロデキストリン)の効果も含まれた。
細胞表面コレステロールがmβCDにより除去され、細胞が洗浄されたあと、トロンビン溶液は特定時間で別に各ウェルに添加された。
DMRシグナルは、リアルタイムで記録された。
各々のグラフは、7つの独立応答の平均である。
(a)トリプシン媒介Ca2+可動化。
(b)トリプシン媒介DMRシグナル。
(c)トロンビン媒介DMR応答。
終濃度は、100nMのEGF、100nMトリプシンおよび40ユニット/mlトロンビンであった。
HBSS緩衝液の前処理での細胞応答は、また、コントロールとして含まれるだけだった。
(A)入射角度のシフト;
(B)正規化されたPWHM;
(C)正規化されたピーク;
(D)正規化されたピーク領域。
矢印は溶液が加えられは時間を示した。
(A)時間の関数としての入射角における動的シフト。
(B)時間の関数としての正規化されたPWHM。
(C)TR−phalloidの未処置のA431のアクチンフィラメントの着色パターン。
(D)15分間、16nMのEGFでの既処理後のテキサス赤標識ファロイジンで着色したA431のアクチンフィラメントの着色パターン。
バーは、40μMを表す。
矢印はブラジキニン溶液が加えられた時間を示した。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
2つの終末点間の差分は、ブラジキニン(ブラジキニンB2受容体作用薬)によって媒介されたP−DMR現象の総振幅を反映する。
B2受容体は、A431細胞において内生的に発現される。
細胞は、ブラジキニン刺激の前の静止状態になる。
この例では、384ウェルCoringEpicバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約90%の密集度でA431細胞を含む。
ウェルの半分は100nMでブラジキニンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液HBSSだけで処理された。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
2つの終末点間の差分は、トロンビン(PAR1受容体作用薬)によって媒介されたP−DMR現象の総振幅を反映する。
PAR1受容体は、CHO細胞において内生的に発現される。
細胞は、トロンビン促進の前に細胞を4時間のDMEM培地で培養することによる部分的に静止状態になる。
この例では、384ウェルCoringEpicバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約90%の密集度でCHO細胞を含む。
ウェルの半分は40ユニット/mlでトロンビンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液HBSSだけで処理された。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
CHO細胞は、異なる供与量でトロンビンで処理された。
(V.詳細な説明)
ここに用いられる専門用語は、かかる実施例だけを記載するためにあって、限定であることを目的としないことは、また、理解されるべきである。
(I.定義)
たとえば、「あるマーカーまたは刺激性事象」の場合は、2つ以上のマーカーまたは刺激性事象を含む。
かかる範囲が表されるときに、他の実施例は1つのかかる特定の値からおよび/または他の特定の値までを含む。
値が近似として表されるときに、同様に「約」を用いて、それは特定の値が他の実施例を形成するために、理解され得る。
各々の範囲の終末点は、他の終末点に関して、そして、他の終末点に独立して両方とも有意であると理解される。
また、ここに開示される多くの値があるが、その値自体に加えてその値の「約」も含むと理解される。
たとえば、値「10」が開示される場合、「約10」もまた、開示される。
また、ある値が値「以下」、「値以上」と開示されるとき、当業者によってよく理解されている様に、値間ので可能な範囲と開示されたと理解れる。
たとえば「10」が開示されて値である場合、「10以下」同様に「10以上」も開示される。
また、出願全体にわたって、データが多くの異なるフォーマットで提供され、このデータが、終末点および開始点を表し、データポイントのいかなる組み合わせのために変動すると、理解される。
たとえば特定のデータポイント「10」および特定のデータポイント15が開示される場合、10および15について、越える、以上、未満、以下、そして、等しい、が開示されると考慮され、また、10および15間も同様に理解される。
また、10および15間で、10、11、12、13、14および15が開示されるように、その範囲を作るその範囲間のいずれの数が開示されると理解される。
基質上の細胞の付着層は、たとえば、界面に付着される細胞の層であり、穏やかに緩衝液によって洗浄されるときに、細胞が非付着にならない。
接触またはこの単語の他形態は2以上のアイテムがそれらがさわっていると考えられるほど互いに近接していると、理解される。
接触は、概して粘着を必要としない。
接触は、たとえば、粘着を有さずに起こる。
付属する、または、この単語の他形態は、付着するより、永久的である2つ以上のアイテム間の状態に関連する。
それは、たとえば共有結合的付着を要求しない。
このように、2つ以上のアイテム間の結合の必須の強度の順においては、接触は、付属するより弱い付着より弱い。
反対の明確な指示、または、当業者が明らかに反対であるとそれを理解しない限り、それらがこの明細書の記述内でやりとりされ得る、これらの単語がはっきりした意味を有すると理解される。
たとえば、文がもしも「そして、細胞は付着されたバイオセンサ」含む場合、「そして、細胞はバイオセンサに接触された」こと、「そして、細胞はバイオセンサに付けられた」ことが、開示されたと理解される。
また、様々な付着、接触、付属、付けられたアイテム(例えば細胞またはタンパク質)があることも理解される。
たとえば、バイオセンサからの出力データは、特定の振幅(例えば強度)を有する共鳴ピークを産生する。
例えば、化合物または刺激含有溶液がバイオセンサ界面上の細胞被着をカバーするために先に存在される培地に導かれるとき、化合物または刺激分子が結果の混合物(培地および溶液)において拡散し、特定時間かかって細胞に到達するはずである。
その後、化合物または刺激分子が相互に作用する標的上の依存して、化合物または刺激分子は、延長された時間をかけて、侵入によって決定されまたは分子によって細胞の取込まれた標的に到達するかもしれない。
2つの溶液が一緒に混ぜられるときに、「バルク屈折率変化」は混合溶液の屈折率の結果として変化し、または、溶液は培地または他の溶液と添加されて、混ぜ合わせられる。
プレーナー型導波路の被きょう導波(またはモード)の2つの基本的なタイプがある:
TEm(横電気波またはs−偏光)およびTMm(横磁気波またはp−偏光)である。ここでm=0、1、2、…はモード次数である。
光導波路グレーティング(OWG)バイオセンサはエバネッセント波センサであって、回折グレーティングによって導波路に光の共振結合に基づくものである。
各基本モードには、たとえばTM0,TM1,TM2…およびTE0,TE1,TE2,…の異なる若干の数のモードがある。
導波路基質に結合され得る特定のモードは導波路構成および所定モードの実効屈折率に依存し、それはそのモードのエバネッセントテイルにある細胞形質成分およびバルク溶液の屈折率によって決定される。
ここで使用しているように、標識フリーバイオセンサは、蛍光分子のような標識を必要とせずに結果から検出することができ、および/またはシグナルを生成するいかなるセンサ、または細胞の現象または変化(例えば質量再分布)に関連する。
標識フリーバイオセンサは、一般に定量化シグナルに細胞の現象を変換する光変換器からなる。
かかるシグナル生成は、さまざまな方法で完成し得る。
たとえば、直接表層検知方法は、表面プラスモン共振(SPR) (Jordan & Corn, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces", Anal.Chem., 1997, 69:1449-1456)、グレーティングカプラ(Morhard et al., "Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction," Sensors and Actuators B, 2000, 70, 232-242)、エリフ゜ソメトリ(Jin et al., "A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions", Analytical Biochemistry, 1995, 232, 69-72)、エバネッセント波装置(Huber et al., "Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity)," Sensors and Actuators B, 1992, 6, 122-126)、反射計測(Brecht & Gauglitz, "Optical Probes and Transducers," Biosensors and Bioelectronics, 1995, 10, 923-936)、を含む。
測定SPRまたは導波路グレーティングセンサに概して使用された計測は、適当なスペクトルまたは角の内容を有する光ビームを利用し、このビームが検知界面によって反射されるときに、共鳴する角度または波長応答は出力応答の主要なものになる。
標識フリーバイオセンサの例は、非接触のバイオセンサ、標識無依存検出バイオセンサ、標識フリー光学バイオセンサ、光学非接触のバイオセンサ、光学ベースのバイオセンサ、光学バイオセンサ、光学標識無依存検出バイオセンサ、導波路グレーティング−型バイオセンサ、光導波路光モード分光学バイオセンサ、エバネッセント波装置を含む。
さまざまな標識フリーバイオセンサおよびそれらの使用は、ここに記載されて関連される。
標識フリーバイオセンサのより特定の例およびそれらの使用を提供するために、標識フリーバイオセンサの使用の特定の若干の方法およびモードは、標識フリーバイオセンサの説明に記載されている。
不必要な重複を避けるために、かかる説明が、標識フリーバイオセンサのすべてのタイプのために、繰り返されるというわけではない。
しかし、かかる特定の方法または態様の特定のバイオセンサの使用が記載されるときに、使用の環境または状態が標識フリーバイオセンサの一つ以上のタイプを除外しない限り、かかる使用がかかる方法およびモードのいかなる標識フリーバイオセンサもの使用を図示すると理解されるべきである。
方法およびモードがここに記載した(使用の環境または状態が標識フリーバイオセンサの一つ以上のタイプを除外しない限り)いずれでもおよび全てのいずれでもおよび全てのバイオセンサのかかる使用は、具体的には、熟慮されて、具体的には、考慮されなければならない。
このように、たとえば、特定のグレーティング結合器バイオセンサを使用して細胞におけるEGF−起因性EGFRシグナル伝達の解析が説明されている場合、他のいかなる適当な標識フリーバイオセンサも使用した細胞におけるEGF−起因性EGFRシグナル伝達の解析が開示されていると考えるべきである。
このように、たとえば、表面プラスモン共振−型バイオセンサを使用した細胞におけるEGF−起因性EGFRシグナル伝達の解析が、開示されていると考えるべきである。
スターベーション培地が細胞をインキュベートするかまたは細胞を培養するために使われるときに、結果として得られた細胞は静止状態になる。
これらの文献の開示内容は、より充分にこれが付随する最高水準の技術を記載するために全体として本出願の明細書に援用したものとする。
開示される引用はまた、それらに含まれる材料のためにここに個々に、そして、特に引用したものとする。そして、引用が依存される文において、議論される。
(II. 組成物および方法)
方法とシステムは一般に直接光学バイオセンサ分野に関し、そして、具体的には、光学標識非依存検出(LID)バイオセンサ(例えば導波路グレーティング−型バイオセンサ)を使用して、たとえば、生体細胞内の化合物−起因性質量再分布をリアルタイムでモニタするためのシステムと方法に関係し、これは、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)活性現象sおよび抗作用を含み、Epidermal Growth Factor Receptor活性、細胞骨格再構成、細胞死および細胞増殖、同じく、細胞シグナル伝達、脱感作および生体細胞内の転位、同じく、付着細胞の形態学的変化、細胞接着、細胞運動およびバイオセンサ上で培養される細胞に関係する。
直接の光学センサ(DOS)技術は、蛍光または発光の標識を励起せずに、分子同定または細胞現象を測量可能シグナルへ変換するために光変換器を利用するものに関連する。
励起および続く発光またはかかる標識の発光に依存する技術は、間接的な光学技術と称され、それがまた、開示された方法の或る実施例において使われる。
また、例えばGPCRまたはEGFRまたはPDGFRまたはサイトカイン受容体のような細胞上の受容体など、細胞活性に対する化合物のスクリーニングする方法が、開示される。
ここに開示される組成において組み合わせのいずれも可能で、「細胞−バイオセンサ」および「細胞−バイオセンサ試薬」組成物であると理解される。
たとえば、A431細胞、バイオセンサおよびEGFからなる細胞−バイオセンサ試薬組成物が、開示される。
ここに開示される標識フリーバイオセンサは、タンパク質標的または基質加入の刺激作用によって媒介された転位を分析することに使用でき、たとえば、細胞核に対するまたは膜に対するまたは細胞質ゾルに対するまたは他細胞器官に対するもの(たとえば、(エンドソーム、小胞体(ER)、または、ゴギリ(gogli)または核)、或いは、細胞外空間(例えばリガンド結合、遺伝子トランスフェクションまたはタンパク質トランスダクション、ファゴサイトーシス、エンドサイトーシス、その他)からのさまざまなリサイクリング経路または取込みの全体にわたるものに使用できる。
他の例では、標識フリー光学バイオセンサが異なる機能上の区画の中の特定の標的または標的複合体のおよび/または刺激作用に応答する画定された微小環境の中の再分布をモニタするかまたは特定の標的の新規合成を測定するために使われること、または、特定の区画または局所(例えば作動薬−起因性Gq−共役型受容体のためのCa可動化またはCaイオノフォア)から刺激作用によって媒介された放出を検査すること。
この文脈において、標的は、分子または細胞成分として使われ、追跡されるべきまたはアッセイの部分であるべきものである。
他の例において、標識フリー光学バイオセンサは標的分子または標的複合体(例えばバクテリアまたはウィルスまたはファージまたは脂質粒子またはエキソゾーム粒子、その他)の移動をモニタすることに使用でき、かかる移動はある細胞から他の細胞へ(例えば、ギャップジャンクションまたはイオンチャネルによる)、あるいは、細胞から周囲の生育環境へ(たとえばエクソサイトーシスとして公知のプロセスまたはコントロール放出プロセス(例えば細胞表層膜での人工のウェルによるアポトーシスまたは拡散))、または、どちらでも、である。
或る実施例のこれらの組成物および方法は、たとえば刺激性事象により生じることが可能であるモニタリング間に起こっている細胞現象のタイプの予言となるデータの分離した点のたとえば1、2または3だけの収集によってできるので、データ収集中のポイントの適用および同定による高スループット方法に適している。
この方法は、高スループットスクリーニングに適用できる。
もう一つの実施例でが、開示された組成物、方法および技術は、スクリーニングまたはモニタリングのための方法に吸着、分配および/または多数の種類の光学センサの空間的にアドレス指定可能な領域または単一のウェル内で位置する多数バイオセンサ上の細胞被着に作用している化合物の毒性を提供する。
これらの方法が、多数の異なるアッセイ(例えば、ADME/Tox(機能的アッセイ))において使われることができて、事実多数の異なるアッセイを単一のアッセイフォーマットに組み込む。
或る実施例において、開示された組成物、方法および技術は、細胞増殖の阻害物質または活性化物質のる高いスループットスクリーニングのために、波長または角のシフト単独でよりむしろ、光導波路光モード分光学(OWLS)すなわち所定モードの共鳴ピーク分光学または所定の導波モードの共鳴バンド画像化を利用する。
この方法は、細胞密度上の所定のセンサの結合されたピークの最大半減(PWHM)でのピーク幅の依存を使用する。
開示された組成物、方法および技術の或る実施例において、マイクロプレートの全部のセンサの内結合している共振バンドの像が、同時に集められ、細胞増殖に対するそれらの影響のための化合物をスクリーニングする高いスループット手段として使われる。
細胞内で起こっているシグナル伝達現象にとってと同様に細胞表面で、たとえば、方法はRTKsまたはGPCRに適用され得る。
方法は、細胞骨格成分のモジュレータによって透過化処理された細胞起因性から巨大分子の測定放出に基づく。
具体的には、方法は十分に生体細胞の形質膜を細胞内部で可溶タンパク質が離れて拡散する多孔質とするために特別な化学薬品または生物学的製剤(例えばサポニン、ストレプトリジンO、等)を利用する。
細胞骨格−***モジュレータを有する細胞の処理は、細胞骨格によって隔離されるRNAおよびタンパク質を含んでいる生体分子の更なる放出を導き、結果として光学バイオセンサによって検出され得る質量の減失になる。
これの後に、質量再分布の討論およびこれが光学バイオセンサに関する方法が続く。
また、標識フリー光学バイオセンサを最初に使用しているアッセイを実行することのような、これらのアッセイに対する添加および一時変異と同様にここに開示される光学バイオセンサを使用する、が、それからそれから二次性であるか追加のアッセイにおいて使われるアッセイの一つ以上の試薬に結合する標識の特定のタイプを有して実行され得る典型的な細胞アッセイの討論は、提供される。
開示された方法は、関心のある受容体を過剰発現する細胞を遺伝的に操作する必要なしに、生体細胞内の内因性のGPCRを研究することを可能とする。但し或る実施例において、関心のある過剰発現GPCRを有す細胞は、高感度および最適のアッセイ結果を達成するために好ましくは使われる。
方法は、増加するスループットの効果を提供する。
方法は、少なくとも2つの異なる領域を有する単一センサを使用する:
一時変異のない1および一時変異を有するもう一方;
または、同じチャンバまたは分離されたチャンバ内でリース2つのセンサで使用する:
一時変異のない1および一時変異を有するもう一方。
たとえば、センサの修飾領域は印刷するかまたは試薬/遺伝子または干渉RNA(RNAi)またはアンチセンスのオリゴヌクレオチドかantisense/抗原ペプチド核の酸(PNA)を含んでいる点またはタンパク質を堆積させた、または、抗体細胞がこれらの領域に培養されて、かぶせられる、付着細胞取込みこれらの試薬/材料、そして、トランスフェクションする。
かかる方法は、位置の界面によって媒介されたトランスフェクションと称する。
一旦これらの材料によってトランスフェクションすると、細胞の特定の標的が終わったようになって、−界面によって媒介された遺伝子トランスフェクションまたはタンパク質出産で表してまたは刺激に対する応答を抑制され得るアンチセンス/抗原抑制またはRNA干渉またはノックアウトまたは抗体遮断。
アメリカ特許文献US2004/0023391A1およびUS6,544,790は、材料のための最少で全体としてここに取り入れられる以外細胞に出産のための方法に関した。
位置の界面によって媒介されたトランスフェクションは、特定の標的を有する、そして、のない細胞の特定のタイプの刺激作用−誘導応答の検出を許す。
位置の表層の媒介されたトランスフェクションは、刺激性事象と考えられる。
したがって、本発明の方法は、シグナルの特定の細胞の標的または標識フリー光学バイオセンサを使用して測られる細胞現象の併発を確かめる。
センサ界面の上の材料の沈着または印刷は、ピンプリントのような密着焼付け法(アメリカ特許文献US5807522 A,US6101946 A)またはマイクロプリント方法(アメリカ特許文献US5,731,152)、キャピラリ供給装置(US5,807,522)、調剤装置(米国特許第5,601,980号)マイクロパターン装置または圧被駆動印刷またはマイクロ/ナノ供給装置(アメリカ特許文献US6656432 B1、EP0895082 B1またはUS6399396 B1)のような非接触の印刷を含むがこれに限らず、最高水準の方法を使用して達成され得る。
また、一重化または多重化アッセイフォーマットでかかるアッセイを実行する装置も開示される。
界面に広がる細胞開始がその後起源のレベルへ50%の細胞適用範囲および減衰ころにその最高に到達するときに、PWHMは増加する。
また、ROSシグナル伝達と同様に培養細胞のレドックス状態に影響を及ぼすモジュレータをスクリーニングするとともに、培養細胞のレドックス状態を評価する方法が、開示される。
活性酸素種は、過酸化水素のような分子、次亜塩素酸塩イオンのようなイオン、水酸基のようなラジカルおよびイオンおよびラジカルであるスーパーオキシドアニオンである。
他物質を酸化する能力を有する物質は、酸性であると言われていて、酸化剤、オキシダントまたは酸化剤として公知である。
オキシダントは、通常高い酸化数(例えばH2O2、MnO4−、CrO3、Cr2O7 2−、OsO4)の元素または高く物質(O2、O3、F2、Cl2、Br2)を酸化することによって特別な1、2電子を得る電気的陰性物質物質を有する化学物質である。
活性酸素種は、いくつかの異なる機構によって形成される:
(1)生体分子を有するイオン化放射線の相互作用;
(2)細胞呼吸の避けられない副産物として(例えば、呼吸鎖を下に伝わっている若干の電子は、主な経路(特にそれらがユビキノンを通過するように)から離れて漏れ、酸素分子をスーパーオキシドアニオンに直接変える);
(3)好中球のような食細胞の細胞およびマクロファージの専用の酵素によって総合される(例えば、NADPHオキシダーゼ(食細胞の両方のタイプ);
またはミエロペルオキシダーゼ(好中球だけで))。
ROSは決定的である、しかし、ROS否定の産生を制限する試みがあまりによく成功することは重要である。
ROSが細胞において実行するために重要な機能を有するからである。
例は、(1)甲状腺の細胞がヨウ素原子をチロキシンの合成のサイログロブリンに付けるために過酸化水素に作らなければならないである。(2)マクロファージおよび好中球は数種類のそれらがファゴサイトーシスによってのみ込むバクテリアを殺すためにROSを生成しなければならない。(3)好中球(しかし、マクロファージでなく)も強く防腐性の次亜塩素酸塩イオンを産生するために塩化物イオンを有する過酸化水素(スーパーオキシドアニオンから作られて)の反応に触媒作用を及ぼす酵素ミエロペルオキシダーゼを使用することによってのみ込まれた病原を絶滅させる。(4)多くの生物エネルギーは貯蔵されて、レドックス反応によって放出される。
光合成は、分子状酸素に糖への二酸化炭素および水の酸化反応の還元を含む。
逆反応(呼吸)は、二酸化炭素および水を産生するために糖を酸化する。
中間体ステップとして、還元した炭素化合物はNAD(NAD+)(それはそれからプロトン勾配の生成に貢献する)を減らすために用いる。そして、それはアデノシントリホスフェートの合成を駆動して、酸素の還元によって維持される。
動物細胞において、ミトコンドリアは同様機能を実行する。
語レドックス状態は、しばしばNAD+/NADHおよび生物系(例えば細胞または器官)のNADP+/NADPHの均衡を記載するために用いる。
レドックス状態は、相互転換がこれらの比に依存しているメタボライト(例えば、乳酸塩およびピルベート(β−ヒドロキシ酪酸塩およびアセトアセテート))のいくつかのセットの均衡において反映される。
異常なレドックス状態は、様々な有害な状況(例えば酸素圧低下、ショックおよび敗血症)において発達する。
分子、化合物およびこのパラグラフにおいて議論される組成の全てのフラックスおよび効果が同定され得るかまたはここに開示される方法において一方使われると理解される。
細胞は、それらが各々の近くに位置するかまたははるかに別々である、お互いと通信することを必要とする。
細胞外のシグナル伝達分子は、細胞間の相互作用を管理する。
基本的な機構は、リガンド(シグナル伝達分子)が細胞外のシグナルを細胞内のシグナルに変換するためにその受容体と相互に作用することを必要とする。
このプロセスは、シグナル伝達と呼ばれていて、いくつかの形態で起こる。
第一シグナルが全ての生物と通信するために必要な場合;
シグナル伝達分子は、血流に分泌される。
たとえば、内分泌シグナル伝達は、細胞が循環系に合成して、ホルモンを分泌することを必要とする。
そのホルモンは、それから形質膜上の細胞原形質内の特定標的細胞タンパク質(受容体)によって認識される。
第2に、他状況において、シグナルは局所的に行うことを必要とする。
たとえば、パラ分泌シグナル伝達分子(局在部メディエータ)は、隣接細胞によって放出され得、ECMで局所的に拡散し、近い標的細胞を刺激する。
たとえば、成長および分化因子は、主にパラ分泌シグナル伝達分子として作用すると考えられる。
伝達の第3の形態は、ニューロンのシグナル伝達である。
かかるシグナル伝達は長距離を通じて起こる、しかし、出産は軸索と呼ばれている長く続く細胞過程を経由してある。
ニューロンのシグナルは、標的細胞にまたは他ノイロン細胞に作用する。
軸索末端にそれを渡すことの神経伝達物質と呼ばれている化学シグナルに変えられる電気インパルスとして、シグナルは軸索で進行する。
シグナル伝達の第4の形態は、全部の最も多くの短範囲である。
それは、概して分泌された分子の放出を必要としない。
たとえば、シグナル伝達分子が標的細胞の形質膜に埋め込まれる受容体分子に結合するためにシグナル伝達細胞の形質膜において停泊するときに、接触に依存するシグナル伝達はトランスダクションが完了されることを必要とする。
接触に依存するシグナル伝達は、また、細胞外のマトリックスと相互に作用している細胞の形で起こる。
各細胞は、受容体のその限られたタイプと同様にその専門機能のために、シグナルの限られたセットに応答することが可能である。
その上、各細胞は異なってシグナル分子に応答する。
この症例(たとえば神経伝達物質)のアセチルコリンが1種類の筋細胞を刺激して接触(骨格)または収縮を抑制する(強心剤)。
アセチルコリンは、また、特定の細胞にそれらの分泌小胞の内容物を分泌するようにする。
あるいは、同様受容体は異なる細胞内のシグナル伝達経路を活性化する、または、リガンドは異なる受容体に結合する。
線形モデルにおいては、情報の主な流れが逐次的で、受容体から特定の細胞機能まで中間体ステップの線状鎖を通り抜けると、シグナル伝達経路は考えられる。
しかし、細胞生物学(線形の情報流の代わりに)の複雑度のため、刺激作用によって媒介されたシグナル伝達は拡散ステップ(広がるフィードバック系)を含んでいるフィードバックによる結合である、または、シグナル伝達タンパク質および/または足場タンパク質の複合体に物理的にリンクされる多くのモジュールからなる。
たとえば、広がるフィードバックモジュールは、カルシウムおよびイノシトールトリスリン酸受容体が細胞質ゾルカルシウム濃度を管理する正および負のフィードバックループに示す。
これらの正および負のフィードバックループは、シグナル伝達の交差性連絡で重要な役割を演ずる。
多くの***促進のGPCRのシグナル伝達がかけ合せに示されて、たとえば−ネガか実在方法のEGFRシグナル伝達を有する通信する。
これらのGPCRの活性化も、同じ細胞(アダプタタンパク質を行うタンパク質キナーゼCまたはb−アレスチンによるどちらでも)のEGFRの活性化を導く。
(a) 監視細胞健康体のためのOWLSの使用)
光学型バイオセンサを使用している化合物毒性をスクリーニングしている高いスループットに適している計測が、開示される。
開示された方法、組成および技術は、細胞または細胞群の健康体をモニタするために用いることが可能である。
語「健康体」は、生存および細胞機能に関して細胞の全体的な状態に関連する。
たとえば、細胞がタンパク質またはメッセンジャーRNA産生、細胞シグナル伝達の減少および/または関するタンパク質の増加のようなその健康体(例えば細胞分割の減少、細胞機能の減少)上のネガ効果を表示する多数方法が、細胞死にある。
伝統的に、細胞健康体価値判断は、DNAまたはRNAへの標識されたヌクレオチドまたは細胞の核のクロモソームの保全の特定の遺伝子産物または移入の特定の標的タンパク質(例えばミトコンドリアデヒドロゲナーゼ)または合成の細胞膜統合性または機能を検査するために蛍光染色方法または他の手段を使用した。
或る実施例において、方法は化合物の毒性のために修飾された細胞密度、細胞死パターンおよび細胞層不均質性に関わる所定のセンサの結合されたピークの最大半減(PWHM)でのピーク幅の依存を利用する。
化合物毒性は、導波薄膜表面上の生存細胞、被影響細胞および死細胞の三個体群の発生の結果をもたらす。
界面の結果としてなられた増加する不均質性は、共振ピークブロードニングおよび平坦***を導く。
共振ピークブロードニングおよび***が、化合物毒性のためのシグニチャとして使われる。
細胞が化合物にさらされたあと、共振ピークスペクトルか全部のセンサ共振像は集められることができて、特定時間で分析され得る。
方法は貢献される化合物に応答する細胞の層のための角の波長シフトのリアルタイム計測を含むかまたは、細胞層の質量再分布のために、細胞によってインキュベートされた。そして、光学バイオセンサを使用した。
これらの方法は、細胞毒性およびアポトーシスの動態および機構を研究することに役立つ。
また、高スループット方法が、開示される。
(2.細胞健康体を監視する高スループット方法)
たとえば、アメリカ特許出願10/602,304(出願日06−24−2003公開番号US−2004−0263841公開日12−30−2004)、アメリカ特許出願11/019,439(出願日12−21−2004)、およびN. Fontaine et al., によるApril 5, 2005出願日のアメリカ特許出願(発明の名称"OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS")に開示した光学角度測定システム(バイオセンサおよびそれらの使用以外)は本出願の明細書に援用したものとする。
たとえば、このシステムは、3秒(例は、図1に示された)の速度で、同時にサンプルをとれる7×7ウェルセンサまで許容する。
これは、96ウェルマイクロプレートの96サンプルのための細胞健康体価値判断が数秒内でされ得ることを意味する。
他の典型的なシステムとして、N. Fontaine et al.によるアメリカ特許出願10/993,565(出願日11−18−04)、およびY. Fang et al.によるApril 5, 2005出願日のアメリカ特許出願 (発明の名称"METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE")に開示されたものがあり、この両文献は全体として、そして少なくとも、バイオセンサ、スキャン装置およびマイクロプレートに関連した材料は本出願の明細書に援用したものとし、かかるシステムは各々が1つのバイオセンサを照らして同じバイオセンサから応答を受け取るように配列された光を生成するための配列された光ファイバを使用して、逐次的な方法のマイクロプレート内の多数バイオセンサからと同様に単一センサ内の多数領域から応答を集めるために管理された精査モジュールを使用する。
かかるシステムによって、細胞健康体価値判断が約30秒内でされ得る。
(3.光学型バイオセンサ)
細胞ベースの研究のための光学標識フリー技術の使用を記載しているぶんけんは比較的少なかった。
たとえば、光導波路グレーティング型バイオセンサが動物細胞の接着および拡散を調査するために用いられている。(J.J.Ramsden, et al., "Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells," Biotechnol.Bioeng.1994, 43, 939-945)および、表面プラスモン共振(SPR)が生体細胞のリガンド起因性細胞内反応の研究に使われている。(M. Hide, et al, "Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntraCellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor," Anal.Biochem. 2002, 302, 28-37)
直接表層検知方法は、表面プラスモン共振(SPR)(Jordan & Corn,, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces," Anal. Chem., 1997, 69:1449-1456)と、グレーティングカプラ(Morhard et al., "Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction," Sensors and Actuators B, 2000, 70, 232-242)と、エリプソメトリ(Jin et al., "A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions," Analytical Biochemistry, 1995, 232, 69-72)と、エバネセント波装置(Huber et al., "Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity)," Sensors and Actuators B, 1992, 6, 122-126)と、反射計測(Brecht & Gauglitz, "Optical Probes and Transducers," Biosensors and Bioelectronics, 1995, 10, 923-936)と、を含む。
SPRまたは導波路グレーティングセンサの計測に使用される典型的測定には、適当なスペクトルまたは角成分を有する光ビームを利用して、このビームが検知界面によって反射されるときに、共鳴する角度または波長応答は出力応答の主要成分になる。
共通の特徴は、SPRおよびグレーティング結合器(すなわちOWGまたはRWG)技術両者がセンサ界面若しくは付近で屈折率変化を検知するということである。
この技術は標識フリー検出を可能とし、相互作用がシグナルを出す読み出しのための特定の標識を必要とする大部分の現在技術と異なる。
標識を付加することに関連した不利な点は、その標識付加が労働集約タイプであり高価なだけでなくて、標的生物学的製剤または化合物の生物学的性質の潜在的干渉を有しており、データ解読が難しく偽りの情報がアッセイから発生するかもしれないことが挙げられる。
これらの不利な点、非標識可視化技術の使用時または標識付加に使われる時間を減少することができる、非標識技術がここに開示される。
また、ここに開示されるセンサのいずれでも様々な方法で使われると理解されるべきで、例えば、多重化された多重井戸タイププレート(例えば修飾96ウェルマイクロプレート)に使用できるので、その他複合的な方法で使われる。
ここに開示されるように、標識フリーバイオセンサ、例えばRWGまたはOWGバイオセンサが細胞と連動して使われ、そして、細胞の活動がモニタされ得る。
細胞はバイオセンサ上に培養され得、培養細胞が従来のプレートに培養されてプレートの底面に対する被着層になる時のようにバイオセンサに対する被着層となるようになされる。
細胞が開示されたバイオセンサ上で培養されるとき、バイオセンサの出力が変化する。
図1は、システム上の培養細胞の出力の例を示す。
図2は、光導波路グレーティングセンサの線図を示す。
この図において、細胞はセンサの上に培養される。
光源(例えばレーザ)が角度を変化させることでのセンサでの定方向であるときに、角度の特定のセットで、光はセンサに結合される。
他の角度で、光は直接反射されるかセンサを通過する。
ここに明らかにしたように、細胞表面での受容体の刺激作用のような細胞操作において、質量再分布が細胞内で起こる。
この質量再分布によって多くのものが生じ、その一つは光がセンサに結合する角度の変化である。
この角度変化は細胞内で起こっている現象を同定するために利用され得、そして、かかる現象が細胞内で起こる質量再分布に基づくバイオセンサと関連した出力に関するシグニチャプロファイル(signature profile)を有することはここの記載から理解できる。
さらに、実施例において、開示された組成物、方法および技術は、試薬反応および洗浄ステップを含むいかなる特別な処理ステップも省くことができる。
また、或る実施例、細胞増殖アッセイのような開示された組成物、方法およびおよび技術は、ほとんどすべての従来法のために一般に必要である他のいかなる試薬の影響なく、関心ある化合物だけの非共存および存在の標準培養条件の下で実行できる。
他の試薬の存在は、アッセイ結果の誤解に結果としてなるであろう。
(J.J. Ramsden, et al., "Kinetics of Adhension and Spreading of Animal Cells", Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 939-945)
これらの試薬自体が細胞増殖上の直接効果を有するであろう。
(M. Hide, et al., "Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntraCellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor," Anal. Biochem. 2002, 302, 28-37)
スクリーニングされる化合物は、細胞増殖よりむしろ、これらの試薬上の効果を有するであろう。
たとえば、直接細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼを抑制する化合物はMTTの遺伝子変換の抑制に結果をもたらし、それによって、MTTアッセイは、関心ある特定の他の標的に対してモジュレータをスクリーニングするために用いられるときに、偽陽性を導くであろう。
細胞増殖が一般に遅いプロセス(例えば、数時間、数日または数週かかる)であり、一般に37℃インキュベーションを必要とするので、ここに開示される以外の室温で一般にシグナルを集める標識フリー増殖アッセイでは高スループットスクリーニングの実行がむずかしい。
たとえば、放射性であるか他の物質(例えば光に敏感な蛍光化合物)を貯蔵または操作する必要がない。
細胞増殖上の化合物のIC50sを検査するために、特定の状況において、これらの方法が、使われる。
しかし、ここに開示される方法がそうであるように、これらの方法は、高スループットスクリーニングに適していない。
ここに開示されて、導波路型バイオセンサは、Gタンパク質の活性化のための作動薬−起因性指向性質量再分布が受容体(GPCR)または受容体チロシンキナーゼ(例えばEGFRin生体細胞)を結合したモニターもだけでなくに、指向性質量再分布を導くシグナル伝達経路または細胞の機構を研究するために用いることが可能である。
(a) OWLSおよび細胞毒性)
センサ上の界面固定化、生物学的製剤の不均質付着を有するセンサのためのこれらの微細構造または実験的に、そして、理論的に観察される材料としては挙げられるが、これに限定されるものではない均質のための各々のモードの1つの鋭い共振ピークの代わりに、少なくとも一つの肩部(すなわち、二次性の)が各々のモードのための各々のモードおよびよく分離した重複の(さらに)ピークの主な共振ピークを有する排臨をピークまで上げること。参照(see Horvath, R., et al. "Effect of patterns and inhomogeneities on the surface of waveguides used for optical waveguide lightmode spectroscopy applications", Appl. Phys. B. 2001, 72, 441-447; Voros, J., Graf, R. et al., "Feasibility Study of an Online Toxicological Sensor Based on the Optical Waveguide Technique," Biosensors & Bioelectronics 2000, 15, 423-429 the references therein are incorporated)。
以前に、研究者は導波路上の細胞付着性および拡散移動の間、結合されたピークが広げられることに気がついた。その一方で、グレーティング上の標準ミクロ構造はピークのシフトおよび***を産生する。
共振ピークの広幅化が、細胞付着性および拡散移動の指紋として使われた。
(4.細胞の光学バイオセンサおよび質量再分布)
具体的には、センサとして使用するプレーナ光導波路は、基質、導波性薄膜およびカバー培地からなる。ここで、カバー培地は屈折率を決定することによって特徴づけられる物質である。
プレーナー型導波路型バイオセンサは、導波路を囲んでいる培地における変化を検出するために使用され、導波路の電磁場伝搬性が周囲の培地に達してエバネッセント電磁場(その深度は、侵入深さまたは検知体積とみなせる)として伝搬する。
質量再分布が検知体積内で起こるときに、応答変化は反射ビームの角であるかスペクトルの変化として観察される。
角のシフトは、質量再分布応答シグナルの動態を得るために測定される。
加えて、それのため、異なる細胞応答は全体的な質量再分布シグナルとは異なって貢献する。
たとえば、細胞外のマトリックスからの細胞離断はセンサは表面若しくは付近で起こり、したがって、細胞で起こっているそれらよりかなり大きい応答を導くであろう。
細胞は、多数の細胞器官を含んでいる細胞原形質(概して5−30μM)からなる。
最大の細胞器官は、大きさが3−10μmの間で概して変動する細胞核である。
細胞核はDNA−タンパク質複合体およびタンパク質で満たされる。そして、最も重要なものがクロマチンである。
ミトコンドリアは、0.5−1.5μmから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
他細胞成分は、小胞体(ER)(概して0.2−1μm)、リソソーム(概して0.2−0.5μm)、ペルオキシソーム(概して0.2−0.5μm)、エンドソーム(概して約100nm)およびgolgiを含む。
a) 光導波路グレーティングベースの表層の検知技術
RWGバイオセンサは、回折グレーティングによって導波路への光の共振結合に基づく、エバネッセント波センサである。
RWGに基づく表層の検知技術はエバネセント場を利用する。そして、それは、選択的に所定のスペクトル帯幅の上の固定された化学で生物学的な分子の吸着に応答するために、導波路界面からの波長より通らない。
他の光学型バイオセンサが、また、エリプソメトリ装置、エバネッセント波装置および反射計測装置のような使われる。
Optは、構造についてのより詳細な討論およびLIDバイオセンサについてアメリカ文献(U.S. Patent No. 4,815,843 entitled "Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples" and K. Tiefenthaler et al. "Integrated Optical Switches and Gas Sensors" Opt. Lett. 10, No. 4, April 1984, pp.137-139,)提供され、いずれがバイオセンサのための全体として最少で材料についてここに取り入れられる。バイオセンサについてアメリカ特許文献U.S. Patent App. 60/701,445, filed 7-20-2005, for "Label-Free High Throughput Biomolecular Screen System and Method" and U.S. Patent App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. for "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine et al., filed on April 5, 2005,に開示されている。これらはここに本願に援用される。
((1) 対称性導波路グレーティングバイオセンサ)
グレーティング結合器センサは、導波路および回折グレーティングの組み合わせからなる。
図2aは、高屈折率(例えばNb2O5のnF約2.36)の薄膜からなる古典的な4つの層導波路バイオセンサに下部の屈折率(例えば1737のガラスのためのns約1.50)の基質上の厚さdFを有する材料を示す。
屈折率を有する生物学的製剤の付着層は、導波薄膜に固定する(nA)1.4および厚さdAのまわりで、そして、全てのセンサの上に構造がカバー培地(1.35のまわりの屈折率(nc)を有する生物学的な溶液であること)であること。
この従来の構成において、導波薄膜の屈折率は、少なくとも1%、たとえば、1%、5%、10%、20%、30%、50%、70%または100%による下部の屈折率の基質のそれより高い。
たとえば、下部の屈折率の基質の屈折率は、5%、7%、10%、15%、20%、30%または50%カバー培地のそれより高い。
カバー培地(一般に細胞ベースのアッセイ適用法のための水溶媒質)の屈折率は、概して約1.32、1.35、and1.38である。
所定の導波モードはたとえばTM0、TE0、TM1、TE1、その他に関連する。
レーザは角度を変化させて導波路を照射して、光は導波モードの実効屈折率(Nとして示される)によって決定される特定の角度だけで、導波路に結合される。
光モードのエバネッセントテイルは基質内にて伝搬し薄膜に沿って培地をカバーするので、光モードは3つの培地全部を同時に経験または知覚する。
これは、進行している光モードによって経験される屈折率が3つの屈折率の評価される混合であることを意味する。
実効屈折率Nは、モード方程式から数値的に算出され得る。そして、それは薄い付着層の厚さが光の波長未満(dA<<λ)であると仮定している4つの層導波路のための以下の形態式で書かれる。
[Tiefenthaler, K., and W. Lukosz, "Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemical sensors" J. Opt. Soc. Am.B, 1989, 6, 209-220]:
この方程式の左側上のプラスおよびマイナス符号はそれぞれ+xおよび−x方向に伝搬する導波モードを示している。
エバネッセント波の振幅(Em)は、界面から距離dの増加と共に指数的に減衰する。
膜厚がカットオフ厚さに接近するときに、モードの実効屈折率(N)がnmaxに接近することを公知である。
さらに、式(5)は、侵入深さが、より大きい屈折率を有する薄膜側のカットオフ点で無限大となり、他方側では、侵入深さが有限であるとを意味する。
この場合また、deffは、無限である。
この値は、界面(グレーティング構造と同様に照明波長)に存在する培地の屈折率に依存する。
入射角が臨界値に等しいときに、dCは無限となり、そして、屈折光の波面は界面に直角となる。
これは、(1)図2aにおいて細胞内部で破線の矢印によって強調されるように、我々はモニタされたのは細胞の付着層の底一部だけであること、(2)図4に示すように、標的または複合体がセンサ界面により近い時と、それがセンサ界面からもっと先である時と比べて、特定の質量の標的または複合体はより総合応答に貢献することを意味する。
図4は、距離の増加と共に指数的に減衰する培地に通されるエバネッセント波の強度を示す。
そのより高い感度により、特記しなければ、本出願の大部分の典型的な研究においてTM0が使われている。
((2) 逆対称性導波路グレーティングバイオセンサ)
かかる対称性導波路センサの光伝搬性からの指数的に減衰しているエバネセント場は、短い深度(概して約50−200nm)に、カバー培地を通すだけである。
基質側面上のエバネッセントテイルはカバー培地側面上のものより、かなり長くてかつ強度が高い。
感度が被検体付着層のモード仕事率伝搬性の画分に依存するように、これは応答を被検体に制限する。
モードプロフィールの反転はこの限界を克服して、より大きく侵入深さを許可する(より長く)。そして、それによって形態または細胞内成分の解析を許す。
Horvath et al. (US20030109055A1 and Horvath, R., Lindvold, L.R., and Larsen, N.B. "Demonstration of Reverse Symmetry Waveguide Sensing in Aqueous Solutions,", Applied Physics B, 2002, 74, 383-393; これらはここに本願に援用される。
これらはいわゆる逆の対称性導波路の実施可能性を示す。
逆の対称性導波路の原理は、図2aに示すように、導波性薄膜(すなわち概して水溶液のための1.33)をカバーしている培地の屈折率未満の導波路基質の屈折率を作ることに基づく。
図5に示すように、逆対称性は、三つの異なる幾何学構成によって実現する:
(1)希薄導波薄膜は、マイクロメートルサイズで構築された支持体に沈澱した;
かかるナノポーラス(nanoprous)な基質の屈折率が約1.15であるメソポーラス(mesoporous)であるかナノ多孔質支持体に、(2)希薄導波薄膜は、沈澱した;
そして、薄い導波薄膜は、ナノメートルサイズで構築された支持体に沈澱した。
かかる逆構成を使用することによって、カバー培地侵入深さはかなり従来の導波路のそれを上回る。そのとき、膜厚は2つの導波路のカットオフ厚さに接近する。
さらに、膜厚を制御することによって、探測深度は、また、上限なしで管理されていることが可能である。
((3) 光検出系)
U.S. Patent App. 10/602,304, filed 06-24-2003 having publication no. US-2004-0263841, published 12-30-2004 and U.S. App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. for "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine, et al., filed on March 31, 2005, これら全てはバイオセンサおよびそれらの使用のための最少で、援用によって全体としてここに取り入れられる。
細胞現象が導波路界面(例えば透過化処理された細胞からの生物物質の管理された解放)で起こるときに、結果は質量(導波路モードの定数がまた、マクスウェルの電磁方程式に従って変えなければならない伝搬)の減失を原因として生じるので、カバー培地の実効屈折率を変える。
導波路グレーティング構造のための位相整合条件の結果が上記に言及したように、入力光の好適な結合角度(または波長)は導波路伝搬定数変化に従って変わらなければならない。
これらの肉眼の物理変化は、顕微鏡学的な細胞現象を示すためにモニタされ得る。
(b) 光導波路光モード分光学(OWLS)理論)
折れ線波動モデルによって記載されている全反射によって、導波モードはプレーナー型導波路において広がる。折れ線波動モデルを得た後、通常波と2反射波との位相差は薄膜β内の光の所定導波路構造および偏光と波長のための波ベクトルχ成分との関数である。
自己無どう着性基準によって決定されて、βの値は、モード方程式(Horvath, R., et al., "Effect of Patterns and Inhomogeneities on the Surface of Waveguides Used for Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy Applications," Appl. Phys. B. 72, 441-447)から、数値的に算出され得る:
導波路のモード伝搬方向はχである、そして、m=0,1,2….はm次案内モードのモード屈折率である。
折れ線波動モデルにおいて、各々の光線が平面波を表す(P.K. Tien., "Integrated Optics and New Wave Phenomena in Optical Waveguides," Rev. Mod. Phys. 1977, 49, 361)。
光が導波路に結合される場合、それは折れ線波が薄膜界面に当たるそれらの点で、結合を考慮するのに必要なだけであり、そして、これらの点で、光線光学が使われる。
グレーティングおよびレーザ光線の有限の幅を原因として生じるので、平面波を有する角度aoの下でグレーティングを照らすときに、回析された光は平面波分配を使用して記載されている。
これは、ほぼ2p/Lの最大半減(PWHM)でのピーク幅を有するβ0でピークに至り、これは光学不確定原理から算出される (Tiefenthaler, K. and Lukosz, W, J., "Sensitivity of grating couplers as integrated-optical chemical sensors", J. Opt. Soc. Am. B. 1989, 6, 209-220)。
|G(β)|2=IG(β)。
被結合光強度、I(α)および入射角(それはまた、光導波路光モード分光学(OWLS)技術を使用して測定され得る)間の関係は、以下の方程式を使用して算出され得る:
たとえば、マイクロチューブルは長距離の上の細胞器官を輸送する。
刺激は、細胞が培養されるセンサ界面のまさしくその末梢の濃く包まれた細胞器官のサブミクロン運動に結果としてなることが可能である;
かかる運動は、細胞内で質量再分布を導く。
模倣が「輸送」ことまたは「転位」と呼ばれているというシグナルまたは「再分布」に応答するかかる運動。
かかる輸送転位または再分布現象は、一般に質量再分布と関連する。
質量再分布は、光学バイオセンサによって検出され得る;
そして、質量再分布に関するシグナルは指向性質量再分布(DMR)シグナルと呼ばれる。
解析を単純化するために、動的質量再分布は、2つのタイプ、センサ界面に垂直に起こる垂直質量再分布と、センサ界面に平行して起こる横(水平)質量再分布とに分割され得る。
特定の刺激性事象がこれらの質量再分布うちの1つ、または両方の結果としてなると理解される。
かかるDMRは、また、垂直の質量再分布とみなせる。
具体的には、センサ界面に対する平行である方向およびセンサのエバネッセント波の方向に対する垂線の刺激性事象−起因性質量再分布は、細胞層内の質量の均一の変化およびこのように共鳴ピーク、共鳴バンド像および/またはOWLSスペクトルの変化の結果を導く。
かかる変化が、検出されることができて、刺激性事象の効果または刺激性事象−起因性細胞応答上の化合物のためのシグニチャとして使われる。
かかる質量再分布は、横質量再分布とみなせる。
外部性シグナルは特定の細胞シグナル伝達の活性化を媒介する。そして、多くの場合細胞の内容物(動的質量再分布に対する当量)の動的再分布に結果としてなる。
検知体積(すなわちエバネッセント波の侵入深さ)内で起こるときに、DMRは明らかにされることができて、このようにRWGバイオセンサ(センサ界面の近くで局在部屈折率の変化に知覚しうる標識フリー技術)によって、リアルタイムにおいてモニタした。
多パラメタ計測のためのその機能のため、バイオセンサは細胞のための高い情報内容に検出することを提供するためにポテンシャルを有する。
これらのパラメータは、角のシフト(最も一般の出力のうちの1つ)、強度、最大半減(PWHM)でのピーク幅および共鳴ピークの領域を含む。
各々のセンサを照らすために約200μm ×3000μmの光ビームを使用する我々の角測定システムのユニーク設計のために、各々のセンサの共鳴バンド像が細胞状態(例えば、密度および接着程度)の均一性にに関して、全てのセンサ全体の異なる場所にある細胞のための細胞応答の均一と同様に追加の役立つ情報に提供できる。
導かれた光は、基質−薄膜および培地−薄膜界面での全反射による制限により、全てが導波路に平行な伝搬方向を有する光の一つ以上のモードとして見られる。
導波路は、その周囲の培地より高い屈折率値を有する。
導かれた光モードが全ての層をカバーする横振幅プロフィールを有するので、各モードの実効屈折率Nは全ての層の屈折率の秤量合計である。
そして、σはモードタイプ数で、TE(横電気波またはs−偏光)で1に等しく、TMモード(横磁気波またはp−偏光)で0に等しい。
数種類の細胞は、主に接触の三タイプ、局所の接触、近い接触および細胞間マトリックス(ECM)接触によって、界面上に被着することは公知である。
局所の接触は、基質界面の10〜15nm内で来る付着細胞膜(例えば0.2μM×10μm)の狭い領域である。
近い接触は基質から1〜50nmの分離される細胞膜の領域に関連し、これに対してECM接触が基質から100nm以上分離される細胞膜の領域を示す。
このように、センサが細胞密集度がまだ高量(約95%)であるときでも、カバー培地を検出することが可能であると分かる。
しかし、生体細胞が約70%水を含むことを公知であり、そして、大部分の細胞内の生体高分子はフィラメントネットワークのマトリックスによって構成されて、空間的に哺乳動物細胞の適当な部位に制限される。
さらに、細胞の体高は概して入射光(ここでλ=830mm)の手に余る。その一方で、侵入深さは一般に細胞の体高より非常に小さい。
このように、検出することはそうする細胞のためのバイオセンサは、基質、導波路および細胞層の三層構成として見られる。
エバネッセント波の振幅(Em)は、界面から距離zの増加と共に指数的に減衰する:
細胞性状の使用するバイオセンサおよび一意性の構成に基づく、ここで使用するTM0モードの侵入深さが約120であることナノメートル、我々が細胞の底一部をモニタするだけだった意味。
転位は、振幅、持続期間および特定の標的による細胞シグナル伝達の動態の正確なコントロールを可能にする。
加えて、場合によっては、外部性刺激によって、また、細胞状態(例えば接着程度および細胞骨格構造)の変化が生じることがありえた。
かかる変化が検知体積内で起こるときに、モード屈折率Nはカバー培地およびエバネッセントテイル間の相互作用のために変化する。
各々の層は、それ自身の屈折率niを有して、zi(図2b)の距離によって、センサ界面から離間される。
全ての層は等体積を有すると考慮されてもよい。その理由は、単位面積Aは定常的であると考慮されて、導波路の被きょう導波の伝搬長さと同様に入射光ビームの物理的な大きさに限られている光学バイオセンサの空間分解能によって決定されるからである。
細胞内の所定の体積の屈折率は、主に生体分子の濃度によって決定される主にタンパク質[Beuthan J, O. Minet, J. Helfmann, M. Herrig, and G. Muller. 1996. The spatial variation of the refractive index in biological cells. Phys. Med. Biol. 41:369-382):
Ciは、層iの溶質の濃度(g/100ml)である。
比屈折増分がタンパク質および他溶質のための同様である間、体積につき重量に関するそれらの濃度がかなり他の溶質より大きいので、タンパク質は主に各々の層の屈折率を説明する。
このように、均一な層iの屈折率変化Δniは、ほぼ区分的連続関数を形成する:
(ii)実効屈折率の変化はタンパク質再配置のためのイオン可動化(例えばCa2+流入およびCa2+フラックス)が刺激作用によって媒介したよりはむしろタンパク質濃度の変化の直接の関数になる;
(iii)センサ界面に向かう特定質量の標的または複合体の再配置が界面から離間されるその移向より総合応答率に貢献する;
(iv)光学シグニチャは、センサ界面から離れて異なる距離で起こっている質量再分布からの寄与の合計である統合したシグナルである。
細胞シグナル伝達の複合した本来性のため、異なる標的で媒介された異なる細胞シグナル伝達の活性化は類似した全体的なDMRシグナルに結果としてなるかもしれない。
しかし、特定のシグナル伝達現象のための細胞の標的のユニークセットの関与のため、選択的阻害物質の予め定められたセットによって媒介された阻害プロフィールは特定の刺激によって活性化されている細胞シグナル伝達の特異性を分類する手段を提供するかもしれない。
バイオセンサの低い横方向解像力のため、横質量再分布はこれらのシフトによって分解されるためにむずかしい。
しかし、グレーティングおよびレーザ光線の有限の幅のため、RWLS理論切片において議論されるように、平面波を有する角度αoの下でグレーティングを照らすときに、回析された光は平面波分配を使用して記載されている。
これは、いかなる付着層も存在しないとき光学不確定原理から算出した、ほぼ2p/LのPWHMを有するβoでのピークを導く。
これらの方程式を使用しているモデリングは面白い所見を導き、それは共鳴ピーク(またはスペクトル)の形が質量分布の横方向不均質性について価値ある情報を運ぶことを示唆する。
かかる横方向不均質性は、強くカバー培地屈折率を乱さなくて、かなり共鳴ピークの形を変える。
たとえば、細胞の異なる個体群は異質に細胞に対し毒性である化合物に応答してもよい。その一方で、単一の付着細胞は若干の細胞過程(例えば細胞移動および侵襲)の間、特定の細胞の標的または分子集合体の偏在を経てもよい。
我々は、起こるときに、不斉横質量再分布がまた、微細構造の変化および共鳴ピークの形に結果としてなることがありえたと仮定した。
細胞骨格は、たとえば、抗張力を、「軌道」または「ドッキング部位」をシグナル伝達のために用意して、輸送することによって、そして、力を細胞移動、細胞内輸送および細胞分割のために用意することによって、細胞形状を維持するために提供することによって多様な細胞の活性を実行することに関係させる。
細胞骨格フィラメントの三種、アクチンフィラメント、中間径フィラメントおよびマイクロチューブルがある:
(各々の実行異なる生物学的な諸関数)。
これらのフィラメントの中で、それらが細胞の形を保って、細胞質的な***を形成して、若干の細胞−−細胞または細胞−−マトリクス結合、シグナル伝達および筋収縮に参加するように、アクチンフィラメント大部分は形質膜の下でちょうど集中する。
さらに、細胞のタンパク質の局在は、タンパク質相互作用の特異性および効率を厳格に管理して、空間的にタンパク質活性化および失活機構を分離して、特定の細胞機能および応答を決定するために制御される。
刺激作用に応答して、しばしば、時々、シグナル伝達経路およびそのネット相互作用の性質、細胞状態および細胞のコンテクスト(context)に依存する細胞のタンパク質の有意な再配置がある。
タンパク質および分子集合体の再配置は、その振幅、持続期間および動態の正確なコントロールを可能にすることによる細胞シグナル伝達だけでなく、細胞機能(例えば移動、侵襲、成長、サイクリング、分化、生残および死亡)に対して基本的である。
GPCRは、膜結合タンパク質の表面のファミリである。
非刺激の細胞において、内存性GPCRは、主に細胞表面で位置決めをする。
リガンドにさらされた後に、細胞は細胞内のシグナル伝達および調節性機構によって、きつく、そして、正確に管理されている一連の間隙で一時性の現象で応ずる。
これらの現象は、GPCRのシグナル伝達サイクル(シグナル伝達サイクル)の間、細胞の内容物の秩序あって、誘導されて、方向で動的な再分布を導く。
細胞の内容物の動的な再分布をモニタすることは、GPCRシグナル伝達への洞察およびGPCRスクリーニングのための強力な手段を提供した。
例(直接のスクリーニングストラテジとしてのこのプロセスの作動薬刺激作用始められた関心のある後のβ2−アドレナリン受容体密度GFP共役の再配置の直接タイプ可視化)について説明すると、
これらの輸送アッセイのうちの1つは、Xsira Pharmaceuticals Inc(前はNorak Biosciences)からのTransfluor技術である。
この技術は、化合物に応答して蛍光標識されたアレスチンの細胞内の位置をモニタするために高分解能蛍光画像化を使用する。
蛍光標識されたアレスチンの再局在は、活性現象の指示として見られる。
DMRシグナルは、生体細胞の新しい生理応答として作用する。
理論的解析は光学シグニチャ(そのことは入射角または波長のシフトによって指示した)が主に検知体積(DMRに関連した)内で、垂直の質量再分布に知覚しうることを示した。その一方で、共鳴ピークの形(例えば最大の半分のピーク幅、強度および領域)に関する光学出力パラメータは刺激作用−起因性横質量再分布に影響される。
細胞層へのはかなさ波尾穿通性の指数関数的減衰のため、それがセンサ界面からもっと先である時と比べて、標的または複合体がセンサ界面により近いときに、特定の質量の標的または複合体はより総合応答率に貢献する。
さらに、センサ界面の方の特定の質量の標的または複合体の再配置はシグナルの増加に結果としてなるのに、標的または複合体移向の再配置は界面から離れてシグナルの減少につながる。
センサの共鳴ピークの幅または位置が細胞密度および増殖に知覚しうるので、かなりアッセイ結果に衝撃を与えてもよい細胞(例えば細胞増殖、細胞密度および接着の程度)の生物学的な状態は検査され得る。そして、還元したアッセイ多様性に結果としてなる。
光学バイオセンサが標識のなくて非観血的であるので、バイオセンサに基づく細胞アッセイは多重化する。
たとえば、A431のプロテアーゼ活性受容体(PAR)と同様に内因性のブラジキニンB2受容体(P2Y受容体)の作動薬−起因性活性化が、類似したGq−タイプ光学シグニチャ(図66)を導くことがわかった。
さらに、光学バイオセンサが統合した応答を提供した時から、特定の標的で媒介されたDMRシグナル伝達はまた、その下流のシグナル伝達標的の輪郭を描くために用いることが可能である。
たとえば、A431のEGF−起因性DMRは、その下流の標的を1つの標的とする化合物の輪郭を描くために使用される:MEK1(図44)。
これらの結果は、バイオセンサに基づく細胞アッセイが本来多重化していることを示唆した。
これらのパラメータは、シフトを垂直の質量再分布に知覚しうる反射光および大部分は横質量再分布に知覚しうる共鳴ピークの形を定義しているパラメータの角度または波長に含む。
これらのパラメータの組み合わせは、更に検査される(EGFRシグナル伝達のための図84において、そして、ブラジキニンB2シグナル伝達のための図85において、例は活性酸素種シグナル伝達のための図80に示される)細胞上のリガンドの作用上の詳細な情報を提供してもよい。
あるいは、バイオセンサが非観血的だった時から、バイオセンサに基づく細胞アッセイは容易に他技術(例えば質量分析および蛍光画像化)と統合され得る。
これらの技術は、更に細胞上の化合物またはリガンドの作用を確かめる。
細胞シグナル伝達の複合した性質のため、異なる標的で媒介された異なる細胞シグナル伝達の活性化は類似した全体的なDMRシグナルに結果としてなるかもしれない。
しかし、特定のシグナル伝達現象のための細胞の標的のユニークセットの関与のため、選択的モジュレータの予め定められたセットによって媒介された転形プロフィールは特定の刺激によって活性化されている細胞シグナル伝達の特異性を分類する手段を提供するかもしれない。
したがって、DMR応答は、生体細胞の系生態学研究のためのユニークおよび完全な読み出しとして処理され得る(例は、EGFRシグナル伝達のための図38−47に示される;
または、A431細胞のPARシグナル伝達のための図71−79の)。
これらの研究は、異なる標的の転形がEGFによってDMRシグナル誘導の異なる減衰に結果としてなることを示した。
上皮増殖因子(EGF)刺激作用に応答して、静止A431細胞のDMR応答が、EGFの濃度に対する飽和性であるとわかって、種で有力なEGFRチロシンキナーゼ阻害物質(AG1478)によって、充分に抑制されることが可能だった。
静止A431細胞のDMR応答上のさまざまな周知の阻害物質/薬剤の効果は細胞応答を主にRas/mitogen−活性タンパク質(MAP)キナーゼ経路に結合した。そして、それは主にMEKで進む。
(5.細胞アッセイ)
これらのアッセイは、アッセイのためのシグニチャを産生するために用いることが可能である、または、アッセイから一つ以上のステップと同様に決定を作るために用いることが可能である一つ以上のバイオセンサ出力パラメータの使用を取り入れる。
条件の特定のセットのために集められる出力情報である出力データの形で、出力があることが可能である、そして、貯蔵されてリアルタイムの分析をした。
バイオセンサの使用中に生成するデータ出力は、概してグラフ形態例えば応答ユニット対時間(一例としてここに開示される多くの他の図と同様に図6Aを参照)として表される。
応答ユニットは角度測定検出系が使われる角のシフト(程度に関して)であり、または、CCDカメラを利用している角度測定検出系がある波長シフト(波長測定検出系が使われるピコ−メートルに関して)または画素位置シフト(画素に関して)はバイオセンサの共鳴バンド像をまとめたものである。
また、応答ユニットは角度(図6B参照)を内結合する機能としての結合された光または波長の強度である。そのとき、所定モードの共鳴ピークスペクトルが使われる。
もう一つの実施例では、CCDカメラを利用している角度測定検出系がバイオセンサ(図6C参照)の共鳴バンド像をまとめるために用いるときに、応答ユニットは画素または位置的強度の位置である。
バイオセンサ出力パラメータまたはバイオセンサ出力データパラメータはそれぞれバイオセンサ出力または出力データのいかなる形質でもある。そして、測定されることができて、バイオセンサ出力またはバイオセンサ出力データを分析したものである。
或る実施例において、バイオセンサ出力パラメータは、また、同定されることができて、多数アッセイ全体に使われる形質である。
シグニチャは、特定のアッセイのための症候として使われるパラメータのいかなるバイオセンサ出力パラメータもまたは組み合わせである。
たとえば、シグニチャは刺激性事象の後のピークの強度大きさの使用でき、または、それは刺激性事象の後のピーク強度の位置でありえ、または、それは最大半減のピーク強度の位置でありえる。
たとえば、このシグニチャが使われ、細胞の培養上の2つの異なる化合物または細胞(全てのデータ出力の比較よりむしろ)の2つの異なる培養上の単一化合物の効果の効果を比較することができる。
このように、シグニチャは単一の時間点または単一の波長または単一波動角度で起こってもよく、または、組み合わせはそうであることに従い分析される。
(応答ユニットのために上の討論参照)
(a) バイオセンサ出力パラメータ)
たとえば、細胞内で刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態を定義している6つのパラメータは、全体的動態(すなわち形)でありえる応答の位相(この具体例において、細胞応答に関する3つの主な位相が、正の指向性質量再分布(P−DMR)(図6A点C−D);ネット−ゼロ指向性質量再分布(ネット−ゼロDMR)(図6A点D−E);そして、負の指向性質量再分布(N−DMR)(図6A点E−F−G);(動態)各々の位相、P−およびN−DMR位相の総振幅およびP−からN−DMR位相(図6A)への遷移時間tの全体の持続期間時間;がある。
他のバイオセンサ出力パラメータは、共鳴ピーク(図6B)から得られる。
たとえば、ピーク位置、強度、ピーク形および最大半減(PWHM)でのピーク幅が、使われる(図6B)。
バイオセンサ出力パラメータは、また、バイオセンサの共鳴バンド像から得られる。
データは、配列された角度測定システムを使用して得られて、5つの5つの追加の特徴:バンド形、位置、強度、分配および幅を例示する。
ここに開示されるように、これらのパラメータの全部がバイオセンサを使用しているいかなる細胞アッセイものいかなる所定の適用法のためにも、それぞれにまたは一緒に使われる。
いかなるサブセットもまたは組み合わせのパラメータの使用は特定のアッセイ(例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ)上の所定のアッセイまたは所定の変異のためのシグニチャを産生する、そうすると、EGF受容体のための特定のシグニチャはアッセイの基礎を形成した。
((1) 刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態に関連したパラメータ)
これらのパラメータは、細胞に対する刺激性事象が起こるようにバイオセンサデータ出力に起こるのでその変化率に注目する。
刺激性事象は例えば、培地に対する分子の添加、培地からの分子の除去、ペーハー(pH)の変化または温度変化または細胞に対する照射の導入など、細胞の状態を変えるいかなる現象でもある。
刺激性事象は、刺激性事象によって生じる細胞に対するいかなる影響(例えば指向性質量再分布)でもある刺激性効果を産生する。
刺激性事象は、化合物、化学物質、生化学、生物学的製剤、ポリマーなどである。
生化学であるものまたは生物学的製剤は、そうしてもよいペプチド、合成ペプチドまたは自然ペプチドである。
たとえば、多くの異なるペプチドはシグナル伝達分子として作用して、炎症誘発性ペプチドブラジキニン、プロテアーゼ酵素トロンビン、および、血圧管理ペプチドアンギオテンシンを含む。
これらの三つのタンパク質がそれらの配列および生理学において区別され、異なる細胞表面受容体で作用すると共に、それらはG−タンパク質共役型受容体(GPCR)と呼ばれている細胞表面受容体の一般のクラスにおいて分担する。
他のGPCRのポリペチドリガンドは、バソプレシン、オキシトシン、ソマトスタチン、ニューロペプチドY、GnRH、ロイチナイジングホルモン、FSH、パラトルモン、オレキシン、ウロテンシンII、エンドルフィン、エンケファリンおよび多数他を含む。
GPCRは広くて多様な遺伝子ファミリであり、ペプチドリガンドに応答するだけでなく、また、小分子神経伝達物質(アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンおよびアドレナリン)や、光、臭気物質、味覚、脂質、ヌクレオチドおよびイオンにも応答する。
GPCRによって使用される主なシグナル伝達機構は、細胞内のカルシウム遊離およびcAMP産生を含んでいる下流二次メッセンジャ系に結合するGタンパク質GTPアーゼタンパク質と相互に作用することである。
ペプチドGPCRによって使用される細胞内のシグナル伝達系は、全部GPCRによって使用するそれらに対する同様であって、それらが相互に作用するGタンパク質および活性化される二次メッセンジャ系によって概して分類される。
Gs−被結合GPCRのために、受容体によるGタンパク質Gsの活性化はcAMPのアデニル酸シクラーゼおよび産生の下流活性化を刺激し、その一方で、Gi−共役型受容体はcAMP産生を抑制する。
cAMP産生のキー結果のうちの1つは、タンパク質キナーゼAの活性化である。Gq−共役型受容体はホスホリパーゼC、放出IP3、そして、ジアシルグリセロールを刺激する。
IP3はER内の受容体に結合し、細胞内カルシウムの放出、次のタンパク質キナーゼCの活性化、カルモジュリン依存性経路を生ぜしめる。
GPCRのための二次メッセンジャシグナル伝達系に加えて、GPCR経路は、チロシンキナーゼ生長因子受容体を含んでいる他のシグナル伝達経路でクロストークを呈し、そしてキナーゼ経路をマップ(map)する。
EGF受容体または局所の接着複合体のような受容体チロシンキナーゼのトランスアクチベーションは、アダプタタンパク質Shc、Grb2およびSosでras活性化を刺激し、そして、Erk1およびErk2を活性化しているキナーゼを下流マップ(downstream Map)する。
また、Srcキナーゼは、ラス癌遺伝子(ras)の活性化で決定的な介在の役割を演じ、GPCRによってキナーゼ経路をマップする。
細胞の条件が指向性質量再分布が生じることがありえた若干の方法または細胞または細胞培養の変化において変わったので、この状況はまだ刺激性事象である。
多くの異なるアッセイのためにここに開示される多数の「シグニチャ」がある、しかし、ここに実行されるいかなるアッセイのためにも、そのアッセイの「シグニチャ」は決定され得る。
また、いかなる所定のアッセイのためもの複数の「シグニチャ」があることが可能であることはあり得る、そして、ここに記載されているように、各々は決定され得る。
バイオセンサ出力データを集めて、一つ以上に注目した後に、所定のアッセイのためのパラメータまたはシグニチャは、得られる。
最適のシグニチャを同定することは多数実験を実行するのに必要でもよい、そして、最適のシグニチャを見つけることは異なる条件の下で実験を実行するのに必要でもよい、しかし、これはされ得る。
ここに開示される方法のいずれでも「同定する」ステップまたは「決定する」ステップまたは、たとえば、「提供する」ステップを含み、たとえば、シグニチャがそれらの上へ加わったものと理解される。
((a) 全体的動態)
この全体的な動的パラメータは、データ収集の完全な運動の写真を観察する。
観察され得る全体的な動態の1つの見方は、時間上のデータ出力によって産生される曲線の形状の変化である。
このように、データ出力によって産生される曲線形状は刺激性事象の発生において、変化するかまたは確実に留まる。
その変化の方向は、全体的な質量分布を示し、たとえば、正のDMR(P−DMR)位相は、センサのエバネッセントテイル内での正味の質量増加を示し、ネット−ゼロDMRはセンサのエバネッセントテイル内で質量の正味変化がほとんどないことを示唆し、負のDMRはセンサのエバネッセントテイル内で正味の減少質量を示す。
光学バイオセンサを使用して得られた刺激作用−起因性細胞応答の全体的な動態は、単一の位相(P−DMR、N−DMR、もしくは、ネット−ゼロDMR)、または、二位相(例えば、二相はこれらの三位相のいかなる組み合わせでもありえる)、または、三位相、または、多数位相(例えば一以上のP−DMRが時間経過中に起こり得る)からなる。
((b) 応答の位相)
標識フリーバイオセンサは、曲線としてグラフで示され得るデータが出力を産生する。
たとえば、この曲線は転移点を有し、ここで、データは増加状態から減少状態またはその逆まで状態にする。
これらの変化は相転移と呼ばれ、そして、たとえば、それらが起こる時間およびそれらの形状がバイオセンサ出力パラメータとして使われる。
たとえば、正の指向性質量再分布(P−DMR)、ネット−ゼロ指向性質量再分布(ネット−ゼロDMR)または負の指向性質量再分布(N−DMR)がある。
P−DMR、N−DMRおよびNZ−DMRの振幅は、分離したバイオセンサ出力パラメータ(たとえば図6Aおよび図7参照)として測定され得る。
((c) 動態)
たとえば、相転移の完成でのレートである。
たとえば、相転移完了はどのくらいの速さか、または、データ出力完了にどのくらい長くかかるか、である。
測定され得る動態の他の例は、データ出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さである。
他の例は、P−およびN−DMR位相の一方または両方の時間の全体の持続期間である。
他の例は、それがいずれをP−およびN−DMR位相の一方または両方の総振幅を得るとみなすか速度または時間である。
他の例は、P−からN−DMR位相への遷移時間tでありえる(図6A(図が動態力学的パラメータのこれらのタイプの全ての多数例に他と同様に提供する)。
P−DMRてN−DMR現象または位相の動態は、また、測定され得る。
たとえば、図6Aおよび図7Aに示すように、上皮増殖因子(EGF)を有する人間の静止性人間類表皮癌A431の刺激作用は、少なくとも3つの位相からなるダイナミック応答に結果としてなる。
6A図および7において立証されるように、EGF濃度はより高い、より大きいP−DMRてN−DMRシグナルの振幅にある、断食しているものはP−DMRてN−DMR現象である、そして、より短い、遷移時間はP−DMRからN−DMR現象まである。
P−DMR現象の振幅がEGF濃度を有する合併した類縁を示すときに、N−DMRシグナルの振幅は明らかにEGF濃度に対する飽和性であった。そして、約1.45nM(図7B参照)のEC50に結果としてなった。
遷移時間tが、数秒でEGF(図7C参照)の濃度増大Cによって、指数的に減少するとわかった。
加えて、N−DMRシグナルの減衰は、非線形回帰を付けている。
得られた一つの位相減衰定数kはまた、飽和性であった。そして、5.76nM(図7D参照)のKdに結果としてなった。
((2) 共鳴ピークに関連したパラメータ)
光導波路光モードスペクトルは、バイオセンサを照らす光の角度の広い範囲を使用して、角度の関数として、結合された強度の強度をモニタする方法のバイオセンサに、光の結合の光対角度の強度に注目することによって起こる一特定のデータ出力である。
このスペクトルにおいて、多数導波モードの多数の共鳴ピークは、共同起こる。
共鳴ピークおよびOWLSスペクトルの後の原理が同じものであるので、取り換えられて所定の導波モードの共鳴ピークまたは多数導波モードのOWLSスペクトルを使用する。
バイオセンサにおいて、特定の波長光が起こるか、または、光がバイオセンサに特定の角度で当たるように光が生じる時のどちらかの場合、光源から発される光はバイオセンサに結合され、そして、この結合はバイオセンサからのシグナルを増加する。
結合光角度または波長の関数としての強度のこの変化は、共鳴ピークと呼ばれている。
(たとえば、図6B参照)。
センサの異なる所定モードは、異なる特性を有する類似した共鳴ピークを引き起こす。
関して使われる所定モードで異なる共鳴ピークまたは共鳴性スペクトルを定義している多くのパラメータが、DMRまたは細胞効果を査定するためにこのピークにある。
これらのサブセットは、議論される。
((a) ピーク位置)
これが起こる角度または波長(位置)は、刺激性事象に応答して質量再分布または細胞現象により変わる。
たとえば、EGF受容体のような特定の受容体のための潜在的な成育因子がある場合には、培養細胞のための共鳴ピークの位置は結合波長または結合角度を増加または減少させ、結果として共鳴ピークの中央の位置の変化させる。
理解されることは、ピーク強度の位置が測定され得、測るに良好な点であると、たとえば、75%のピーク強度または50%のピーク強度または25%のピーク強度または66%のピーク強度または45%のピーク強度での位置のような、共鳴ピークに沿ったいかなる点の位置でも測定され得る(たとえば、ピーク強度の1−100%からの全てのレベルが考慮されることが開示される)。
しかし、ピーク強度以外の点を使用するときに、位置は常にピーク強度(たとえば、45%のピーク強度であるピーク強度)位置の前および後にある。
このように、ピーク強度以外のいかなる強度のためにも、その強度が起こるピーク内で、2つの位置が、常にある。
これらのピークでない強度の位置はバイオセンサ出力パラメータとして利用され得る、しかし、単に強度の位置がプレピーク強度かポスト−ピーク強度であるかどうかについて知っていることを必要とする。
((b) 強度)
1つの特に関連した強度は、所定モードの共鳴ピークの最大強度である。
最大強度のこの大きさは、位置のように、細胞または細胞培養に対するかかる影響を有する刺激性事象の存在に基づく変わり、この変化が測定され、シグニチャを使用できる。
ちょうど共鳴ピーク位置と同様に、共鳴ピーク強度は、また、ピーク内でいかなる強度もまたは位置で測定され得る。
例えば、バイオセンサ出力パラメータ、50%の最大強度または30%の最大強度である強度または最大1%および100%の強度間の最高強度またはいかなるパーセントもの70%として使用してもよい。
同様に、強度の位置と同様に、最大45%の強度のような、最大強度以外の強度が使われる場合、この強度を有する共鳴ピーク内で、2つの位置が常にある。
強度を有する非最大強度を用いて位置パラメータがされ得るちょうどその時、ちょうど強度が予め最大強度かポスト−最高強度であるかどうかを説明しなければならない。
しかし、他のバイオセンサ出力パラメータは、全体の角のシフト(すなわち共鳴ピークの中央の位置)のような、まったく効果のない分子から阻害物質および活性化物質を区別するために用いることができる。
PWHMは、図6Bにおいて例示されるように、ピークの最大強度(体高)の半分であるピーク上の点の間で引かれるラインの長さである。
たとえば、細胞増殖の阻害物質はまったく処理なしで細胞のためのシフトより小さい角のシフトを引き起こす傾向があるのに、活性化物質は、まったくいかなる処理も、全てのセンサ上の細胞密度が本質的に同一である時またはほぼ同じものない細胞を有するセンサと比較すると、より大きい角のシフトを引き起こす傾向がある。
細胞増殖を抑制する(阻害物質として)かまたは刺激する(活性化物質として)化合物の潜在能力または機能は、全化合物の濃度が同じであるとすると、PWHM値上のそれらの効果によって決定され得る。
PWHM変化の予め定められた値は、共鳴ピークの中央の位置の変化と協力して、阻害物質または活性化物質をろ過するために用いることが可能である。
使用する測定システムに従い、所定モード、ユニットまたはPWHMの値の共鳴ピークを検出することは、変化してもよい。
たとえば、角度測定システムのために、ユニットは程度でありえる。
程度のPWHMの変化は、第1000に(たとえば)第1000に第1000に第1000に第1000に第1000に1、2、3、5、7または10でありえた。
((c) ピーク形)
最大半減のピーク強度でのピークの形または他のいかなる強度にもたとえば((例えば30%、40%、70%または88%)、または、あらゆる20および100%間のパーセント)バイオセンサ出力パラメータとして使用する。
形は、下記のピークの領域によってまたは特定の強度より上に特徴づけられる。
たとえば、半分で、最大のそこのピーク強度は、点(すなわちプレピーク強度および点(すなわちポスト−ピーク強度))である。
ラインはこれらの2つの点の間で引かれる、そして、共鳴ピーク内のこのラインまたは共鳴ピーク内で線より下の領域より上の領域は決定されることができて、バイオセンサ出力パラメータになる。
所定のピークの統合した領域がまた、細胞に作用している化合物の効果を分析するために用いることが可能であると理解される。
たとえば、半分での共鳴ピークの幅で、最大のピーク強度(HMPW)は、50%のピーク強度である共鳴ピーク上の予めピークの強度点および50%のピーク強度であるポスト−ピークであるライン上の点間のラインの大きさを測定することによって決定され得る。
この計測が、それからバイオセンサ出力パラメータとして使われる。
共鳴ピークの幅が20および100%のピーク強度間のいかなる強度のためにも、このような方法で決定され得ると理解される。
(これの例は、図(例えば図6B)から透けて見える)。
((3) バイオセンサの共鳴バンド像に関連したパラメータ)
多数バイオセンサ上の結合現象または細胞付着性または細胞増殖のために、研究者は一般に時間−逐次的な方法のこれらの現象をモニタする。
したがって、異なるセンサの中の直接タイプ比較は、対抗でありえる。
さらに、これらの検出系測定がセンサを照らすために小さい点(約100−500mm直径)のレーザ光線を利用することは、波長であるか角であるどうか。
応答または共鳴ピークは、明らかにする領域から細胞応答の平均値を表す。
96ウェルバイオセンサマイクロプレート(例えばコーニングEpicマイクロプレート)のために、各々のRWGセンサがほぼ3×3mm2であって、各ウェルの底にあり、センサは一般に384ウェルマイクロプレートフォーマットのための1×1mm2の大きさを有する。
したがって、現在のセンサ技術を使用して得られた応答は、センサ界面の少ない分を表すだけである。
理想的には、検出系によって、同時に多数バイオセンサ上の生体細胞被着の応答をモニタできなければならないだけでなくて、各々のセンサの比較的大きい領域または多数領域から、シグナル測定を許しもしならない。
反射光は、直接結合された光に関する。
あるいは、共鳴バンドは、センサを照らすために小さいレーザ点を使用する方法および一次元または二次元の全部のセンサ全体のスキャンの精査測定システムで集められることができて、所定の導波モードの共鳴ピークを集める。
センサ内の位置の関数としての共鳴ピークまたは光強度は、センサの共鳴バンドを形成するために最後に再構成され得る。
バイオセンサにおいて、特定の波長光が起こるか、または、光がバイオセンサに特定の角度で当たるように光が生じる時のどちらかの場合、外結合された光はセンサ界面の又は近くの屈折率変化の関数として変化して、そして、この変化は画像化システムによって集められた各々のセンサの共鳴バンドの特性のシフトを導く。
さらに、後に培養される全てのセンサ全体の細胞の平坦でない付着は、共鳴バンド(たとえば、図1の回られた共鳴性バンド参照)を使用して、直接視覚化され得る。
理想的な多重井戸タイプバイオセンサマイクロプレートにおいて、各々のセンサの位置は、他バイオセンサに正規化する親族である。
すなわち、センサは並び全体の各ウェルまたはマイクロプレートのカラムの中心で整列配置される。
したがって、得られた共鳴バンド像が、刺激作用に応答して細胞付着性または細胞変化にに関して、内部基準として使われる。
したがって、所定モードの各センサのかかる共鳴バンドは、DMRまたは細胞効果を査定するためにこのバンドに関して使われる付加パラメータを提供する。
これらのサブセットは、議論される。
((a) バンド形状)
形は、各々のセンサの大きい領域全体の強度分布によって定義される。
図1および他に示すように、形は、大きい領域(たとえば、図1に示すように、各々の共鳴バンドは、約200mm×3000mmの大きさを有する全てのセンサ全体の応答を表す)全体の刺激作用に応答して、付けられる細胞の均一性または細胞変化の指標として使われる。
((b) 位置)
強度は、各々のバンドの最高強度を有する中心位置を生成するために画像化ソフトウェアを使用して量を定められる。
かかる位置は、刺激作用または化合物処理に応答して細胞変化を検査するために用いることが可能である。
((c) 強度)
全てのバンドの平均値強度または画像化バンドの各々の画素(ピクセル)の絶対強度は、細胞付着性の品質を検査して、細胞応答を評価するために用いることが可能である。
((d) 分配)
このパラメータは、細胞がないか、または、固定された調査分子がないとき、センサ自体の界面特性を評価するために使用され そして、センサ界面の照射された領域全体の細胞付着の品質を検査する。
また、全ての領域全体の細胞密度が同一のときに、このパラメータがまた、細胞に対する化合物影響の均一性を検査するために使われる;
または、なぜならば、細胞密度が照射された領域全体の他からの異なる1つの領域である化合物−起因性細胞応答上の細胞密度の効果を検査すること。
((e) 幅)
このパラメータは共鳴ピークのPWHM値のそれらに対するほとんど同一の特徴(このように役立つ情報内容)を共有する。但し、次の場合は除く−あれはセンサ(共鳴ピークに利用できる1つのPWHMだけの代わりに)の照射された領域の多数領域で、多数帯域幅を得る。
他パラメータに対する同様が共鳴バンド像によって得られて、幅が上述した適用法のために使われる。
いかなるサブセットもまたは組み合わせのパラメータの使用は特定のアッセイ(例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ)上の所定のアッセイまたは所定の変異のためのシグニチャを産生する、そうすると、EGF受容体のための特定のシグニチャはアッセイの基礎を形成した。
(b) 細胞および細胞コンテクスト操作)
そこで、細胞を理解することは、細胞小器官現象(例えば細胞生物学、生化学)および分子生物学および多細胞現象(例えば生理学)を理解するための必須である。
細胞を分析することによって、生物学者は異なる標的分子の中の複合した機能上の類縁の多数を学んでいる。
標的分子は、DNA、RNA、脂質、タンパク質および、その中に、炭水化物を含む、そして、かかる分子の会合体中のいかなる生体分子でもありえる。
さらに、生物学者は基本的な細胞生物学原理を理解して、人間疾患を処理して、人の健康を改良するための薬剤候補物質をスクリーニングするために細胞を使用する価値を学んだ。
分析される細胞は、本質的に細胞のいかなるタイプでもあってもよい。
細胞のいかなるタイプも、開示された方法のいずれにでもおいて分析され得る。
分析される細胞は、生物または試験管で細胞培養されたものいずれから直接得られる。
標的を有する細胞は、いかなる生殖細胞系列、体細胞、分化全能性もしくは多能性幹細胞 、***もしくは非***細胞、実組織もしくは上皮細胞、又は不死化もしくは形質転換細胞からのいかなる細胞でもあってもよい。
現在まで、不死化安定細胞株の広いアレーが利用できる。
これらの安定細胞株は、多くの異なる生物、組織および発育時期に誘導する。
この巨大なアレーの試料採集は、American Type Cell Culture Collectionおよび他の細胞庫から入手可能である。
細胞は、一般に膜二重層によって少なくとも部分的に制限するか、2つ以上の実体への複製および***またはかかる実体の子孫、いかなる生物学的な実体も含む。
無核または突然変異した誘導体またはそれの子孫(例えばネット状赤血球および成熟した赤血球、その他);
それらの細胞核を取り除かれた誘導体;
そして、それらのいずれ間の融合体;
加えて、細胞は配偶子(例えば卵子、***、など)を含む。
細胞も、原核生物(例えばバクテリアおよびアキアクトテリア(archactacteria)を含む。
典型的な生物は、その中に哺乳類(例えば類人猿、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、人間、サル、ハツカネズミ、ブタおよびヒツジ)を含む。
典型的な生物も、その中に非哺乳動物脊椎動物(例えば鳥類、爬虫類動物、両生類(例えばツメガエルのようなカエル)および魚(例えばアウト(kout)、サケ、金魚およびゼブラフィッシュ))を含む。
典型的な生物も、非哺乳類無脊椎動物(例えばショウジョウバエ(例えばD.キイロショウジョウバエおよびD.オナジショウジョウバエ)の生物種、線虫(例えばC.エレガンス)、ウニ(例えばムラサキウニ)および粘菌(例えば細胞性粘菌))を含む。
典型的な生物も、単細胞の真核生物(例えばイースト(例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、ピキアパストリスおよびカンジダアルビカンス)および原生動物(例えば病原で非病原の原生動物))を含む。
典型的な生物も、無維管束植物と同様に植物(例えばシロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、豆、テーダマツ)を含む。
一次細胞は、異なる細胞タイプ、組織、器官または生物の領域から生じるか、またはそれらの混合液であってもよい。
例は、血液幹細胞、B−およびT−リンパ球、赤血球、好中球、好酸球性、マスト細胞、顆粒球、巨核球、マクロファージ、脂肪細胞、こう細胞、星状細胞、神経芽細胞、ニューロン、骨格筋芽細胞または筋管、平滑筋筋芽細胞、強心剤筋芽細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、血管内皮細胞、ケラチン合成細胞、軟骨細胞、内胚葉から誘導される細胞、中胚葉、外胚葉、および/または、栄養芽層のような胚体外の誘導体を含む。
組織は、一般にいかなるグループもの細胞を生物の一時であるか安定間隙の接近またはそれの培養された外植体に含む。
この間隙の接近は、自然におよび/または人工的に起こることができ、天然であるか通常の状態および/または誘導されたか病気にかかった状態、またはその中を表す。
人工の接近は、移植され、植設され、および/または融合された組織(器官または組織移植体、異種移植片、異タイプ移植、などを含む)を含み、さらに、その中に個別の有機体(例えば植皮片)内で移動された組織を含む。
病気にかかった組織は、(1)遺伝子欠損;
(2)汚染物質トキシンまたは照射のような環境性被害;
(3)非抑制成長;
(4)異常分化;
(5)異常細胞移動;
(6)例えばウィルス、バクテリア、原生動物、イースト、真菌および/または寄生生物の感染;
または(7)それのあらゆる組み合わせによる異常組織を含む。
組織は、いかなる野生タイプ、ミュータント、トランスジェニック、非現実的受精卵、桑実胚、胞胚、胎児、胚、新生児、若年性、青年または成人からのいかなる組織でもあってもよい。
適切な生後の組織の例は、
(1)、心筋、平滑筋、骨格筋を含むの筋肉;
(2)中央または末梢神経系(例えば脊髄または脳)からの神経組織;
(3)他の心臓組織;
(4)腎臓;
(5)肝臓;
(6)脾臓;
(7)食道、胃、小腸および大腸を含む消化系;
(8)膵臓;
(9)胆嚢;
(10)心臓、静脈および動脈を含む循環系組織および造血系細胞;
(11)免疫組織(例えば胸腺およびリンパ節);
(12)副腎;
(13)硬骨;
(14)軟骨;
(15)***の上皮その他のような上皮組織;を含む。
組織も、上記のいずれでもの自然および人工のものを含む。
胎児期細胞の例は、羊水、割球、絨毛膜絨毛、胎児血および他の胎児の組織から得られるそれらを含む。
出生後細胞の例は、骨髄穿刺液、リンパ、全血、血清、血漿、胸水、皮ふ生検、腫瘍生検または外科手術から得られるそれらを含む。
上記の通りに、出生後細胞の追加の例は、他の身体の流体および/または分泌(例えば尿、大便、唾液、粘質、粘液、涙、発汗、***、脊髄液、乳汁、痰、など)からまたは組織から得られたそれらを含む。
これらの確立した細胞株はいかなる適切な方法、ウイルス性、腫瘍性、物理的、化学的、突然変異誘発性、自然発生的および/またはカンズジェニック(kansgenic)形質転換を含む方法によって産生できる。
加えて、細胞はいかなる適切な方法(例えば遺伝の一時変異(例えば、物理的なおよび/または化学処理、照射、処理、感染または射出によって)および/または後成的発現一時変異(例えば、メチル化か他の分子の一時変異、カンズポソン(kansposon)機能、クロモソーム刷込み、酵母接合タイプスイッチングおよび/またはテロメアサイレンシングによって))にもよって修飾された株化細胞の特徴づけられるか特徴のない誘導体を含む。
差別化される細胞タイプは、脂肪細胞、繊維芽細胞、ミオサイト、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球性、好塩基、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン合成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
幹細胞はドナーから最近得られる幹細胞であってもよい、そして、特定の好適な実施例において、幹細胞は自己由来の幹細胞である。
ガラス管内で伝播される確立した幹細胞株から、幹細胞がまた、あってもよい。
totipotentに、多能であるにせよ、適切な幹細胞は、胎生期幹細胞および成体幹細胞を含み、分化全能性もしくは多能性、多分化能、または、より小さい発生的の細胞を含む。
幹細胞は、好ましくは哺乳類(例えば齧歯動物(例えばハツカネズミまたはラット)、霊長目動物(例えばサル、チンパンジまたは人間)、ブタ、および反すう動物(例えばウシ、ヒツジおよびヤギ))に由来する。
このように、単一細胞株が、全ての実験または化合物スクリーニングに適しているというわけではない。
たとえば、特定の標的の発現量は、明確に1種類の他のタイプに対する細胞からの異なるであり、場合によっては、特定の標的(例えばEGFR)によるシグナル伝達経路は、細胞の異なるタイプの中でかなり異なってもよい。
したがって、かかる標的による効果を生成するモジュレータが、開示される質量再分布を含んでいる劇的に異なる細胞応答を導くことができる。
それらの理由のため、細胞の特定のタイプは、特定の標的が制御可能に発現されまたは減少または眠らせるように、再操作されることを必要とする、または、若干の例において、特定のシグナル伝達経路が操作される。
かかる再操作された細胞に結果としてなり得る多くの最高水準の技術がある。
たとえば、トランスフェクション試薬または他の物理的なアプローチの助けを借りて、標的遺伝子または標的分子を有する細胞のトランスフェクションは、特定の標的の増加している発現量に結果としてなり得る。一方、反対の標的抗体またはアンチセンス、反対の標的遺伝子オリゴヌクレオチドおよびそれらの派生物、ペプチド阻害物質、または、干渉リボゾームリボ核酸(RNAi)を有する細胞のトランスフェクションは、標的分子の抑制に至ることができる。
加えて、細胞シグナル伝達の決定または細胞のコンテクストに依存している細胞応答のための新規な技術の必要がある。
細胞のコンテクスト上の細胞シグナル伝達の依存は、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達によって完全に例示される。
RTK刺激作用に応答して細胞表面で発生するシグナルの生物学的な結果は、強く細胞のコンテクストに依存している。
異なる細胞、または、特定の細胞株の分化の異なるステージにおいて発現されたときに、同じRTKは全く異なる応答を誘発する(参照、J. Schlessinger, "Cell signaling by receptor tyrosine kinases." Cell 2000,103, 211-225)。
たとえば、発生の初めに、FGFR1は、細胞移動のコントロールにおいて中肺葉性パータニングおよび原腸形成のための重大プロセスの重要な役割を演じている。
しかしながら、繊維芽細胞におけるFGFR1の刺激作用は細胞増殖を導く一方、ノイロン細胞において発現されたFGFR1の刺激作用が細胞生存および分化を誘発する。
これらの目視観測のための最もらしい説明は、異なる細胞が異なる応答を媒介する細胞タイプ−特定のエフェクタタンパク質および転写因子を発現するということである。
この見解によれば、RTKsおよびそれらのシグナル伝達経路は多数プロセスに栄養補給ができ、そして異なるエフェクタタンパク質および異なる細胞の生育環境の転写因子の活性を管理できる。
したがって、類似した入力は、異なる細胞のコンテクストの異なる出力を生成する。
換言すれば、RTKsによって活性化されたシグナル伝達カセットは、情報を細胞表面から細胞核およびそれらの活性化の生物学的な結果の他細胞の区画まで中継するために、展開したのである。
細胞を「培養する」ことは一つ以上の細胞が生きて成長すること意味する。
特定の状況では、一つ以上の条件下で細胞をインキュベートすることは、実際に一つ以上の細胞を殺す場合もある。
(c) 一般の方法ステップ)
この一般の方法において、標識フリー光学バイオセンサ(801)を提供する。
その時の細胞は、直接ある所望の密集度.に対するこのバイオセンサ(802)上の培養する
(培地に1%の密集度から100%の密集度および各々のパーセンテージまで)。
それから、緩衝液は任意に適用され得る(803)。
また、化合物または化合物、または、試験される組成は、バイオセンサ上の培養細胞に適用され得る。
これは、刺激性の現象である(804)。
それからここに記載されているバイオセンサ出力パラメータのいずれでも使用して、バイオセンサは測定され、刺激性の現象(504)に対する細胞応答がモニタされ得るために、データは集められる。
一般に、起こる多くの異なるステップが、開示された方法内である。
たとえば、方法は標識フリー光学バイオセンサ(例えば光学LIDバイオセンサ)を提供することを含む。
ここに議論されるように、方法も一般にバイオセンサ上の細胞を培養することを含む。
概して細胞を培養することは、光学バイオセンサをカバーする細胞培地で起こる。
或る実施例において、たとえば、細胞を培養皿に付けるように、細胞がバイオセンサの界面に付属するようにすることができる。
細胞がバイオセンサ上で培養されるときに、ここに議論されるように、それらはいかなる密集度にも育てられる、そうすると、さまざまなアッセイは細胞で実行され得る。
たとえば、細胞は、細胞の化合物もしくは組成または細胞内の特定の標的上の効果を決定する、受容体の作動薬もしくは拮抗薬またはシグナル伝達経路の活性化物質もしくはリプレッサのようなモジュレータ、または、作動薬、拮抗薬、活性化物質またはサプレッサのような潜在的モジュレータのような検査化合物または検査化合物もしくは組成のセットによってインキュベートされ得る。
モジュレータは、特定の現象を増加するか減少させる分子である。
作動薬は、受容体をもたらし、天然リガンドが受容体を達成する方法に関する分子(例えば化合物または組成)である。
一般的に、これは受容体をオンにするかまたはそれを活性化することである。
拮抗薬は、天然リガンドの効果を減少または除去する方法の受容体に関する分子(例えば化合物または組成)である
一般的に、拮抗薬は受容体の阻害物質またはリプレッサである。
作動薬の若干のクラスは天然リガンドまたはリガンド類似体の非存在下で作用できると理解される。その一方で、他はリガンドまたはリガンド類似体の存在下で機能する。
たとえば、拮抗薬は天然リガンドの競合阻害剤であり、または、それは非競合阻害剤であり得る。
バイオセンサからの出力は、時間依存している方法を含んでいる様々な方法で集められる。
たとえば、時間依存光学応答を得るための光学LIDバイオセンサを測定するステップは、生体細胞内での質量再分布を示し、生体細胞内で作動薬−起因性GPCR活性化をモニタ可能にするように、実行され得る。
これらの緩衝液は、培地またはバイオセンサ、または、細胞を安定させるために適用され得る。
使用する緩衝液は、モジュレータ−標的相互作用または刺激性事象−標的相互作用に基づく最適のアッセイ結果を獲得するために一般に選ばれる。
たとえば、ここに議論されるように、一組のパラメータの特定のシグニチャを産生する周知のモジュレータ(例えば作動薬または拮抗薬)によって、バイオセンサ−細胞培養複合体はインキュベートされてもよい、そうすると、他の化合物または組成物はバイオセンサ−細胞モジュレータ混合液によってインキュベートされてもよく、モジュレータ活性上の化合物の効果は、一般に測定の後、シグニチャの変化またはバイオセンサ出力を探索することによって決定され得る。
化合物または緩衝液に関連したステップの全部が量を増やす際に実行され、組成濃度の効果に注目し、または、組成がバイオセンサ出力に関係していると理解される。
これは多くの方法で完成させることが可能で、生体細胞が光学LIDバイオセンサ表面の非遮断部に付着可能であるように、培養細胞の付着を防ぐスタンプを使用して、光学LIDバイオセンサの一部界面を遮断(ブロック)して、それから光学LIDバイオセンサ表面の非遮断部をカバーするように細胞培地の生体細胞を配置することができ、その後、光学LIDバイオセンサ表面からスタンプを取り外すようにする。
第2の細胞は細胞または同じタイプの細胞の異なる段階、その他で異なるタイプ、しかし、それらでありえる。そして、第2の細胞は第一のインディペンデントを培養している。
スタンプがあるように、これが多数時間として実行され得ると理解される。
それで、たとえば、4枚の分離したスタンプがある場合、それがバイオセンサに使われた、そして、これらの各々が連続的に移動する、そして、他の細胞群がセンサに提供される場合、バイオセンサ上の細胞の5つの培養において達するだろう。
方法を参照している自己および系は、還元を考慮に入れてまたは外界温度、圧変動および他の環境性変化に対する不必要な感度を除去して、更に細胞の特定の標的またはタイプに関して、確証する情報を提供する。
これは、また、装置に多数バイオセンサ(例えば異なるバイオセンサを有するチャンバ)を供給することによって多重化され得る。
かかる方法は、たとえば、どの受容体拮抗薬が遂行されたかについて、どの化合物によってについての情報を提供するであろう。
測定システム;
そして、前記測定システムが前記光学LIDバイオセンサに対する光ビームを発して、前記測定システムに光学LIDバイオセンサ表面にある生体細胞内で、質量再分布をモニタするのを可能にする前記光学LIDバイオセンサから、光ビームを受け取る光学標識インディペンデント検出(LID)バイオセンサ。
光学LIDバイオセンサを提供すること;
生体細胞が光学LIDバイオセンサ表面に付くことが可能であるように、光学LIDバイオセンサをカバーするために培地の細胞の生体細胞を配置すること;
光学LIDバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用すること;
そして、1に生体細胞内で作動薬−起因性GPCR活性化のために、質量再分布をモニタするのを可能にする生体細胞内で、質量再分布を示す時間依存光学応答を得るために光学LIDバイオセンサに測定すること。
また、少なくとも緩衝液を適用する所で、光学LIDバイオセンサ溶液の表層にある細胞培地に系は開示される。
光出力パラメータに関する差分は、分析される。
(d) 細胞増殖アッセイのためのバイオセンサの使用)
いくつかのアプローチが、過去において使われた。
トリパンブルー染色は細胞生存のための起訴者として使われる細胞膜統合性を評価する単一の方法である、しかし、方法は顕微鏡の下で死んでいる細胞を計数することを必要として、高スループットスクリーニングに適応することができない。
多くの細胞増殖アッセイは、増殖(すなわち細胞分割)の間、3H−チミジンまたは5−ブロモ−2'−デオキシウリジン(BrdU(チミジン類似体))を細胞に組み込むことによって溶解する細胞の測定全体の核酸またはタンパク質含有量によって細胞の数を推定する。
新しく合成されたDNAへの5−ブロモ−2'−デオキシウリジンの移入は蛍光標識された反BrdU抗体または特定の核酸ステイン(例えばヘキスト33342、TO−PRO−3およびLDS 751)を有する速く増殖している細胞の間接的な検出を許可する。そして、それによってBrdU標識付加期間の間、細胞周期のS期を進んだ細胞の同定を容易にする。
最も普及しているアッセイのうちのもう1つは、MTT細胞増殖アッセイである。
成育可能で代謝的に活性細胞において機能するだけである細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって、比色MTTアッセイは、還元のために不溶解性の紫のホルマザン結晶に黄色のテトラゾリウム塩(MTT)の遺伝子変換に基づく。
ほぼ2−4時間のMTT試薬での細胞のインキュベーションの後、清浄液は細胞を溶解させて、色のついたホルマザン結晶を可溶化するために添加される。
サンプルは、プレート読取機を使用して570ナノメートルの波長で読み込まれる。
産生される色の総計は、生体細胞の数に正比例する。
生体細胞の数の拡大はミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性の増加に結果としてなった。そして、これは、形成されたホルマザン色素の総計の増加を導く。
たとえば、多くの従来のBrdUに基づくプロトコルは、BrdUエピトープのためにDNA変質が反対のBrdU抗体にアクセスできるようになることを必要とする。
DNA変質は、熱(>90°C)または酸(2−4m HCl)によって概して達成される。
他細胞構造およびテストがこれらの処理の間、かなり保存されないので、かかるきつい処理は、しばしば多パラメタ解析を実行することをむずかしくする。
加えて、これらの従来のアッセイは、特定の細胞タイプを分析することに役立ってもよい;
そして、細胞の異なるタイプは、適切に異なるインキュベーションプロトコルが最適のアッセイ結果を達成することを必要とする。
(e) 高スループットスクリーニングのための特性)
バイオセンサ出力データがここに議論されるように、多くの異なるパラメータを使用して査定され得るという条件で、これらの高スループット方法は基礎を形成される。
そして、ここに議論されるように、死亡または増殖のような細胞または特定の細胞現象内のその特定の細胞または受容体またはシグナル伝達経路の転形は特定のシグニチャを有する。
ここに議論されるように、このシグニチャは一つ以上のバイオセンサ出力パラメータからなる。
重要な高スループット方法のため、方法期間中の時間点は重要であり、バイオセンサ出力パラメータデータの収集が細胞の状態の症候であり、すなわち、シグナル伝達経路が活性化してまたは不活性化され、または、細胞は死もしくは細胞は増殖していた。
かかるこの点が、シグニチャを定義するために用いるバイオセンサ出力パラメータの組み合わせが存在する所である。
また、この方法は、バイオセンサ上の細胞培養のための刺激性事象について、1時間、30分、12分、11分、10分、9分、8分、7分、6分、5分、4分、3分、2分、1分、59秒、または、各1秒ごとカウントダウンした時間内でバイオセンサ出力パラメータデータを集めると理解される。
バイオセンサ(たとえばセンサの完全プレート)の全てのための収集の全部がこれらの時間にもおいて完了されることはまた、好ましい、しかし、これが必要でないと理解される。
((1) 細胞密集度)
正常培養条件の下の導波路基質上の細胞現象としてなられた密度によって、細胞(減少と同様に両方の増加)の数の変化を検査するように、開始細胞数は限界範囲においてなければならない。
細胞密度が大きくなるにつれて、バイオセンサからの出力シグナルも大きくなると理解される。なぜなら、プレートにある細胞が多くなるにつれて、例えば刺激性事象の後のような所定時間で測定されるDMR現象が多くなる事実からである。
このように、細胞の数は、たとえばDMR現象(例えばP−DMRおよび/またはN−DMR)の共鳴バンド像(例えばバンド形、幅、強度、分配および/または位置)および/または振幅の共鳴ピーク(例えば強度、PWHM、形および/または位置)および/または特徴の特性を変える。
たとえば、しかし、密集度は30−100%、30−70%、40−60%、55%に対する45%または約50%でありえる。そして、密集度は、38または57または63のような、30および100%間のいかなるパーセントでもありえるまたは88または75または95、または、99%でありえる。
異なる適用法のために、好適な密集度は、最適の運転性能を達成するために変化してもよい。
たとえば、細胞増殖アッセイのために一般に、好適な密集度は約50%である、しかし、これは僅かに異なる細胞タイプまたは異なるアッセイのため異なるであろう。
これらの条件の下で、標準状態の下で培養される細胞に対してPWHMが最大付近であり、細胞増殖を妨げるモジュレータがたとえ細胞増殖のための促進因子か阻害物質であるとしても、角度/波長シフトまたは共鳴ピーク/バンド位置と同時に協力して評価され得る。
ここで、両モジュレータがPWHMの減少の結果となっても、促進因子は角シフトを増加させるとともに阻害物質は処理のない細胞と比較して角シフトを減少させる。
細胞シグナル伝達およびネット相互作用に関する受容体アッセイまたはほかの応用のために、モニタされる細胞現象に従い、細胞の密集度は、30%から約99%まで変化してもよい。
たとえば、細胞アポトーシス研究のために、細胞密集度は、約10%−約99%の範囲であってもよい。
GPCRスクリーニングまたはEGFRスクリーニングのための細胞密集度は、好ましくは約50%−99%の範囲である。
((a) 細胞増殖阻害)
実施例において、細胞増殖上の化合物の効果を測定するための開示される方法は、次のステップを含む:
(a)第1および第2の光学型標識フリーバイオセンサを用意する;
(b)培地の所定接種数のうちの1つの細胞を前記第1のセンサ上に配置して、細胞増殖条件下の最適培養後、付けた細胞が最適密集度に届くようにする;
(c)所定濃度化合物がある場合に前記培地の同じ接種数の同じ細胞を配置する;
(d)上述の第1のセンサの細胞密度まで最適の密度に到達するまで同じ条件の下で細胞を培養する;
(e)そして、光学測定システムを使用して光学出力パラメータを集める。
最適の密度は、好ましくは40%−70%の間にあり、最も好ましくは 45%−55%の間である。
光学測定システムは、好ましくは平行の測定システムまたは精査測定システムである。
化合物、いずれの阻害物質もまたは活性化物質は、ここに開示する、センサ基質上へ付けられる細胞の異なる数に結果としてなって、細胞の所定のタイプの増殖速度を変える。
取付けられた細胞の密度の差分は、異なる光導波路光モードスペクトルを引き起こす。
2つのパラメータ、角のシフトおよびPWMHに基づく、活性化物質対阻害物質を区別する。
(f) 細胞毒性スクリーニングのためのバイオセンサの使用)
これらの一次性のスクリーニングから現れる活性化合物の財産は、薬物開発のボトルネックをつくった。
第1ラウンドのヒットはしばしば安全性を満たさない、そして、効能基準は人間処理のために要求したので、産物が人間に与えられる前に、最適化の逐次的な回診は必要である。
最適化は、Absorption(吸収)、Distribution(分布)、Metabolism(代謝)、Elimination(排出)およびToxicity(毒性)(ADME/Tox)を試験するアッセイを必要とする。
ADME/、今日30億ドルの市場を薬剤発見および現像セッティングにおいて代表して、Toxスクリーニングは、関連するリード化合物および薬剤障害の大きい画分を与えられる中心段階に毒性性状を持っていっている。
発生的配管路の全体の新薬摩滅の30のパーセントは、毒性プロフィールおよび副作用に帰される。
ADME/Toxスクリーニングは、市場または医療に持ってこられるいくつかの薬剤によって生じる死亡を防いでもよかった(Zechnich、A.D.その他(1994)West. J. Med. 160(321−5))。
この驚くべき毒性は、ADME/Toxスクリーニング年の初めに現在市場に出ている安全な抗ヒスタミン剤の数および薬剤科学者の中の発達する関心を考慮して優れたケーススタディを提供する。
リード化合物および薬剤障害の大きい画分が毒性性状と関連したと仮定すると、ADME/Toxスクリーニングは薬剤発見および現像セッティングの中心段階をしている。
化学物質ライブラリが正や負効果のスペクトルを有する化合物を含むという仮定は、ADME/Toxスクリーニングの基礎を形成する。
その中に、薬剤候補物質の有益な特徴は、高量特異性、低い毒性、良好な口の生体吸収および半減期を含む。
早い高量−スループットADME/Toxスクリーニングのゴールは、発見プロセスの初期に、毒性に関して、「良好」で「悪い」化合物とを区別することである。
課題の同定は、今日では、薬剤スクリーニングの初期に単一の最大のコストを節減する機会を薬剤工業において代表する。
伝統的に、薬物開発のADME/Toxアプローチの配備は薬物開発の後の段階で起こった本質的に発見の初期位相に続くプロセス下旬−の「ヒット(hit)化合物」Such、配列は実行可能だった。そして、薬剤発見標的の数はほんの少しだった、そして、高量−スループットスクリーニングアッセイ点の数は製薬の企業全体に比較的低かった。
薬剤発見空間の変更概念図式については、薬剤標的の数は広がっている、そして、アッセイ点の体積も高量−スループットスクリーニングにおいて実行される。
したがって、それはトリアージに迅速かつ効率よく産業のために避けられない、または、同定する(「ポテンシャルヒット」)、それはADMEおよび毒性スクリーニングができないもしれない。
このように、ADME/Toxスクリーニングは、薬剤発見および現像(例えば原発(高量−スループットスクリーニング)および二次性スクリーニング)の中で進行中に以前に実行されることを必要とする。
さらに、薬剤吸着を予測するための統合したアプローチ、毒性および生理作用は、非常に薬剤発見および生長過程のためになる。
((1) 化合物吸着をモニタしているリアルタイム、分配および毒性)
従来のHTSスクリーニングの間の化合物吸着および毒性に関する情報は、一般に捨てられるかまたは逃がされる;
加えて、化合物吸着および毒性のための効果は、データ分析を複雑にする。
技術をスクリーニングしている高量内容の増加している使用は、機能的スクリーニングを有する毒性スクリーニングに橋をかけ始める。
(a)光学型標識フリーバイオセンサを提供し;
(b)培地の細胞を配置して、細胞はバイオセンサ表面上へ付け;
(c)細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し;
(d)そして、バイオセンサ上で培養される細胞応答をモニタする。開示された方法は、また、細胞培地に少なくとも緩衝液をOptionallyに適用している(c)によって特徴づけられる。
さらに、解析においてここに議論されるように、開示された方法はまた、複数のバイオセンサ出力パラメータを取り入れる。
事実、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15、または、より多くのバイオセンサ出力パラメータを利用して方法は実行され得、そして、或る実施例において、たとえば、正確にアッセイまたは細胞条件のためのシグニチャを得ることは複数のパラメータを利用するのに必要である。
また、或る実施例において、刺激性事象またはバイオセンサデータ出力収集の後、シグニチャのために使用したバイオセンサデータ出力パラメータは、1時間、50分、40分、25分、10分、9分、8分、7分、6分、5分、4分、3分、2分、1分、59秒、または、各1秒ごとカウントダウンした時間未満で起こる。
(g) 監視細胞活性のためのバイオセンサの使用)
組成、方法および開示される技術は細胞ベースのアッセイの分野にも関する。
使われるセンサのエバネッセント波の小さい侵入深さおよび性質のために、センサ界面の近くで起こる細胞の付着層内の刺激作用−起因性DMRだけは実効屈折率の変化を導く、そして、順に、それはセンサからの反射光の角度シフトを結果としもたらす。
角のシフトは、DMR応答シグナルの動態を得るために測定される。
加えて、それのため、異なる細胞応答は全体的な質量再分布シグナルとは異なって貢献する。
たとえば、細胞外のマトリックスからの細胞離断はセンサは表面若しくは付近で起こり、したがって、細胞で起こっているそれらよりかなり大きい応答を導くであろう。
細胞活性を検出するために光学バイオセンサを利用する方法およびセンサの検知体積内の質量再分布に基づく化合物/刺激作用起因性細胞変化が、開示される。
例えば、開示された組成物、方法および技術は受容体チロシンキナーゼ(RTKs)および逐次的なシグナル伝達現象にリガンドの結合をモニタするための光学型バイオセンサの使用および使用方法に関しており、かかる現象には細胞内のシグナル、分子もしくは会合体の運動のリアルタイムの内部移行、および/または、細胞骨格再配列および細胞形態学的変化を含んでいる。
これらの生体細胞内のシグナル伝達現象のうちの1つを妨げる化合物またはモジュレータスクリーニングのための方法が開示される。
これらのシグナル伝達現象、例えば結合、逐次的なリン酸化(phyosphorylation)、内部移行/細胞骨格再配列および細胞接着(接着)を潜在的に妨げ得る化合物またはモジュレータをスクリーニングするための方法も開示される。
もう一つの実施例では、生体細胞の特定の受容体に対して化合物の生理学的であるか薬理学的な効果を確かめる方法が、開示される。
開示された方法によって、リガンド結合、リン酸化および内部移行/細胞骨格再配列の、三つのシグナル伝達経路受容体の現象の動態を同時に研究することが可能となる。
本発明の方法によれば、これらのシグナル伝達現象を妨げる化合物をスクリーニングするかまたは分類することが可能となる。
また他の実施例では、光学出力パラメータで定義されたようなそれらのユニークな特性に基づく測定されたDMRシグナルを妨げるシグナル伝達経路の多数標的のためのモジュレータをスクリーニングする方法が開示される。
しかし、これらの細胞内のシグナル伝達および輸送動態の直接測定に利用できる限られた実験データだけがある。
直接測定がシグナル伝達現象の動態だけで足りないことは、これらのモデルの確証を制限する。
したがって、細胞シグナル伝達現象の動態を同時に研究する方法および技術が、EGFRシグナル伝達を更に理解するために必要である。
((1) 質量再分布モニタリング)
光学型バイオセンサの固有の限られた侵入(50−500nM)検知特性(すなわち、体積の検出)のため、センサが感知する体積内で起こる質量再分布は、反射ビームの角度またはスペクトルとして観察可能であるセンサ応答の変化に結果として得られる。
このセンサ応答は、溶液組成変化と同様に時間の関数として記録され得る。
このように、いかなる刺激性事象もの動態または検知体積内で質量再分布を導く刺激性事象によって生じる効果が分析され得る。
分析される細胞の密集度が高感度検出にとって重要であると理解されなければならない。
ここで記載するように、必要とした感度をより多くすればするほど、最適の検出のために細胞の密集度はより重要となる。
刺激性事象によって起因性をモニタしている質量再分布のための細胞の密集度は、30−100%の範囲内が好ましい。
あるいは、それが70−99%であっても好ましい。
異なる応用(細胞増殖、化合物毒性、細胞アポトーシス、化合物吸着および代謝、細胞シグナル伝達経路活性化、細胞形態学的変化、細胞接着(接着)および運動、受容体および標的(分子または分子集合体)活性化、並びに、移動、その他)のための開示方法は、最適のアッセイ結果を達成するため異なる細胞密集度(すなわち細胞密度)を必要とする。
また、異なる標的/シグナル伝達経路活性化と同様に細胞の異なるタイプは、最適の細胞応答および機能のための異なる細胞密集度を必要とする。
かかる密集度がアッセイプロトコルまたは方法を制限する意図でないと理解されなければならない。
(h) 細胞成分およびバイオセンサ)
細胞(例えば図10で示す概して1008)は、多数の細胞器官を含む細胞原形質(典型的範囲5−30μM)を有する。
一般的に、最大の細胞器官は、大きさが3−10μmの間で変動する細胞核である。
細胞核は、DNA、RNA、タンパク質および核酸−タンパク質複合体(例えばDNA−タンパク質またはRNA−タンパク質複合体)を含む。
重要なDNA−タンパク質複合体は、クロマチンである。
ミトコンドリアは、0.5−1.5μmから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
たとえば、他細胞成分は、小胞体(ER)(概して0.2−1μm)、ライソソーム(概して0.2−0.5μm)、ペルオキシソーム(概して0.2−0.5μm)、エンドソーム(概して約100nm)およびgogliを含む。
生体細胞(例えば1008)は非常に動的である、そして、大部分の細胞器官は細胞内で広く進行する。
たとえば、マイクロチューブルは長距離の上の細胞器官を輸送する。
刺激はセンサ界面(例えば1010)のまさしくその末梢の濃く包まれた細胞器官のサブミクロン運動に結果としてなることが可能である。そこでは、細胞(例えば1008)は培養される;
そして、かかる運動は、細胞(例えば1008)内の質量再分布(例えば1006)を導く。
質量再分布(例えば1006)は、光学バイオセンサ(例えば1014)によって検出され得る;
質量再分布(例えば1006)に関するシグナルは指向性質量再分布(DMR)シグナルと呼ばれる。
エバネッセント電磁場として周囲の培地(たとえば(付着細胞1008))に達するバイオセンサ(例えば光学LIDセンサ1014)の電磁場伝搬性の限られた範囲(何百ものナノメータに対する約tens)のために、中で、侵入深さが細胞層の、たとえば、ずっと細胞または細胞を通してしみ出るために不十分であるので、特定の状況(質量再分布の例えば画分だけ)において、1006は検出され得る。
電磁場が延長する距離は侵入深さまたは検知体積と呼ばれる。
特定の状況において、バイオセンサ界面(例えば1010)に、特定の距離内である付着細胞の下部だけは、検出され得る。
いずれの方向にしても、細胞小器官は、原形質膜の下方で、いわゆるアクチン皮質に侵入しなければならず、アクチン・フィラメントの緻密な網目構造が数百ナノメータの厚みを構成している。
アクチン・フィラメントが絶えず集合し離散する限り、その網目構造は、動的であり、細胞小器官に対する浸透性を有する。
その集合と離散とを調整する制御機構は、アクチン皮質の浸透性をも調整すると思われる。
細胞内小胞(エンドサイトーシス小胞)は、結合性リガンドとともに受容体を内部処理ステーションに輸送する。
カベオラは、細胞シグナル伝達における役割を持つとみられる、原形質膜関連の小胞である。
脂質ラフトは、原形質膜を小さな浮島として定着させるものと考えられており、当該浮島では、選び抜かれた複数の膜タンパク質が密かに出会ってシグナルを交換する。
結局、ここに開示されるように、膜受容体の母集団領域が存在することとなる。
これらの多くは、おそらく、下流のエフェクター分子を絶えず補充し解放する大きな分子複合体に組み込まれている。
そのような現象の中には、(1)タンパク質の標的化、あるいは、細胞核、細胞膜、細胞基質(シトソル)に対する再循環経路を介した基質の補充、あるいは、他の細胞外空間から若しくは他の細胞外空間に対する基質の補充、あるいは、細胞外空間からの取り込み(リガンド結合、遺伝子トランスフェクション、感染およびタンパク質配送)という現象や、(2)媒介による放出地点とともに所定の微少環境において様々な機能区画内で新たに合成された細胞内構成要素の再分布という現象が含まれる。
これらの細胞性現象は、シグナル伝達サイクル期間の間に或る時点で指向性質量再分布をもたらす。
((3)多数の細胞モニタリングのための侵入深さ)
シグナル伝達現象が単一の細胞器官およびシグナル伝達複合体によって媒介されたのを見るために、伝統的に生体内の方法は、単一細胞器官を撮像して、小数で分子を検出して、やがて高分解能および空間でそれらの機能を報告することを必要とする。
若干の細胞器官が具体的には、色素で染色され得る限り、蛍光−顕微鏡法は自然の選出である、そして、ますます、タンパク質はそれらの機能を悪くすることのない緑の蛍光性タンパク質(GFP)のような蛍光性タンパク質を有する複合化であった。
しかし、大部分の形質膜現象は、一時的に形質膜に入れられた細胞質ゾルタンパク質を有する相互作用を含む。
形質膜に集中するときに、コンフォーカル顕微鏡検査でもほとんど半ミクロンの深度まで細胞を調査するので、これらおよびより従来の蛍光−顕微鏡は細胞質ゾルからの強い『バックグラウンド』蛍光を示し、細胞質ゾルは、形質膜の近くの小さい構造または分子集合体からのより弱い蛍光を隠す。
たとえば、GPCRはシグナル伝達経路細胞の広いアレーに関与している。
リガンド結合は、受容体配座変化と、受容体オリゴマー形成と、Gタンパク質活性化(Gαサブユニット上のGDP−GTP交換、GαおよびGβγ脱会合、受容体からのGタンパク質デカップリング、Gα−およびGβγ−シグナル伝達複合体の生成)と、下流のシグナル伝達活性化(二次メッセンジャ生成(Ca2+可動化、inositoltriphosphateな生成および/または細胞内のcAMPレベル転形)を導く)と、を含む一連の細胞内および細胞のシグナル伝達現象を始め、そして最終的に、特定の遺伝子形質発現の変化を起こす結果となる。
リガンドによって媒介されたGPCR活性化も、細胞表面からGPCRの脱感作および多くの細胞内のタンパク質の輸送を導き、同じく、標的細胞のフェノタイプ、形態および物性の変化を導く。
これらの変化は、静的、長期持続または動的(例えばサイクリングまたは振動)である。
異なるシグナル伝達現象は、ミリ秒(例えばGPCR配座変化)から、何十秒(例えばCa2+フラックス)、何十分(例えば遺伝子形質発現または形態学的変化)、までの範囲で変動して、かなり異なる動態を呈する。
それらの特性(例えば動態)がはっきりしているにもかかわらず、これらの現象は質量再分布を導く。
さらに、一般に光学バイオセンサを使用して得られた光学出力パラメータは、多くの細胞現象による応答の全体的な平均値を表わし、異なるの細胞現象は全体的な出力パラメータに異なる寄与をもたらす結果となる。
侵入深さにかかわる細胞の全体的なDMR応答の依存性は、DMRシグナルがどこで、いつ起こることを示す極めて役立つ指標である。
したがって、測定された量は、主に生物および界面間の接触面に、そして、センサ界面の近くの形質膜領域および形態学的変化の近くで関係する。
形質膜からはるかに間隔をおいて配置される細胞または全部の生物の屈折率内部で異なる区画または細胞器官の運動または活性を調査するために、これらの変化に到達するために侵入深さを延長しなければならない。
図11は、侵入深さに依存するセンサのエバネッセント波の行動を示す。
これは、細胞モニタリング上の侵入深さの重要性を強調する。
光学出力シグナルまたはパラメータが統合されかつ代表的な刺激作用−起因性細胞応答の読み出しであるので、受容体エンドサイトーシスまたは標的複合体運動または細胞の細胞形態学的変化または細胞接着または運動のような多数の現象は光学バイオセンサを使用して、得られた総合応答に対する異なる貢献をしてもよい。
これらの現象は、センサ界面に関する異なる位置で起こってもよい。
したがって、同じ刺激性事象により誘因された細胞応答をモニタするための多数侵入深さを使用することによって、総合応答に対する各々の結果の寄与およびこのように細胞応答の機構が理解され得る。
実施例において、方法は特定の刺激作用に応答して細胞の特定のタイプの全体的なDMRシグナルを測定するためにセンサで異なるモードを含む。
異なる侵入深さのセンサ結果のモードを与えられる異なるは、感度を変えた(例えば、TM0モードは、同じセンサのための約90nmのような、TE0モードがするより、長い侵入深さ(例えば所定のセンサのための120ナノメートル)を引き起こす傾向がある。
もう一つの実施例でが、開示された方法は、異なる導波路およびグレーティング構造を有する少なくとも2つのバイオセンサおよび細胞の全体的なDMRシグナルを測定するために所定モードのための異なる侵入深さに結果としてなる性状を利用する。
もう一つの実施例でが、開示された方法は、細胞の全体的なDRMシグナルを測定するために従来の対称性および逆対称性導波路バイオセンサにグレーティングを使用する。
輸送シグナルの感度または再分布(DMR)が侵入深さにシグナルを出す方向質量が、特定の細胞の輸送現象を同定するためのシグニチャとして使われる。
バイオセンサ構成および構造の一時変異を含む本発明の方法または「調律」特定の導波路センサの侵入深さ、高感度および細胞内の区画特異性を有する特定の細胞の輸送現象をモニタするかまたは検出する役立つ手段を提供する。
異なる侵入深さを有する多数センサの特に使用は、各々の細胞のDMRまたは輸送現象のシグニチャを表すために用いることが可能である。
かかる輸送またはDMR現象のために、本発明によって、Z軸の高空間分解能およびより高い感度で現象を測定または検出できる。
((4)多重化細胞光学バイオセンサを使用しているアッセイ)
しかし、化合物選択作用についてのごくわずかな情報しか、発生しない。
現在、選択作用研究は、薬剤発見プロセスの行われた下流である;
不都合な結合を原因として生じるので現段階で化合物を捨てることは、薬剤発見プロセスを高価で時間がかかるようにする。
平行に多数標的に対して化合物の活性を検査するマルチ標的スクリーニングは、薬剤発見プロセスの初期に能率的に化合物選択作用のアドレス指定を行うのに必要である。
これらの考慮を与えられて、標的の同定の増加しているペースおよび化合物ライブラリの拡大と共に、マルチ標的スクリーニングに快く従う新しい技術が、必要である。
実施例において、本発明の方法は、同じクラス標的の標的または多数ファミリの多数クラスに対して、スクリーニング化合物のための手段として集積光出力パラメータを利用する。
たとえば、EGFによって媒介したEGFRを通した人間のA431細胞のRas/MAPK経路の活性化は、ユニークなDMRシグニチャを導く。
標的の多数クラスがEGFR(Srcキナーゼ)を含んで、MEK1/2、ダイナミンおよびアクチンフィラメントは、全体的なDMRシグニチャで異なる役割を演ずる。
また、A431細胞の他の例において、Ras/MAPK経路の活性化は、EGF−誘導応答として類似したDMRシグニチャのいくつかのGPCR作動薬−起因性EGFRトランスアクチベーションおよび結果で媒介され得る;
このように、GPCRクラス標的の多数ファミリは、審査されることができて、検査した。
細胞は、異なる種類の細胞であり、生理学的関連、疾患関連または病理学的関連のものである。
細胞は細胞の同じタイプから由来したものでも、または、未修飾されたもの、または、関心のある特定の標的をノックアウトまたは抑制または過剰発現したような、遺伝的操作もしくは再操作したものでもでもあり得る。
たとえば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびそれらの再操作されたCHO細胞が、使われる。
図12に示すように、バイオセンサ(1201)が用意され、そして、このバイオセンサの一部は物理的に遮断され(1202)、よって、細胞がたとえバイオセンサ上に配置されても細胞はこのバイオセンサ遮断部上にて培養されなくなる。
それから細胞タイプAを有する細胞培地を配置して、非遮断領域上で成長させるようにする(1203)。
それから、バイオセンサの遮断領域は非遮断とされて、そして、細胞の第2の培地たとえば細胞タイプBが添加されて、タイプBが遮断された領域(805)上で培養されるようなる。
刺激性事象(1206)を与える分子を含む溶液は、それから供給される。
バイオセンサは、それから、2つの領域(初期の非遮断領域および遮断領域)からのデータが集められ比較されるように作動される。
ブロッキング遮断は、一部のセンサをカバーするためにゴムスタンプを配置することによってまたはポストまたはカラムの所定の数を有するカバープレートを配置することによって達成され得る。
ポストまたはカラムの端は、センサの表面部分に接触する時にセンサ性能の損傷または劣化しないように、ゴムのような軟らかい材料でできている。
ポストまたはカラムの数および位置は、センサマイクロプレートの所定のフォーマットに適合されている。
あるいは、各々のセンサが少なくとも2つの区画に分割され得るように、ブロッキングはセンサマイクロプレートに装置を配置することによって達成され得る。
たとえば、装置はマイクロカラムの所定の数を有するカバープレートとし、各々のカラム端(またはカラム全部)において、ポリマーのような柔らかい材料でできている薄い壁(概して1mm)を設けることが可能である。
一度、カラムが各ウェルに配置されると、マイクロカラムの底がセンサの中心領域に接触して、両側は各ウェルの内壁と接触する。
カバープレートは、好ましくは流体経絡の所定の数を含み、各経絡は各マイクロカラムまたはマイクロカラムの部分と協働する。
原基細胞付着性の後、一般の培地は、多数のバイオセンサを含むチャンバに適用され得る。
図13および14に示すように、方法はバイオセンサが位置する事実に関連した開示された方法の一時変異にチャンバ(例えばミクロタイタープレートのウェル)の特定の点を提供する。
多数区画を有する多数のウェルマイクロプレートを各ウェル内で含む装置が利用される、そして、各々の区画がバイオセンサを有する場合、異なる細胞の解析または条件のセットを考慮に入れて、細胞の異なるタイプは各ウェルまたはバイオセンサ(1302)のために異なる各々のチャンバに置かれる。
それから任意に、一般の培地は全てのバイオセンサをカバーするために各ウェルに配置され得る、または、各々の区画のために異なる培地は開示されている(1303)二つ間のいかなる組み合わせにもよって適用され得る。
溶液1303はマーカー(例えば刺激性事象をつくる分子)を含む、または、二次性の溶液は刺激性事象(1304)のための一つ以上の分子を含んで適用され得る。
バイオセンサはそれからモニタされることができて、測定される、そして、各々の区画またはセンサからの結果は集められることができて、比較され得る(1305)。
或る実施例において、本発明はバイオセンサマイクロプレートのユニークタイプを示し、そして、図14の例に示されるように、光学バイオセンサ埋設多区画および多重井戸タイプマイクロプレートであり、各井戸が4つの区画を含み、各区画が1つの基質包埋導波路グレーティングを有している。
各々の区画が、細胞の寄主単一のタイプに使われる。
4つの区画は内壁によって分離され、内壁(好ましくは100ミクロンおよび2ミリメータ間の)の体高は概して各ウェル(それは、いかなる所定のマイクロプレートもの典型的体高である)のそれら未満であり、4つの区画を有する各ウェルは、細胞の多数の標的または多数タイプ上の1つの薬剤候補物質の効果を同時に検査するために用いられる。
細胞培地溶液がある時が隣接した区画を有する交叉汚染のない前記区画の1つの区画および滞在にあてはまるように、ウェル内の区画は物理的なバリアによって分離され得る。
区画が2、3、4、5、6およびより多くでありえ得ると理解されなければならない。
多区画を有する各ウェルはより高い物理的なバリア(例えば典型的マイクロプレートのプラスチック壁)によって分離され、比較的大量の一般の溶液が全ての区画をカバーする各ウェルに適用されることができて、単一のアッセイのために使われる。
材料は、好ましくは標的遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありえる、そして、その派生物または抗原オリゴヌクレオチドそして、その派生物または干渉RNA(単一の要素をもつか重複の座礁された、または、あらゆる種)、または、抗体またはタンパク質、または、タンパク質ドメインまたは薬剤、または、ペプチドでありえる。
摘出される材料の異なる種または細胞による吸収のために、特定のトランスフェクション試薬は、使って最適の効果に到達する。
かかる方法または組成は、細胞に制限のための方法に関連した材料のために少なくともアメリカ文献US2004/0023391A1およびUS6,544,790(それは全体としてここに取り入れられる)にて説明したようにすることで成し遂げられる。
材料の沈着は、密着焼付け法技術(例えばピン印刷技術)を使用するか、または装置または非接触の印刷技術(例えば供給装置またはシステム)で達成され得る。
物理的バリアによって分離される同じウェル内の多バイオセンサのために、直接、材料を含んでいる溶液の沈着は、達成されたマイクロプレート供給装置で可能である。
かかる方法は、基質の界面の上へ供給材料のための方法に関連した材料のために、少なくとも、たとえば、アメリカ文献US5807522A、US6101946 A、米国特許第5,731,152号、米国特許第5,807,522号、米国特許第5,601,980号、US6656432B1、EP0895082 B1またはUS6399396 B1(それは全体としてここに取り入れられる)の説明したようにすることで成し遂げられる。
これらの方法は、細胞が予め培養されている各々の区画に、トランスフェクション試薬を混ぜ合わせられる材料の直接タイプ導入を使用することができて、センサに付属した。
たとえば、DNAを含有するトランスフェクション試薬液は、細胞が底基質の上へ配置された各々の区画に添加される。
((5)光学バイオセンサを使用している標的の同定)
薬剤研究者がほぼ500の生物学的な標的だけを研究することに限られていて、((Drews, J., "Drug Discovery: A Historical Perspective" Science 2000, 287, 1960-1963))。最近まで、ヒトゲノムのシークエンシングの完成については、利用できる潜在的な生物学的な標的の数は、非常に拡張されている。
genomicsに基づく方法であけられるポテンシャル標的の数は、標的価値判断技術の莫大な必要をつくった。
従来の薬剤発見教育法は、しかし限られた数の標的ファミリだけ有して、アドレス指定を行う。
この状況は従来法が「インチを閉じ込められた」ことを示唆し、方法は速く主要な薬品会社の事務ゴールを満たすのに必要である新しい薬剤(例えば5当たり年に対する三)の数として、つくることができない。
従来の方法は、主要な疾患、例えば心臓血管疾患、神経変性疾患、癌およびタイプ−2つの糖尿か何かのための突破処理に主に会ったことのない医学のニーズを提供しそうにない。
これらの理由のために、標的価値判断は、最速成長のうちの1つおよびゲノム研究の大部分の臨界分野になった。
薬剤が臨床試験へ進むときに、標的タンパク質および疾患間のより強いリンクの確立は低い不全率を導く、そして、薬剤標的として価値があることを証明された標的のより短いリストはより大きい成功を導く。
加えて、タンパク質機能のより良い理解を成し遂げるより速い手段は、標的価値判断プロセスを短くする。
1)標的スクリーニング、2)標的の同定、そして、3)標的確証。
標的価値判断の第一および/または初期として、標的スクリーニング段階は、疾患プロセス(例えば遺伝子形質発現解析で同定される特定の遺伝子の増加機構)と関連する分子を同定することを含む。
標的の同定は、明らかに疾患プロセスで役割を演ずる分子を同定することを含む。
このように、かかるアプローチは、確実性のより大きい程度、しかし、可能性がまだ存在すると定める同定された標的が、最高種でないかまたは疾患プロセスを妨げるために最高結合部に付属しないまたはそれらが、それが疾患でdominat役割を演ずることができない、または、薬剤による標的の癌または一時変異が不都合な副作用を導くので、標的が薬剤標的に適していないことを意味して、「druggable」であってはならない。
全部が成功している場合、標的確証まで進むことができて、選択された分子の中のいずれがphenotypicな変化を導くかについて決定するプロセスである調整される、(それが処理の標的として値を有することを示唆すること)。
たとえば、シグナル伝達経路活性化、細胞運動性および形態学的変化に関連した質量再分布は、特定の標的の疾患会合のシグニチャとして使われるが、これら多数の変化が腫瘍プログレッションおよび移動の含むからである。
実施例において、方法は2種類の特定の標的による刺激性事象によって媒介された細胞のDMR応答の比較を含む。
図15に示すように、光学バイオセンサ(1501)が用意される。
それから、細胞の特定タイプ細胞A(1502)を含む細胞培地がバイオセンサに配置される。それから、緩衝液(1503)が任意に添加され得る。
特定の経路または受容体のモジュレータまたはポテンシャルモジュレータまたは細胞のような刺激性事象である特定のマーカーは、例えば溶液(1504)に加えられる。
それからバイオセンサは、細胞応答をモニタするために用いる(1505)。
この同じステップのセットは、第2のバイオセンサ(1506)上にて、そして、第2の細胞タイプまたは細胞培養で実行される(1507)。
第2のバイオセンサ(1510)の測定の後、2つの応答(1505)および(1510)が比較される(1511)。
バイオセンサ(1201)が用意され、そして、このバイオセンサの一部は物理的に遮断され(1202)、よって、細胞がたとえバイオセンサ上に配置されても細胞はこのバイオセンサ遮断部上にて培養されなくなる。
それから細胞タイプAを有する細胞培地を配置して、非遮断領域上で成長させるようにする(1203)。
それから、バイオセンサの遮断領域は非遮断とされて、そして、細胞の第2の培地たとえば細胞タイプBが添加されて、タイプBが遮断された領域(1205)上で培養されるようなる。
刺激性事象(1206)を与える分子を含む溶液は、それから供給される。
バイオセンサは、それから、2つの領域(初期の非遮断領域および遮断領域)からのデータが集められ比較されるように作動される(1207)。
図13は、バイオセンサが位置する事実に関連した開示された方法の一時変異にチャンバ(例えばミクロタイタープレートのウェル)の特定の点を提供する。
装置が利用される場合、それは多数チャンバを含む、そして、多数バイオセンサが使われる、そして、異なる細胞の解析または条件のセットを考慮に入れて、細胞の異なるタイプは各々のチャンバまたはバイオセンサ(1302)のために異なる各々のバイオセンサに配置され得る。
それから任意に、一般の培地は全てのバイオセンサをカバーするために各々のチャンバに配置され得る、または、各々のチャンバのために異なる培地は開示されている(1303)二つ間のいかなる組み合わせにもよって適用され得る。
溶液1303はマーカー(例えば刺激性事象をつくる分子)を含む、または、二次性の溶液は刺激性事象(1304)のための一つ以上の分子を含んで適用され得る。
バイオセンサはそれからモニタされることができて測定される、そして、各々からの結果は集まって、匹敵した(1305)。
光学LIDシステム1000は光を制御するためのモジュール、データ生成のための電子技術および他成分、収集および解析からなる測定システム1002を含む、そして、光学LIDバイオセンサ1004は非常に使って質量再分布を検出して、モニタする。
質量再分布が起こる時がセンサのエバネッセント波の方向に合わせられて、方向質量として再分布と呼ばれるシグナルは、発生して、集められることができて、分析される。
しかし、再分布が起こる質量またはセンサに対する平行は力に表面をつけるまた、ある例えば、多くの出力パラメータ(例えばPWHM、共鳴性帯域幅および形、その他)によって示されるように、光学バイオセンサによって検出される、GPCR1020または分子集合体のような分子の転位は細胞内区画(例えばエンドソームまたは小胞体)に、センサに直面している細胞表面からから起こってもよい。
かかる運動は、生体細胞1008(1つだけ示される)で番号1006をつけた矢印に示すように、一般に、侵入深さで決まるセンサの検知体積内の質量の減少を導く。
好適な実施例においては、測定システム1002は、光学LIDバイオセンサ1004(たとえば、SPRセンサ1004や導波路グレーティングセンサ1004)に対する計測を実行して、生体細胞1008内の質量再分布を検出しかつ測定する。
このような計測は、光学LIDバイオセンサ1004に対して適当なスペクトルや角度を持つ光ビーム1012を照射して、光ビーム1012が検知界面1010で反射されたときに、その反射光ビーム1014において前記質量再分布を表す共鳴角成分や波長応答成分が主成分となるように実行され得る。
よって、生体細胞1008内に検出可能な質量再分布が存在すれば、光学LIDバイオセンサ1004は、角度成分や波長成分の変化として観測される応答量変化を検出することが可能である。
そのような光学的応答量は、時間に関する関数として記録することができる。
このように、ここに議論されるように、生体細胞1008内の質量再分布に導く動態バイオセンサ出力パラメータすなわち他パラメータのいかなる現象のを解析することが可能である。
すなわち、図は、作動薬誘発性でありかつ時間依存性の光学応答1601を示し、この光学応答1601の一部は、生体細胞1008内の標的GPCR1602の転位に起因するものである。
当該細胞は、導波路型バイオセンサ1014の上面1010に付着している。
説明の便宜上、測定システム1002は、符号"C"を付された部分には示されていない。
作動薬による活性化に応じて、GPCR1602は、α、βおよびγというサブユニットからなるヘテロトリマーGタンパク質を活性化する。
これらのGαサブユニットおよびGβγサブユニットは解離して、形質膜1604でGRK1606が受容体1602に補充されるように働く。
次に、GRK1606は、GPCR1602のカルボキシ末端をリン酸化する。
そして、比較的豊富な細胞内タンパク質であるβ−アレスチン1608は、形質膜1604において細胞質内で急速に(数分以内に)活性化GPCR1602へ転位し、GRKリン酸化受容体を捕捉し、同族のGタンパク質から当該受容体を切り離す(脱共役する)。
このとき、β−アレスチン1608は、脱感作されたGPCR1602に結合し、細胞表面1604のクラスリンで覆われたピットに転位し、そこでは、受容体1602がクラスリンで覆われた小胞(CCV:Clathrin-Coated Vesicles)に内面化される(図"B"参照)。
最終的に、完全な複合体1602,1606がエンドソーム1610(細胞内小胞1610)に運ばれる(図"C"参照)。
以上のプロセスは、転位(トランスロケーション)現象として知られている。
GPCR転位に関するより詳細な情報については、以下の3つの論文を参照されたし。・Drews,J.著、「薬物発見:1つの歴史観(Drug discovery: a historical perspective)」、サイエンス(Science)、2000年、第287巻、1960〜1963ページ。・Ma,P.、Zemmel,R.共著、「新規性の価値(Value of novelty)」、 Nat.Rev.Drug Discov.、2002年、第1巻、571〜572ページ。・Pierce,K.L.et al.共著、「7つの膜貫通型受容体(Seven-transmembrane receptors)」、Nat.Rev.Mol.Cell Biol.、2002年、第3巻、639〜650ページ。上記3つの論文の内容は、本願明細書に援用されるものとする。
指向性質量再分布をもたらす可能性がある他の生物学的現象は、GPCR活性化に起因する細胞の形態的変化である。
かかる細胞の形態的変化の中には、細胞骨格の再構成や付着力の変化が含まれる。
細胞骨格は、真核細胞の細胞質の至るところに広がるタンパク質微細繊維の複合ネットワークであり、当該真核細胞内での多種多様な活動の実行に関わっている。
細胞骨格は、当該細胞に対する引張強度を与えるとともに筋収縮を可能にするものでもあり、細胞運動を行い、細胞内のシグナル伝達および輸送、細胞***、セル形状の変化に関係するものである。
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の活性化は、理論的には細胞骨格の再構成に影響を及ぼすであろう少なくとも2つの独立した現象を引き起こす。
第1の現象は、細胞内のシグナル伝達経路の活性化であり、第2の現象は、受容体媒介のエンドサイトーシス(細胞食作用)(すなわち、転位現象)であり、このエンドサイトーシスは、GPCRの大部分で作動薬による活性化が生じた後に起こる現象である。
作動薬またはGPCRの結合が生じた後に細胞内シグナル伝達経路が活性化すると、さらに2系統の関連現象が誘発される。
第1の系統では、二次の細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらすプロセスが誘発される(Gタンパク質−>エフェクタ−>メッセージ)。一方、第2の系統のメカニズムは、第1の系統の現象に作用することによって細胞内のシグナル伝達の度合いを調整するものである。
これらのメカニズムの中には、膜結合型受容体の下方制御(ダウンレギュレーション)、内部移行およびリン酸化反応や脱感作が含まれる。
双方の系統の現象が、細胞内のアクチン・フィラメントの再構成をもたらすことができると仮定する。
たとえば、GPCRが活性化した後は、色々な形のGタンパク質(たとえば、GαおよびGβγ)がF−アクチン・フィラメントと結合し得る。また、前記のシグナル伝達分子等がアクチン・フィラメントから分離し得る。
受容体媒介のエンドサイトーシスを介して起こる膜結合型受容体の内部移行プロセスも、アクチン・フィラメントの動態に関与している可能性がある。
事実、図16に示される光学応答1601によれば、3つの異なる現象を特定することができる。
これら3つの主要な現象は、以下の通りである。(1)作動薬を入れると、大きな屈折率変化に起因して、シグナル1601に非常に大きく急激な低下を確認できる(すなわち、一般に化合物溶液は細胞媒体よりも比較的低い屈折率を有しているので、化合物を入れるとLIDシグナルが低下する)。
(2)応答シグナル1601がほとんど20分間に亘って緩慢に変化する移行期間を確認できる。この移行期間は、クラスリン被覆ピットに対する受容体1602の脱感作、アレスチン結合、GRK1606による活性化された受容体のリン酸化反応、その他の細胞性応答あるいはこれらの組み合わせと関係しているのかもしれない。
(3)エンドソーム1602に対するGPCR複合体1602,1608の転位に対応して、ほとんど50分間に亘って応答シグナル1601の緩慢な低下を確認できる。
他の場合としては、初期段階の直後に生ずる付加的現象も、明らかに確認できる(たとえば、図16)。すなわち、これは、主に、細胞媒体内の化合物の拡散現象や、細胞表面の活性化されたGPCRに対して細胞内の構成要素が補充された現象に起因する応答シグナル1601の増加を意味する。
光学LIDシステム1002がこの検査をどのような方法で実行するのかにつき、図17に示される方法1700を参照しつつ以下に詳細に説明する。
図18の物質CHO細胞が10%の胎仔血清(FBS)(示されないデータ)または0.1%のFBS(少なくとも16時間)(1801)を含んでいる培地で培養されされようと、150mlの細胞培地に50mlのEGF溶液の導入の直後に20秒未満、概して続くシグナルの迅速変化を除いて、EGF刺激作用は有意なDMR応答の否定結果を示さなかった。
この迅速変化は、バルク屈折率変化による。
対照的に、EGFの添加のような刺激性事象が起こるときに、A431細胞のEGF−誘導応答は強く培養条件に依存する。
20時間の0.1%のFBSにおいて餓死A431細胞のEGF−処理は、3つの逐次的な位相からなる時間依存応答(1802)を引き起こして、3つのバイオセンサ出力パラメータ、(i)増加するシグナル(P−DMR)(点C−D)を有する正の位相、
(ii)ネット−ゼロ位相(点D−E)、および、(iii)バルク屈折率変化の初期の急速位相の後の減少されたシグナル(N−DMR)(点E−F−G)を有する減衰位相、を示した。
対照的に、増殖しているA431細胞(10%のFBS)はP−DMR位相(1803)を引き起こしたが、一方、それらの静止A431細胞と比較して、4時間だけの0.1%のFBSによって処理されたA431細胞は、変えられた動態および非常小さい振幅を有する以外、同様応答(1804)を引き起こした。
これらの結果は、例えば細胞シグナル伝達経路(すなわちこの特定のサンプルのEGF)の活性化物質または阻害物質を使用することで、マーカー−起因性DMR応答に基づく細胞の所定のタイプの標的(例えばEGFR)を同定または評価できることを示唆する。
(i) 細胞シグナル伝達)
例えば、図3を参照すると、本発明に係る光学LIDバイオセンサ1014を用いて、生体細胞1008内の作動薬誘発性のGPCR活性化に起因する質量再分布をリアルタイムに測定する方法1700の基本手順を示すフローチャートが図示されている。
この方法1700は、(a)、光学LIDバイオセンサ1014を用意し(ステップ1702)、
(b)生体細胞1008が光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に付着するように、光学LIDバイオセンサ1014を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞1008を配置し(ステップ1704)、
(c)必要に応じて、少なくとも1回、緩衝溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ1706)、
(d)化合物(作動薬)含有溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ1708)、
(e)光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行し、光学LIDバイオセンサ1014上に培養された生体細胞1008の時間依存性の光学応答1601を測定する(ステップ1710)、
という手順である。
これは、光学LIDバイオセンサ1014上に培養された生体細胞1008が生き生きと活動しているからこそ可能となる。すなわち、そのような生体細胞1008は、周囲の媒体組織の変化や温度変化を感知し、そのような変化に応答し得るからである。
これに対し、生体細胞1008は、緩衝液を入れた場合と同様の変化を感知するので、化学物質をこれ以上導入しないと仮定すれば、前記の媒体組織の変化に対して耐性を持つことになる傾向がある。
従来のGPCRのスクリーニング方法と比べて、この方法1700は、標識に依存せずに、より高い感度で、より容易に実行することができ、既知の受容体が下流のシグナル伝達経路とどのように結合しているのかという予備知識や天然リガンドの予備知識を必要とせずに、全てのGPCR1602に適用可能なものである。
[0229] さらに、前記ステップ1704では、高い感度を得るために、最適条件下で培養されてからしばらく後に、細胞が光学LIDバイオセンサ1014の上面1010上で接着性を持つようになりかつ高い密集度(必要に応じて75%以上)を持つに至るように細胞の数が最適化される必要があるという点に留意すべきである。
この方法1900は、(a)光学LIDバイオセンサ1014を用意し(ステップ1902)、
(b)生体細胞1008が光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に付着するように、光学LIDバイオセンサ1014を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞1008を配置し(ステップ1904)、
(c)光学LIDバイオセンサ1014が安定化するまでのしばらくの間に、既知の親和性(結合力)を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ1906)、
(d)受容体と結合した拮抗薬から離れて競合するために十分な高い濃度を有する化合物(作動薬)を含む溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ1908)、
(e)光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行して、光学LIDバイオセンサ1014上で培養された生体細胞1008の時間依存性の光学応答1601を測定する(ステップ1910)、
という手順である。
さらに、この方法1900は、当該方法1900が生体細胞1008における同族受容体用の化合物の機能性に関する予備知識を必要とするという一点を除いて、上記方法1700と同様の方法である点に留意すべきである。
たとえば、拮抗薬がGPCR1602の活性化を抑制するか否か、あるいは、拮抗薬がGPCR1020を活性化させて転位をもたらすか否かを知っておくことが必要である。
この方法2000は、(a)光学的LIDバイオセンサを用意し(ステップ2002)、
(b)生体細胞1008が光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に付着するように、光学LIDバイオセンサ1014を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞1008を配置し(ステップ2004)、
(c)転位が起こらないように、短時間の間に、既知の親和性(結合力)を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ2006)、
(d)当該短時間が経過した後、一定濃度を有する化合物を含む溶液を細胞媒体の中に添加し(ステップ2008)、
(e)光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行して、光学LIDバイオセンサ1014上に培養された生体細胞1008の時間依存性の光学応答1601を測定する、
という手順である。方法1900と同様に、この方法2000は、生体細胞1008内の標的GPCR1602に関する予備知識を必要とし、この特殊なGPCR1602に対して、生体細胞1008を前処理するための作動薬あるいは拮抗薬を事前に選別しておくことが必要である点に留意すべきである。
また、上記方法1700と同様に、検査対象の化合物を最初に導入し、続けて、既知の作動薬を入れることができる。
光学LIDバイオセンサ1014の性能は、一般に、光学的特性や当該センサの設計内容および特性の影響を受けること、並びに周辺温度や圧力といった環境変動の影響を受けることがよく知られている。
自己参照型の光学LIDバイオセンサ1014を使用することの主な利点は、上面1010が参照領域とサンプル領域とを有するので、これにより、当該サンプル領域を用いて生体細胞1008内の質量再分布を検出することが可能になると同時に、参照領域が当該参照領域に付着する生体細胞1008を持たないようにすれば、このような参照領域を用いて、生体細胞1008内の質量再分布の検出に悪影響を与え得る偽の変化量を参照することが可能になる、という点である。
この自己参照型光学LIDバイオセンサ1014は、以下の手順を用いて構成できる。すなわち、
(a)光学LIDバイオセンサ1014を用意し(ステップ2102)、
(b)軟質スタンプ(たとえば、ゴム製スタンプ)を用いて光学LIDバイオセンサ1014の上面1010の一領域(参照領域)を物理的に遮断し(ステップ2104)、
(c)光学LIDバイオセンサ1014の遮断されていない領域(サンプル領域)を覆う成長媒体の中に適当な数の生体細胞を配置し(ステップ2106)、
光学LIDバイオセンサ1014上の遮断されていない領域に生体細胞1008が付着した後に、前記軟質スタンプを除去する(ステップ2108)。
この時点で、方法1700,1900,2000で説明した通りの生体細胞分析を実行する。
ここで、細胞研究のため、異なる方法を適用して自己参照型LIDセンサを構成することが可能である点に留意すべきである。
たとえば、物理的な遮蔽物を用いてセンサを2つの部材に分割し、一方の部材にのみ媒体内の細胞を付着させることができる。
細胞が付着した後にその物理的な遮蔽物を除去すればよい。
よって、本発明がさらに多重生体細胞分析を同時に実行するように強化されることが望ましい。
方法2200によれば、以下の手順により、複数種の生体細胞1008における作動薬誘発性のGPCR活性化に起因する質量再分布を測定することができる。
すなわち、(a)光学LIDバイオセンサ1014を用意し(ステップ2202)、
(b)光学LIDバイオセンサ1014の上面1010の一部部位に生体細胞1008が付着することを防止するスタンプを用いて、光学LIDバイオセンサ1014の上面1010の当該部位を遮蔽し(ステップ2204)、
(c)光学LIDバイオセンサ1014の上面1010のうちの遮蔽されていない部位を覆う細胞媒体の中に第1のタイプの生体細胞1008を配置して、光学LIDバイオセンサ1014の上面1010のうちの遮蔽されていない部位に生体細胞1008が付着できるようにし(ステップ2206)、
(d)光学LIDバイオセンサ1014の上面1010からスタンプを除去し(ステップ2208)、
(e)光学LIDバイオセンサ1014を覆う細胞媒体の中に第2のタイプの生体細胞1008を配置して、光学LIDバイオセンサ1014の新たな暴露表面(遮蔽物が除去された表面)110に当該第2のタイプの生体細胞1008が付着できるようにし(ステップ2210)、
(f)光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に配置された細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し(ステップ2212)、
(g)光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行して、光学LIDバイオセンサ1014上にある2タイプの生体細胞1008内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答1601を測定する(ステップ2214)、
という手順である。前述した2タイプの細胞を互いに関連付けることができる点に留意すべきである。たとえば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に対して、過剰発現した標的受容体を含む遺伝子操作されたCHO細胞を関連付けることができる。
方法2300によれば、以下の手順に従って、複数種の生体細胞1008における作動薬誘発性のGPCR活性化に起因する質量再分布を測定することができる。
すなわち、(a)複数の光学LIDバイオセンサ1014からなる配列を含むチャンバー(マイクロプレート)を用意し(ステップ2302)、
(b)これら光学LIDバイオセンサ1014のうちの少なくとも1つのバイオセンサを覆う細胞媒体の中に第1のタイプの生体細胞1008を配置し、当該少なくとも1つのバイオセンサ1004の上面1010に当該第1のタイプの生体細胞1008が付着できるようにし(ステップ2304)、
(c)被覆されていない残る光学的LIDバイオセンサのうちの少なくとも1つのバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第2のタイプの生体細胞1008を配置して、当該少なくとも1つの残る光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に当該第2のタイプの生体細胞1008が付着できるようにし(ステップ2306)、
(d)覆いのある光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し(ステップ2310)、
当該覆いのある光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行して、当該覆いのある光学LIDバイオセンサ1014の各々の生体細胞1008内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答1601を測定する(ステップ2312)、
という手順である。
したがって、各スポット領域に重畳された細胞のみが形質導入されることとなり、この結果、形質導入型細胞クラスター配列を形成することとなる(米国特許第6544790号"Reverse transfection method")。
同様に、タンパク質細胞導入試薬と複合した複数の機能性受容タンパク質からなる配列を、類似の形質導入型細胞クラスター配列に利用することが可能である(米国特許出願公開第2004/0023391号; "Methods and devices for protein delivery")。
現存の技術を用いれば、いずれのタイプの形質導入型細胞配列も化合物スクリーニングのために利用することが可能である。
方法2400によれば、以下の手順を実行することにより、単一タイプの生体細胞1008内の複数のGPCRに対する作動薬のスクリーニングを行うことができる。
すなわち、(a)光学LIDバイオセンサ1014を用意し(ステップ2402)、
(b)光学LIDバイオセンサ1014を覆う細胞媒体の中に生体細胞1008を配置して、生体細胞1008が光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に付着できるようにし(ステップ2404)、
(c)複数の拮抗薬の混合溶液からなる溶液を添加し(ステップ2406)、
(d)光学LIDバイオセンサ1014の上面1010に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し(ステップ2408)、
(e)光学LIDバイオセンサ1014に対する計測を実行して、生体細胞1008内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答1601を測定する(ステップ2410)、という手順である。
上記ステップ2406で使用された複数の拮抗薬からなる混合溶液の代わりに、上記化合物からなる溶液を使用すると同時に、上記ステップ2408で使用された化合物溶液に代えて、複数の拮抗薬からなる混合溶液を使用することができる。
((1) 輸送動態研究の重要性)
たとえば、EGFRシグナル伝達ネットは、ほとんど瞬間的な反応(リガンド結合の後の受容体リン酸化)から、多数分(ライソソームに対する小胞形成またはソーティング)を通じて起こる反応または特定の細胞株の形態学的変化まで変動している反応を含む。
EGFRの中で輸送ことは多数ステップで管理される。そして、エンドサイトーシス、早いエンドソーム(endosomal)のソーティングおよびライソソームターゲッティングを含む。
内部移行の後、EGFRは形質膜へ往復されるか遅発タイプまたは多胞体(multivesicular)のエンドソームに輸送される。
後期エンドソームの受容体は、減生のためのライソソームに更にソートされるかまたは細胞表面に戻ってリサイクルした。
受容体の占有は、ソーティングプロセスの各々のステップに参加するそれらの能力を書き取らせる。
EGFRシグナル伝達カスケードおよびその活性化配列の主要な階層が周知であるにもかかわらず、細胞発育、生残または分化のような異なる細胞応答を制御する合併した動態ネットワークおよび臨界なシグナル伝達現象は不十分だが理解される。
リガンドによって媒介されたEGFR活性化による細胞応答のリアルタイム動態を測定する技術は、非常にシグナル伝達カスケードおよびネットの動態についてよく知っていることのためになる。
((2) G−タンパク質共役型受容体経路)
GPCRが外部性シグナル(すなわち新薬のような刺激の存在)を細胞内応答(response)に変換するので、GPCRはそれらを薬剤標的として、そして、新薬を試験するために極めて価値がある。
リガンド結合は、受容体配座変化と、受容体オリゴマー形成と、Gタンパク質活性化(Gαサブユニット上のGDP−GTP交換、GαおよびGβγ脱会合、受容体からのGタンパク質デカップリング、Gα−およびGβγ−シグナル伝達複合体の生成)と、下流のシグナル伝達活性化(二次メッセンジャ生成(Ca2+可動化、イノシトール三リン酸(inositoltriphosphate)生成および/または細胞内のcAMPレベル転形)を導く)と、を含む一連の細胞内および細胞のシグナル伝達現象を始め、そして最終的に、特定の遺伝子形質発現の変化を起こす結果となる。
リガンドによって媒介されたGPCR活性化も、細胞表面からGPCRの脱感作および多くの細胞内のタンパク質の輸送を導き、同じく、標的細胞のフェノタイプ、形態および物性の変化を導く。
これらの変化は、静的、長期持続または動的(例えばサイクリングまたは振動)である。
異なるシグナル伝達現象は、ミリ秒(例えばGPCR配座変化)から、何十秒(例えばCa2+フラックス)、何十分(例えば遺伝子形質発現または形態学的変化)、までの範囲で変動して、かなり異なる動態を呈する。
現在のGPCRアッセイは、リガンド受容体結合、二次メッセンジャ(Ca2+、IP3のcAMP)アッセイ、タンパク質相互作用アッセイ、転位アッセイおよびリポータ遺伝子アッセイを含む。
GPCR活性化が最終的に輸送タンパク質および/または形態学的変化を導くので、細胞表面上のGPCRによるいかなる化合物の作用および続く遂行された細胞現象(例えば、輸送ことおよび/または形態学的変化)を研究する方法が要求される。
((3) シグナル伝達経路受容体チロシンキナーゼ(RTK))
((a) RTKsの多様性)
膜受容体は、それらが認識するリガンド、それらが誘導する生物応答およびそれらが有する一次構造に基づく異なるファミリに分類され得る。
細胞表面受容体の1つの大ファミリは、固有タンパク質チロシンキナーゼ活性を与えられる。
これらの受容体チロシンキナーゼ(RTKs)は、標的タンパク質上のYの水酸基にATPのリン酸塩の移植に触媒作用を及ぼす。
RTKsは、細胞周期を含んでいる大部分の基本的細胞過程、細胞移動、細胞代謝および生残(細胞増殖および分化と同様に)の制御時に重要な役割を演ずる。
PTKsは、大きくて多様な多遺伝子族である。
それらの主関数は、生物の多細胞見方の調節を含む。
成長に関する細胞シグナルに対する細胞、分化、接着、運動性および死亡は、チロシンキナーゼでしばしば伝達される。
対照的に、セリン/トレオニンキナーゼファミリ(例えばサイクリン依存しているキナーゼおよびMAPキナーゼ)の多数は、真核生物の全体にわたって節約されて、単細胞で多細胞有機体のプロセスを管理する。
人間において、チロシンキナーゼは多数疾病状態の現像で有意な役割を演ずるために示された。そして、糖尿および癌を含んだ。
歴史的に、チロシンキナーゼはオンコ遺伝子の原型的なクラスを定義する。そして、人間悪性の大部分の形態に関係している。
チロシンキナーゼ遺伝子は、また、多種多様な先天の遺伝的症候群に結合された。
チロシンキナーゼは、タンパク質セリン/Tおよび構成メンバをチロシンキナーゼと明らかに同定しているユニークなサブドメインモティーフを有する二相の特異性キナーゼ以外のそれらに、非常に節約された触媒作用のドメイン同様を含む。
チロシンキナーゼ遺伝子は、海綿動物、刺胞動物、ネマトーダ、環形動物、節足動物、きょく皮動物および脊索動物、その他において特徴づけられた。
いずれのイントロンも/エキソン構造または系統的配列解析に基づく、人間のチロシンキナーゼは、20の受容体および10の非受容体クラスに分類され得る。
ドメインをリガンド結合は、単一の膜内外ヘリックスによる細胞質のチロシンキナーゼドメインに対する結合である。
細胞質のドメインは、異種タンパク質キナーゼによって自己リン酸化およびリン酸化に従属する節約されたタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)コアおよび追加の調節配列を含む。
RTKsは、受容体のいくつかのサブファミリへの更なる広告でありえる:
インシュリン受容体(IR)ファミリ、上皮増殖因子(EGF)受容体ファミリ、たとえば、PDGF受容体ファミリ。
受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子(EGF)ファミリは、4つの受容体、EGF−R(ErbB1)、ErbB2(Neu)、ErbB3およびErbB4からなる。
((b) RTKsの二量体化)
リガンド結合は、それらの細胞質のドメインの自己リン酸化に結果としてなっているこれらの受容体の二量体化を誘発する。
IRファミリの構成メンバは、22のヘテロダイマを形成している2つのポリペプチド鎖のジスルフィド結合されたダイマーである。
IRの細胞外のドメインに対するインシュリン結合は、細胞質のドメインの増加する自己リン酸化に至る四原子ヘテロテトラマー(heterotetrameric)構造の再配列を誘発する。
特性リガンドは、ダイマー対を定義する;
順番に、ダイマー対は、シグナル伝達経路を定義する。
(GH受容体(GHR)を有する複合体における成長ホルモン(GH)およびEPO受容体(EPOR)を有する複合体におけるエリスロポイエチン(EPO)の構造学はこれらのサイトカインが二価であることを示す。そして、1つのリガンドは同時に2つの受容体に結合して1:2(リガンド:受容体)複合体を形成する。
受容体二量体化は、追加の受容体:受容体相互作用によって更に安定させられる。
RTKsおよびサイトカイン受容体の細胞外で細胞質のドメインのユニーク構成を有する受容体ダイマーの特定の形態だけは、トランス−自己リン酸化およびPTK刺激作用を導く。
((c) EGFR)
EGF受容体は、胎生期および生後発育の間、そして、腫瘍のプログレッションにおいて複合した役割を演ずる。
成長および分化のそれらの役割から離れて、EGFR受容体は、トランスアクチベーションプロセスに参加して、他受容体(例えばGPCR)を有するクロストークに関係している。
((d) シグナル伝達経路EGFR)
以下のリガンドが結合して、初期の変化は、他ファミリ、受容体のキナーゼ活性の活性化および細胞質のドメインのY残基上の受容体の自己リン酸化を有する形態ホモダイマまたはヘテロダイマに対する受容体二量体化である。
受容体自己リン酸化はSrc相同2(SH2)のような特定のタンパク質相互作用ドメインにドメインを運んでいる多くの二次性のシグナル伝達タンパク質類のためのドッキング部位の生成に結果としてなる。そして、それは具体的には、リン酸化されたY残基と相互に作用する。
各々のdimericな受容体複合体は、異なるSH2を含有するエフェクタタンパク質を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める。
この相互作用の結果として、これらの二次性のシグナル伝達タンパク質類は、動作中になることができて、多くの下流シグナルの引き起こす。
たとえば、接着体タンパク質(Grb)を有する複合体がグアニンヌクレオチド解離因子(SOS)に結合した活性EGF−Rダイマー。
複合体がそうするGrb−SOSも、直接受容体のまたは間接的にShcによるホスホチロシン部位に結合する。
これらのタンパク質相互作用はRasに近い接近にSOSをもたらす。そして、Ras活性化を考慮に入れる。
これは、その後、順番に、遺伝子形質発現を進めて、細胞増殖に貢献する転写因子(例えばc−fos、AP−1およびElk−1)を活性化するシグナル伝達経路ERKおよびJNKを活性化する。
細胞増殖を進める1つの特定の経路は、シグナル伝達タンパク質Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK、ERKおよびERK/MAPKを含んで、Ras/MAPK経路として公知である。
((i) EGFRシグナル伝達および質量再分布)
EGFRは多くの異なるリガンドのいかなる一つもの結合によって活性化され得る。そして、それぞれは生物応答のいくぶん異なるスペクトルを刺激するように見える。
さらに、異なるEGFRリガンドは、受容体微小環境(例えば小胞内の(intravesicular)ペーハー)の関数として、受容体に結合するそれらの能力において変化する。
受容体依存性エンドサイトーシスは形質膜からの細胞表面受容体およびそれらの貨物の特定の除去を許して、エンドソームにそれらを標的とする。ここで、それらはダウンレギュレーションまたはリサイクリングのためにソートされる。
エンドサイトーシスの後、受容体−リガンド複合体は、それらのintravesicular環境において変化するいくつかの異なる区画を通過する。
細胞の区画(輸送として参照した)の中の受容体運動は、複合体の活性に対する有意な影響を有する。
異なる細胞内の区画も、EGFRキナーゼのいくつかの基質に、それらのアクセスにおいて変化する。
異なるエンドサイトーシス区画の基質アクセスおよびリガンドに依存する活性間の結合した類縁は、輸送ことは各々のリガンドに情報ユニークを「復号化する」ように機能してもよいことを示唆する。
さらに、リガンド−受容体相互作用の残存は、輸送受容体を制御する。
このように、受容体エンドサイトーシスおよび減生は、シグナルの大きさ、応答の特異性および応答の持続期間を制御する重要な機構でる。
誘導された経路で形成される小胞は、被覆−ピット媒介された早期エンドソーム(EE)小胞と称する。Al EE小胞はソーティング段階を通り抜けるか、細胞表面に戻るか後期エンドソーム(LE)になる。
EE小胞が形質膜(PM)に戻ってリサイクルするときに、その受容体の全ては形質膜の部分になり、そして、いかなる解放されたリガンドも細胞外の培地に放出される。
同様に、EE小胞がLEになるときに、その内容の全てはLEへ移される。
形質膜に対するリサイクリングおよび後期エンドソームになる速度は、EE小胞のタイプに依存する。
エンドサイトーシス小胞は、非常に速い速度または遅れ(すなわち、ゆっくり)た後、形質膜へリサイクルされる。
通常、被覆−ピットEE小胞は、ゆっくり形質膜に戻ってリサイクルする、そして、その結果、被覆−ピットEE小胞のかなりのパーセンテージが、LE.になる
対照的に、構成するEE小胞はより耐性の再循環速度を有する、そして、このように、それらのほとんどは形質膜に戻る。
受容体は、LEのソーティングの第2の段階を通り抜けられるか、減生のためにタグを付けられるか、ライソソームに送られるか細胞表面へリサイクルされる。
小さい小胞は、特定の速度でソーティングエンドソームから逃げる。
この小胞も等級を下げられるその内容のためのライソソームに溶ける、または、それは形質膜の方へ戻ってリサイクルする。
力学的に、後期エンドソームからリサイクルしている受容体は、golgiを通過しそうである。
それらのエンドサイトーシスプロセスのネット結果は、EGFR活性化の後、細胞の指向性質量再分布を導く。
さらに、EGFRsの発現量は、1から他の細胞株まで変化してもよい。
それのため、リガンド起因性EGFR活性化によって媒介された細胞内の質量再分布は異なる細胞株の中で変化してもよい。
たとえば、人間の表皮がんA431細胞が、過剰発現するEGFRs(細胞につき約1,700,000コピー)を内生的にすることは公知で、このようにEGFRシグナル伝達のための理想モデルとして使われた(D.W. Barnes, "Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum-free cell culture," J. Cell. Biol. 1982, 93, 1-4)。
EGFを結合すると、即座に、A431細胞のEGFRsは、動作中になって、Ras/MAPK経路を含んでいる異なる経路で、さまざまな細胞応答を導く。
たとえば、37℃でのEGFを有する静止A431細胞の刺激作用は、細胞外のマトリックスから最終的に受容体エンドサイトーシス、屈折性の(refractile)形態学的変化および細胞離断を導く(Z. Lu, G. Jiang, P. Blume-Jensen, and T. Hunter, "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase," Mol. Cell Biol. 2001, 21, 4016-4031. and Y. Danjo and I. K. Gipson, "Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement," J. Cell Sci. 1998, 111, 3323-3332)。
また、受容体エンドサイトーシスはEGFシグナルを減らす重要な細胞過程である。但し、若干の証明はEGF受容体複合体がエンドソーム(endosomal)の区画のシグナルに続くことを示唆する。
エンドサイトーシスプロセスは、多数ステップを含む:
活性受容体に対する細胞内成分の加入、エンドソームへの結果としてなられた複合体の次の内部移行、細胞内のいくつかの区画の中の内面化された受容体複合体の運動および最終的に細胞膜に対する減生およびリサイクリング背。
細胞の密度が受容体および密度に表面をつけて、それらのリガンドの大きさのため、加えて、そして、受容体輸送と同様に使用する(例えばA431細胞株)細胞株の形態が活性化の後、引き起こすRTK経路の多くのシグナル伝達現象が、指向性質量再分布にある。
たとえば、細胞表面EGFRsに対するリガンドの結合は、細胞表面で質量の増加を導く;
短い期間の間の質量再分布のネット−ゼロ−変化の活性EGFRs結果と相互に作用している逐次的な自己リン酸化および細胞内成分。
活性受容体の中で輸送は、各細胞の異なる区画内で有意な質量再分布を導く。
たとえば、EGFR輸送プロセスは、細胞膜の表面上のタンパク質グレーティングに、形質膜、クラトリンの会合体によって形成される構造およびアダプタでクラトリン−被覆−ピットに、受容体の加入によって始められる。
六角形配列へのクラトリンのポリメリゼーションは懸垂足場をアダプタを組織するために提供する。そして、それは内面化された受容体の細胞質のドメインの配列モティーフを認識する。
アクチン細胞骨格はクラトリン−被覆−ピットの発生に貢献すると考えられる。但し、アクチンフィラメントとエンドサイトーシス機構を接続する特定の成分は不明である。
Cortactinは、Fアクチン関連のタンパク質であって、膜内で培養細胞の火ぶくれを局所化して、大きいGTPアーゼダイナミンの直接の結合パートナーである。
アクチンおよびダイナミンと共に、Cortactinは受容体によって媒介されたエンドサイトーシス機構(Bajzer, Z., et al., "Binding internalization, and intracellular processing of proteins interacting with recycling receptors - a kinetic analysis", J. Biol. Chem. 1989, 264:13623-13631)の重要な成分である。
((ii) EGFRsの構成する活性)
受容体ダイマーの限られた個体群が、PTK活性(活性ダイマー)のトランス−自己リン酸化および刺激作用と互換性を持つ構成のそれらの細胞外で細胞質のドメインの四次構造によって存在する。
細胞外のドメインに対するリガンド結合は、活性ダイマーおよび従ってPTK刺激作用の発生を安定させる。
RTKsの自己リン酸化がリガンド結合の非存在下でさえチロシンホスファターゼの阻害物質によってまたは受容体過剰発現によって強化されるので、活性ダイマーがリガンド結合の非存在下でさえ存在することを提案された。
実験は、形質膜上にて1分当たり、2%の非結合(リガンドなしの)および15%のリガンド結合の受容体が内面化されことをを示す。
さらには、静止A431細胞においては、成育因子の比較的低い濃度(例えばウシ胎児血清(FBS))(重量の0.5%未満)を含んでいる培地またはいかなるFBSのない培地において、細胞を培養することによって得られ、その構成性によるEGFRのさらに若干の程度リン酸化がある。
EGFの濃度が増加するように、応答を定義している3つの主要なバイオセンサパラメータはかなり変わる。
EGF濃度はより高くなり、1)より大きいP−DMRてN−DMRシグナルの振幅、2)、P−DMRてN−DMR現象の動態はより耐性である、そして、3)時より短いP−DMRからN−DMR現象(遷移時間t)への遷移の結果としてなる。
P−DMR現象の振幅がEGF濃度を有する複雑な類縁を示すときに、N−DMRシグナルの振幅はEGF上の強いおよび飽和性供与量依存を示した。そして、約1.45 nM(図7b参照)のEC50に結果としてなった。
遷移時間tが、数秒でEGF(図7c参照)の濃度増大によって、指数的に減少するとわかった:
加えて、N−DMRシグナルの減衰は、非線形回帰を付けている。
得られた一つの位相減衰定数kは、5.76nM(図7d参照)のKdを有する典型的飽和性応答を引き起こした。
それらの用量依存的動態パラメータ(N−DMR位相の遷移時間および減衰定数)は、前の実験データとの優れた契約およびヒーラー細胞の標的遺伝子(C−fos)の形質発現の動態に関する計算の予報において、そして、EGFRエンドサイトーシスの中であった(Schoeberl, B., C. Eichler-Jonsson, E. D. Gilles, and G. Muller. "Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF receptors". Nat. Biotech. 2000, 20:370-375)。
これらの結果は、EGF−誘導細胞形態学的変化および受容体エンドサイトーシスがDMR現象である、そして、DMRがEGFR活性化従属現象であることを示した。
((e) PDGFR)
ノックアウト研究は、PDGFに対するこれらの細胞応答の多くがハツカネズミ現像の間の必須であることを証明した。
2つのリガンド(PDGFaおよびPDGFb)が、ある、そして、2つの受容体、PDGF受容体αおよびPDGF受容体β(PDGFRaおよび、それぞれ、PDGFRβ)。
PDGFbおよびPDGFRsは脈管系の支持体細胞の現像のための必須であるのに、中枢神経系、神経冠および器官現像を含む多数のコンテクストの必須役割については、PDGFaおよびPDGFRaは胚形成の間、広くより必須である。
全てのPDGFは分泌された、ジスルフィドにリンクされたホモダイマとして機能する、しかし、PDGFAおよびBだけは機能的ヘテロダイマを形成する。
PDGFRsも、ホモおよびヘテロダイマとして、そして、アッセイがリガンドがそれらの親和性において異なることを証明し、そして、αβおよびββ受容体のために生体内において機能する。
全ての周知のPDGFは特性『PDGFドメイン』を有する。そして、それは分子間および分子内結合に関係している8つの保存システインを含む。
各々の受容体は、細胞質の領域の細胞外のリガンド−結合ドメインおよび裂けたチロシンキナーゼドメインの5つの免疫グロブリン反複を有する。
リガンド結合に、チロシンキナーゼドメインを活性化して、PDGFRsは二量体化(dimerize)し、そして、それはそれから受容体細胞質のドメインのいくつかのY残基を自動的にリン酸化する。
これは、シグナル伝達タンパク質のためのドッキング部位およびPDGFR結合にシグナル伝達を始めるアダプタをつくる。
両方の受容体は同じ主要なシグナル伝達経路の多数を活性化する。そして、Ras−MAPK(マイトジェンは、タンパク質キナーゼを活性化した)、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)およびホスホリパーゼC経路を含む。
しかし、相互に作用しているタンパク質のアレーはPDGFRaおよびPDGFRsの間で僅かに異なる。そして、生体内にそれらの機能上の能力のなんらかの違いに結果としてなる。
((f) 他のRTKs)
EGFRsおよびPDGFRsの他に、他受容体チロシンキナーゼは、インシュリン受容体、インスリン様増殖因子I受容体(IFG−1R)、神経成長因子受容体(NGFRs)、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFRs)を含む。
同様に、これらのRTKsは、細胞表面膜横断受容体だけでなくあるが、また、キナーゼ活性を有する酵素である。
受容体チロシンキナーゼの構造上の組織は、リガンド特異性、単一のパス膜内外疎水性ヘリックスおよびチロシンキナーゼドメインを含んでいる細胞質の一部を運ぶための多領域細胞外のリガンドを呈する。
キナーゼドメインは、NおよびC末端上の両方に調節配列を有する。
NRTKは、キナーゼドメインを有して、しばしば追加のいくつかのシグナル伝達またはタンパク質−タンパク質相互に作用しているドメイン(例えばSH2、SH3およびPHドメイン)を所有する。
と、と、とを備えることを特徴とする。
ATPは2つの葉の間に開裂において結合する、そして、タンパク質基質の配列を含んでいるYはC末端葉の残基と相互に作用する。
RTKsは受容体の二量体化が続く細胞外のドメインに、リガンド結合によって活性化される。そして、NRTKの活性化機構が、リン酸基転移応答を可能にするために異形のタンパク質−タンパク質相互作用を含んで、より多くの複合体であるのに対して、細胞質のドメインのリン酸基転移応答を容易にする。
((4) 細胞骨格転形)
細胞骨格は、真核細胞の細胞原形質の全体にわたって伸びるタンパク質フィラメントの複合して動的なネットである。
細胞骨格は、細胞の多種多様活性を実行することに関係している。
それは、抗張力を細胞のために用意することによって細胞形状を維持する。
それも、若干の細胞移動(構造(例えば鞭毛およびシリア)を使用すること)を可能にして、細胞内輸送(小胞および、たとえば、細胞器官の運動)および細胞の***で重要な役割を演ずる。
細胞骨格は、細胞が細胞器官を移動する「軌道」を提供することにシグナルを出していて、輸送細胞内、クロモソームおよび他ものに関係している。
細胞骨格の長い繊維は、サブユニットのポリマーである。
細胞骨格からなる繊維の一次タイプは、マイクロフィラメント、マイクロチューブルおよび中間径フィラメントである。
(i) マイクロフィラメントは、7ナノメートルから12cmの長く続くまで概してタンパク質の紐からなるねじれた二本鎖である。
タンパク質は、アクチンである。
その機能は、筋収縮、細胞形状および細胞原形質の運動を助ける。
(ii) 中間径フィラメントは、クラス−ストランドの8つのサブユニットでできている。
タンパク質構造は、異なる組織タイプによって変化する。
この成分は、形を維持し、神経細胞拡張を支持して、一緒に細胞を付けるのを助ける。
(iii) マイクロチューブルは、螺旋形になる2−部分サブユニットからなる管である、。
それは、チュービュリンでできている。
それは、染色体移動、細胞器官の運動およびシリアおよび鞭毛の運動を手伝う。
たとえば、小腸の上皮細胞において、繊維の全ての三タイプがある。
マイクロフィラメントは絨毛への突起し、細胞表面に形を与えている。
マイクロチューブルは、中心体から細胞周辺へ伸びている。
中間径フィラメントは、隣接した細胞をデスモソーム経由で接続する。
((a) 細胞骨格構造)
それは、細胞形状を維持して、若干の細胞移動(構造(例えば鞭毛およびシリア)を使用すること)を可能にして、細胞内輸送(小胞および、たとえば、細胞器官の運動)および細胞の***で重要な役割を演ずる動的な構造である。
真核細胞は、細胞骨格フィラメントの三種、アクチンフィラメント、中間径フィラメント、およびマイクロチューブルを含む。(Janmey, P. A. (1998). The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78, 763-781))アクチンフィラメントは直径約7ナノメートルである。
このフィラメントは、ヘリコイダル形において指向される2つのアクチン連鎖からなる。
それらは大部分は形質膜の下でちょうど集中する、それらが細胞の形(形態細胞質突出***(仮足および微小絨毛のような))を保つように、シグナルの若干の細胞−細胞および細胞−マトリックス結合およびトランスダクションに参加する。
それらは、また、細胞質***にとって重要で、ミオシンと一緒に、筋収縮である。
中間径フィラメントの直径は約8〜11ナノメータである。
それらは、細胞骨格のより安定(強く結合した)で異質の成分である。
それらは、細胞(例えば、それらは核エンベロープまたはサルコメアの構造成分である)の内の三次元構造を組織する。
それらも、細胞−細胞て細胞−マトリックス若干の結合に参加する。
マイクロチューブルは、約25nmの中空シリンダであり、順に、αおよびβチュービュリンのポリマーである13プロトフィラメントによって形成される。
それらは非常に動的な行動を有して、ポリメリゼーションのためのGTPを結合する。
それらは、中心体によって構成される。
これらのフィラメントは、細胞内輸送でキー役割(ダイニンおよびキネシンを有する関連するそれらが、コンドリオソームまたは小胞のような細胞器官を輸送する)を演し、そして、有糸***紡錘体である。
((b) 透過化処理された細胞からの生体材料の管理された解放)
多数研究は、内存性巨大分子が細胞骨格要素に結合している直接タイプによる哺乳動物細胞の細胞原形質内で、非常に構成されることを示した。
細胞骨格(特にアクチンミクロフィラメントネット)は、この組織を維持することで重要な役割を演ずる。
多数化学薬品または生物学的製剤での細胞の処理は、透過化処理された細胞に至る細胞表層膜の小孔形成に結果としてなる。
これらの化学薬品または生物学的製剤は、界面活性剤(例えばサポニンおよびフィリピン)またはトキシン(例えばジギトニンまたはストレプトリジンO)を含む。
しかし、内部膜に最小の損傷を生ぜしめかつ透過化処理された細胞の非常に一様な個体群(>97%)に導くことで慎重に滴定されるときに、他の孔形成試薬と比較して、サポニンは長所がある。
サポニン(プラントから派生したグリコシド)は、周知であるが、可溶タンパク質が離れて拡散するために十分に形質膜を多孔質とする能力を有する。
サポニン処理された細胞が生体高分子の若干の一部の減失を経るにもかかわらず、透過化処理された細胞現象としてなられたが生体細胞の生物学的機能で最も多くのものを依然として保持している。
これは、プロセスの複雑度にもかかわらず、これらの透過化処理された細胞のタンパク質合成が高レベルで残るという事実によって立証され、それはこのシステムが生体細胞の起源の構造保全の多くを保持したことを示唆する。
これは大部分の巨大分子が構成される細胞構造の一部として隔離されるという理由からである。そして、したがって、これらの透過化処理された細胞から解放されない。
たとえば、運搬RNA、アミノアシル‐tRNA合成酵素およびEFlのような翻訳器具の成分は、透過化処理された細胞において通常きつく隔離される。
タンパク質合成機構だけは細胞骨格によって隔離されない、細胞の多くの他の成分はまた、安定してまたは一時的に細胞構造と関連する。
これらの一時的に関連する成分は、部分的に透過化処理された細胞から解放され得る。
また、多くの他の引っ込んだ生体高分子は、細胞骨格構造を***させた後にこれらの透過化処理された細胞から解放される。
透過化処理された細胞からのこれらの更なる放出された材料は、質量の減失に結果としてなる;
LIDセンサによって検出され得るLIDセンサの界面上の細胞層の実効屈折率の変化にこのように結果としてなること。
このように、光学バイオセンサを使用して得られた変化が、細胞骨格構造を妨げるモジュレータの指標として使われる。
他方法は高分解能蛍光映像技術に基づき、直接、細胞内の細胞骨格構造を視覚化するかまたは化合物処理の後細胞の運動性を測定するか、または細胞骨格−相互に作用しているメーカータンパク質(例えばCdc42またはRho)の活性化を測定する。
化学薬品または生物学的製剤を使用して可溶タンパク質が離れて拡散する透過化処理された細胞を生成する方法が、開示される。
光学バイオセンサを使用して細胞骨格成分のモジュレータをスクリーニングするためのLIDバイオセンサを使用するシステムと方法が、開示される。
加えて、細胞骨格配列のための全ての既存で細胞ベースのアッセイとは異なり、本発明の方法は、生体細胞よりかなり多くの単純さについては以外、生体細胞の大部分の生物学的な機能を保持する透過化処理された細胞を利用する。
単一の標的に対して通常モジュレータをスクリーニングする蛍光画像化ベースのアッセイと異なって、本発明の方法は、多重化能力(すなわち細胞内で多数標的を妨げるモジュレータをスクリーニングする能力)を提供する。
全体の内部反射けい光映像技術によって結合に、動態、親和性、含まれる標的を含む、開示された方法は、高量情報に毒性と同様に内容スクリーニングを提供する。
方法は、可溶タンパク質が離れて拡散する透過化処理された細胞を生成するために孔形成試薬(たとえば(サポニン))の使用を含む。
多くの孔形成試薬を有する細胞の処理が透過化処理された細胞を導くことを公知である。
細胞内巨大分子が細胞骨格要素に直接タイプ結合による哺乳動物細胞の細胞原形質内で、非常に構成されるので、サポニン−処理された細胞が生体高分子の若干の一部の減失を経るにもかかわらず、透過化処理された細胞は細胞骨格超集められた構造による細胞内機構の隔離によって、まだ生体細胞の大部分の生物学的な機能を保持する。
しかし、細胞からこれらの翻訳成分の放出が付いてくるタンパク質合成の劇的な還元は、マイクロフィラメントの破壊にそこにある。
また、多くの他の引っ込んだ生体高分子は、細胞骨格構造を***させた後にこれらの透過化処理された細胞から解放される。
透過化処理された細胞からのこれらの更なる放出された材料は、質量の減失に結果としてなる;
LIDバイオセンサによって検出され得るLIDバイオセンサの界面上の細胞層の実効屈折率の変化にこのように結果としてなること。
このように、光学バイオセンサを使用して得られた変化が、細胞骨格構造を妨げるモジュレータの指標として使われる。
実施例において、本発明の方法は、図25に示される方法2500を使用して細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングする。
方法2501に従って、生体細胞1008のサポニンのような孔形成試薬によって誘導された細胞表面膜の小孔形成による質量再分布をモニタする方法は次のステップを含む:
(a)光学にLIDバイオセンサ1004を提供し(ステップ2502);
(b)前記センサ1004の上の細胞培地に細胞1008を配置し(ステップ2504);
(c)緩衝液を任意に適用し(ステップ2506);
(d)おおわれた光学LIDバイオセンサ1004の上面1010に位置決めをした細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し(ステップ2508);
孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し(ステップ2510);
(e)そして、光学LIDバイオセンサ1010を測定して透過化処理された細胞1008内での質量再分布を示す時間依存している光学応答をモニタする(ステップ2512)。
孔形成性試薬は、細胞が試薬にさらされるときに、細胞表層膜の細孔の発生に結果としてなることが可能である化学であるか生物学的な化合物または組成物である。
様々な光学出力パラメータが細胞モニタリングおよび検査のために使われるにもかかわらず、刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態に関する出力パラメータは監視細胞シグナル伝達のための2つのパラメータおよびリアルタイムのその結果である。
たとえば、MAPKキナーゼ経路の活性化は、インテグリンが、細胞展開または移動の間の細胞形状変化を導く遺伝子形質発現を管理するために、細胞間マトリックス(ECM)原因インテグリン媒介FAKリン酸化(周囲のタンパク質(paxillin、Fyn/shcおよびsrc)を順番にリン酸化して、シグナル増幅を導く)に応じて上皮細胞を使用する機構と確認されている。
FAKも、PI−3つのキナーゼを結合して、MAPキナーゼ経路の上流域である。
MAPキナーゼまたはPI−3つのキナーゼが抑制されるときに、アクチン再構成は遮断された。
RhoGTPがより長く活性のままであるそのGAP機能を機能させなくて、Srcはp190RhoGAPをリン酸化する。そして、更なるシグナル増幅を進める。
活性RhoGTPは、下流キナーゼ(例えばRho関連の高次コイルを含有するタンパク質キナーゼ(p160ROCK)および増加アクチン重合および収縮に透けて見える(p140Dia)p140)に結合する。
アクチン再構成はインテグリン菌株群形成を援助する。そして、FAKリン酸化および他のシグナル伝達現象を増やすより多くのECM結合を許す。
シグナル伝達経路細胞およびそれらの細胞現象が強く細胞のコンテクストに依存しているので、所定の細胞タイプのために、種で予め定められた標的による所定のシグナル伝達経路の活性化がいかなるDMR(刺激作用がネット−ゼロDMR位相を導くだけのことを意味すること)も、を導くことができないと理解されなければならない、または、場合によっては、それからの異なるDMR応答の結果は異なる細胞株を使用することを得た。
さらに、異なる標的(例えばRTK対GPCR)による刺激によって媒介された特定のシグナル伝達経路の活性化は、細胞の単一のタイプの同一であるか異なるDMR応答を導くかもしれない。
換言すれば、特定の標的による刺激によって媒介されたDMRは、多数の細胞−シグナル伝達ネットの相互作用の統合して代表的な提示である。
さらに、刺激−起因性細胞応答力も、細胞条件に依存する(静止状態状態対増殖するか、または区別を生じるかまたは非分化して、例えば他状態対回路−G1の状態、その他)。
場合によっては、センサ界面に付けられる細胞は、所望の状態に到達するために前処理されなければならないかもしれない。
たとえば、特定の標的の刺激−起因性活性化で活性化され、そして細胞発育および増殖および/または分化を最終的に導く特定の特定のシグナル伝達経路の活性化を研究するために、細胞は好ましくは静止性状態においてあるべきである。
静止状態状態に到達するために、細胞発育および増殖を刺激する増殖している状態での細胞が、ほとんどいかなる成育因子も有しない培地等によって前処理されてなければならない。
前処理時間は、また、細胞の機能および動態を原因として生じるので、所望の状態に到達する臨界である。
或る実施例において、細胞の監視リガンド結合およびリアルタイムの逐次的なシグナル伝達現象のための方法が開示され、以下のステップを含む:
(a)光学型標識フリーバイオセンサを用意し;
(b)受容体チロシンキナーゼを有する細胞をセンサ界面上に配置する。ここで、細胞は、バイオセンサ界面上の付着および細胞の成長のために必要である血清の特定の濃度を含む培地内で懸濁し;
(c)任意ではあるが、37℃で特定時間、低濃度血清または無添加の培地において付着細胞を飢餓させ(スターベーション);
(d)細胞の層を有するバイオセンサを検出系へ配置して、その応答をモニタし;
(e)任意ではあるが、少なくとも一回、緩衝液を細胞培地に特定期間で、添加し;
(f)任意ではあるが、RTKにリガンドを含んでいる溶液を培地に添加し;
(g)そして、付着細胞の層の時間依存応答をモニタする。
RTKを有する細胞のスターベーション処理はリガンドに対する細胞応答を最大にするため、好ましい。その理由は、血清で多数成育因子が見つけられるからである。
これらの成育因子は、PDGF(血小板由来増殖因子)、EGF、インシュリン、TGF−a、インスリン様増殖因子I(IGF−I)および神経成長因子(NGF)を含む。
血清の培地または低濃度(約0.5%)またはウシ血清アルブミン(BSA)が、細胞を飢餓させるために使われる。
スターベーション時間は、概してオーバーナイトスターベーションを含む。
ここに開示されるかかる方法がRTKシグナル伝達に限られていないと理解されなければならないし、そして、標的(例えば***促進のGPCRおよびそれらのリガンド)の多くの他のタイプに適用され得る。
(a)マイクロプレートに多数ウェル(底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサを有する各ウェル)を供給し;
(b)細胞の多数のタイプを提供し;
(c)培地おいて懸濁した1種類の細胞を少なくとも一つのウェルに配置し;
(d)密集度の特定のレベルまで達されるまで細胞を付着および成長のため適当な培地で培養し;
(e)各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし;
(f)培地にRTKにリガンドを含んでいる溶液を適用し;
(g)細胞の異なるタイプの層の時間依存応答をモニタして、比較する。
細胞で異なるタイプは、異なる細胞増殖培養液を必要とするかもしれない。
同じ種類の細胞のために、異なる細胞増殖培養液は、関心のあるRTKの細胞表面発現量上の培地の効果を研究するために適用され得る。
(a)マイクロプレートに多数ウェル(底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサを有する各ウェル)を供給し;
(b)細胞が所望の密集度で各々のバイオセンサに付けられるようにRTKの比較的高い形質発現レベルを有する細胞の特定の数を培地に提供し;
(c)特定時間で付着細胞を飢餓させるために培地を交換し;
(d)各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし;
(f)各々のバイオセンサをカバーしている培地に、異なる濃度でリガンドを含んでいる溶液を適用し;
(g)細胞の用量依存および時間依存応答をモニタして、比較する。
それらの対応する動態と同様に結合している用量依存的およびDMRシグナルは、関心のあるRTKに使ってリガンドの効力を決定する。
かかる方法がまた、RTKまたは他のシグナル伝達分子の活性化および次の細胞変化のために全体的なDMRシグナルで有意な役割を演ずる下流標的に対して、阻害物質の効力を決定するために使われると理解されなければならない。
たとえば、静止A431細胞のEGF−起因性DMRシグナルは、調整され得るかまたはMEK1/2またはアクチンフィラメントのような下流に重合(polyermization)またはダイナミンまたは受容体キナーゼ活性によって影響を受けるかまたは上流に分子(例えばカルバコールを含んでいる特定のGPCR作動薬)を送られている。
標的に対するまた、それらのユニークなDMRシグニチャを使用して検査され得るモジュレータまたは得られた全体的なDMRシグナルに対する影響の効力。
(a)光学型標識フリーバイオセンサを提供し;
(b)配置しているバイオセンサをカバーする培地の関心のあるRTKを有する細胞の特定の数細胞がバイオセンサの界面の上へ付属する;
(c)バイオセンサを使用している細胞応答をモニタしている;
(d)添加細胞培地に特定の濃度で化合物を含んでいる溶液;
(e)RTKにリガンドを含んでいる溶液を適用して、連続的に細胞の時間依存している応答をモニタすることは、続けてバイオセンサを培養した。
((5) 分析コレステロール輸送)
輸送膜のコレステロールの顕著な役割は、ますます明らかになる。
たとえば、形質膜−局在性コレステロールのスターベーションはクラトリンによって媒介されたエンドサイトーシスを阻害するが、しかし、小胞性リサイクリングは影響を受けないようである。
直接のある程度のコレステロールが実行可能でないので、間接的ないくつかの方法はコレステロールおよび脂質シグナル伝達の細胞内分配を研究するために開発された。
膜非透過性失活剤を使用している蛍光性ステロールからのクエンチング発光は、形質膜のコレステロールの細胞内transbilyar分配を決定するために用いる。
しかし、このアプローチは理想的でない、幾分、蛍光性のコレステロール類似体の性状の量的差分がコレステロールと比較してあってもよいからである。
コレステロールが不十分に水の可溶であるにもかかわらず、さらに、コレステロールかなりの速度での膜から自発的に脱着できる。
最もしばしば、それは同じ膜に戻るが、それはまた、利用できるどんな他の疎水性結合部にでも結合する。
放射性同位元素を使って同定されたコレステロールおよびコレステロールエステルは、リポタンパク質によって摘出され得る。
総コレステロールは、ガスクロマトグラフィー/質量分析法のような直接タイプ化学法によってまたは間接的な方法(例えばコレステロールオキシダーゼに基づくアッセイ)によって測定され得る。
コレステロール輸送を測定するこれらの方法および使われる分配のいずれのためにでも、関心のあるさまざまな細胞器官は、浄化されなければならない。
非常に精製された膜分画を得ることは、一般に全くむずかしく、そして、冗長な純化プロトコルは、コレステロール移植のリスクを増やす。
小胞体および形質膜と同様に、細胞器官が容易に分離され得るときに、これらの方法は最も役立つ、しかし、それらはエンドソームおよびゴルジ膜のような細胞器官が考慮されるときに、解釈するのが非常に困難でありえる。
フィリピンは、比較的弱い蛍光団であって、冷やされた電荷結合素子カメラによって検出され得る。
しかし、フィリピン染色は質的な情報をコレステロール分布のために用意するだけである。これは、その蛍光強度が必ずしも線形にコレステロール組成に関連があるというわけではないからである。
他の限界は、コレステロールが長く続くの間、フィリピンを有するインキュベーションを再配布するかもしれないということである。
このように、フィリピンを使用している実験からの細胞内のコレステロール分布の数量化は、可能でない。
このアッセイは、形質膜上の酵素が細胞内区画(例えば、生体細胞のエンドサイトーシスによってまたは膜切断によって)に接近する場合コレステロールの総計を過大評価する、または、コレステロールがアッセイの間、形質膜へ移動する。
多数の方法が細胞のコレステロール分布の測定するたにに開発されると共に、その全部はそれらの解読の不確実性のさまざまな程度に委ねられる。
それは、したがって、細胞内コレステロール分布の信頼できる解析を得るためにいくつかの異なる方法によって得られた結果を比較するのに必要である。
プロセスを使用している細胞が逆コレステロール輸送と言った外側に、それはまた、***され得る。
逆コレステロール輸送の第一段階は、細胞外の受容体に対する末梢の細胞の形質膜からの自由なコレステロールの発散である。
コレステロールのこの運動は、細胞で細胞外の因子によって支配される。
多数研究は、細胞コレステロール(具体的には、これらの受容体の一時変異が明らかにコレステロール流出を強化する方法)の細胞外の受容体に集中した。
逆コレステロール輸送が高密度リポタンパク質(HDL)によって媒介されたと一般に考えられる。
HDLのようなリン脂質を含有する受容体については、律速段階は形質膜からのコレステロール分子の脱着である。
コレステロール受容体(それはすでにリン脂質、例えばHDL粒子またはPL−apoA 1つの円板を含む)は、膜コレステロールドナーおよび受容体粒子間の濃度勾配を経た拡散によって、コレステロールを除去する。
水の拡散モデルはしたがって、双方向性の質量の輸送モデルである。そして、それは受容体粒子が細胞の形質膜を結合するかまたは通すことを必要としない。
スカベンジャー受容体Bタイプ1(SR−B1)の発現レベルは、HDLまたはリン脂質粒子にコレステロール流出の速度に関連する。
コレステロール流出を刺激するSR−B1の機能は、受容体−リガンド結合から独立しているように見えて、受容体粒子にコレステロールの水溶拡散を容易にする膜コレステロールドメインの組織に対する影響を反映する。
脂質フリーapoA−1に対するコレステロール流出は、カセット輸送体A1(ABCA1)を結合しているATPの形質発現に大いに依存している。
apoA−1媒介コレステロール流出の重要性が明確であるとともに、コレステロール搬出のABCA1の正確な機能には議論の余地があり、最近の研究では、apoA−1の受容体としての役割、細胞内のコレステロール輸送体、または、細胞表面でのapoA−1のドッキングを支持する膜脂質分配に一時変異を誘発することを提案している。
図26は、方法の例が流出しているコレステロールを妨げるモジュレータをスクリーニングすることを示す。
この方法は、流出しているコレステロール上の化合物の効果のリアルタイムの計測に基づく。
細胞表面または細胞内プール上のコレステロール組成のスターベーションは細胞表面に位置する微小絨毛の消失に結果としてなる。そして、界面上の細胞被着の平坦度に結果としてなる。
細胞の平坦度は、増加するシグナルを有する正のDMR位相を導く。
この生体影響に基づく、細胞表面(例えば比較的低い濃度でのサポニン)上のコレステロールをコレステロールを細胞表面(例えばメチル−βシクロデキストリン(mβCD)または高密度リポタンパク質(HDL))から抽出するか結合するかまたは隔離するマーカーとして、我々は試薬を使用する。
光学バイオセンサを使用して得られた変化が、流出しているコレステロールを妨げるモジュレータの指標として使われる。
図27は、コレステロール経路の概略図を提供する。
これらの2つの細胞タイプ間の差分は、細胞表面と関連する異なるコレステロール組成による。
EGFを有するA431細胞の前処理は、かなりmβCD−誘導応答を抑制した。
これは、細胞表面に位置するEGFRsに対するEGFの結合が受容体の有意なエンドサイトーシスに結果としてなるという理由からである;
そして、受容体エンドサイトーシスによって、細胞表面コレステロール組成の還元が生じる。
同様に、H7、タンパク質キナーゼA、CおよびG阻害物質を有するA431細胞の前処理は、また、mβCD−誘導応答の抑制を導いた。
これは、タンパク質キナーゼが細胞表面上のコレステロール組成の臨界な調節因子であるという理由からである。
((6) 活性種のシグナル伝達および細胞レドックス状態を分析すること)
好気エネルギー代謝は、酸化的リン酸化(ミトコンドリア電子伝達(多成分NADHデヒドロゲナーゼ酵素の複合体を経た)の酸化還元エネルギーがATPの高エネルギーリン酸結合に変換されるプロセス)に依存している。
O 2 はシトクロムcオキシダーゼ(このミトコンドリア酵素の複合体の末端の酵素の成分)のための最終的な電子受容体として役立つ。そして、それはH2OにO2の四電子還元に触媒作用を及ぼす。
O2の部分的に還元され非常に活性メタボライトはこれらの(そして、その他)電子伝達反応の間、形成され得る。これらO 2 メタボライトはスーパーオキシドアニオン(O 2 ・)および過酸化水素(H2O2)(それぞれ、O 2 の一および二電子還元によって形成される)を含む。
遷移金属イオンがある場合には、より多くの活性水酸基ラジカル(OH・)は、形成され得る。
O 2 のこれらの部分的に還元したメタボライトは、分子O 2 と関連してしばしばそれらのより高い反応性による「活性酸素種」(ROS)と称する。
ROSは、まず最初に脂質、タンパク質およびDNAに原因損傷にポテンシャルを有する代謝の毒性副生成物とみなされる。
ROSの潜在的に損害を与えている効果から守るために、細胞はいくつかの抗酸化剤酵素(例えばSOD(それは、O 2 ・をH2O2に還元する)、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ(それは、H2O2をH2Oに還元する))を所有する。
このように、酸性の応力は、オキシダント産生間のインバランスおよび細胞の抗酸化剤容量として広義には酸性の外傷を防ぐことであってもよい。
酸性の応力は、アテローム性動脈硬化、肺線維症、癌、神経変性疾患および加齢を含む多数の人間の疾患に関係した。
哺乳動物細胞において、様々な細胞外の刺激は最近ROSの細胞内の濃度のエバネッセント増加を誘発することを示した、そして、ROS生成の特性阻害は刺激剤に依存するシグナル伝達の完全な遮断に結果としてなる。
ROS産生の下流効果は、タンパク質の多少可逆性の酸化反応である。
反転可能に酸化されるそれらの機能によって、チオールは酸性の応力のキー標的と認められる。
レドックスに敏感なタンパク質(それは活性サイトCとしてチロシンホスファターゼ(PTPs)を含む)はH2O2を含むさまざまなオキシダントによる特性酸化反応の標的である、そして、この一時変異は細胞内還元剤によって逆転する。
PTPs上のROSによって動作する阻害はシグナルがタンパク質Yリン酸化によって媒介した受容体チロシンキナーゼ(RTK)の伝搬を助ける。そして、一般に増殖刺激と関連する。
ROSの細胞の産生がその抗酸化剤容量を圧倒するときに、脂質、タンパク質およびDNAのような細胞高分子に対する損傷は起こる。
このように、ROSおよびフリーラジカル生成の検査は、主に細胞の成分(例えば脂質、タンパク質またはDNA)を有するROSの相互作用から生じているさまざまな最終産物の間接測定によって製造した。
特性ROSの同定のための大部分の方法は、発光であるか蛍光性のシグナルを引き出すために酸化的に修飾されるさまざまな「検出器」分子(例えば発けい光性、化学ルミネセンスであるか色原体のプローブ)を有する反応に基づく。
かかる方法は、同じ細胞のリアクタンス性酸素の多数形態を有する可能性によって複雑になってもよい。
加えて、酸化窒素ラジカルは、他の活性酸素分子をするのと、同じプローブの光学的性質の変化を産生する。
定量分析は、また、むずかしい:
1)チエニル(thiyl)またはスルフィニルラジカルまたは別トラップを形成するかまたは酸素種を減らすグルタチオンの高い細胞内の濃度;
2)金属の易変の濃度、どちらでも触媒作用を及ぼすかまたはいずれを抑制するラジカル反応;
そして、3)スペルミンのような他のフリーラジカル−クエンチング作因の存在。
ROSシグナル伝達を研究するために、さまざまな細胞の標的のための周知で特定のモジュレータの広いアレーは、特定時間(概して1時間)のための細胞を前処理するために用いた。
ROSシグナル伝達ネットは、それからH2O2−起因性DMRシグナル上のモジュレータの効果によれば、計画を立てられる。
細胞のレドックス状態を調整するスクリーニング化合物にとって、細胞は長く続く期間(概して一晩日に)の間の化合物によって前処理される。
細胞のレドックス状態上の化合物の効果は、H2O2によって媒介されたDMRシグナルによって検査され得る。
本発明も、光学バイオセンサに基づく細胞の適用法に検出することをする。
いかなる電子−転送タンパク質もまたは酵素の系は、電子伝達反応の「副生成物」としてROSの発生に結果としてなることが可能である。
酵素の供与源は、以下からなる:
コンドリオソームのROSの生成は、還元条件の下で全体のO 2 消費量の約1−2%を説明する。
ミトコンドリアSODの高濃度のために、細胞原形質に逃げそうにないO 2 の内部ミトコンドリア濃度は、非常に低い定常タイプレベルで維持されてあって、ある。
特にアポトーシスの調節に関して、細胞シグナル伝達を媒介するミトコンドリアROSのためのポテンシャルは、近年の有意な耳目を得た。
酸素圧低下−起因性遺伝子転写を媒介することは、また、コンドリオソームが「O 2 センサ」として機能することを示唆された。
小胞体は、主に脂質およびタンパク質生合成に関係している他の膜結合細胞内小器官である。
平滑な小胞体(境界リボソームを欠いている)は、脂質−可溶薬剤を無毒化するために一連の反応に触媒作用を及ぼすチトクロームP−450および他の有害な代謝産物を含む酵素を含む。チトクロームP−450が、不飽和脂肪酸および生体外物質を酸化することができ、O2および/またはH2O2を産生するために分子O2を減らす。
核膜は、いずれが未知数であるか、機能以外の小胞体のそれらに似ているシトクロムオキシダーゼおよび電子伝達系を含む。
これらの酵素の系からの電子「漏れ」が生体内に細胞のDNAに損害を与えるROSを引き起こすと仮定された。
ペルオキシソームは、全体の細胞のH2O2産生の重要な供与源である。
それらは、グリコール酸塩オキシダーゼ、D−アミノ酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼL−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、および脂肪酸アシルCoAオキシダーゼを含む多くのH2O2−生成酵素を含む。
ペルオキシソームカタラーゼは、「過酸化的」反応の様々な他の基質を酸化するためにこれらのオキシダーゼによって産生されるH2O2を利用する。
ペルオキシソームが循環に入る様々な毒性分子(エチルアルコールを含むこと)を無毒化する肝臓および腎臓細胞において酸性反応のこれらのタイプは、特に重要である。
ペルオキシソームにおいて実行される酸性反応の他の機能は脂肪酸の酸化反応である。そして、哺乳動物細胞のそれはコンドリオソームおよびペルオキシソームで起こる。
これらの細胞内小器官において発生するH2O2の小さい画分だけは、ペルオキシソームカタラーゼを逃れるように見える。
キサンチンオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ジヒドロオロット酸デヒドロゲナーゼ、フラビンタンパク質デヒドロゲナーゼおよびWジオキシゲナーゼのような可溶性酵素は、触媒作用的サイクリングの間、ROSを生成する。
ドーパミン、エピネフリン、フラビンおよびヒドロキノンのような小分子の自動酸化は、細胞内のROS産生の重要な供与源でありえる。
ほとんどの場合、かかる自己酸化反応の直積は、O2である。
形質膜関連のオキシダーゼ(例えば食細胞のNADPHオキシダーゼ)は大部分の成長因子−および/またはサイトカイン−刺激されたオキシダント産生の供与源として関係した。但し、正確な酵素の供与源はまだ充分に特徴づけられていない。
異なるクラスの受容体を結合する様々なサイトカインおよび成育因子は、細胞のROSを生成すると報告された。
外部性ROSは、また、生体細胞において導かれる。
たとえば、外部性H2O2は、細胞に形質膜全体に拡散する。
細胞の標的はより明確でないにもかかわらず、同定されて、過去の10年を通じて広がった。
受容体キナーゼおよびホスファターゼは、酸性の応力の標的であってもよい。
生長因子受容体は、非常に自動的にリン酸化する。にリガンド起因性二量体化またはオリゴマー形成によって共通に最も活性その細胞質のキナーゼドメイン。
紫外線に応答する受容体のリガンドから独立した菌株群形成および活性化はまた、かなり示された、そして、この効果はROSによって媒介されたように見える。
外部性H2O2(通常ミリモル範囲の)は、PDGF、PDGFおよびEGF受容体のYリン酸化および活性化を誘発することを示した。
EGF受容体のLysophatidic酸の起因性トランスアクチベーションは、ROSの中間の発生によって媒介されたように見える。
大部分の成育因子およびサイトカインが形質膜で、又はその近くで、ROSを生成するように見えるので、リン脂質メタボライトはレドックスシグナル伝達のための潜在的に重要な標的である。
たとえば、ジアシルグリセロールの酸化タイプは、PKCを活性化する際に、その非酸化されたフォームより効果的だった。
加えて、PKC活性化およびタンパク質Yリン酸化は、血管内皮細胞および繊維芽細胞のH2O2−起因性PLD活性化のために必要に見える。
Srcファミリ(Srcキナーゼ)およびヤヌスキナーゼ(JAK)ファミリに帰属している非RTKsは、また、少なくとも、外因的な加算オキシダントのための標的である。
さらに、ROSシグナル伝達は、MAPK経路に参加する。
外部性オキシダントは、ERKMAPK経路を活性化する。
この効果のための機構は不明である、そして、正確な分子的標的は未知数である。
若干の研究は、ROSによって媒介されたERK活性化が生長因子受容体、Srcキナーゼおよび/またはp21Rasの高さの上流域現象であってもよいことを示唆する。
この効果のための潜在的な他の機構は、チロシンホスファターゼ(PTPs)および/またはプロテインホスファターゼAのオキシダント−起因性失活であってもよい。
これらの標的は、NF−kB(免疫性で扇動的な応答に関係している多くの遺伝子の形質発現を管理する転写因子)、活性化物質タンパク質−1(AP−1)(転写複合体、Fos−JunまたはJun−Junタンパク質の二量体化によって形成された)およびDNA結合が類似したレドックス機構(例えばSp−1、c−Myb、p53およびegr−1)によって管理される他転写因子を含む。
1)細胞内レドックス状態および2の変化)タンパク質の酸性の一時変異。
方法は、培養細胞層の底部分内で、質量再分布を媒介するために外部性ROSとして過酸化水素の使用を含む。
方法は、以下のステップを含む:
光学を提供することは、独立検出にマルチ光学出力パラメータ計測ができる(LID)バイオセンサと標識する;
バイオセンサ表面上で細胞をインキュベートすること;
モジュレータ溶液を細胞に適用すること;
外因の活性酸素種溶液を細胞に適用すること;
監視前記光学出力パラメータ。
前記モジュレータは、細胞の標的のよく特徴づけられたモジュレータのプールから選ばれる。
前記モジュレータ溶液は、適用されて、前記細胞(例えば30分、60分、1時間、3時間、6時間、24時間、2日、3日、5日、その他)を有する短い期間の間、インキュベートした。
前記活性酸素種は、過酸化水素である。
(6.標識フリー細胞アッセイに対する添加)
(a) 標識付加技術と連動して標識フリーバイオセンサを使用している2つの部分アッセイ)
最も普及している2つの技術は、表面プラスモン共振(SPR)またはグレーティング結合導波路のような技術を使用して、ここに議論されるように質量分析(MS)および屈折率(RI)の変化の計測に基づく。
屈折率および蛍光(コンフォーカルまたはエバネセント場)の変化の同時計測のための誘電被覆光学グレーティングを含んでいる光学バイオセンサに結合する機器を含んでいる系はここに開示される。
例(蛍光と異なった)のために、所望のタンパク質の結合および望ましくない若干のタンパク質は、質的にシグナル(屈折率の変化)の同じ「タイプ」を提供する。
標識フリー検査法は、したがって、本来的に非特異的である。
このあいまい性を相殺するために、RILID方法は、結合した生物特定の同定を可能にするためにMSに結合した。
蛍光は、多数種の標識付加(異なる蛍光染料または粒子により)を可能にして、約200ナノメートル内で検出を可能にするエバネッセントモード(全内反射率蛍光またはグレーティング結合導波路を使用する)、または、約10μm内の検出を可能にして、優れた横方向解像力(遠距離場の約300ナノメートル未満または近距離場の<100nm)を有するコンフォーカルモードにおいて使われる。
標識フリーバイオセンサおよび標識化の2つの技術の組み合わせを使用したバイオ検出のための他の「経絡」としてのRILIDの使用が開示され、両技術は時間および空間解像力を共有するが、一方が本来の種の特異性(標識化すなわち蛍光)であり、他方が本来の種の非特異性(標識フリーバイオセンサ、RILID)である。
それが1に遭遇されるそれらのような複合したバイオ−検出結果を分析するのを可能にするように、細胞内で生物学的経路を研究すると共に、この組み合わせは本質的に強力である。
たとえば、受容体(例えばGPCR)に対するリガンドの結合は、時間を有する屈折率プロフィールの複合した変化に結果としてなる細胞のカスケードを誘発する。
これらのカスケードの一つ以上は、異なるリポータ系を使用している蛍光または標識化によって調査され得、標識化は細胞、細胞器官(例えば小胞体を調査する使用している細胞器官特性色素、ゴルジまたは細胞核))、タンパク質(例えばGFP−bアレスチンの転位)、または、DNAレベル(蛍光in−situハイブリッド形成(FISH)を使用している遺伝子形質発現)で行われる。
時間内の多色蛍光および空間に対するLIDシグナルの相関は、経路について重要な手がかりを提供する。
さらに、特定の蛍光性リポータおよび/または標識は、しばしば相互に互換性がない。
一つ以上の蛍光性リポータの必要が除去されるように、その情報がRILID.309を通して入手可能であるので、開示された方法は相関の解析を許して、アッセイ現像を可能にする。
プレーナー型導波路型バイオセンサを利用している多モード検出系が、開示される。
この系は、屈折率変化(結合することのバイオマスおよび次の活性化のネット変化および細胞応答によって波長の変化または反射光起因性の角度によって示される)をモニタするだけでなくて、蛍光(または化学発光、バイオ発光、リン光または電子発光、その他)において変わりもする。
また、薬剤発見および基本的研究ために、極めて高い内容アッセイを提供する検出系は、提供される。
その結果、多数の異なるアッセイからの出力は、薬剤発見(または分化)について、案内決定にくり返し的にまとめられる。
このプロセスは、時間がかかり、まぎらわしい。
マルチパラメトリック検出は、潜在的な薬剤化合物によって経路(または多数経路)およびそれらの転形の多数ステップについて、手がかりを提供する解析手法の組み合わせを使用しているいくつかの正面上の情報を得る必要がある。
多重化が結合同期の検出を意味するという点で、マルチパラメトリック検出は、多重化することとは別であり、多重化は経路の同じステップをモニタするために1つの技術(または組み合わせ(例えば放射性で蛍光性の標識の組み合わせ))を使用している。
グレーティング結合導波路は、RILIDおよび蛍光を可能にすることによってマルチパラメトリック検出のためのプラットフォームに関して独自に有利である。
(III. 組成)
これらの開示材料は、それらが組み合わせ、結合、サブセット、相互作用、基、その他とされたとき、それはこれらの材料の中で開示された理解されるべきで、これらの化合物の各々のさまざまな個体および集団組み合わせおよび置換の特性基準が明確に開示されることができないと共に、各々は具体的には、熟慮されて、ここに記載されていると理解される。
どの組み合わせも熟慮される具体的には、特定の受容体が開示されて、議論され、そして、受容体を含んでいる分子数に作られる多くの一時変異が議論される場合、たとえば、そして、可能である受容体および一時変異の置換具体的には、反対に示される。
BおよびCが分子D、EおよびFのクラスと同じく開示されて、分子Aのクラスである場合、このように、そして、結合分子の例、ADは開示される、そして、各々が個々に詳述されない場合であっても、各々は組み合わせ、A−E, A−F, B−D, B−E, B−F, C−D, C−E, およびC−Fが開示されて考慮されることを意味して、個々に、そして、集合的に熟慮される。
同様に、これらのいかなるサブセットもまたは組み合わせは、また、開示される。
このように、たとえば、AE、Bachelor of FinanceおよびC−Eの亜属が、開示されて考慮される。
この概念が、開示された組成物を製作し使用する方法におけるステップを含むがこれに限らず本出願の全ての見方にあてはまる。
このように、実行され得る様々な追加のステップがある場合、各々のこれらの追加のステップが開示された方法の実施例のいかなる或る実施例もまたは組み合わせによって実行され得ると理解される。
(1.開示された組成物/組合せの化学を有するスクリーニングによって同定される組成)
(a) 組合せの化学)
核酸、ペプチドおよびここに開示される関連した分子が、組合せのアプローチのための標的として使われる。
また、ここに中で開示される組成または一部がそれについて組合せのスクリーニングプロトコルの標的として使われる組合せの技術またはスクリーニング手技で、同定される組成が、開示される。
分子が、開示された組成物(例えば開示された細胞)を使用することはまた、開示される時を同定して、単離した。
このように、産物は開示された組成物(例えば開示された細胞)がまた、ここに考慮されることを含むアプローチが開示した組合せであるものまたはスクリーニングを使用することを生じた。
たとえば、推定の阻害物質は、急速に相互作用を同定するために蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して同定され得る。
技術の下にある理論は2つの分子がバックグラウンドを越えてレベルで空間の近くに相互に作用するときに、シグナルが生じるということである、または、シグナルは消滅され得る。
それから、様々な実験は実行され得る。そして、たとえば、推定の阻害物質において加わることを含む。
阻害物質が2つのシグナル伝達分子間の相互作用と争う場合、シグナルは空間の各々から除去される、そして、使用するシグナルのタイプに従い、これによってシグナルの減少または増加が生じる。
この減少または増加しているシグナルは、推定の阻害物質の有無と相関している。
いかなるシグナル伝達手段も、使われる。
たとえば、たとえば、開示され分子二つの間の相互作用の阻害物質を同定する方法が開示され、次のステップ:推定の阻害物質がある場合、一緒に第1の分子および第2の分子に連絡させるステップ(そこにおいて、第1の分子または第2の分子は蛍光ドナーからなり、または、第1であるか第2の分子は概して蛍光ドナー分子でなく蛍光受容体からなり、)と;そして、推定の阻害物質が存在および不存在の場合、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer)を測定するステップ(そこにおいて、その非共存のFRET計測と比較した推定の阻害物質がある場合には、FRETの減少は、推定の阻害物質が2つの分子間のバインディングを抑制することを示す)とを含む。
かかる方法は、細胞システムにもよって実行され得る。
ランダム方向分子の大きいプールを合成して、配列を定義して、若干の選抜および濃度プロセスに対するその複合した混合液(たとえば100のヌクレオチドRNAの100mgのほぼ1015個別連鎖)を従属させる。
カラム上のリガンドに対する分子境界のアフィニティークロマトグラフィおよびPCR増幅の繰り返された回路で、Ellington and Szostak (1990) は、小分子を結合することは染まるというような方法で、1010のRNA分子の折り重なったと見積もった。
かかるリガンド−結合行動を有するDNA分子は、同様に単離された 。(Ellington and Szostak, 1992; Bock et al, 1992).
同様ゴールを狙う技術が、小有機分子、タンパク質、抗体および従来技術において熟練のそれらにとって公知の他巨大分子のために存在する。
小さい器官のライブラリ、オリゴヌクレオチドまたは抗体に基づく広く組合せの化学と称するかどうか、スクリーニングは所望の活性のための分子の中で固まる。
組合せの技術は分子間の結合相互作用を定義するために、そして、特定の結合活性を有する分子を単離するために特に適している。そして、巨大分子が核酸であるときに、しばしばアプタマと呼ばれている。
たとえば、バクテリオファージ表示ライブラリは、特定の標的と相互に作用する多数のペプチドを単離するために用いた。U.S. Patent 6,031,071; 5,824,520; 5,596,079; and 5,565,332 、そして、表示および方法が組合せの化学と関係づけるバクテリオファージに関連したそれらの材料のために、少なくともここに援用したものとする5。
この組合せの化学方法は、核酸のタンパク質および遺伝の仕事率の機能上の仕事率を結合する。
RNA分子は、ピューロマイシン分子がいずれの中で共有結合して3末端に付けられるかについて発生するRNA分子。
この修飾RNA分子の試験管内の翻訳によって正しいタンパク質が生じる。そして、翻訳されるRNAによってコード化される。
加えて、ピューロマイシン(延長されることができないペプチド受容体)の付着のため、発達するペプチド鎖はRNAに付けられるピューロマイシンに付けられる。
このように、タンパク質分子はそれをコード化する遺伝形質に付けられる。
正常な試験管内の選抜手順は、現在機能的ペプチドを単離するためにされ得る。
一旦ペプチド機能のための選抜手順が完全な従来の核酸であると、操作手順は選択された機能上のペプチドのために符号化する核酸を拡大するために実行される。
遺伝子の物質的な、新規なRNAの増幅が3末端でピューロマイシンによって写されたあと、新規なペプチドは翻訳される、そして、選抜の機能上の他の回診は実行される。
このように、タンパク質選抜は、核酸選抜技術のように反復的な方法において実行され得る。
翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに付けられるRNAの配列によって管理されている。
この配列は最適翻訳(すなわちストップコードンでないその他)のために設計される乱数列からの何ででもありえる、または、それは探す分子が改善した周知のRNAの退化した配列でありえるかまたは周知のペプチドの機能を変えた。
核酸増幅およびインビトロ翻訳のための条件は、従来技術において通常の熟練のそれらにとって周知で、ロバーツおよびSzostakに記載の好ましくは実行されるRoberts and Szostak (Roberts R.W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997)。
イースト2−雑種系は、タンパク質:タンパク質相互作用の検出および解析に役立つ。
二−雑種系(まず最初にイーストサッカロマイセス酵母(Saccharomycescerevisiae)に記載されている)は、新規な調節分子(場および宋(ネイチャー340:245−6(1989)(Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989)))のタンパク質に対する特性)を同定するための強力な分子的遺伝学的技術である。
選出の分子を結合する合成薬品または設計されたペプチド配列間の新しい相互作用が同定されてもよいために、コーエンその他はこの技術を修正した。
かかる技術の利点は、選抜が細胞内の生育環境においてされるということである。
方法は、酸性活性化ドメインに付属したペプチド分子のライブラリを利用する。
従来技術において方法論を当業者にとって周知に扱って、さまざまな組合せのライブラリと協力して、それらの小分子または巨大分子を単離することができて、特徴づける。そして、それは所望の標的を結合するかまたは相互に作用する。
これらの化合物の相対的な結合能は比較され得る、そして、最適化合物は競争的結合研究を使用することを同定した。そして、それは従来技術において当業者にとって周知である。
代表的な技術および方法は、米国特許5,084,824, 5,288,514, 5,449,754, 5,506,337, 5,539,083, 5,545,568, 5,556,762, 5,565,324, 5,565,332, 5,573,905, 5,618,825, 5,619,680, 5,627,210, 5,646,285, 5,663,046, 5,670,326, 5,677,195, 5,683,899, 5,688,696, 5,688,997, 5,698,685, 5,712,146, 5,721,099, 5,723,598, 5,741,713, 5,792,431, 5,807,683, 5,807,754, 5,821,130, 5,831,014, 5,834,195, 5,834,318, 5,834,588, 5,840,500, 5,847,150, 5,856,107, 5,856,496, 5,859,190, 5,864,010, 5,874,443, 5,877,214, 5,880,972, 5,886,126, 5,886,127, 5,891,737, 5,916,899, 5,919,955, 5,925,527, 5,939,268, 5,942,387, 5,945,070, 5,948,696, 5,958,702, 5,958,792, 5,962,337, 5,965,719, 5,972,719, 5,976,894, 5,980,704, 5,985,356, 5,999,086, 6,001,579, 6,004,617, 6,008,321, 6,017,768, 6,025,371, 6,030,917, 6,040,193, 6,045,671, 6,045,755, 6,060,596, and 6,061,636.に、中で見つかるが、これに限られていない。
(b) コンピュータは、ドラッグデザインを援助した)
核酸、ペプチドおよびここに開示される関連した分子が、いかなる分子のモデリングプログラムもまたはアプローチの標的として使われる。
分子が、開示された組成物(例えば開示された細胞)を使用することはまた、開示される時を同定して、単離した。
このように、産物は開示された組成物(例えば開示された細胞)がまた、ここに考慮されることを含むモデリングアプローチが開示した分子的を使用することを生じた。
これは、構造知見およびコンピュータモデリングで達成される。
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造および分子と相互に作用する新化合物の合理的な設計の可視化を許す。
三次元作成物は、選択された分子のX線結晶学的解析またはNMR画像化から、概してデータに依存する。
分子の力学は、力場データを必要とする。
コンピュータグラフィックス系は、新化合物が標的分子とつながって、化合物および標的分子の構造の実験的操作を許す方法の予報に結合特異性を仕上げるのを可能にする。
分子−化合物相互作用が小さい変化が一方または両方において作られる時であるというの予報は分子力学ソフトウェアおよびコンピュータによる加強法を必要とする。そして、通常分子デザインプログラムおよびユーザー間のユーザーフレンドリーな、メニュー選択方式の界面に結合する。
CHARMmは、エネルギー極小化および分子動態力学機能を実行する。
QUANTAは、建設、グラフィックモデリングおよび分子構造の解析を実行する。
QUANTAは、双方向建設、一時変異、可視化および各々を有する分子の行動の解析を許す。
そして、核酸成分、のためのモデル酵素に関しては、Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090.がある。化学薬品をスクリーニングして、視覚的に表す他コンピュータプログラムは、BioDesign, Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario.である。
これらが主にかかるタンパク質に薬剤特性に適用法のために設計されるにもかかわらず、それらは一旦その領域が同定されるならば、DNAまたはRNAの特性領域と、特に相互に作用している分子の設計に適している。
(2.キット)
キットはいかなる試薬も含む、または、ここに議論される試薬の組み合わせまたはそれは必要であると理解されるかまたは開示された方法の実算において有益である。
たとえば、キットは方法の或る実施例において議論される増幅反応を実行するためにプライマを含んでもよい。そして、衝液および酵素と同程度よく意図するプライマを使用することを必要とする。
(IV. 組成を作る方法)
(1.核酸合成)
かかる方法は、ヌクレオチドフラグメント単離にしたがう標準酵素消化から、(たとえば、次の参照されたい:Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6))、純合成薬品方法、たとえば、ミリガンオアベックマンシステム1プラスDNA合成装置(たとえば、Model 8700 automated synthesizer of Milligen-Biosearch, Burlington, MA or ABI Model 380B))を使用したシアノエチルホスホラミダイト法に、及ぶ。
オリゴヌクレオチド生成に役立つ合成薬品方法は、Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (phosphotriester and phosphite-triester methods), and Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980)に記載されている。
タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)に記載されている周知方法を使用して作られる。
(2.ペプチド合成)
たとえば、ペプチドまたはポリペチドは、いずれのFmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)基またはBoc(tert−ブトキシカルボニル)基化学もも使用して、現在利用できる実験室設備を使用して、化学的に合成できる。(アプライドバイオシステムズ社、フォスター市、カルフォルニア)(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)
当業者は、たとえば、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペチドが正規化学反応によって合成され得ると直ちに認めるであろう。
たとえば、ペプチドまたはポリペチドは合成できて、その合成樹脂から切断できないのに、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは合成できて、樹脂からその後切断され得る。それによって、他のフラグメントに機能的に遮断される末端基を露出できる。
ペプチド縮合反応によって、これらの2つのフラグメントは、それらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合を経て共有結合で接続され、それぞれ、抗体またはそれのフラグメントを形成する。(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M. and Trost B., Ed. (1993)これらは、ペプチド合成に関する材料のために少なくともここに援用したものとする。
また、ここに記載されているように、ペプチドまたはポリペチドは生体内でそれぞれに合成される。
一度、隔離されると、これらの独立ペプチドまたはポリペチドはペプチドまたは類似したペプチド縮合反応を経てそれのフラグメントを形成するために結合され得る。
あるいは、合成ペプチドの天然型化学ライゲーションは、総合してより短いペプチドフラグメントから大きいペプチドまたはポリペチドを造るために利用され得る。
この方法は、2つのステップ化学反応からなる(Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science, 266:776-779 (1994))。
第一ステップは、アミノ末端Cys残基を含んでいる保護されていない他のペプチドセグメントと保護されていない合成ペプチドチオエステルとの化学種選択的反応であり、チオエステル結合中間体を初期の共有結合性産物として与える。
反応条件の変化なしで、この中間体は自発的速い分子内反応を経て、ライゲーション部位で天然型ペプチド結合を形成する((Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101;Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994);Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991);Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)))。
この技術は、タンパク質ドメインの類似体と同様に、大量の十分な生物学的活性度を有する比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられている(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992))。
(3.組成生成方法クレーム)
生成プロセスには、合成薬品化学法および標準の分子生物学方法などこれらの組成を作るために使われる様々な方法がある。
これらおよび他の開示された組成物を作る方法が具体的に開示されると理解される。
開示された核酸のいずれでも細胞を変えるプロセスによって産生される細胞が、開示される。
不自然に起こり開示された核酸のいずれでも細胞を変えるプロセスによって産生される細胞が、開示される。
開示された核酸のいずれでも発現させるプロセスによって産生される不自然に起こっている開示されたペプチドのいずれでも、開示される。
開示された不自然の核酸のいずれでも発現させるプロセスによって産生される開示されたペプチドのいずれでも、開示される。
ここに開示した核酸分子のいずれでも、動物が哺乳類である動物内で、細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって産生される動物が、開示される。
また、核酸分子のいずれでもここに開示した、哺乳類がハツカネズミ、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長類である動物内で、細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって産生される動物が、開示される。
(V.組成を使用する方法)
(1.研究道具として組成を使用する方法)
開示された組成物が、単一のヌクレオチド染色体の多タイプを単離するかまたは同定するためのいかなる周知の方法にもおいて使われる。
組成がまた、スクリーニングアッセイのいかなる周知の方法にもおいて使われる。そして、マイクロアレーに関する。
組成がまた、たとえば、研究相関性に開示された組成物のコンピュータ読み込み可能な実施例を使用するいかなる周知の方法でも使われる、または、分子のモデリング解析を実行することは開示された組成物に関した。
(VI. 或る実施例の図解)
(a)光学型標識フリーバイオセンサを提供し;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように培地に細胞を配置し;
(c)細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し;
(d)そして、バイオセンサ上で培養された細胞応答をモニタする。
(a)細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように化合物を有する細胞をインキュベートし;
(b)化合物の細胞上の効果を同定して、同定ステップは標識フリーバイオセンサの出力を観察して分析するステップを含む。
(a)細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように化合物を有する細胞をインキュベートし;
(b)化合物の細胞上の効果を同定して、同定ステップは標識フリーバイオセンサの出力を観察して、出力とシグニチャ出力と比較するステップを含む。
(a)光学型標識フリーバイオセンサを提供し;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように、培地へ細胞の特定の数を配置してバイオセンサをカバーし;
(c)細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し;
(e)、そして、バイオセンサ上で培養された細胞の時間依存応答をモニタする。
(a)細胞−バイオセンサ組成を形成しているバイオセンサの界面上の細胞を培養し;
(b)細胞−バイオセンサ組成を分析して、分析のステップが細胞が培養される界面の不均質性を同定するステップを含む。
(a)バイオセンサを提供し;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するように、各ウェルに細胞を配置してバイオセンサをカバーし;
(c)各ウェルの細胞培地に化合物溶液を適用し;
(d)特定の時間で光導波路光モードスペクトルを集め;
(e)細胞がいかなる化合物にもさらされないようして、コントロールウェルを有する各々の化合物のPWHMを比較して、単一のデータポイントを使用して、化合物の毒性があることを評価する。
(a)マイクロプレートへ取り付けた光学型標識フリーバイオセンサを用意し;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付属して細胞がバイオセンサをカバーするように、細胞培地とともに各ウェルに細胞を配置し;
(c)各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を適用し;
(d)指定された時間での各ウェルの全部のセンサ領域のTM0モード共振角バンド像を収集する。
(a)バイオセンサを用意し;
(b)細胞発育のための期間の後細胞密集度45%−55%に達するように、細胞をバイオセンサに接触させて細胞−バイオセンサ組成物を形成し;
(c)細胞−バイオセンサ組成物を有する化合物をインキュベートして化合物−細胞バイオセンサ複合体を形成し;
(d)バイオセンサの出力を集め;
(d)出力からPWHMを得て;
(e)各化合物−細胞バイオセンサ複合体のPWHMをコントロールと比較し;
そして、細胞−バイオセンサ組成物が化合物にさらされないようにして、細胞に対する化合物の影響を有することをPWHMの減少が示す。
(a)光学型標識フリーバイオセンサを提供し;
(b)細胞が、付着のために必要である血清の特定の濃度を含んでいる培地およびバイオセンサ界面上の細胞の成長において懸濁されるようにして、センサ界面上に受容体チロシンキナーゼ(RTK)を有する細胞を配置し;
(c)細胞の静止状態状態に達するために血清または他の成長因子のないまたはオーバーナイトのためのいかなる血清または他成育因子のない培地を有する細胞を任意にインキュベートし;
(d)検出系へ細胞の層を有するバイオセンサを配置して応答をモニタし;
(e)刺激を含んでいる溶液の添加の前後で、または、2つの溶液(化合物を含んでいる第1のものおよびリガンドまたはマーカーを含んでいる第2のもの)の特定の期間でに分けた逐次的な添加で、付着細胞の層の時間依存応答をモニタする。
(a)各ウェル底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサがある多数ウェルを有するマイクロプレートを供給し;
(b)多数のタイプの細胞の提供し;
(c)培地において懸濁した1種類の細胞を、少なくとも一つのウェルに配置し;
(d)細胞を、密集度の特定のレベルまで達するまで付着および成長させるための適当な培地で培養し;
(e)各が細胞の層によってカバーされたバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系へ配置して、応答をモニタリングし;
(f)培地にRTKにリガンドを含んでいる溶液を適用し;
(g)細胞の異なるタイプの層の時間依存応答をモニタして、比較する。
(a)各ウェル底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサがある多数ウェルを有するマイクロプレートを供給し;
(b)細胞が所望の密集度で各々のバイオセンサに付けられるようにRTKの比較的高い形質発現レベルを有する細胞の特定の数を培地に提供し;
(c)特定時間で付着細胞を飢餓させるために培地を交換し;
(d)各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし
(f)各々のバイオセンサをカバーしている培地に、異なる濃度でリガンドを含んでいる溶液を適用し
(g)細胞の用量依存および時間依存応答をモニタして、比較する。
(a)光学型標識フリーバイオセンサを用意し;
(b)関心のあるRTKを有する細胞の特定の数を、細胞がバイオセンサ界面上へ付属するように配置し;
(c)バイオセンサを使用してる細胞応答をモニタし;
(d)細胞培地に特定の濃度で化合物を含んでいる溶液を添加し;
(e)リガンドを含んでいる溶液をRTKに添加して、バイオセンサ上で培養した細胞の時間依存している応答を連続的にモニタする。
生体細胞が光学LIDバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学LIDバイオセンサをカバーし;
光学LIDバイオセンサ表面にある細胞培地に、孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し;
そして、光学LIDバイオセンサを測定して細胞から生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
生体細胞が光学LIDバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学LIDバイオセンサをカバーし;
光学LIDバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し;
そして、光学LIDバイオセンサを測定して細胞内で細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングするのを可能にする細胞から、生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
生体細胞が光学LIDバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学LIDバイオセンサをカバーし;
光学LIDバイオセンサ表面にある細胞培地に、孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し;
光学LIDバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し;
そして、光学LIDバイオセンサを測定して細胞内で細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングするのを可能にする細胞から、生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
バイオセンサからバイオセンサ出力を集める。
また、細胞が20−99%密集度で培養される方法、細胞が30−80%密集度で培養される方法、細胞が40−65%密集度で培養される方法、細胞が70−99%密集度で培養される方法、および、細胞が80−95%密集度で培養される方法のいすれかを含む方法が、開示される。
または、方法において、細胞は90%を超える密集度に育てられる;
または、方法において、細胞は洗浄液で二回洗浄される;
または、方法において、細胞を飢餓させることは、それらをDMEMだけで培養することから成る;
または、方法において、細胞を飢餓させることは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40時間、起こる;
または、方法において、細胞を飢餓させることは、一晩起こる;
または、方法において、すすぎ緩衝液は、2.5mMのプロベニシド(probenicid)がある場合には、1×標準ハンクス均衡塩類溶液、20mMのHEPES緩衝液、ペーハー7.0から成る;
または、方法において、シグナルはカルシウムシグナルである;
または、方法において、カルシウムシグナルは6秒の間隔で、6分以上記録された;
または、方法において、バイオセンサはHTS7000バイオアッセイリーダ(BioAssay Reader)から成る;
または、方法において、方法は室温で、起こる;
または、方法において、バイオセンサはコーニングEpic(商標登録)角度測定システムである;
または、方法において、バイオセンサは、TMモードの使用する;
または、方法において、バイオセンサがp−偏光を所定のTM0モードにおいて使われる;
または、方法において、化合物はすすぎ緩衝液において薄められた;
または、方法において、すすぎ緩衝液は、1×標準ハンクス均衡塩類溶液、20mMのHEPES緩衝液、ペーハー7.0から成る;
または、方法において、細胞を飢餓させることは、FBSを欠いている緩衝液で起こる;
または、方法において、溶液が0.05%未満のDMSOを有する溶液において、化合物はある;
または、方法において、飢餓させるステップは、37℃で起こる;
または、方法において、更に飢餓させるステップは、空気/5%のCO2の下で起こる;
または、方法において、細胞は細胞を有する化合物溶液をインキュベートする前に化合物を欠いている化合物溶液によって前処理される、それまで、安定した位相に達する;
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドの中央の位置の画素密度の変化を同定する;
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドのまたは更に時間の関数として、バイオセンサデータをプロットするステップから成る角のシフトを測定する;
または、方法において、増加するシグナル(P−DMR)は検知体積内で生体分子の総計の増加を意味する、そして、減少されたシグナル(N−DMR)は検知体積内で生体分子の総計の減少を意味する;
または、方法において、方法は細胞および化合物のためのシグニチャを同定する;
または、方法において、シグニチャは次のN−DMR位相が続くP−DMR位相から成る;方法において、P−DMR位相はN−DMR位相の崩壊速度より高い速度で起こる;
または、方法において、シグニチャはP−DMRがそれまで位相が評価プラトーに渡すP−DMRを段階的に実行することを成る;
または、方法において、シグニチャは2つの連続的P−DMR現象から成る。方法において、高いレベルに対する第1のP−DMR位相は第2のP−DMR位相が1秒起こる速度がレベルを上げたより、大きい速度で起こる;
または、方法において、シグニチャは化合物濃度の関数として、シグナルをバイオセンサからプロットするステップから成る、更にノイズレベルより上のいかなるDMRシグナルも含まない。
細胞は、付着細胞でありえる。
付着細胞は、バイオセンサ表面に付着する細胞である。
刺激性事象は、化合物を細胞培養に加えることからなる。
化合物は、細胞のシグナル伝達経路細胞を調整する。
転形は、シグナル伝達経路細胞を活性化する。
転形は、シグナル伝達経路細胞を抑制する。
化合物は、細胞上の細胞表面受容体を調整する。
化合物転形は、受容体の作動薬でありえる。
化合物転形は、受容体の拮抗薬でありえる。
細胞表面受容体は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、インテグリン受容体、Na+/H+交換体受容体および免疫性の受容体でありえる。
受容体チロシンキナーゼは、上皮増殖因子受容体(EGFR)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGF)、インシュリン受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)でありえる。
モジュレータは、細胞骨格構造を不安定にする。
モジュレータは、細胞骨格構造を安定させる。
化合物は、細胞内酵素、細胞内のキナーゼ、細胞内小器官または細胞内のタンパク質を調整する。
化合物は、細胞間マトリックスを調整する。
バイオセンサ出力データパラメータは、刺激性事象の動態に関連したパラメータでありえる。
バイオセンサ出力パラメータは、バイオセンサ出力データの全体的な動態を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、相転移の完成の速度を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがデータ出力を完了することにかかる時間の長さを分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、データ出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さを分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、P−DMR位相の時間の全体の持続期間を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、N−DMR位相の時間の全体の持続期間を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、P−DMRの総振幅を得るための速度を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがN−DMRの総振幅と考える時間の全長を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがP−DMRの総振幅と考える時間の全長を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、P−からN−DMR位相への遷移時間tを分析することからなる。
位相を分析することは、相転移を分析することからなる。
位相を分析することは、正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナルを分析することからなる。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルを分析することからなる。
位相を分析することは、ネット−ゼロ指向性質量再分布(ネット−ゼロDMR)を分析することからなる。
位相を分析することは、正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナルの形を分析することからなる。
位相を分析することは、振幅を分析することからなるの正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナル。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルの形を分析することからなる。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルの振幅を分析することからなる。
分析全体的動的は、出力データによって産生される完全な曲線の形を分析することからなる。
バイオセンサ出力データパラメータは、共鳴ピークに関するパラメータでありえる。
バイオセンサ出力パラメータなる光がバイオセンサに結合される入射角対光強度を分析する。
バイオセンサ出力パラメータは、光がバイオセンサに結合される光の波長対光強度を分析することからなる。
バイオセンサ出力パラメータは、ピーク位置を分析することからなる。
ピーク位置を分析することは、ピーク強度の位置の前に起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる。
ピーク位置を分析することは、ピーク強度の位置の後、起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の強度を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の前に共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の後、共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる。
第2のバイオセンサ出力パラメータは、分析ピーク位置からなる。
バイオセンサ出力パラメータは、ピーク形を分析することからなる。
ピーク形を分析することは、共鳴ピークの下の領域を決定することからなる。
共鳴ピークの下の領域は、共鳴ピークに起こっている最大半減の強度点の間で引かれるラインより上の領域だけを含む。
ピーク形を分析することは、最大半減の強度点で共鳴ピークの幅を分析することからなる。
バイオセンサ出力データパラメータは、共鳴バンド像に関連したパラメータでありえる。
共鳴バンド像は受信システムとの協働でセンサ全体を光スポットで照射して集められ、センサ全体に内結合した光強度分布の共鳴バンド像を形成する。
受信システムはCCDカメラを含む。
共鳴バンド像に関するパラメータは、バンド形、バンド位置、バンド強度または光強度分布でありえる。
バイオセンサは、同時に分析され得る。
各ウェルバイオセンサからデータポイントを集めるための時間は1時間未満、30分、5分、1分、30秒、10秒、5秒、2秒においてされ得る。そして、それが生物学的拡散である1秒およびところが制限される。
細胞は、スターベーション培地または差別化された状態を有する細胞を培養することによって細胞増殖培養液または静止性状態を有する細胞を培養することによって増殖している状態であるまたは特定の細胞周期状態で、得られる。
スターベーション培地は、細胞の培養の細胞増殖容量を減少させるいかなる培地でもある。
モニタリングは、1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分または5分、30分のサンプリングレートで持続性のやり方で行われる。
シグニチャ出力は、正のDMR、負のDMRおよびネット−ゼロDMR位相の三位相のうちの少なくとも1つからなる動的質量再分布応答を含む。
細胞は、細胞株または遺伝子操作による変種細胞株から生じる。
化合物の効果は、吸着、分配、代謝および細胞上の化合物の毒性の解析のために決定され得る。
かかる効果は、細胞上の化合物の機能上の検査から得られ、吸着、分配、代謝、排出および細胞上の毒性の効果を同定する。
バイオセンサの出力は、バイオセンサの反射ビームの角であるかスペクトルの変化としての観察可能でありえる。
細胞培地に方法は少なくとも緩衝液を適用することを更に含む。
化合物は、抗癌化合物または潜在的な抗癌化合物でありえる。
バイオセンサ上の少なくとも105の105の細胞が、あることが可能である。
細胞は、少なくとも80%の密集度に到達する。
バイオセンサは、マイクロプレートに埋め込まれる。
細胞は、少なくとも1時間、5時間、16時間、24時間、36時間、1週または2週の間のバイオセンサに育てられる。
バイオセンサは、生体細胞と接触してバイオセンサ界面の領域との間に差異を認めることが可能である。
遂行された細胞は、一部のその細胞内の成分を放出するかまたは死んでいる細胞でありえる。
化合物は、化学物質である、生化学(生物学的製剤)薬剤またはポリマー。
方法は、化合物によってインキュベートした後にアッセイステップを実行することを更に含む。
分析は、60秒か、45秒か、30秒か、15秒か、10秒か、5秒か、4秒か、3秒か、2秒か、1秒以下で起こる。
不均質性は、最大強度を有する導波モードの共鳴ピークを産生する出力を集めて、最大半減強度(PWHM)で、ピークの幅を比較することによって決定され得る。
導波モードは、TMモードでありえる。
バイオセンサが多重化フォーマットにおいてあるときに、バイオセンサはマイクロプレートのいくつかのウェルに埋め込まれる。
マイクロプレートの1つのウェルの1つのバイオセンサが、あることが可能である。
マイクロプレートの1つのウェルの多数バイオセンサがあることが可能である。そこにおいて、バイオセンサはバリアの有無にかかわらず物理的に分離され得る。
あってそこで物理的に、バリア(ウェル内の区画がより低くマイクロプレートのウェルを非常に定義しているそれでありえることを定義しているバリア)。
バイオセンサは、光導波路バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、光導波路グレーティングバイオセンサでありえる。
光導波路光モードスペクトルは、導かれたTMモードの共鳴ピークでありえる。
バイオセンサは、光学バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、光学型バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、標識フリーバイオセンサでありえる。
バイオセンサは、細胞を培養するための系に付けられる。
系は、プレートでありえる。
プレートは、複数のウェルを有するプレートでありえる。
プレートは、マイクロプレートでありえる。
細胞は、70%の密集度に到達する。
バイオセンサは、導波路型バイオセンサでありえる。
導波路型バイオセンサは、Nb2O5光学型バイオセンサでありえる。
細胞は、付着細胞でありえる。
細胞は、30%、50%または90%の密集度に育てられる。
出力は、導波モードまたは導波モードの共鳴バンド像の光導波路光モードスペクトル(OWLS)または共鳴ピークでありえる。
PWHMの変化は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
PWHMの広幅化は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
PWHMの***は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
共振バンド広がりは、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
細胞は、少なくとも70%の密集度に到達する。
バイオセンサは、マイクロプレートに付けられる。
バイオセンサは、マイクロプレートの各ウェルの底に埋め込まれる。
バイオセンサは、光学型標識フリーバイオセンサでありえる。
細胞−バイオセンサは、化合物で覆われる。
化合物は、溶液においてある。
開始細胞数は、増殖の増加か増殖の減少の解析を見越す。
細胞の数は、化合物の非存在下で30−70%間の密集度に到達する。
細胞の数は、40−60%間の密集度に到達する。
細胞の数は、45−55%間の密集度に到達する。
細胞の数は、50%の密集度に到達する。
化合物を有するインキュベーションの前にバイオセンサ上で培養される細胞の数は、少なくとも1000か、2000か、3000か、4,000か、5,000か、6,000か、7,000か、8,000か、9,000か、10,000か、11,000か、12,000か、13,000か、14,000か、15,000か、16,000か、17,000か、18,000か、19,000か、20,000か、21,000か、22,000か、23,000か、24,000か、25,000か、30,000か、35,000か、40,000か、45,000か、50,000か、55,000か、60,000か、65,000か70,000の細胞からなる。
集められる出力は、スペクトルでありえる。
集められる出力は、全部の独立のバイオセンサ領域のTM0モード共振角のバンドの像でありえる。
集められる出力は、全部の独立のバイオセンサ領域のTM0モード共振角のバンドの像でありえる。
方法は全体の角のシフトを提供している出力を得ることを更に含む。方法において、全体の角のシフトの減少は化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す。
方法は全体の角のシフトを提供している出力を得ることを更に含む。方法において、全体の角のシフトの増加は化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す。
集められる出力は、結合された光の強度を得ることができて、これをプロットする光の入射角の機能。
細胞は、少なくとも1時間、5時間、10時間、16時間、24時間、36時間またはオーバーナイトのためのバイオセンサ上で培養され得る。
結合モードは、TMモード(TM0)でありえる。
TM0モードは、始細胞接種数の関数として、更にプロットされ得る。
方法は、37℃で特定の時間のための血清の低濃度を含んでいる培地の付着細胞を飢餓させることを更に含む。
時間の特定の総計のための細胞培地に少なくとも緩衝液を適用することを更に含む。
方法は、培地にRTKにリガンドを含んでいる溶液を適用することを更に含む。
細胞培地は、PDGF(血小板由来増殖因子)、EGF、インシュリン、TGF−a、インスリン様増殖因子I(IGF−I)および神経成長因子(NGF)を欠いている。
スターベーション培地は、血清またはウシ血清アルブミン(BSA)の約0.1%未満の濃度を有する。
バイオセンサ出力の収集は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36または48時間起こる。
細胞の異なるタイプは、異なる培養条件を必要とする。
細胞からの生体材料の監視放出は、細胞の孔形成試薬−起因性透過性に依存していることが可能である。
孔形成試薬は、細胞表層膜の小孔形成に結果としてなることが可能である化学物質または生物学的製剤でありえる。
孔形成試薬は、サポニン、ジギトニン、フィリピンまたはストレプトリジンOでありえる。
(VII.実施例)
数(例えば総計、温度、その他)に関して精度を確実にするために努力実行された、しかし、若干の間違いおよび偏差は説明されなければならない。
一方、部分が重量部であることを示さなかった限り、温度が°Cにおいてあるかまたは外界温度および圧力であって、ある大気の。
(1.例1−バイオセンサに基づく細胞毒性スクリーニング)
細胞が細胞障害能作因にさらされるときに、そのようなフェノタイプはプラズマ膜統合性の妥協である。そして、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む。
導波路型バイオセンサ技術を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびA431細胞上のDMSOの効果をモニタするための実施可能性は、検査された。
ほぼ105の105の細胞は、コーニングEpicLIDマイクロプレートの各ウェルに配置された。
これらの細胞は、細胞が基質界面に対する被着層になったことを確実にして、少なくとも80%の密集度に到達するためにオーバーナイトのための血清培地で培養された。
異なる濃度(1%、2%、5%、10%、15%、18%および20%)でのDMSOに対する細胞応答は、検査された。
より高い濃度約≧25%の使用するセンサおよびシグナルの最大手に余るバルク屈折率変化のDMSO結果は、消失した。
リース2で、実験のセットは、各々の細胞株のために実行された。
(a) 材料および方法)
DMSOは、Sigma Chemical社(セントルイス(MO))から得られた。
動物細胞のためのLive/DEAD細胞増殖試薬キット分子フローブ(Molecular Probes)は、ユージン(オレゴン)から得られた。
細胞培養のための、約10×105細胞(A431またはCHO−K1)が200mlの培地において懸濁されたものを、96ウェルコーニングEpicバイオセンサマイクロプレートの各ウェルの配置されて、そして、オーバーナイトのための空気/5%のCO2の37℃で培養された。
アッセイの前に、細胞は対応する培地を有する一度、洗浄された。
アッセイの間、100mlの培地の細胞は、50mlのDMSO溶液が適用される前に、各々20mMのHEPES(pH7.4)を含んでいる25mlのHBSS緩衝液液が少なくとも15分によって分離した二つに委ねられた。
全てのこれらのステップの間、平行の角度測定システムは、細胞応答のリアルタイム動態をモニタするために用いた。
染色の後、蛍光−顕微鏡法(ツァイスAxioplan蛍光−顕微鏡)は処理されて未処置の細胞の形態および蛍光分配を視覚化するために用いた。
(b) 結果)
図29のように、DMSO−起因性用量応答およびCHO細胞の時間に依存する応答曲線に示すように層は<20%のDMSO濃度で、応答がほとんど特色のないことを示す。但し、段階的な減少がDMSO溶液の導入の後場合は除く。
原基がある、そして、急速が位相を増やした点に注意される。そして、それは全ての濃度でのDMSOが導かれたあと、右の屈折率変化をかさばらせるために予定される。
しかし、DMSOの濃度が20%に達するときに、観察され得る4つの現象がある:
(A)大きい応答シグナルにより、バルク屈折率がDMSO溶液の導入の直後に変わる;
(B)小さい減少されたシグナル(おそらくウェルの2つの流体の混合による);
(C)それらの濃度でのDMSOが細胞内部で通して、バイオ流体を交換するので、緩慢および安定はおそらくシグナルを増やした;
(D)そして、DMSOおよび結果としてなること高濃度の毒性によって生じる細胞のタンパク質または他生体分子の減失のための持続性で減少されたシグナルは、細胞表層膜の保全を失った。
屈折率値があることを公知である:
DMSOのためのこのstudy1.437およびタンパク質のための約1.5において使用される水の緩衝液媒体のための1.3328。
加えて、バイオ流体(それは主に1.3328の屈折率を有する水からなる)のための約70%(重量)が、細胞にある。
もう30%は、タンパク質、DNA、RNA、脂質分子を含む。
また、DMSOの濃度が10%未満のときに、細胞膜が実験の継続期間の間にDMSOによってかなり影響を受けないことを公知である;
しかし、DMSOの濃度が10%および20%の間にあるときに、障害を生じる細胞膜のパーセンテージは増加している。
より高い濃度で、ほとんど全ての細胞膜が障害を生じた(Beske, O., et al., "A novel encoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiple cell types", J. Biomol. Screening. 2004, 9, 173-185)。
CHO細胞およびA431細胞株間の現象Bのために異なる行動は、基質上の細胞の2つのタイプの異なる付着および形態のためにありそうである。
CHO細胞はA431細胞未満で広がる傾向がある。そして、大部分の現象Dを説明する遂行された細胞からの材料で失われたものは両方の細胞株に対して同様であるときに、基質(それはバイオ流体交換現象(現象C)が生物学的な再分布現象より顕著ではならないことを意味する)に付けられるA431細胞のより薄い層に結果としてなる。
(2.例2−光学センサによる化合物毒性HTスクリーニング)
(a) 化合物毒性をスクリーニングしている高量スループットのための方法)
本発明の方法によって、全部のプレートのための数秒内の化合物毒性を検出する。
これは順番に、細胞が培養されるセンサ界面の不均質性に結果としてなる。
毒性研究の間、バイオセンサは三タイプ領域:生体細胞有する領域、死んでいるか瀕死の細胞を有する領域(そこにおいて、死んでいる細胞は細胞内の成分減失傾向になり屈折率変化を導く)、および細胞のない領域、を検出する。
不均質性発生によって所定の導波モードまたは幅の共鳴ピークおよび共鳴バンド像の分配のPWHMの変化が生じることがありえた。そして、それは全く細胞密度に依存している。
薄膜界面で培養される細胞が指向されすなわち特定の種類の好適な構造を有するようにするか、または、特定の領域での細胞が毒性化合物を知覚しうるようにする事例の場合、化合物毒性は例えば共振ピークの肩部(共鳴ピークおよびバンド広がりを導く)および平坦***などの微細構造を起こすことになる。
TM0ピークのPWHMは、比較的低い。
毒性化合物が加えられたあと、細胞は影響を受け始める。
影響を受ける細胞は、物理的で生理学的な変化(すなわち形態、形および細胞内の成分再配列)を経る。
最終的に、影響を受ける細胞は、死ぬ。
化合物処理の後の特定の時間で、細胞の個体群:生体細胞、影響を受けた細胞および死んでいる細胞は、混ぜられる。
したがって、時間が化合物処理の後、増加するように、TM0ピークのPWHMはその比較的低いレベルから増加して、特定の時間でのその最高に着いて、減少された総合応答率(すなわち角の波長シフト)によって、また本来低次にその減衰を始める。
その最高に到達する動態は、細胞に作用している化合物の細胞株および機構に依存している。
このプロセスは、細胞付着性および拡散移動プロセスに対する反対形である。
(a) 光学型標識フリーバイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋めたものを用意する;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するようにバイオセンサをカバーするようにた各々へ細胞を配置する;
(c)各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を添加する;
(e)特定の時間での光導波路光モードスペクトルを集める。
細胞がいかなる化合物溶液にもさらされないコントロールウェルを有する各々の化合物のPWHMを比較して、単一のデータポイントを使用して化合物の毒性を評価する。
必要であるならば、時間に依存するPWHM変化は動態を研究するために記録され得る。
(a) 光学型標識フリーバイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋めたものを用意する;
(b)細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するようにバイオセンサをカバーするようにた各々へ細胞を配置する;
(c)各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を添加する;
(e)特定の時間での各ウェルの全部のセンサ領域のTM0モード共振角のバンド像を集める。
細胞がいかなる化合物溶液にもさらされないコントロールウェルのそれを有する化合物溶液によって処理されたセンサの共鳴バンドの幅を比較して化合物の毒性を評価する。
細胞が細胞障害能作因にさらされるときに、そのようなフェノタイプはプラズマ膜統合性の妥協である。そして、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む。
導波路型バイオセンサ技術を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびA431細胞上のDMSOの効果をモニタするための実施可能性は、高スループット方法を使用して検査された。
結合モードは、横磁気(TM0)モードである。
図31Bは、TM0モードの最大半減(PWHM)のピーク幅が算出されて、CHO細胞密集度の関数として、プロットされることを示す。
細胞の密集度が増加するように、PWHMは増加して、50%の密集度あたりで最高で届いて、出発値に減少を始める。
細胞のための結合されたピークのための小さいショルダーピークが全ての密集度レベルにある点に注意することは価値がある、しかし、細胞を有しないセンサのための否定は付属した。
これは、おそらくCHO細胞が選択方位(図35A参照)を有するグレーティングセンサ界面上へ付属するのを好むという事実による。
共鳴ピークスペクトルは、DMSO(18%の終濃度を有する)の添加の後、異なる時間で記録された。
約25%の下の細胞密度のために、時間の上のPWHM値の不変が、ある。
しかし、センサ上の細胞の密集度が高量(>70%)であるときに、続かれるPWHMの初期の増加が減少性PWHM値によってある。
共振ピークの広幅化の他に、DMSO処理後の約25分の時点での共振ピークの肩部および平坦***のような微細構造の発生がある。
面白いことには、DMSO処理に応答する共鳴ピークの広幅化または形変化は動的プロセスであり、DMSO−起因性細胞応答が特定の細胞のシグナル伝達経路(例えばアポトーシス)と整合していることを示唆している。
像は、緩衝液(カラム2)を有する、そして、18%のDMSO(カラム1)を有する25分処理の後、される。
像は、その(i)に緩衝液によって処理される細胞が物質を全部のセンサの共振バンドのいかなる変化もの否定結果にしないことを示唆する細胞の密集度があること;
そして、18%のDMSOで処理される細胞が密集度依存している共振バンド広がりに、上昇に与える(ii)。
細胞の密集度が70%を超えるであるときに、DMSO−起因性共振バンド広がりがある。
これらの結果は、共振バンド広がりの広幅化が化合物毒性のためのシグニチャとして使われることを示唆する;
そして、細胞密度または密集度は、有効な見積を作るために重要である。
共鳴ピークスペクトル、広幅化またはDMSO処理に応答する共鳴バンド像の形変化に対する同様は動的機構である。そして、DMSO−起因性細胞応答が特定の細胞のシグナル伝達経路(例えばアポトーシス)に関するかもしれないことを示唆する。
より重要なことに、マイクロプレート内の全ての96のセンサのための共鳴バンド像は3秒内で集められる。そして、共鳴バンド像またはスペクトルに基づく本発明の方法が極めて高いスループット技術を細胞毒性価値判断および複毒性スクリーニングに対して提供することを示唆する。
像は、緩衝液(カラム2の6つのウェル)を有する、そして、DMSO(カラム1の6つのウェルおよびカラム3の図34に示す6つのウェル)の異なる濃度を有する25分処理の後、される。
結果は、DMSOの毒性効果が濃度に依存していることを示す;
より高い濃度だけによって有意な細胞毒性が生じる。そして、そのことはバンド形の変化によって指示した。
特に面白い所見は、使用するDMSOの濃度が約15%であるときに、第2の共振バンド排臨(おそらくセンサ上のCHO細胞培養の選択方位による)があるということである。
培養条件(図35参照)の下でグレーティング構造によって整列配置するようである。
これらの結果が、整合しているとわかった、そして、このように、方法(示されないデータ)を染色している従来のLive/DEAD細胞によって確かめられる。
(3.例3−高スループット増殖分析)
結合モードは、横磁気(TM0)モードである。
図36Bは、TM0を使用している最大半減(PWHM)で、モードが算出されて、初期の接種細胞数の関数として、プロットされることをピークの幅に明らかにする。
初期の細胞接種数が増加するので、PWHMは増加し、最高で20000および30000の間の初期の接種細胞(対応する密集度は約50%である)に届き、そして、出発値へ減少を開始する。
細胞のための結合されたピークのための明らかなショルダーピークが全ての密集度レベルにある点に注意することは価値がある、しかし、細胞を有しないセンサのための否定は付属した。
また、CHO細胞が好む事実のために、これは選択方位(図35参照)を有するグレーティングセンサ界面上への付属傾向である。
面白いことに、ここで示される結果は固定された期間(図31参照)以後、異なる細胞密度に到達するために細胞の異なる接種数を使用して、得られたそれらと整合している。そして、本発明の方法が再生可能なことを示唆する。
センサが細胞密度に知覚しうることを示唆して、バンドが全部のセンサの中で撮像する共振が観察されるTM0モードの形および位置は、初期の接種細胞数に依存している;
蛍光−顕微鏡法を使用している細胞密度解析によって確かめられるように、CHO細胞の増殖速度は、初期の接種細胞数に依存するの後、分子フローブからの生/死細胞キットを有する染色する。
対応する密集度は、5%、30%、55%、75%および95%、それぞれ、10000の、20000の、30000、40000、50000の細胞の初期の接種数のためのである。
(4.例4−バイオセンサを使用している細胞シグナル伝達経路研究)
(a) 材料および方法)
全ての化学薬品は、いずれのSigma Chemical社(セントルイス(MO))もまたはTocris Chemical社(セントルイス(MO))から得られた。
細胞培養のための、細胞(2×105〜1×106)(A431かCHO−K1)の特定の数が200mlの培地において懸濁されたこと96ウェルコーニングEpicバイオセンサマイクロプレートの各ウェルの配置されて、そして、細胞密度達する約90%および上記(もし指定されていなければ)までの特定の時間のための空気/5%のCO2の37℃で培養された。
結果としてなられた細胞は、「増殖(profilerating)する」として細胞と呼ばれた。
「静止性」細胞は、いいえを含んでいる培地を有する所望の密集度の増殖している細胞を培養することによって得られるかまたは少なくとも16時間小さい(約0.1%ウシ胎児血清(FBS))。
アッセイの間、100mlの培地の細胞は、刺激を含有する50mlの溶液が適用される前に、各々20mMのHEPES(ペーハー7.4)を含んでいる25mlのHBSS緩衝液が少なくとも15分によって分離した二つに委ねられた。
全てのこれらのステップの間、平行の角度測定システムは、細胞応答のリアルタイム動態をモニタするために用いた。
複効果研究のために、逐次的な処理に対する50mlの培地に委ねられ、始める改質プロトコルが、使われた:
二回25mlのHBSS緩衝液(少なくとも15分によって分離される各々)、50mlの化合物溶液および最後に刺激を含有する50mlの溶液。
使用する検出系は、U.S. Patent App. 10/602,304, filed 06-24-2003 having publication no. US-2004-0263841, published 12-30-2004 and U.S. Patent App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. For "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine, et al., filed on March 31, 2005, のそれでありえる。いずれもバイオセンサのための最少で援用によって全体としてここに取り入れられるか、それらが使用される。
(b) 結果)
((1) リガンド結合をモニタしているリアルタイムおよびRTKsの逐次的なシグナル伝達現象)
A431細胞株は、内生的にな過剰発現されたEGFRsを有する癌細胞線である。
10%のウシ胎仔血清(FCS)を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)の培地のA431細胞は、各ウェルの底の導波路バイオセンサを有するマイクロプレートの各ウェルに適用された。
細胞は37℃一晩培養された、血清培地は交換された。そして、0.1%の血清だけを含んでいる培地および細胞はもう18時間連続的に培養された。
全部の時間経過は、室温で、得られた(約20℃)。
EGF(A)の添加の後、静止A431細胞(18時間の0.1%のウシ胎児血清(FBS)で培養されることによって得られる)のEGF−処理は、3つの異なる、逐次的な位相からなる時間依存応答を引き起こした:
(i)増加するシグナル(P−DMR)を有する正の位相(図6Aの点C〜D);
(ii)ネット−ゼロ位相(点D〜E);および、
(iii)減少するシグナル(N−DMR)を有する減衰位相(点E〜F〜G)。
20秒未満(図6AのCに対する点B)の間続いて、シグナルの速い応答変化がある点に注意された。そして、それはウェルに50mlのEGF溶液の導入に起こる。
この迅速変化はバルク屈折率変化に主に予定される。そして、それは一時的にいかなるDMRシグナルも圧倒する。
測定されたP−DMRシグナルは主にEGFR活性化の後、形質膜の陥入のために活性EGFRsに対する細胞内成分および細胞の平坦度の加入によるのに、細胞離断および受容体内部移行はN−DMR現象の2つの主な誘因である。
しかし、P−DMR現象はまた、非細胞機能に関連した現象を含むかもしれない。そして、細胞培地および化合物溶液の間で溶液拡散および温度差を含む。
生物学的製剤および生化学研究は、37℃で、ほとんど細胞膜の内側の表面で位置決めをする約5−20分内で、EGF−境界受容体が早期エンドソームに内面化され得ることを示した。
その後、他成分を有する複合体化のこれらのEGFRsは、いずれが細胞膜(すなわち、輸送ことの間、これらの受容体は、センサ界面から移動する)の内側の顔から遠く離れて、相対的に両方とも位置するか減生のための遅発タイプエンドソーム(20−60分)およびライソソーム(>60分)へ移される。
受容体およびリガンドの継続的なフラックスが、異なる区画である;
そして、多数ステップは、それらの全体的な動的な分配を書き取らせる。
EGF−境界受容体は、急速内部移行のために細胞表面(約3分)で、比較的短い時間を費やすだけである。
((2) EGFRの発現量および細胞表面発現量を測定する方法)
EGFまたは37℃を有する静止A431細胞の刺激作用は、最終的に細胞外のマトリックスから室温で、受容体エンドサイトーシス、屈折体形態学的変化および細胞離断を導く(Z. Lu, G. Jiang, P. Blume-Jensen, and T. Hunter, "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase," Mol. Cell Biol. 2001, 21, 4016-4031)。
このように、配列された測定システム(図6A(図18)参照)を使用しているリアルタイムにおいて測られるように、EGF刺激作用は、A431細胞内で有意な質量再分布に結果としてなる。
結果は、細胞が強く培養条件に依存することをA431のそのEGF−起因性DMR応答に明らかにした。
20時間の0.1%のFBSで培養されるA431細胞のEGF−処理は、3つの異なる逐次的な位相からなる時間依存応答を引き起こした:
(i)増加するシグナル(P−DMR)を有する正の位相(図6Aの点C〜D);
(ii)ネット−ゼロ位相(点D〜E);および、
(iii)減少するシグナル(N−DMR)を有する減衰位相(点E〜F)。
しかし、静止A431細胞と比較して、4時間だけの0.1%のFBSによって処理されるA431細胞は、変えられた動態および非常により小さい振幅を有する同様応答以外を引き起こした。
逆に、増殖しているA431細胞(10%のFBSによって培養されて)は、EGF刺激作用に応答してP−DMR現象を引き起こすだけだった。
さらに、CHO細胞が内生的ににEGFRを表さないという事実と整合した有意な応答は、静止性であるか増殖しているチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のために観察されてなかった(E. Livneh, R. Prywes, O. Kashle, N. Reiss, I. Sasson, Y. Mory, A. Ullrich, and J. Schlessinger, "Reconstitution of human epidermal growth factor receptors and its deletion mutants in cultured hamster cells," J. Biol. Chem. 1986, 261, 12490-12497.)。
これらの結果は、EGF−起因性DMRシグナルが依存しているEGFRであることを示唆した。
結果は、CHO細胞がEGF(CHO細胞がEGFRを表さないという事実と整合した)によってインキュベートされるときに、透明なP−DMRしも、B−DMRもシグナルがないことを示す。
対照的に、EGF刺激作用によって誘発されるP−DMRてN−DMRシグナルは、静止A431細胞のための308および、それぞれ、2.34である。
しかし、非餓死(すなわち、増殖している)A431細胞は、明らかなN−DMRなしで非常により小さいP−DMRシグナルを引き起こした。
これらの結果は、血清細胞増殖培養液がEGFRsの細胞表面発現量に影響を及ぼすという事実を確かめる;
より高い血清培地は、血清がEGFを含むという事実および多くの他の成育因子のために下部の細胞表面EGFR形質発現に結果としてなる。
((3) RTKsにリガンドの効力を決定する方法)
しかし、応答を定義している三大前提パラメータは、透明な傾向を使用するEGFの濃度に表示した。
EGF濃度はより高い、(i)より大きいP−DMRてN−DMRシグナルの振幅にある、断食している人はP−DMRてN−DMR現象および(iii)である(ii)より短い、遷移時間はP−DMRからN−DMR現象へのtである。
P−DMR現象は、細胞機能−関連したおよび他寄与を含む。
考えられる貢献者は、処理、細胞膜invigination、細胞内成分の加入および細胞骨格リモデリングに応答して、そして、より少ない外延(EGF結合)に細胞平坦度を含むが、これに限定されるものではない。
細胞培地および化合物溶液間の溶液拡散および温度差を含む、非細胞機能に関連した現象は、また、解析を複雑にするかもしれない。
それらのため、我々はEGF濃度を有する全体的なP−DMR振幅の合併した類縁を観察した。
P−DMR現象の振幅がEGF濃度を有する合併した類縁を示すときに、N−DMRシグナルの振幅は明らかにEGF濃度に対する飽和性であった。そして、約1.45 nM(図7B)のEC50に結果としてなった。
遷移時間tが、数秒でEGF(図7C)の濃度増大Cによって、指数的に減少するとわかった:
得られた一つの位相減衰定数kはまた、飽和性であった。そして、5.76nM(図7D)のKdに結果としてなった。
結果は、EGF−起因性DMRがシグナルを出す(i)がEGFR活性化に依存していることを示した;
光学バイオセンサが使って、リガンド起因性質量再分布に基づくリガンドの効力がシグナルを出すと決定する(ii)。
((4) 異なる段階でRTKシグナル伝達に影響を及ぼすスクリーニングモジュレータに対する方法)
図41は、異なる条件の下で結合およびDMRシグナルのネット変化を要約する。
その結果は、細胞浸透ダイナミン抑制ペプチド(DIP)(Burke, P., et al., "Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking", Mol. Biol. Cell. 2001, 12:1897-1910)が、全く、N−DMRシグナルを遮断するが、P−DMRシグナルを非常により遅い動態によって僅かに増加させることを示した。
DIPはGTPアーゼダイナミンの浸透する細胞阻害物質であり、エンドサイトーシスを防止するアンフィフィシンとダイナミンの結合を競争的遮断する((Burke, P., et al., "Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking", Mol. Biol. Cell. 2001, 12: 1897-1910)。
これらの目視観測はN−DMRシグナルが受容体転位およびその関連する細胞形態変化を含むことを示唆する。これは、EGF−起因性EGFR内部移行はダイナミンに依存する経路で主に起こって、細胞骨格再配列を含み、活性EGFRsを有するダイナミンの結合はEGF結合の親和性に影響を及ぼすからである。
DIPがある場合の全体のP−DMRシグナルは、DIPの非存在下のものより50%以上超え、P−DMR位相(Cから図6AのDまで)の間、いくつか内面化された活性化EGFRがあることを示唆している。
EGF−境界受容体が急速内部移行のために37℃で細胞表面(約3分)で、比較的短い時間を費やすことは公知である。
加えて、輸送の間、それぞれ形成された被覆ピットおよび平滑ピットEEの48.7%および96.2%、、が細胞表面に戻ってリサイクルすると見積もられた。
すなわち、クラトリン−被覆−ピットによる受容体内部移行は、大多数のエンドサイトーシスを説明するのに十分である。
したがって、被覆−ピットEE小胞による受容体内部移行は細胞内の受容体蓄積の優位な機構である、そして、リガンドが系に存在するときに、これは特に真性である。
ウオルトマニンは、強力(選択的な)である2−4nM(Powis, et al, "Wortmannin, a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase", (1994) Cancer Res. 54 2419)のIC50を有するホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI 3−キナーゼ)の浸透する細胞および不可逆阻害剤。
これは、PLC−ガンマ経路のブロッキングがEGF刺激作用に応答して細胞の両方の現象に影響を及ぼすというわけではないことを示唆する。
PD 98059は、MEKの機能させなくされた形態に結合することによるマイトジェン−活性タンパク質キナーゼキナーゼ(MAPKK/MEK)および行動の特定の阻害物質である。それによって、cRAFまたはMEKキナーゼ(IC50=2−7μM)によってそのリン酸化を防ぐ(Alessi, et al., "PD 98059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo", November 17, 1995, J.Biol.Chem., Vol. 270, No. 46, pg. 27489-27494)。
PD98059によるMAPKKsのブロッキングは、EGF結合におそらくEGFRを有する細胞応答のシグナルおよび持続期間の大きさを減らす。
PP1は、Src−ファミリチロシンキナーゼの強力阻害剤であって、p56lckおよびp59fynT(それぞれ、5および6nMのIC50)を抑制して、更に適度にp38、CSK、PDGF受容体、RETから派生したオンコプロテイン、c−キットおよびBcr−Ablを抑制する(Liu et al, Structural basis for selective inhibition of Src family kinases by PP1", (1999) Chem.Biol. 6, 671)。
その受容体に結合している上皮増殖因子(EGF)によってY 1477でクラトリンH鎖の急速リン酸化が生じる。そして、それはクラトリン会合体を制御しているドメインでうそをつく。
EGFによって媒介されたクラトリンリン酸化の後に、細胞末梢に対するクラトリン再分布が続いて、シグナル伝達EGF受容体(EGFR)によるSRCキナーゼの下流活性化の産物である。
SRCキナーゼを欠いている細胞または特定のSRCファミリキナーゼ阻害物質によって処理される細胞において、クラトリンリン酸化および再分布のEGF刺激作用は起こらない、そして、EGFエンドサイトーシスは遅れる。
これらは、海流観測と整合している。
278, 18902−18913).
GHは、GH受容体(GHR)(サイトカイン受容体超ファミリの細胞表面グリコプロテイン構成メンバ)と相互に作用することによってその深在性の体形成で代謝の調整効果を行う。
最近の研究は、クロストークがEGFRファミリ(表面上異特定の種類のシグナル伝達受容体(それぞれ、チロシンキナーゼ受容体のサイトカイン受容体およびファミリ)の例)のGHRおよび構成メンバの間にあることを示唆する。
GHによって、上皮増殖因子受容体のリン酸化が生じる(EGFR;
ErbB−1)、そして、そのファミリ(ErbB−2)。
このGH−起因性EGFR Yリン酸化は、否定EGFR(キナーゼ活性)以外の、JAK2を必要とすることを示した。
GHによって基礎でEGF−起因性ErbB−2つのチロシンキナーゼ活性化およびYリン酸化の減少が生じる。そして、GHによってそれを描くErbB2の経路に依存するリン酸化がEGFに応答して活性化に脱感作したERKが生じることを示唆する。
蛍光−顕微鏡法研究は、EGFR−シアン蛍光性のタンパク質キメラのEGF−起因性細胞内の再分布がGH共同処理によって著しく減少することを示した。
これは、また、海流観測と整合している(Huang, Y., et al., "Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor (EGF) receptor in 3T3-F442A cells", J. Biol.Chem. 278, 18902-18913)。
((5) AG1478による静止A431細胞起因性のEGF−誘導応答の供与量依存している抑制)
これらのDMR現象が受容体リン酸化、強力および特定のEGFRキナーゼに依存していると同定するために、阻害物質チロホスチン(tyrphostin)AG1478が、使われた。
A431は予め20時間のいかなるFBSのないも培地において飢餓させた。そして、それらが同じ期間(図42A)の0.1%のFBS媒体で飢餓させたより、かなり耐性のP−DMR現象およびより短い遷移時間のための動態に結果としてなった。
1時間の異なる濃度でのAG1478を有するA431細胞の前処理は、EGF−誘導応答の用量依存的抑制において、N−DMRシグナルの振幅がAG1478の機能としてプロットされるときに、典型的阻害を生むことは約194nMのIC50によってカーブする結果になった(図42、そして、b)。
しかし、0.5%のジメチルスルホキシドを有するA431の前処理は、EGF−誘導応答(示されないデータ)に対する少しの影響を有した。
これらのデータは、EGFRキナーゼリン酸化がEGF−起因性DMR変化のために必要なことを示す;
そして、使って光学バイオセンサを使用して得られたDMRシグナルは、測定されるDMR現象で重要な役割を演ずるモジュレータの効力を決定する。
((6) 静止A431細胞の32ナノメートルのEGF−誘導応答上のラス癌遺伝子/MAPK経路モジュレータの効果)
さらに、ERK活性化はEGFR活性化の大域的、陰のシグナル下流を表すようである。そして、それは脱接着(deadhesion)において重要でもよい。
このように、MEK阻害物質U0126、p38 MAPK阻害物質SB203580およびSB20219を含む、Ras−MAPK経路を標的としている阻害物質の効果、そして、JNK阻害物質SP600125は、検査された(図44参照)。
U0126は、かなり後発の時間tを有するP−DMRてN−DMRシグナルの振幅を圧縮した。
これは、MEK1/2の阻害がN−DMRシグナル(前の研究と整合した)を導く細胞離断および運動を防ぐことを示唆する。
しかし、MEK1/2が抑制されるときに、活性EGFRのエンドサイトーシスはまだ起こってもよい。
エンドサイトーシスが細胞離断および運動と比較してセンサ界面から離れて起こるので、エンドサイトーシスはかなり総合応答率により貢献してはならない。
したがって、それらの静止A431の応答がMEK1/2つの阻害物質によって前処理したEGF−起因性は、受容体エンドサイトーシスと整合している。
これは、更に計算のモデリング結果と整合している応答の動態で支えられた。
対照的に、SB203580およびSB20219は不完全な減衰を導くだけだったのに、SP600125はEGF−誘導応答に対するほとんど影響を有しなかった。
これらの結果は、DMRの静止A431細胞EGF模倣において応答がMEKでRaf−MEK経路および収益を含むことを示す。
((7) 静止A431細胞の32ナノメートルのEGF−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果)
A431の前処理の1μMワートマニン(wortmainnin)(強力および選択的PI3K阻害物質)、1μMKT 5720(タンパク質キナーゼAの有力で選択的阻害物質)10μM KT5823(タンパク質キナーゼGの選択的阻害物質)、そして、10μM KN 62(CaMキナーゼIIの選択的阻害物質)は、応答上のほとんど効果を有しなかった。
対照的に、GF 109203x(タンパク質キナーゼCの選択的阻害物質)は応答(図45参照)上の部分音減衰を呈した。
これらの結果はそのタンパク質キナーゼCを示す、しかし、PI3K(タンパク質キナーゼAおよびCaMII)はDMR変化を刺激するためにEGFの機能を変えない。
((8) 静止A431細胞の32ナノメートルのEGF−誘導応答上の細胞骨格モジュレータの効果)
アクチンフィラメント破壊作因(サイトカラシンBかラトランキュリンA)を有するA431の前処理は、全くN−DMRシグナルを破壊して、かなり遅い動態を有する持続性のP−DMR位相に結果としてなった。
2つのトキシンは、異なる機構によってアクチン組み立て分解をかき乱す:
サイトカラシンBはアクチンフィラメントを覆い、そして最終的にアクチンフィラメント脱重合を導く。その一方で、ラトランキュリンAはアクチンモノマーを隔離して、アクチンフィラメント脱重合を生ぜしめる。
しかし、安定させている多因子のFアクチン作因ファロイジンかマイクロチューブル***するものビンブラスチンおよびノコダゾール(示されないデータ)は、EGF−誘導応答に対する少しの影響も有した。
これらの結果は、むしろ、N−DMRシグナルに結果としてなっている細胞の運動がアクチン重合以外のアクチンより先に存在する再構成によらなくて、マイクロチューブル会合体から独立していると同定する。
対照的に、細胞内タンパク質の中で輸送ことはアクチンフィラメントを必要とした時から、P−DMRシグナルは活性受容体に少なくとも部分的に細胞内成分の加入による。
特別な証明は、細胞膜浸透するダイナミン抑制のペプチド(DIPC)の効果から来た。
50でのDIPCを有するA431の前処理μMは、より耐性の動態については以外、サイトカラシンBおよびラトランキュリンAによって前処理されるそれらに、同様応答を引き起こした。
((9) 静止A431細胞の32ナノメートルのEGF−誘導応答上のホスホジエステラーゼ阻害物質の効果)
前の研究は、細胞のコンテクスト上のそのcAMP経路クロストークおよび従属する漸先形の成育因子−刺激されたMAPキナーゼ活性を示した。
ホスホジエステラーゼ(PDE)が細胞のcAMPレベルを管理するので、EGF−誘導応答上のPDEsの役割がPDE阻害物質シロスタミド(cilostamride)、ミルリノン、Ro20−1724、R(−)−ロリプラムおよびザルダベリンを使用して研究されて、(10時に各々μM)。
これらの阻害物質のどれも応答(図47参照)に対する明らかな影響を有しなかった。そして、cAMPが全体的なDMR応答に関係していないことを示唆した。
前の研究は、タンパク質キナーゼAがRaf−1の活性に敵対することができて、このようにPDE活性を調整することによるRas−MAPK経路を管理することを示した。
しかし、静止状態において、細胞Raf−1はPKA阻害物質を知覚しえない構成リン酸化を呈し、これは、PKA阻害物質KT5720(図45)およびPDE4阻害物質Ro 20−1724およびR−(−)−ロリプラム(rolipram)がEGF−起因性DMRシグナルにほとんど遂行しないという我々の目視観測と整合した。
((10) EGF起因性EGFR内部移行、細胞形態変化および室温で、A431細胞(22℃)の指向性質量再分布)
酸ストリップ法を使用している界面−境界テトラメチルローダミン(tetramethylrhodimine)の標識されたEGF(TMR−EGF)を選択的に除去することによって、EGFR内部移行の外延が、検査されて、細胞培養条件に依存しているとわかった。
増殖している細胞のそれらより非常に高い細胞表層で内面化された受容体は、静止状態細胞で見つけられた。
静止状態細胞のEGF−起因性形態学的変化は、定着の後、テキサス赤標識ファロイジン染色によって視覚化された。
前の研究は、37℃でのA431がEGF処理に細胞間マトリックスから時間に依存する屈折率形態学的変化および離断を呈することを示した。
これらの研究と整合して、細胞の端にフィラメントアクチンの端によって示されるように、EGF処理およびこの変化の約15分の後、変化に始まるアクチンリモデリングは、より長い刺激作用でより劇的になった。
((11) 略図は、EGF−起因性DMRシグナル−受容体エンドサイトーシスのための1つの可能な機構を示す)
図49のモデルは、皮質のアクチン細胞骨格がエンドサイトーシスおよび細胞骨格組織の界面で、分子のための潜在的な機能上の役割を関係させているエンドサイトーシスプロセスの異なるステップに関係している方法を表す。
その同族リガンド(例えばEGF)によって、受容体活性化に続いて、受容体エンドサイトーシスにおける三大前提ステップが、ある:
1)エンドサイトーシス機構の間隙の組織。
細胞骨格構造は、エンドサイトーシスのための機構の側方運動性を組織するかまたは強制する。
形質膜の変形および陥入は、細胞骨格で支えられる。
2)、形質膜の基礎をなしている皮質のアクチン障害は、溶かされることを必要とするかもしれない。
アクチン重合はエンドサイトーシス小胞形成および3の間、膜***を駆動するために力を提供する)、Actinポリメリゼーションは彗星テイルを形成することによって細胞原形質に新しく形成されたエンドサイトーシス小胞の運動を進める。
(5.例5−細胞骨格のためのモジュレータをスクリーニングする方法)
結果としてなられた透過化処理された細胞は、細胞内材料(主に可溶タンパク質)の特定の総計を放出する。
しかし、直接結合することによる隔離または細胞骨格構造を有する会合のためにこれらの透過化処理された細胞によってまだとどまる多くの生体材料が、ある。
実は、これらの透過化処理された細胞は、タンパク質合成のような生体細胞の生物学的な機能の多数を保持する。
細胞骨格構造を***させる化合物を有する細胞の処理は、相当に生体材料をこれらの透過化処理された細胞から自由にすることに結果としてなることが可能である。
細胞骨格は、細胞の多種多様活性を実行することに関係している。
それは、抗張力を細胞のために用意することによって細胞形状を維持する。
それも、若干の細胞移動(構造(例えば鞭毛およびシリア)を使用すること)を可能にして、細胞内輸送(小胞および、たとえば、細胞器官の運動)および細胞の***で重要な役割を演ずる。
細胞骨格は、細胞が細胞器官を移動する「軌道」を提供することにシグナルを出していて、輸送細胞内、クロモソームおよび他ものに関係している。
異なる濃度でのサポニンの添加の後、異なる応答は、顕性である。
低濃度で、応答がほとんどない。
サポニンの濃度が約20μg/mlより上にあるときに、続かれる減少されたシグナルが増加応答によってある。
初期の増加するシグナルはセンサの界面上の細胞から平らにすることのために最適でありえる。そして、センサの検知体積内で、質量増加に結果としてなる。
ところが、減少されたシグナルは、細胞からたぶん生体材料の減失を反映する。
他の可能性は、センサの検知体積内で、ネット−減少された質量を導く細胞の成分および/または形態変化の再配列による。
試験される最も高い濃度で、初期の増加するシグナルがない。
逆に、下部の濃度でのそれらより大きい有意な応答を有する減少されたシグナルだけが、ある。
テキサスRed−Xファロイジン(Texas red-X phalloidin)は、きのこ毒複合化から作られるFアクチンのための高親和性プローブである。
テキサスRed−ファロイジンを使用している染色は細胞が浸透することが必要である。そして、ホルムアルデヒド固定の後、一般にされる。
これは蛍光性のファロイジン結合が大部分の生体細胞に透過性でないという理由からである。但し、非標識のファロイジンは細胞の膜を通す。
サポニンの高濃度で処理される細胞内部の強い蛍光は小孔形成を示す、そして、細胞は浸透する。
この研究に基づく、67のug/mlでのサポニンの濃度は、化合物スクリーニングのために選ばれた。
結果は、これらの化合物が主に4つのカテゴリに分類され得ることを示す:
N−DMRシグナルの増加する動態および振幅によって証明されたように、生体材料の増加する減失が生じる(i)化合物(例えばサイトカラシンB);
サポニン−誘導応答に対する影響を示さない(ii)化合物(例えばダイナミン抑制のペプチド、ブレフェルジンA);
より長い時間の後の類似した全体の変化については以外、サポニン−処理された細胞の生体材料の減失を遅延させる(iii)化合物(例えばファロイジン);
そして、細胞から生体材料のサポニン−起因性減失を遮断する(iv)化合物(例えばビンブラスチン)。
これらの目視観測は、これらの化合物の周知の性状と整合している。
サイトカラシンBは、会合体を防いでいるアクチンフィラメントをおおって、アクチンフィラメントの最終的に動的性質のために、アクチンフィラメント脱重合を導く。
対照的に、ファロイジンはFアクチンに結合して、アクチン重合を進める。
ビンブラスチンは、チュービュリンを結合することによるマイクロチューブル会合体を抑制して、螺旋会合物の自己会合を誘発する。
ダイナミン抑制のペプチド(DIPC)およびブレフェルジンAは、アクチンまたは他フィラメントに対する非結合剤である。
これらの結果も、否定他フィラメント以外の、アクチンフィラメントが生体高分子のための引っ込んだ部位で最も多くのものを提供することを示唆する。
これは、利用できる限られた蛍光解像力によることが可能である。
しかし、ファロイジン−前処理された細胞は、かなり下部の染色を引き起こす。
これは、非標識のファロイジンが標識付加のファロトキシンによってFアクチン染色を遮断するという理由からである。
(6.例6−標識フリー光学バイオセンサを用いたGタンパク質共役型受容体(GPCR)細胞分析を実行するためのシステムおよび方法)
ここに開示されるように、これらの転位は光学LIDバイオセンサ表面に配置できる。
図52−60に示される特定のデータは、コーニング(Corning)社によって製造された光導波路グレーティングセンサシステムおよびLIDマイクロプレート(Nb2O5プレート)を使用して、得られた。
図52は、光学LIDシステム1000によって測定された、チャイニーズハムスター卵巣細胞1008(CHO細胞1008)内の作動薬誘発性応答を示すグラフである。
CHO細胞1008は、ベータ−アレスチンやGRKのみならず、ベータアドレナリン受容体、アルファ2−アドレナリン受容体、P2Y受容体をも内在的に発現することが知られている。
また、ムスカリン受容体は、CHO細胞1008において非常に低いレベルで内在的に発現されることが知られている。
この実験では、複数の光学LIDバイオセンサ1014からなる配列を含むマイクロプレートの各ウェルの中には、約5×104個のCHO細胞1008が入れられた。
次いで、CHO細胞1008が基板上面1010に対して確実に付着性を有するように、24時間の間、CHO細胞1008は150μlの血清媒体内で培養された。
グラフには、検査済みの4種類の化合物に対するCHO細胞1008の光学的応答が示されている。
これら4種類の化合物は、(1)P2Y受容体に対する作動薬であるATP(100μM)、(2)アルファ2−アドレナリン受容体に対する作動薬であるクロニジン(10μM)、(3)ベータアドレナリン受容体に対する作動薬であるエピネフリン(100μM)、(4)ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンM(10μM)、である。
ムスカリン受容体は、CHO細胞1008の中で非常に低いレベルで内在的に発現されるので、ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンMは調整機能を果たす。
各ウェルには血清媒体が入れられており、上記の4種類の作動薬はそれぞれ異なるウェルに直接的に添加された。
その後、光学LIDシステム1000によって光学的応答が収集された。
オキソトレモリンMは、ほとんど細胞応答を誘発しなかった。
図53によれば、プロセスの最終段階の動態解析により、3つの作動薬(ATP、エピネフリン、クロニジン)の全てについて類似の緩慢なプロセスに至ったことが明らかである。
図16に示されるステージ3での変化は、これら作動薬によって引き起こされたものであり、図12のグラフが示すものである。
このような類似の変化は、GPCR転位について必須成分であるベータ−アレスチンがCHO細胞1008内の制限因子であるという事実を反映している可能性があり、これは、クラスリン被覆ピットのサイズとベータ−アレスチンのサイズとが似たサイズであるという事実を与えるものである。
図55は、導波路バイオセンサ1004上の生体CHO細胞1008における単分子膜のリガンド依存性かつ時間依存性の応答量を表す実験結果を示すグラフである。
作動薬としては、(1)クロニジン、(2)オキソトレモリンM、(3)NECA、および、M1受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
作動薬としては、(1)クロニジン、(2)オキソトレモリンM、(3)NECA、および、M1受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
図57は、導波路バイオセンサ1004上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ1(M1 CHO)を有する場合と(CHO)を有しない場合とについて、生体CHO細胞1008における単分子膜の応答量のリガンド誘発性変化の総量を表す実験結果を示すグラフである。
図52と図54〜図56に示した結果は、(1)CHO細胞とM1−CHO細胞の双方で発現したアルファ2−アドレナリン受容体が存在して、これらの作動薬(クロニジン)が質量再分布シグナルを誘発し、
(2)CHO細胞では、比較的低レベルあるいは無視できる程度のM1受容体が発現した一方で、M1−CHO細胞では、高レベルのM1受容体が発現したが、その理由として、拮抗薬(テレンゼピン)ではなく、作動薬(オキソトレモリンM)がM1−CHO細胞内で極めて大きな応答を引き起こしたことが挙げられる。
実験結果は、DIPを有する細胞の前保温・培養処理が、双方の細胞株でオキソトレモリンM誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、オキソトレモリンM誘発性の質量再分布がダイナミン依存性を持つことを示唆している。
このようなダイナミン依存性は、作動薬誘発性のGPCR転位の大部分で共通の性質である。
実験結果は、DIPを有する双方の細胞株の前保温・培養処理が、クロニジン誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、クロニジン誘発性の質量再分布もダイナミン依存性を持つことを示唆している。
実験結果は、DIPを有する双方の細胞の前保温・培養処理がNECA誘発性応答に若干影響を与えたことを示しており、これは、NECAが、ダイナミンに依存しない経路を通じて双方の細胞株で質量再分布シグナルを引き起こしたことを示唆している。
図61は、静止A431細胞の付着層内でGPCR作動薬−起因性指向性質量再分布の結果を示す。
三つのGPCR作動薬、ブラジキニン(100nM)、カルバコール(10μM)、および、クロニジン(1μM)は、EGF(8nM)によるその起因性と比較すると、静止A431細胞の誘導された時間依存応答である。
(F) GPCR作動薬−およびEGF−誘導応答に関する10μMAG1478でのA431の前処理。
EGFRがシグナル伝達系の臨界的な下流の要素であるとわかった。そして、***促進のGタンパク質共役型受容体(GPCR)、サイトカイン受容体、インテグリンおよび膜−脱分極性応力−誘導している作因によって使用されるそれらを含んだ。
前の研究は、A431が内生的ににブラジキニンB2受容体、ムスカリニック受容体およびα2−アドレナリン作用性受容体を表すことを示した。
GPCR作動薬、ブラジキニン、クロニジンおよびカルバコールを有する静止A431の刺激作用は、2つの異なるDMR応答曲線の結果を示した。
カルバコールおよびクロニジン刺激作用は、EGFの低濃度(2−8nM)によって、それらの起因性としてほとんど同一の特徴を有する応答を導いた。
期待されるように、処理前の10でのAG1478を有するA431のμMは、全くN−DMR位相を破壊して、かなりP−DMR位相の動態を減らした。
対照的に、ブラジキニン刺激は極めて速いP−DMR位相(100秒以内で)および非常により短い遷移時間tに結果としてなる。
AG1478を有するA431の前処理は、部分的に応答を減らすだけである。
(i)他によるそれらの前の研究を有する整合した、GPCR作動薬を有する刺激作用はそうしてもよい特定の細胞のコンテクストに依存する異なる機構によるRas−MAPK経路を有するクロストーク、GPCR作動薬−起因性EGFRトランスアクチベーションはRas/MAPK活性化の結果としてなられたシグニチャを使用して検査され得る。(2)GPCR作動薬−引き起こされるEGFRトランスアクチベーションがEGF刺激作用として比較できるDMRシグナルを導くので、その天然型生育環境の内因性の標的GPCRに対して、GPCRシグナル伝達およびスクリーニング作動薬および拮抗薬を研究するように、トランスアクチベーションはシグナル伝達増幅機構として作用する。
異なるGPCR作動薬に応答するDMR応答の異なる動態は異なるGPCRが異なる機構によるRas/MAPK経路をトランスアクチベート(transactivate)することを示す。そして、おそらく受容体が結合したGタンパク質および細胞コンテクストに依存する。
EGFRファミリの構成メンバは、細胞質のチロシンキナーゼドメイン、単一の膜貫通領域およびリガンド結合および受容体二量体化に関係している細胞外のドメインを含む。
EGFRに対するリガンドの結合は、ホモダイマの発生または他ファミリを有する受容体のヘテロダイマを導く。
各々のdimericな受容体複合体は、異なるSrc相同2(SH2)を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める−エフェクタタンパク質を含む。
二量体化は、下流の細胞のシグナル伝達経路の多種多様アレーを始める自動的にリン酸化の結果となる。
接着体タンパク質(Grb)を有する活性EGF−Rダイマー複合体は、解離因子(SOS)をグアニンヌクレオチドに結合した。
複合体がそうするGrb−SOSも、直接受容体のまたは間接的にShcによるホスホチロシン部位に結合する。
これらのタンパク質相互作用はRasに近い接近にSOSをもたらす。そして、Ras活性化を考慮に入れる。
これは、その後、順番に、遺伝子形質発現を進めて、細胞増殖に貢献する転写因子(例えばc−fos、AP−1およびElk−1)を活性化するシグナル伝達経路ERKおよびJNKを活性化する。
EGF =上皮増殖因子、EGFR =上皮増殖因子受容体、Shc=src相同ドメインコンセンサス、grb2 =生長因子受容体−境界タンパク質2、sevenlessのSOS =哺乳動物息子、Raf=RasII活性化II因子、MEK=MAPキナーゼキナーゼ、MAPK =マイトジェン活性タンパク質キナーゼ(PI3K =ホスファチジルイノシトール3』キナーゼ(PIP2 =フォスファチジルイノシトール3,4)(ジホスフェート、PIP3 =フォスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェート、PLCg=フォスフォリパーゼ(g、DAG =ジアシルグリセリン、IP3 =イノシトール3,4,5トリホスフェート、PKC =タンパク質キナーゼC)))。
図61 GPCR作動薬において、誘導されたEGFRトランスアクチベーションは、示される。
受容体チロシンキナーゼのGPCR−刺激されたトランスアクチベーションによるSrcファミリキナーゼの活性化。
GPCRおよび受容体チロシンキナーゼ間のクロストークの最もよく理解されている機構は、リガンド(例えば膜関連のADAMファミリMMPsのHB−EGF、以下の活性化)のGPCR−刺激されたタンパク質分解性放出を含む。
TransactivatedされたEGF受容体(EGFR1/2)はShcおよびGrb2/mSos複合体を入れる。そして、それらがRas活性化複合体のGPCR−起因性会合体のためのプラットフォームとして役立つ。
EGF受容体のトランスアクチベーションは、cRaf−1、MEK1/2、多数系のERK1/2 MAPキナーゼカスケードのGPCR−刺激された活性化を説明する。
Srcファミリキナーゼは、EGF受容体活性化に応答して活性化されて、GPCRシグナル伝達のこの種類の決定的なdownstreamroleを演奏する。
なお、添加若干の証明が、特にGβgサブユニット−依存している経路において、SrcがGPCR−刺激されたMMP活性化の不十分によく理解されているプロセスで、役割を演ずることを示唆するにおいては、
(7.例7−多モード検査法)
(ここに異なるバイオセンサの討論参照)。
例は、案内多層の、そして、回折グレーティングの組み合わせの中で、概してバイオセンサ(グレーティング結合器センサ)からなる。
概して、4つの層導波路バイオセンサは、薄膜、しかし、それ以上より低い屈折率(ns)(例えば屈折率約1.50を有する1737ガラス、コーニング符号)の基質上のdF(例えば屈折率約2.36のNb2O5)の厚さを有する高屈折率(nF)材料の薄膜からなるカバー培地に屈折率約1.35(nc)を有する生物学的な溶液にある。
基質は、基質側面から光入射を許可するために好ましくは透明である。
生物学的製剤(屈折率約1.4(nA)および厚さdA.については、導波薄膜に固定される)の付着層
固定される生物学的製剤としては、挙げられるが、これに限定されるものではない(抗体)テスト、受容体、ペプチド、バクテリオファージ、「単一の要素をもつ」DNA(RNA)−切片、遺伝子、遺伝子切片、標的、タンパク質、結合タンパク質、酵素、阻害物質、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アレルゲン、病原、炭水化物、メタボライト、ホルモン、有効成分、低分子量を有する分子、脂質、シグナル、細胞およびバクテリア。
レーザは角度を変化させることで導波路を照らす、そして、光は導波モードの実効屈折率によって決定される特定の角度だけで、導波路に結合される。
結合されるレーザ光線は、界面に隣接して液体の電磁場をつくっている導波薄膜の平面の界面に、平行を伝播する。
2つの条件が果たされることを必要とする場合、所定モードタイプは導波波だけとして広がる:
導波薄膜の屈折率が少なくとも1%、周囲の基質より大きくて、培地の屈折率をカバーするために有する(a);
そして、導波薄膜の厚さは異なる値より大きい(2)、カットオフ厚さdCを呼ぶ。
バイオセンサはマイクロプレートと関連して、各ウェルが少なくとも一つの導波路グレーティング構造を含む。
検体が標識をつけられるときに、傾向、例えば、付けられる部分、検体が発するいずれにでもおいて、それは蛍光、化学発光、バイオ発光、リン光または光(広いおよび/または狭い励起スペクトルを有する)または化学物質/電気化学的活性化を有する励起上の電子発光と標識をつけられる。
被検体が標識をつけられないときに、それが固定されたプローブ分子のsite(s)を結合している特性に結合する標識をつけられた結合パートナーは親和性が基準リガンドとして使われるように要求した。
基準リガンドは、プローブ分子に対して被検体の相対活量または親和性を決定するために用いる。
プローブ分子に対する基準リガンドに対する被検体の基準リガンドまたは競争的結合の結合の標識に依存する検出は、色の変化に基づく((例えば蛍光、化学発光またはバイオ発光、リン光、または電子発光、その他)。
第1の方法において、導波路グレーティング基質は、導波薄膜内の光を伝播して、同時に、固定されるプローブ分子の側を通しているエバネッセント波を生成するために用いる。
標識をつけられた分子および導波薄膜界面間の距離に依存している異なる効率については、通されたエバネッセント波は、標識をつけられた被検体または標識をつけられた基準リガンドの励起に結果としてなる。
標識をつけられた分子は、界面により近ければちかいほど励起の効率も向上する。
特に、エバネセント場励起は、全ての平らな導波性界面に沿って、界面−境界蛍光団の強化された励起確率/効率を提供する(Budach, W.; Abel, A. P.; Bruno, A. E.; Neuschafer, D.; "Planar Waveguides as High-Performance Sensing Platforms for Fluorescence-Based Multiplexed Oligonucleotide Hybridization Assays" Anal. Chem. 1999, 71(16): 3347-3355. and Edmiston, P. L.; Lee, J. E.; Wood, L. L.; Saavedra, S. S. "Dipole Orientation Distributions in Langmuir-Blodgett Films by Planar Waveguide Linear Dichroism and Fluorescence Anisotropy" J. Phys. Chem.1996, 100: 775-784.)。
これはコンフォーカル顕微鏡検査に基づく発光検出原理とは対照的にある。ここで、光源は画定された体積要素に集光され強い局所電界(すなわちエピ蛍光)を導く。
これをすることによって、導波路グレーティング構造は、次の2検出のためのコア構成要素になる。両検出の一方は、センサー界面での特定の分子吸着によるエバネセント場の伝搬培地の屈折率変化に基づく標識に依存しない検出であり、他方は、色変化(強度、強度分布、全反射蛍光強度、その他)に基づく標識に依存する検出である。これらは優れた感度を提供する。その理由は、エバネッセント波が標的の標識の有無にかかわらず標的またはその複合体の距離の増加に応じて指数的に減衰する事実にある。
ユニーク構造(例えば、グレーティング構造、期間、深度、導波薄膜の性状および厚さ、センサの構成、その他)を有する所定のセンサは、特定波長のレーザが正常な角度の近くででセンサに結合され得る傾向がある。
この正常な角度結合(直角)は細胞検出に好適であり、細胞が培地で覆われ同様に大部分の液状処理装置が直角で液変化を選ぶからである。
しかし、一般に励起蛍光分子は、波長の特定の範囲を有する特定光源を必要とする。
たとえば、Cy3は530−560nmの範囲である励起光を必要とする。
DMRシグナル同様に同じ光源を使用する蛍光を検出するために、センサは同一光源と導波路との結合を許すように構成しなければならない。
このように、伝播された光のエバネッセント波は、侵入深さまたは検知体積内で蛍光分子を刺激するために用いることが可能である。
このアプローチは、導波路センサ設計に関し厳格さを緩和し、広範囲にわたる異なるセンサ設計に適用され得る。
(8.例8−A431細胞中の内存性GPCRの同定)
GPCR作動薬のパネルと協力してRWGバイオセンサを使用している内存性GPCRの活性化で媒介された静止A431細胞のDMRシグナルを調査すると、受容体が結合されるGタンパク質(すなわちGq、GsおよびGi)に基づく、ユニークなDMRシグニチャが、GPCRの各々のクラスのために同定された。
DMRシグナルは、作動薬の供与量および内存性受容体の発現量に依存していた。
DMRシグナルの一方のタイプから他方に対する用量依存的スイッチングは、GPCR作動薬の小さいセットのために観察された。
ネットワーク相互作用およびGPCRシグナル伝達の調節をマッピングする能力があると共に、標識フリーでかつ非侵入的なバイオセンサは、リアルタイム動態力学的計測を可能にする。そして、このようにそれらがGPCR薬剤発見およびデオルファナイゼーション(deorphanization)のために使われる。
GPCRは、心血管で、呼吸で、胃腸で、神経学上で、精神医学で代謝無秩序のような主要な疾患の現像およびプログレッションに関係した。
GPCRは、ヒトゲノムのdruggableな標的の単一の最大のファミリを表して、GPCRが2000の販売の600億ドル以上を有する現在の薬剤標的の約50%を説明するという事実で示すように、小分子薬剤発見のための最も産生的な領域であることを証明された。
現在のGPCRに基づく薬剤がほぼ200の周知のGPCRの約25%を標的として、約140新しく分類された孤児のための受容体でそこであるだけのことを考えれば、GPCRは十分な機会を薬剤発見に対して提供する標的クラスである。
作動薬によって媒介されたGPCRの活性化はそれらの関連するGタンパク質および他調節タンパク質を有する動的な相互作用の引き起こす。そして、それは細胞内反応のカスケードを支配する。
GPCRは三基に分割され得る。そして、それらの被結合Gタンパク質亜タイプ:Gq、GsおよびGiによって特徴づけられる。
概してGPCRで媒介されたリガンド起因性細胞現象は、受容体コンフォメーションおよびオリゴマー形成状態と共に始まる。そして、シグナル伝達活性化Gタンパク質活性(Gαサブユニット上のGDP−GTP交換、GαおよびGβγ脱会合、受容体からのGタンパク質デカップリング、Gα−の生成およびGβγ−シグナル伝達複合体)、並びに、二次メッセンジャ生成(Ca2+可動化、イノシトール三リン酸(inositoltriphosphate)生成および/または細胞内のcAMPレベル転形)を導く下流シグナル伝達、が続く。
その後、GPCRシグナル伝達は、エンドサイトーシスによる細胞表面から特性遺伝子の形質発現およびGPCRの脱感作まで至る;そのいずれかの多数が多数の細胞内のタンパク質の中で動的輸送を巻き込む。
最終的に、フェノタイプ、形態および標的細胞の物性は、変えられる。
シグナル伝達および調節性機構は、一般に細胞応答を支配するタイムリで正確に管理された作用をする。
その結果、シグナル伝達ほとんどすべてのGPCRは、細胞の内容物の動的再分布がシグナル伝達サイクルの間、命じられて、管理されるという感覚において共通である。
細胞の内容物の動的な再分布をモニタすることは、GPCRシグナル伝達の洞察およびGPCRスクリーンのための強力な手段を決意しなければならない。
(a) 材料および方法)
((1) 材料)
A−77636、BRL 54443、クロニジン、エピネフリン、ジマレート(dimaleate)HTMT、イソプレンターノル(isoprenternol)、オキソトレモリンM、オキシメタゾリンおよびSKF38392は、Tocris Chemical社(セントルイス(MO))から得られた。
Fluo−3は、分子プローブ(Molecular Probes)(ユージン(OR))から得られた。
アンギオテンシンII、apelin1−17、apelin1−13、ボンベシン、ブラジキニン、DAMGO、ダイノルフィンA、endothelin−1、ガラニン、GLIGKV−アミド、GLIGLR−アミド、グルカゴン、a−メラノサイト刺激的ホルモン(a−MSH)、モチリン、ニューロキニンA、ニューロメジンN、ニューロペプチドY、ニューロテンシン、nociceptin、SFFLR−アミド、P物質、ウロテンシンIIおよびYFLLNRP−アミドは、Bachem(プロシアの王(PA))から得られた。
コーニングEpic(登録商標)TMの96ウェルおよび384ウェルバイオセンサマイクロプレートは、コーニング社(コーニング(NY))から得られ、使用の前に6分のための高強度性紫外線(UVO−洗浄剤、Jelight社会社、ラグーナヒルズ、CA)照射によって洗浄した。
10%のFBSを含んでいるDMEM培地が96ウェルマイクロプレートの中で各々よく置かれた200mlにおいて、3−5経路での約3〜7.5×104細胞は、停止した。
細胞増殖培養液が384ウェルマイクロプレートの中で各々よく置かれた50mlの同様に約1〜2×104細胞。
細胞接種の後、約95%密集度に達する(約2−4日)まで、細胞は空気/5%のCO2の下で37℃で培養された。
((2) Fluo−3−Ca2+可動化アッセイ)
細胞はそれから緩衝液によって二回洗浄された。そして、2.5mMのプロベニシドを含んでいる1×100mlのHBSSによって維持された。
アッセイは100mlのGPCR作動薬溶液を細胞プレートへ移すことによって始められた、そして、カルシウムシグナルは、HTS7000バイオアッセイリーダ(PerkinElmer Life Science, Boston, MA)を使用して、6秒の間隔で、6分以上記録された。
アッセイは、光学検知データを有する直接タイプ比較を許すために室温で、実行された。
(3) 光学バイオセンサが分析する動的質量再分布(DMR)
特別ないくつかの作用が取られ、不必要な効果を最小にした。
第1に、バルク屈折率変化を最小にするために、化合物溶液が導かれるときに、いかなるプロベネシドのないも1×HBSS緩衝液は全ての化合物を希釈するために用いたのに、DMEM緩衝液は細胞を飢餓させるために用いるだけだった。
第2に、速く定常状態に到達するのと同様に、細胞応答を容易にするために、細胞を有するセンサプレートが室温で、系に置かれるときに、細胞は予め持続性の期間(概して20±2時間)のいかなるFBSのないもDMEM緩衝液によって飢餓させた、そして、静止性細胞がいかなる洗浄液のないもアッセイのために直接使われた。
第3に、全ての化合物溶液のDMSO濃度は0.05%以下まで最小にされた。但し、DMSOのより高い濃度が開示されたアッセイにおいて使われる。
その後、細胞を含んでいるセンサマイクロプレートは光学系に配置された、そして、細胞応答は室温で、溶液の添加の前後で記録された。
化合物研究のため、50μlのGPCR作動薬溶液が導かれる前に、各ウェルの細胞が50μlの化合物溶液即ち1×HBSSによって安定した位相(すなわち明らかな質量再分布でない)まで前処理された。安定した位相は(一般に1時間内で)達した。
全ての研究は、温度変動および蒸気化冷却の効果を最小にするために、溶液が導かれた短い期間(約数秒)の除外上のマイクロプレートの蓋を有する室温で、実行された。
ここに示される応答のユニットは、CCDカメラによって撮像された各センサの共鳴バンドの中央位置の画素の変化であり、1ユニットは実験的な正常化プロトコルに基づいて約5.82×10−4の屈折率に等しかった。そして、正常化プロトコルはグリセリンおよびジメチルスルホキシドの濃度に依存する応答を使用する。
ここに開示されるように、他ユニットがパラメータおよびアッセイの必要を作動することに基づく決定され得ると理解される。
(b) 結果および討論)
((1) A431細胞の内存性GPCRおよびそれらのシグナル伝達)
GPCRの多くの他の異なるタイプに対して、周知の作動薬の小さいライブラリを使用しているランダムスクリーニングと協力して、アプローチは主にA431の周知の内因性の受容体に基づいた。
特定のGPCRが受容体が結合されるGタンパク質の複数のタイプによる、そして、他の非Gタンパク質シグナル伝達経路にさえよるシグナルを変換してもよいことは非常にあり得る。
他によってされるRT−PCR研究は、他研究がP2Y2がまた、内生的に発現されることを示唆したにもかかわらず、A431が内生的ににP2Y受容体(P2Y1(比較的低く)、P2Y4、P2Y6およびP2Y11)の少なくとも4つのファミリを表すことを示した。
ほとんど何も、A431のH1受容体のシグナル伝達経路に知られていない。
面白くA431.の内因性のGi−共役型受容体のための文献記録でほんの少しであるだけにある
1つの例は、A1受容体である。
LPA1が主にGi経路によるシグナル伝達を導くことは公知であるにもかかわらず、いいえがあって、あらゆる文献A431.のLPA1のシグナル伝達機構のための記録
((2) A431の内存性GPCRの活性化の光学シグニチャ)
用量依存的および動態力学的応答は、記録されて、分析された。
典型的運動の計測において、作動薬による各々のセンサ起因性の共鳴性光の角のシフトは、リアルタイムにおいてモニタされて、時間の関数として、プロットされる。
増加するシグナル(P−DMR)は、検知体積(約120nm)内で、生体分子の総計の増加を意味する;
逆に、減少されたシグナル(N−DMR)は、検知体積内で生体分子の総計の減少を意味する。
検知体積(また、侵入深さとして公知の)は導波薄膜内の被結合光の固有特性である。そして、それは細胞層および培地に達しているエバネッセント波をつくる。
図63aに示すように、光学シグニチャの第一類は2つの主要な位相を呈した−急速を有するP−DMR位相はゆっくり減衰するシグナル(図63aのCに対する点B)を有するシグナル(図63aのBに対する点A)および次のN−DMR位相を増やした。
光学シグニチャのかかるタイプに結果としてなる作動薬は、B2受容体作用薬ブラジキニン、P2Y受容体作動薬ATPおよびPAR作動薬トロンビン(トリプシン)を含むGLIGLR−アミド、GLIGKV−アミドおよびSFFLR−アミド。
Fluo−3を使用している従来のCa2+可動化アッセイは、細胞のFluo−3の蛍光強度の変化によって測られるように、これらの作動薬の全部が細胞内のCa2+レベルの用量依存的***の引き起こすことを示した。
ブラジキニンによって媒介されたA431応答のための細胞の機構の詳細な解析と共に、これらの結果はかかる光学シグニチャがGq−共役型受容体の活性化に帰されることを示唆した。そして、それは速いCa2+可動化および下流シグナル伝達現象を導く。
多くの場合、ゆっくり減少されたシグナルおよび小さい振幅を有する初期位相がある。そして、それは作動薬溶液(図63bのBに対する点A)の導入の直後に起こる。
一般に初期位相を完了する時は、化合物溶液(約数秒)の導入によるそれらの起因性より非常に長い。
化合物溶液が添加されるときに、化合物溶液およびDMEM培地間のマッチしない屈折率はもしあればバルク屈折率変化に関する速い位相に結果としてなる。
光学シグニチャのかかるタイプに結果としてなる作動薬は、b2作動薬エピネフリンおよびisoprenternol、並びにA2AおよびA2B作動薬NECAを含む。
従来のCa2+可動化アッセイは、これらの作動薬の全部が細胞内のCa2+レベル(示されないデータ)のいかなる有意な変化もの引き金を引かないことを示した。
一方、2つのアデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンおよびNKH447のどちらでも、いずれのb2またはA2作動薬(図64)にもよるそれらの起因性に対する同様である光学シグニチャに結果としてなった。
両方の化学薬品は、cAMP(Gs−共役型受容体シグナル伝達の二次メッセンジャ)の細胞内のレベルの増加を導くアデニル酸シクラーゼを活性化することは公知である。
10μMのフォルスコリンまたはNKH447を有する静止状態細胞の前処理は完全にエピネフリン(図65)によって媒介されたDMR応答を破壊した。そして、両方の化合物がこれらの作動薬を有する同じ下流シグナル伝達経路を共有している細胞応答に結果としてなったことを示した。
これらの結果はかかる光学シグニチャがGs−共役型受容体の活性化に帰されることを示唆した。そして、それは細胞内cAMPおよび下流シグナル伝達現象の蓄積を導く。
周知の内因性のGPCRを標的とするこれらの作動薬の中で、約500nMの下の供与量でのLPA受容体作用薬LPAだけは、かかる光学シグニチャに結果としてなった。
また、かかる応答の引き金を引いた他作動薬は、MC受容体a−MSHを含む。
かかる光学シグニチャはGi−共役型受容体の活性化に帰され得る。それはGs−共役型受容体と同様に驚かない類似を共有するからである。
GiおよびGsシグナル伝達は、対立するの方法の細胞内cAMP以外の転形を導く。
各々の作動薬は1nMおよび10μM間の5つの異なる供与量で、概して検査された、そして、少なくとも2つの独立実験は結果を確実にするために実行された。
このカテゴリに分類される作動薬は、A−77636、SCH23390およびSKF38392(DRD1)(アナンダミド (CNR1およびCNR2))を含むAngiotensin II(AGTR1)、apelin 1−17およびapelin 1−13(AGTRL1)、BRL 54443(HTR1E/F)、クロニジン、そして、UK14304(ADRA2A、BおよびC)(DAMGOおよびダイノルフィンA(OPRM1およびOPRK1))endothelin−1(EDNRAおよびEDNRB)、ガラニン(GALR1およびGALR2)、グルカゴン(GCGR)、インターロイキン−8(CXCR1)、IP−10(CXCR3)、モチリン(MOTR)、P物質(TACR1)、ニューロキニンA(TACR2)、ニューロメジンN、そして、ニューロテンシン(NTSR1)(ニューロペプチドY(NPY1、2、4、5、6R))nociceptin(OPRL1)、オキシメタゾリン(ADRA1A)およびウロテンシンII(GRP14)。
これらの作動薬の標的とされた受容体は、括弧において示された。
その少しも有意でないDMRシグナルは、A431細胞のそれらの対応する受容体のいいえまたは比較的低い発現量がある示されるこれらの作動薬から結果になった。
小さいDMRシグナルは、内存性CXCR1のその比較的低いレベルがA431細胞において表されることを示唆されるIL−8つの刺激作用(示されないデータ)から生じた。
他の可能性は、IL−8の低構成する分泌がA431細胞からあるということである。
Fluo−3つのアッセイは、ボンベシンが20±5%の細胞内のCa2+レベルの最大増加を導くことを示した(n=5;
示されないデータ)(ボンベシンがGq−シグナル伝達の引き起こすことを示唆すること)。
予想されるように、それらがブラジキニンによって媒介したより、非常に小さい振幅については以外、ボンベシンを有する静止A431の刺激作用が用量依存的Gq−タイプ光学シグニチャ(示されないデータ)を導いて、ATP、または、PAR作動薬のどちらでも。
明らかなIC50が、ほぼ1nMであるとわかった。
ボンベシンによるDMRシグナル起因性の小さい振幅は、A431のBRS1の比較的低い形質発現を提案した。
((3) A431の内存性GPCRを活性化する作動薬効能の決定)
場合によっては複数のサブファミリ受容体がA431において内生的に発現される、そして、特定の作動薬が異なる効能を有するサブファミリ受容体の多数を活性化してもよいので、作動薬溶液の5×濃度系はまず最初に細胞応答を検査するために用いた。
ほとんどの場合、作動薬溶液の2倍濃度系は、よりはるかに正確に作動薬のEC50値を決定するために用いた。
DMRシグナルの振幅は、作動薬濃度の関数として、プロットされて、EC50を算出するためにPrismによって分析された。
ほとんど同一のEC50の作動薬濃度結果の関数としてのP−DMRてN−DMRシグナルの振幅の解析から、P−DMRシグナルだけはプロットされた、そして、作動薬の結果効能は議論された。
全ての飽和曲線はウェルに1−結合部非線形回帰を付けた。そして、明らかなEC50を導いた。
明らかなEC50値が、2.2±0.6μM(n=3)、10.0±1.2nM(n=3)およびATP、ブラジキニンおよび、それぞれ、トロンビンのための9.6±2.0ユニット/ml(n=3)であるとわかった。
割に、これらの作動薬のEC50値が、また、Ca2+フラックスアッセイ(示されないデータ)を使用して決定されて、光学バイオセンサアッセイによって得られたそれらと整合しているとわかった。
細胞外のATPは、イオンチャネルタイプP2XおよびGタンパク質−被結合P2Y受容体の強力作動薬であることを示した。
RWGバイオセンサがイオンよりむしろ細胞の生体高分子の再分布に、最も知覚しうる、そして、ATPによって媒介された光学シグニチャがブラジキニンおよびPAR作動薬によるそれらの起因性に対する同様であるので、内因性のP2Y受容体が主にATPによってDMRシグナル起因性を説明することを論じられた。
一方、B2、しかし、否定B1受容体は、ブラジキニンの大部分の生理学的で病態生理学的作用のためのA431およびB2受容体会計において内生的に発現される。
トロンビンはPAR1のための作動薬である、そして、SLIGLR−アミドおよびSLIGKV−アミドはPAR2−特性作動薬である。
しかし、SFFLR−アミドおよびトリプシンは、明白にPAR1およびPAR2を活性化する。
ここで、ゆっくり増加するP−DMRシグナルの振幅は、作動薬濃度の関数として、プロットされた。
それぞれ、明らかなEC50値は、NECAおよびエピネフリンのための21.5±1.2nM(n=3)および6.0±1.4nM(n=3)に分かった。
NECAは、A2A、A2Bおよび、それぞれ、20、330および14nMの親和性を有するA1受容体のための作動薬である。
A431.を含んでいるいくつかの細胞株を有する活性が記載されていたアデニル酸シクラーゼ上の作用の反対側の共存しているA1およびA2アデノシン受容体
A431において、Aは低薬量(<約10μM)がA1受容体によるコロニー形成の阻害を産生した二相の応答を呼び起こした、しかし、より高い濃度(最高100μM)は次第にA2受容体によるこの阻害を逆転させた。
かかる二重効果は、このように逆数コントロールおよび微調整のための機会にシグナル伝達経路を与える。
NECAがA1およびA2Aに同様親和性を有するので、NECAによる光学シグニチャ起因性はGsシグナル伝達が支配されることを示した。
A1に更に効果、アデノシンアミンコンジナ(ADAC:Adenosine amine cogener)、0.85、210および285nMの親和性を有するアデノシン受容体選択的作動薬を同定するために、A2AおよびA3受容体が、それぞれ使われた。
我々は、特にADACの高用量に興味があった。
結果は、高用量(>50nM)で、3.7±1.1μM(n=3)の明らかで効果的EC50については、ADACが用量依存的方法の典型的Gs−タイプ光学シグニチャを刺激したことを示した。
一方、A431が内生的ににb2受容体(細胞につき約40,000コピー)の高量数を表した時から、観察されるエピネフリン−起因性DMRシグナルは活性化b2に対する特性である。
エピネフリンは、5−20nMのEC50を有するb2に結合する。
ここで、2つのP−DMR現象の全体の応答は、作動薬濃度の関数として、プロットされた。
明らかなEC50値は、a−MSH(文献値と整合した)のための9.0±1.6nM(n=3)に分かった。
作動薬の選出は、部分的にA431の周知の内因性のGPCRに基づいた。
結果は、光学シグニチャ(すなわち媒介体(すなわちHBSS)だけで処理されるそれに対する同様)(図63d)の四分の一タイプの他に、光学シグニチャが三大前提カテゴリ(図63a,bおよびc)に、それらの作動薬落下によって媒介することを示した。
三異なるストラテジは、これらの光学シグニチャのための細胞のシグナル伝達機構会計を明らかにするために使用された。
最初に、従来の二次メッセンジャアッセイ(すなわちFluo−3つのアッセイ)は、Ca2+可動化が生じるそれらの能力のための作動薬を分類するために用いた。
第2に、活性化物質(フォルスコリンおよびNKH447)が使われた2つのアデニリルシクラーゼ(cylase)(AC)は、静止A431細胞を刺激する。
GPCR作動薬によって媒介されたアデニル酸シクラーゼ活性化物質−媒介された光学シグニチャ間の類似は、検査されて、Gsによって媒介されたシグナル伝達を指摘したものである。
三分の一、特定の作動薬による光学シグニチャ起因性上の周知のモジュレータのパネルの効果の系統学のマッピングは、その細胞の機構およびシグナル伝達ネット相互作用を調査するために実行された。
これらの研究に基づく、光学シグニチャの3つの主要なクラスは、GPCRシグナル伝達の3つの古典的なタイプに割り当てられた:
Gq−、Gs−およびGi−シグナル伝達。
限界のため、内存性の情報はA431細胞(更に確かめられるGi−タイプ光学シグニチャ必要)の受容体をGi−coupledした。但し、HTMTによる用量依存的応答起因性は強くかかる指示を支持した。
適用できる文献記録である場合RWGバイオセンサによって決定されるそれらの効能はいずれのFluo−3つのアッセイ結果もと整合していた。そして、MRCATが使って正確に作動薬効能を決定することを示唆した。
((4) 作動薬によって媒介された細胞応答のシグニチャスイッチング)
細胞の状態およびコンテクストに従い、特定のGPCRの活性化は、複数種類のGタンパク質による細胞応答の引き金を引いてもよい。
たとえば、ブラジキニンによる内因性のブラジキニンB2受容体起因性の活性化は、A431細胞のGqおよびGs−経路による細胞のシグナル伝達を媒介する;
両方のシグナル伝達経路は、各々をcross−regulateする。
B2受容体で媒介されたシグナル伝達がブラジキニンの服用と同様にA431細胞の細胞の状態に依存していることは、ここに分かった。
増殖している状態において、ブラジキニンの低薬量(<100nM)は好ましくはGsによって媒介されたシグナル伝達の引き起こす。そのとき、高量はブラジキニン好意Gq−シグナル伝達の中で、薬を飲む(>100nM)。
その他が手渡すもの、0.5nM間のブラジキニンおよび約100nMはGsおよびGq−経路を媒介した。そのとき、それは約20時間の0.1%のFBSによって得られた静止A431細胞を刺激するために用いた。
逆に、充分に静止A431(約20時間のいかなるFBSまたは他成育因子の非存在下でも、DMEM培地によって得られる)は、主にGq−シグナル伝達(示されないデータ)を有する全ての供与量で、ブラジキニンに応答した。
図69は、LPAによって用量依存的応答起因性を示した。
充分に静止A431細胞は、LPAの低薬量での典型的Gi−タイプ光学シグニチャを有するLPA刺激作用に応答して、LPAの高用量で次第にGq−タイプ光学シグニチャへ切替えた。
1つの可能性は、低薬量でのLPAが好ましくはGiによって媒介されたシグナル伝達を導くLPA1受容体を活性化したということである。
LPAの濃度が増加するときに、内因性のLPA2およびLPA3受容体は動作中になる。そして、Gqによって媒介されたシグナル伝達を導く。
HTMTは、H1およびH2受容体の作動薬である。
低薬量(<約40nM)で、HTMTは用量依存的に典型的Gi−タイプ光学シグニチャ(図70b)に結果としてなった。
HTMTの濃度が約80nMまで増加し続けるように、DMRに関する光学シグニチャは減少し始めて、ほとんど安定した(すなわち明らかなDMRでない)ようになった。
HTMTの濃度の更なる増加は、典型的Gs−タイプ光学シグニチャ(図70b)に、スイッチングに結果としてなった。
P−DMRシグナルの振幅は、HTMT濃度の関数として、プロットされて、明らかにスイッチング(図73c)を示した。
Giシグナル伝達は細胞内cAMPの蓄積を導きそしてGsシグナル伝達は対立する効果を生じるので、HTMTが異なる効能でおそらく異なるリセプタでGsおよびGi−シグナル伝達経路を活性化すると推測することは合理的である。
GsおよびGiシグナル伝達間の虚弱な均衡はネット(正味)の細胞応答を決定する、動的に関する最少で、RWGバイオセンサによってモニタされるように、再分布をかたまりにする。
(9.例9−異なる標的間の交差性伝達の調査)
たとえば、EGFRは特定のGPCR作動薬によってトランスアクチベートされ得る。
また、1つの標的(例えばGPCR)の活性化物質は、他の密接に関連した標的を活性化する。
可逆性のリガンド結合で活性化される代わりに、PARはユニークなタンパク質分解性機構を活性化のために利用する。
トロンビンおよびトリプシンのようなセリンプロテアーゼは、細胞外のN末端外ドメイン(exodomain)で部位特定的に受容体を切断する。
切断部位を活性化することは、残基41−42(R↓SFLLRN)、36−37(R↓SLIGKV)、38−39(K↓TFRGAP)およびPAR1、PAR2、PAR3および、それぞれ、PAR4のための人間の47−48(R↓GYPGQV)である。
開裂は新規なN末端の仮面をはぐ。そして、それは順番に縄でつながれたリガンド配列として作用する。
縄でつながれたリガンドドメインは受容体を分子内に結合して、活性化する。そして、このようにシグナル伝達を始める。
PARを活性化するプロテアーゼは、上皮組織(トリプシン)から凝固因子(例えばトロンビン、凝固因子VIIaおよびXa)、炎症細胞(マスト細胞トリプターゼ(好中球カテプシンG))からのプロテアーゼおよび酵素を含む。
4つのPAR(PAR1、PAR3およびPAR4)のうちの3つは主にトロンビンによって活性化される。その一方で、PAR2はトリプシンのようなプロテアーゼ(例えばマスト細胞トリプターゼおよび凝結Factor Xa)によって活性化される。
PAR3を除いて、縄でつながれたリガンド配列の最初の5つか6つのアミノ酸と一致して、合成ペプチド(PAR−活性化しているペプチドまたはPAR−APs)は直接PARを活性化する。
これらの合成ペプチドがプロテオリシスの中でそれぞれに受容体作用薬として機能するので、PAR−APsはPARの生理学的で病態生理学的機能を研究することに役立つ。
大部分の細胞タイプは、多数PARを発現する。
1つの例は、内生的ににPAR1およびPAR2を発現するA431細胞である。
しかし、A431のPARのシグナル伝達経路の細胞はほとんど知られていないが、epideriomoidカルシノーマ細胞が潜在的なPAR活性化物質であってもよい人間気道トリプシンのようなプロテアーゼを含んでいるいくつかのセリンプロテアーゼを発現する。
(a) 材料および方法)
((1) 試薬)
KN−62およびGF109203xは、Tocris Chemical社(セントルイス(MO))から得られた。
Fluo−3およびテキサスRed−ファロイジン(TR−ファロイジン)は、分子フローブ(ユージン(OR))から得られた。
SFFLR−アミド、GLIGKV−アミド、GLIGLR−アミド、ブラジキニンおよびYFLLNRP−アミドは、Bachem(キングオブプロシア(PA))から得られた。
コーニング社製のEpicTMの96ウェルバイオセンサマイクロプレートは、コーニングInc(コーニング(NY))から得られて、使用の前に6分の高強度性紫外線(UVO−洗浄剤、Jelight社会社、ラグーナヒルズ、CA)照射によってきれいにした。
((2) 細胞培養)
3−5経路での約3〜7.5×104細胞は200mlにおいて停止した。そして、10%のFBSを含んでいるDMEM培地は96ウェルマイクロプレートの各ウェルに置かれてあって、約95%密集度に達する(約2−4つの日)まで、空気/5%のCO2の下で37℃で培養されてあった。
((3) Fluo−3つのCa2+可動化アッセイ)
細胞はそれから緩衝液によって二回洗浄された。そして、2.5mMのプロベニシドを含んでいる1×100mlのHBSSによって維持された。
アッセイは50mlのPAR作動薬溶液を細胞プレートへ移すことによって始められた、そして、カルシウムシグナルはHTS7000バイオアッセイリーダ(パーキンエルマーライフサイエンス、ボストン、MA)を使用している6秒の間隔を有する記録された6分以上であった。
アッセイは、光学検知データを有する直接タイプ比較を許すために室温で、実行された。
((4) 光学バイオセンサが分析する動的質量再分布(DMR))
培養した後に、細胞(約95%密集度)が約20時間DMEMのみで飢餓させて、二回洗浄されて、100μlのDMEMによって維持された。
その後、細胞を含んでいるセンサマイクロプレートは光学系に配置された、そして、細胞応答は溶液の添加の前後で記録された。
化合物研究のための、各ウェルの細胞は、PAR作動薬溶液50μlが導かれる前に、50μlの化合物溶液または1×HBSSによって安定した位相(すなわち明らかな質量再分布でない)に達するまで(一般に1時間内で)、前処理された。
化合物またはPAR作動薬溶液は、細胞培地および化合物溶液間の屈折率にマッチするために1×HBSSにおいて作られた。これは、化合物溶液の導入により一時的起こるにいかなるDMRシグナルも圧倒するバルク屈折率変化の不必要な影響を最小にする。
全ての研究は、温度変動および蒸気化の冷却の効果を最小にするために、溶液が導かれた短い期間(約数秒)の間の除外上のマイクロプレートの蓋を有する室温で、実行された。
CCDカメラによって撮像されるように、本願明細書の全体にわたって示される応答のユニットは、CCDカメラによって撮像された各センサの共鳴バンドの中央位置の画素の変化であり、1ユニットは実験的な正常化プロトコルに基づいて約5.82×10−4の屈折率に等しかった。そして、正常化プロトコルはグリセリンおよびジメチルスルホキシドの濃度に依存する応答を使用する。
((5) 蛍光画像化)
その後、細胞は室温で、1時間、0.5μMテキサス赤標識ファロイジンによってインキュベートされ、洗った。
最終的な洗浄液およびマウンティングの後、細胞は40×対物レンズ(ツァイスAxioplan蛍光−顕微鏡において備えられた)によって検査された。
(b) 結果)
((1) PAR作動薬は、A431細胞の細胞内Ca2+の***を媒介する)
非線形回帰およびスキャッチャード解析に基づく、全てのPAR作動薬によって媒介された飽和曲線は、1−部位結合に非常によく適合しているようである。
EC50が、6±1ユニット/ml(60±10nMに対する当量)、5.0±0.4μM、45.7±5.8nM、2.5±0.3μMおよび3.8±0.4μM、それぞれトロンビン、SFFLR−アミド、トリプシン、SLIGLR−アミドおよびSLIGKV−アミドのためのであるとわかった。
トロンビン、SFFLR−アミド、トリプシン、SLIGKV−アミドおよびSLIGLR−アミドにより誘導された最大である[Ca2+]i***はそれぞれ、48.2±3.5%、74.3±3.9%、100±6.3%、52±6.3%および64±3.7%であることが分かった(図71)。
トリプシンによって得られた最大である[Ca2+]i***は、トロンビンによって得られたのと同じ程度のほぼ2つのひだであった。
他方、トリプシンによって得られる最大である[Ca2+]i***も、2つのPAR2−APsによって得られたそれらより非常に高かった。
一方、SFFLR−アミド(20μM)およびSLIGKV−アミド(20μM)の混合液を有するA431の刺激作用は、単独で200nMトリプシンによって得られるそれに対する同様に、102±5.4%の[Ca2+]i***を誘導した。
面白く、160μM濃度でのPAR1特性不完全作動薬YFLLRNPは、いずれも著しい[Ca2+]i***の誘発をしなかった、しかし、80μMのYFLLRNPを有する細胞の前処理は、200nMトリプシン(48.3±4.5%(n=5))によって媒介した[Ca2+]i***を抑制した。
適当な濃度(<約100μM)でのYFLLRNPが、人間血小板のシグナル伝達経路GqまたはGiを刺激せずに、血小板形変化に結果としてなっているPAR1で、選択的にG12/13のシグナル伝達カスケードを活性化するとわかった。
これらの結果は、トリプシンがPAR2以外のPARを活性化することを示唆する。
最大の応答を誘発することを必要とする濃度は、40ユニット/ml、20μM、400nM、20μMおよび20μM、それぞれ、トロンビン、SFFLR−アミド、トリプシン、SLIGKV−アミドおよびSLIGLR−アミドであった。
((2) PAR作動薬は、A431細胞のアクチンフィラメントの再構成を媒介する)
高量密集度(>90%)での細胞の細胞骨格構造上のPAR作動薬の効果は、光バンドを使用する我々の光学検知システムのユニーク設計を原因として生じるので調査された。(光バンドの大きさ200×3000μm、注:これは、我々の角度測定の現在の構成である;照射のために使用する光の大きさは、概して約50μm〜5mmまでの範囲である)調査されたのは各々のバイオセンサを照射して行われた(DMRに関する光学シグニチャが照射する領域内の全ての細胞の平均値であることを意味すること)。
いずれのトロンビンもまたはトリプシンを有する約95%の密集度での静止A431細胞の刺激作用はアクチンフィラメントの再構成を誘発した。そして、そのことはテキサスRed−Xファロイジンによって、汚れることは模倣する(示されないデータ)ことを示した。
休止A431細胞は典型的染色パターンを示した−アクチンフィラメントは大部分は延長して現れて、細胞原形質の全体にわたって均一に分配する。
100nMトリプシンまたは40ユニット/mlトロンビンで処理された細胞は、約10分(示されないデータ)以後の有意な細胞骨格再構成の引き金を引いて、約30分以後明らかになる。
アクチンフィラメントは、いずれのトロンビンもまたはトリプシンによって刺激された後に主に30分、細胞の端のまわりで集中した。
これらの結果は、トロンビンおよびトリプシンがA431細胞のアクチンフィラメントの再構成を媒介することを証明した。
((3) PAR作動薬は、A431細胞の有意な動的質量再分布を媒介する)
Ca2+可動化結果と同様に、作動薬によって媒介されたDMRシグナルが光学バイオセンサアッセイにもよって、得たPARの飽和曲線は、非線形回帰およびスキャッチャード解析に基づく、モデルを結合している1−部位によって、非常によく合った。
それは、トリプシンのために、高用量(>2000nM)でのトリプシンがバイオセンサ(示されないデータ)の表層から、有意な細胞離断まで至るので、低薬量(<2000nM)でのトリプシンによるDMRシグナル起因性が集中された点に注意する価値がある。
ラトランキュリンAを有するA431の前処理は完全にトロンビン−かトリプシンによって媒介されたDMRシグナルを遮断した。その一方で、サイトカラシンBはまして応答を抑制することに効果的だった。
2つの作因が原因アクチン脱重合に異なる機構を利用することを公知である:
サイトカラシンBはアクチンフィラメントをおおう。その一方で、ラトランキュリンAはアクチンモノマーを隔離する。
かかる差分は、シグナル伝達機構のエンドサイトーシスに影響を及ぼすことか会合体によって受容体シグナル伝達を調整するために各々のトキシンのための異なる機能を導く。
逆に、安定させている多因子のFアクチン作因ファロイジンもマイクロチューブル***するものノコダゾールも、トロンビンおよびトリプシンに媒介された応答に対する有意な影響を有しなかった。
ホスホイノシトール加水分解およびカルシウムに依存するRho活性化に結果としてなっているGq−被結合経路およびG12/13−被結合p115Rho−GEFによるRhoのカルシウムから独立した直接の活性化。
このように、Ca2+シグナル伝達を標的とするモジュレータの効果は、検査された。
使用するモジュレータは、有力なPKC阻害物質GF109203xおよび有力なCa2+/カルモジュリン(calmodulin)に依存するタンパク質キナーゼII(CaMKII)阻害物質KN−62(図73)であった。
GF109203xは、トロンビンおよびトリプシンによって媒介されたDMRシグナルに対する明らかな影響を有しなかった。
しかし、KN−62の前処理は、異なってトロンビンおよびトリプシンによって媒介されたDMRシグナルに影響を及ぼした。
KN−62が僅かにトロンビンによって媒介されたDMRシグナルを抑制するときに、それはほとんど完全にトリプシンによって媒介されたDMRシグナルを破壊した。
トリプシン活性を直接抑制しているKN−62の可能性を検査するために、BAEE加水分解(hydrolyisis)アッセイが、使われた。
結果は、KN−62の存在がトリプシン活性(示されないデータ)に遂行することが明らかでないことを示した。
高用量だけでのYFFLRNPは、有意なDMRシグナル(示されないデータ)を刺激した。
YFFLRNPは、用量依存的にトロンビン、SFFLR−amide−およびトリプシン(図74)によって媒介されたDMRシグナルを抑制した。
検査される最も高い供与量で、YFFLRNPはほとんど完全にトロンビンによって媒介されたDMRを遮断するが、部分的にSFFLR−アミドてトリプシンによって媒介されたDMRを減らすだけだった。
逆に、YFFLRNPはPAR2−AP GLIGKVによって媒介されたDMRシグナルに対する明らかな影響を有しない。
集合的に、これらの結果は、細胞骨格再構成が主に生じられることを示唆したPAR2活性化によるGqによって媒介されたCa2+シグナル伝達、しかし、PAR1活性化によるCa2+から独立した機構。
((4) PAR作動薬の受容体脱感作および交差脱感作)
間隔は、DMR光学アッセイのためのCa2+可動化アッセイおよび約1時間の6分であった。
一旦A431細胞がトリプシンによって刺激されると、他のPAR作動薬(40ユニット/mlトロンビン、20μMのSFFLR−アミド、20μMのGLIGKV−アミド、20μMのGLIGLR−アミドまたは200nMトリプシン)の次の適用が、ほとんど[Ca2+]i***なしを誘導した(図75a−c(示されないデータ))。
逆に、検査されるPAR作動薬のどちらも、ブラジキニン(A431細胞において内生的に発現されるB2受容体のための作動薬)の次の刺激作用によって媒介された[Ca2+]i***のいかなる効果もなかった(図79dに例示)、これは、トリプシンを有する前の刺激作用によるPAR作動薬に対する応答の阻害が膜タンパク質の非特異的消化作用によらなかったことを示唆する。
他方、40ユニット/mlトロンビンを有する前の刺激作用は、40ユニット/mlトロンビンによって媒介された[Ca2+]i***を全くブロックしたが、僅かにトリプシン−起因性[Ca2+]i***を抑制した。ところが、SFFLR−アミド、GLIGKV−アミドまたはGLIGLR−アミドの前の刺激作用はかなり減らされ、しかし、トリプシン−起因性[Ca2+]i***を完全に消してはない(図79e−g;示されないデータ)。
トロンビンの前の刺激作用の後、PAR2−AP SLIGKV−アミドは、前の刺激作用(52.0±6.3%)なしで得たのと同様に[Ca2+]i***(48.5±3.8%)を誘導した。
逆に、トロンビンの前の刺激作用は、SFFLR−アミド(32±4.3%)によって誘導した[Ca2+]i***を部分的にブロックするだけであるが、これは、SFFLR−アミドがPAR1およびPAR2を活性化する他によってなされた以前の目視観測と両立する。[ Blackhart, B. D.; Emilsson, K.; Nguyen, D.; Teng, G. W.; Martelli, A. J.; Nysted, S.; Sundelin, J.; Scarborough, R. M. J. Biol. Chem. 1996, 271, 16466-16471].。
このように、トリプシンはPAR1−APおよびPAR2−APsに反応性を脱感作したのに、トロンビンはPAR2−APsに反応性を脱感作しなかった。
トリプシンを有する前の刺激作用はいずれのトリプシン(示されないデータ)もまたはトロンビン(図76a)によって完全にDMRシグナル起因性を除去した。その一方で、それは三PAR−APs(SFFLR−アミド、GLIGKV−アミド、GLIGLR−アミド)(図76b−c(示されないデータ))のどちらにでもよって、かなりDMRシグナル起因性を抑制した。
逆に、トリプシン前処理は、ブラジキニン(図76d)によって媒介されたDMRに対するほとんど影響を有しない。
SFFLR−アミド、GLIGKV−アミドまたはGLIGLR−アミドがかなり抑制する一方(トロンビンを有する前の刺激作用)、しかし、否定は、完全にトリプシン−起因性DMRシグナルを除去する(図76e−g;示されないデータ)。
さらに、トロンビンを有する前の刺激作用の後、2つのPAR2−APs(SLIGKV−アミドてSLIGLR−アミド)は、前の刺激作用(示されないデータ)なしで得られるそれに、DMRシグナル同様を誘発した。
概要において、これらの結果はトロンビンが主にPAR1を活性化することを示した。その一方で、トリプシンはPAR1およびPAR2を活性化する。
((5) [トロンビンおよびトリプシンによって媒介されたCa2+]i***およびDMRシグナルは、細胞のコレステロールレベルに影響される)
mβCDを有する静止A431細胞の前処理は、用量依存的抑制を導いた[Ca2+]i***は、いずれのトリプシンもまたはトロンビン(示されないデータ)によって媒介した。
両方の用量依存的抑制は、一つの位相減衰非線形回帰によって、非常によく発作をカーブさせる;mβCDが細胞膜コレステロール分子を速く流出することに結果としてなるという事実と整合した。
一方、非活動性のシクロデキストリン立体異性体αCDは、最高8mM、トリプシンおよびトロンビン−誘導応答(示されないデータ)に対する影響を有しなかった。
Ca2+可動化によって測定されたものと同様に用量依存を示したmβCDによるトロンビン媒介DMRの抑制と異なって、mβCDによるトリプシン媒介DMRの抑制は、複雑な性質、mβCDの増加する服用に対する遅く衰えた減衰を示した。
この差分は、トリプシンによって媒介されたDMRシグナルがトロンビンによるその起因性より合併した細胞の機構を含むことを示唆した。
逆に、非活動性のシクロデキストリン立体異性体αCDが、最高8mM、両方の作動薬−起因性DMR応答に対するほとんど影響を有するというわけではなかった。
しかし、αCD(>10mM)の高用量は、バイオセンサ(示されないデータ)の表層から取り外される細胞の有意な総計に結果としてなった。
mβCDを有するコレステロール欠損の後のPARの機能上の回収は、また、検査された。
この実験は、mβCDを含んでいる培地の除去の後、mβCD−処理された細胞の細胞表面コレステロールのタイムリな回収に基づいた。
そうするために、静止A431細胞は細胞表面コレステロール組成の除去を確実にするために15分のための5mMのmβCDによって処理された。そして、DMEM培地だけでの処理された細胞は、続いて三時間、洗浄された。
細胞はそれから100μlによって維持された培地、そして、光学系に配置される。
細胞が合理的に安定した状態に達しているのを許すために15分のためのインキュベーションの後、80ユニット/mlでのトロンビンの100μl溶液は、特定の時間で各ウェルに添加された。
光学応答は、アッセイの全体にわたって記録された。
図78に示されるように、細胞表面コレステロールが除去されたあと、トロンビン−起因性DMRシグナルが時間に依存していたことを示す結果になった。
それがコレステロール除去なしで得られる起源のレベルに達するまで、トロンビン−起因性DMRシグナルは次第に回復した。
トロンビン−起因性光学シグニチャの時間に依存する回収はコレステロールによって援助された微小ドメインの発生が動的で可逆性のことを強く意味した、そして、細胞膜でのコレステロール濃度はPARシグナル伝達を管理する際に重要である。
((6) EGFRおよび部間の交差性の伝達)
EGFを有する前の刺激作用は、ほとんど効果を有しなかった[Ca2+]i***は、トリプシン(図79a)またはトロンビン(示されないデータ)によって媒介された。
しかし、充分にEGFRs、EGFを活性化している100nMでは全くN−DMR現象は遮断されたが、トリプシン(図79b)またはトロンビン(図79c)によって媒介されたDMR応答のためのP−DMR現象は減衰するだけだった。
これらの結果は、アクチンフィラメント再構成を管理する観点からの最少で、交差性の伝達がEGFRおよびPARの間にあってもよいことを示唆した。
変化を中で含んでいる細胞応答[Ca2+]iレベルおよび動的質量再分布は、検査された。
証明の三ラインはトロンビンが主にPAR1を活性化することを支えた。その一方で、トリプシンはPAR1およびPAR2を活性化する。
第一、用量依存、そして、飽和性の[検査されるPAR作動薬のどちらにでも対するCa2+]i***およびDMRシグナルは、A431細胞のPAR1およびPAR2シグナル伝達の存在を提案した。
より大きいものを他のPAR作動薬によって媒介されたそれらに比較する[Ca2+]i***およびDMRシグナルは、そのトリプシンがPAR2以外の受容体を活性化するかもしれないことを示唆されるトリプシンによって媒介した。
[ SFFLR−アミドおよびGLIGKV−アミドの混合液によって媒介されたCa2+]i***は単独でトリプシンによって媒介されたそれに対する同様である。そして、更にトリプシンがA431細胞のPAR1およびPAR2を活性化するという可能性を強化する。
トリプシンを有する前の刺激作用がほとんど完全に遮断した目視観測から、第2の証明は、ある[Ca2+]i***は全てのPAR作動薬、しかし、否定ブラジキニン(B2受容体作用薬)のいずれの一つにもよって媒介した。そして、PAR2と一緒に、PAR1が切断されて、トリプシンによって活性化されたことをこのように示唆した。
他方、トロンビンを有する前の刺激作用は、僅かに減るだけだった[Ca2+]i***、しかし、かなりDMRシグナルは、トリプシンによって媒介した。
面白いことに、トリプシンを有する持続性の前の刺激作用(約1時間)は全くトロンビンによって媒介されたA431細胞のDMR応答を抑制した。そして、無損傷のトロンビン−活性受容体がトリプシンを有する持続性の1時間の刺激作用の後、回復しないことを示唆した。
しかし[Ca2+]i計測異なり、トリプシンでの持続性の前の刺激作用は、シグナルが全ての三つのPAR−APsによって媒介されたDMRを部分的に抑制するだけだった。これは、PAR2受容体の若干の一部が回復されていること意味する。
SFFLR−アミドは、PAR1およびPAR2を活性化することが可能なことは公知である。
また、受容体プロテオリシスおよびリン酸化が受容体内部移行によるPARおよび細胞内シグナル伝達の阻害の活性を管理することは公知である。
細胞のコンテクストに従い、細胞表面での機能的受容体の回収は、何十分から時間まで減じてもよい。
証明の三分の一ラインは、YFFLRNPの効果から来た。
YFFLRNPを有する前の刺激作用は、用量依存的に、PAR2−AP SLIGKV−アミド以外でない、トロンビン、SFFLR−アミドまたはトリプシンによって媒介されたDMRシグナルを抑制した。
最も高い供与量(729μM)で、YFFLRNPは全くトロンビンによって媒介されたDMRシグナルを遮断するが、SFFLR−アミドまたはトリプシンによって部分的にそれらの起因性を抑制するだけだった。
集合的に、これらの結果は、PAR2と比べて、トリプシンがまた、A431細胞のPAR1を活性化するかもしれないことを示唆した。
PAR1、PAR3およびPAR4がトロンビン受容体として役立つと報告される。その一方で、トリプシンは、PAR2の他に、PAR1およびPAR4を活性化することが可能である。
PAR1の活性化は、数種類の血小板およびLNCaP細胞を含む細胞の細胞骨格再構成を導くことを示した。
いずれのトロンビンも有するA431細胞または無作為化された分配からアクチンフィラメントの有意な再配列を引き起こされるトリプシンの刺激作用は、細胞の端の近くで濃度したフィラメントにアクチンフィラメントを延長した。
さらに、検査される全てのPAR作動薬も、バイオセンサ表面上の付着細胞の底部分内で、劇的な質量再分布を誘発した。
アクチンフィラメント破壊作因ラトランキュリンAおよび、選択的にトロンビンまたはトリプシンによって媒介されたDMRシグナルを減らす否定アクチン重合−促進している作因ファロイジンまたはマイクロチューブル破壊作因ノコダゾール以外は、サイトカラシンBの機能は、DMR応答(このようにA431細胞の細胞骨格再構成のPARシグナル伝達の役割)のアクチンフィラメント再配列の役割を提案した。
人間血小板の、示量拡散移動および形変化を経るトロンビンにさらされる、PAR1はp115Rho−GEF、PAR1−被結合Gタンパク質と関連するGTP交換因子(GEF)、G12/13によるRhoAを活性化することを示した。
A431細胞において、YFFLRNP(具体的には、G12/13を活性化すると報告されるPAR1特性不完全作動薬、しかし、否定Gq)が他のPAR作動薬(示されないデータ)に、DMRシグナル同様を誘発することが可能であるとわかった。
さらに、YFFLRNPを有するA431細胞の前処理は、用量依存的に、否定PAR2−AP GLIGKV−アミド以外の、トロンビンおよびSFFLR−アミドによって媒介されたDMRシグナルを減らした。
これらの結果は、A431力のPAR1もの活性化がG12/13による細胞骨格再構成の引き起こすことを示唆した。
他方、トリプシンによって媒介された細胞骨格再構成は、両G12/13−およびGqに依存する経路から生じられる。これは、トリプシンによって媒介されるDMRシグナルがPAR1特性不完全作動薬YFFLRNPと同様にCaMKIIインヒビターKN−62に影響されたからである。
1つの可能性は、PAR1の活性化によるG12/13のシグナル伝達経路以外の、トリプシンがPAR2の活性化によるGqシグナル伝達経路に従い、細胞骨格再構成を誘発したということである。
その非活動性の立体異性体αCD以外のmβCDを有する細胞の処理は、トロンビンおよびトリプシンによってCa2+可動化および動的質量再分布起因性を含むPARシグナル伝達を減らさなかった。
コレステロール欠損によるEGFRのトランスアクチベーションが少なくともN−DMR現象の減衰を説明することを示唆されるEGFを有する前の刺激作用の効果は、トロンビンまたはトリプシンによって媒介した。
さらに、Ca2+可動化を減らすコレステロール欠損の機能は、そのコレステロールを膜が経路をGq−シグナル伝達して、PAR1およびPAR2のシグナル伝達を管理するプラズマに関係させた。
コレステロール抽出が、ARシグナル伝達のための2つの重要な分子PtdIns 4,5−P2およびGqの区画化の減失を導くことを公知である。
コレステロール欠損によるCa2+可動化の抑制は、PtdInsおよびGqの非局在化の直接の結果であるかもしれない。
上記のように、PARで媒介されたDMRシグナルは、Gq経路の中でそれぞれに他経路を含む。
しかし、充分にDMRシグナルを遮断するコレステロール除去の機能は、G12/13のような、そのコレステロール欠損がまた、他のシグナル伝達経路を悪くするかもしれないことを示唆されるトリプシンおよびトロンビンによって媒介した。
これらの所見は、A431細胞においてラフリング(raffling)している膜がコレステロールを必要とする他によってされる前の目視観測に同意した。
面白いことに、機能上の回復実験は、コレステロール−集められた微小ドメインが動的で可逆性であることを示した。
PAR1およびPAR2が異なる機構でおそらく細胞骨格構造の再構成を導く両方ともの活性化。
Gq、そして、Ca2+に依存する機構G12を含んでいる他のシグナル伝達経路/13がPAR1によって媒介された再配列に貢献するかもしれないと共に、PAR2によって媒介された細胞骨格再配列に割り当てる。
さらに、細胞表面でのコレステロールは、A431のPARシグナル伝達を管理することで重要な役割を演ずる。
これらの所見は、PARシグナル伝達が腫瘍浸潤および転移にとって重要かもしれないことを示唆する。
現在の研究は、強く細胞シグナル伝達を解読する際のRWGバイオセンサおよびそのネット相互作用の大きいポテンシャルを増やす。
(10.例10−活性酸素種シグナル伝達および細胞レドックス状態の研究)
より透明でないにもかかわらず、細胞の標的は同定されて、過去の10年を通じて広がった。
受容体キナーゼおよびホスファターゼは、酸化ストレスの標的であってもよい。
生長因子受容体は、その細胞質のキナーゼドメインを自動的にリン酸化するリガンド起因性二量体化またはオリゴマー形成によって、最も共通に活性化される。
紫外線に応答する受容体のリガンドから独立した菌株群形成および活性化も、かなり示され、そして、この効果はROSによって媒介されたように見える。
外部性H2O2(通常ミリモル範囲の)は、PDGF−およびEGF受容体のYリン酸化および活性化を誘発することを示した。
EGF受容体のホスファチジン酸の起因性トランスアクチベーションは、ROSの中間の発生によって媒介されたように見える。
大部分の成育因子およびサイトカインが形質膜で、又はその近くで、ROSを生成するように見えるので、リン脂質メタボライトはレドックスシグナル伝達のための潜在的に重要な標的である。
たとえば、ジアシルグリセロールの酸化タイプは、PKCを活性化する際に、その未酸化されたフォームより効果的だった。
加えて、PKC活性化およびタンパク質Yリン酸化は、血管内皮細胞および繊維芽細胞のH2O2−起因性PLD活性化のために必要に見える。
Srcファミリ(Srcキナーゼ)およびヤヌスキナーゼ(JAK)ファミリに帰属している非RTKsは、また、少なくとも、外因的な加算オキシダントのための標的である。
RWGバイオセンサは、バイオアッセ適用法のための三主成分からなる:
EpicTMセンサマイクロプレート、RWG検出器および液状の取り扱い系。
センサマイクロプレートは所定のSBSフォーマット(例えば96ウェルまたは384−ウェル)のプラスチックの清浄なプレートに付けられるガラス製の床プレートからなる。そして、それは高いスループットスクリーニングを可能にする。
96ウェル EpicTMセンサマイクロプレートにおいて、各ウェルは、ほぼ3×3mm2の1つのRWGセンサを含む。
RWGセンサは、ガラス基質を示しているグレーティング上の誘電材料の薄膜からなる。
広帯域光源(マイクロプレートの底による名目上、正常な発生率で、光ファイバおよびコリメーティングレンズで発生する)は、グレーティング界面の小さい領域を照らすために用いる。
反射光を記録するための検出光ファイバは、照明光ファイバとバンドルされる。
一連の8つの照明/検出ヘッドは線形の傾向に配置される。その結果、反射スペクトルはすぐにマイクロプレートの同じカラム内で、全ての8つのウェルから集められる。
空間的に制御された運動を有する、全部のプレートが照明/検出ヘッド全体の各々のセンサがアドレス指定を行われた多数の時間および各々のカラムでありえるために移向であること順番にアドレス指定を行う。
反射光の一連のスペクトルが、集められて、解析のために使われる。
この検出系が刺激作用に応答して細胞応答によって反射光起因性の波長シフトを測定するので、このアプローチは波長測定システムとみなせる。
H2O2による刺激作用は、センサ(図84A)の検知体積内の有意な質量再分布をトリガした。
DMRシグナルは、2つの主要な現象:三位相(増加する質量シグナル(P−DMR)、遷移位相および減少された質量シグナル(N−DMR))からなる初期のピーク;そして、最終的にプラトーを導く持続性で増加する質量シグナルからなる。
一方、H2O2による刺激作用は僅かにまた、TM0モードの共鳴ピークのPWHMを増やした。そして、細胞層の底一部内で質量分布の増加する不均質性を示した。
PWHMと整合して、統合した領域がほとんど定常的なままであると共に、ピーク強度は、また、刺激作用の後、時間を通じて僅かに減少した。
図81aおよびbに示すように、H2O2刺激作用の光学シグニチャは、強くその供与量に依存する。
H2O2の濃度が約8mMでまたはその未満にあるときに、H2O2の細胞応答は2つの主要な現象(初期ピーク、および持続性増加質量シグナル)からなる典型的曲線を有する。
しかし、H2O2の濃度が16mMでまたはそれより上にあるときに、H2O2の細胞応答は異なる特性(いくぶん安定した遷移状態に続いた初期増加質量シグナル、および最終的に減少された質量シグナル)を有する。
後者の減少質量シグナルは生/死細胞染色(示されないデータ)を有する目視観測と、かなり整合している。そして、それはH2O2の高用量によって処理される細胞がアポトーシス(細胞の質量減失を導くプロセス)を経ることを示した。
結果はキナーゼ阻害物質(PP1およびPP2)がかなりH2O2によって媒介された細胞応答を抑制することをその2つの特定のsrcに明らかにしたのに、陰性対照(PP3)は応答に影響を及ぼさなかった。
これらは、キナーゼがH2O2によって媒介されたDMRシグナルに関係させるそのSrcを提案した;
そして、光学バイオセンサは、使ってROSシグナル伝達に影響を及ぼすモジュレータをスクリーニングする。
異なるレドックス状態は、時間を培養している異なると協力して細胞の異なる初期の接種数を使用することによって達成された。
低いレドックス細胞は、3日の間のウェルにつき75,000の細胞を培養することによって達成された0%のウシ胎児血清(FBS)を有する標準状態およびその後夜通しのスターベーションの下で培養する高いレドックス細胞が10日の間のウェルにつき10,000の細胞を培養することによって達成される、0%のFBSを有する標準状態およびその後夜通しのスターベーションの下で培養する。
細胞密度は同様(約95%)であった。そして、そのことは光学顕微鏡法によって検査した。
図83に示すように、細胞の2つの異なるレドックス状態は、異なって4mMのH2O2に応答した。
H2O2は細胞の低いレドックス状態のための典型的DMRシグナルの引き金を引いた。そして、それは細胞の底一部内で最終的に質量を増やした。
しかし、同じ濃度でのH2O2は、アポトーシス(すなわち、最終的に、細胞内で質量において消失して)を経ている細胞の形質を有する細胞の高いレドックス状態のDMRシグナルを媒介した。
これらの結果は、光学バイオセンサが使って培養細胞の、そして、細胞のレドックス状態に影響を及ぼすスクリーニングモジュレータに対するレドックス状態を差別化することを示した。
(11.例11−細胞アッセイのための多数の光学出力パラメータの)
これらの光学読み出しは、シフトを入射角(共鳴ピークの形を定義している三パラメータと同様に)に含む:
強度、PWHMおよび領域。
その高感度および情報内容のため、TM0モードだけが全てのデータ収集および解析のために使われた。
(a) TM0ピークの形)
細胞密集度が増加するように、共鳴ピークは高量入射角の方向へ移る。
PWHM値(ピーク形を定義しているパラメータ)も、細胞密集度(図31b)上の依存を呈した。
PWHM値は、約50%の細胞密集度で、その最高に到達した;
最大PWHMは、約35%、75%より上の高比重を有する細胞単層の非共存または存在のそれらより高かった。
細胞が充分に起こったあと、これらのデータが得られた点に注意することは約2daysの後、細胞増殖培養液で培養することを広げたことは、価値がある。
図32aに示すように、増殖している細胞(10%のFBSにおいて得られる)が18%のDMSOで処理されるときに、TM0ピークの形および位置は動的変化を呈した。
DMSOを有する既処理の後、時間の全体にわたるピーク増加の強度および領域は、モニタした(約3時間)。
しかし、ピーク位置(すなわち入射角)は動態力学特性を示した:
入射角は、まず最初に質量(例えば25分)の増加およびそれから質量(例えば40および120分)の減少へ移る。
同様に、ピーク形はまず最初に広げられて、複雑な微細構造(例えば25分)を示して、結局狭く(例えば40および120分)なった。
複雑なピーク構造の外観がセンサ界面で、又はその近くで、質量の大規模な不規則な不均質性の含意として使われた。そして、DMSOを有する特定の期間後療法の間、バイオセンサが増加する界面不均質性を検出することをこのように示した。
CHO細胞(DMSO処理の後、25分得られる)の生活/死んでいる染色パターンは、細胞の個体群が混ぜられることを示した:
CHO細胞がDMSO処理に異質に答辞のようなことを意味して、成育可能で、死んでいて影響を受ける細胞(図32b)。
これらの結果は、TM0ピークの形が検知体積内で異質の横方向質量分布を検査するために役立つことを示唆した。
((b) 細胞接着および拡散移動)
細胞は、初期接触による界面または細胞が一般にそれらが懸濁において所有した円脚の形を保持する付着と相互に作用し始める。
その後、取付けられた細胞は、拡散移動(細胞が界面と接触してそれらの領域を増やすプロセス)として公知の形態学的変化を経る。
付着および拡散移動は、界面の性質および細胞が懸濁される培地に依存している。
細胞接着および拡散移動は明らかに検知体積内の垂直で水平の質量再分布を導くので、我々は最初にビンクリスチンの非共存および存在の5%のFBSのA431細胞の接着および拡散移動を特徴づけた。
ビンクリスチンは、チュービュリンに結合することによってマイクロチューブル会合体を抑制する植物アルカロイド(alkaoid)である。
結果は、ビンクリスチンの非存在下で、入射角のシフトが三大前提位相(示されないデータ)を呈したことを示す。
細胞溶液の添加に続くことは即時で速い増加するシグナルで、おそらく三つの現象から生じる:
細胞溶液、センサ界面の上の血清タンパクの固定化および界面を有する細胞の細胞および次の接触の沈降の添加からの増加するバルク屈折率。
その後、持続性の増加するシグナルは起こった。そして、細胞拡散移動の遅いプロセスを示した。
最終的に、飽和したレベルに、達した。
飽和したレベル(16.8±0.6ユニット、n=3)は、同様密度(22.6±1.0ユニット、n=3)で、充分に広げられた細胞のそれら未満だった。
一方、正規化されたPWHM値が、また、異なる特性(示されないデータ)を有する動的であるとわかった。
細胞溶液が加えられたあと、PWHM値は増加し始めた。
約20分後に、PWHMは約2時間内でその起源のレベルへ減衰し始めた。そして、それがプラトーに到達するまで、ゆっくり持続性の増加が続いた。
終末点でのPWHMは約25%、開始点でのそれより高かった。そして、それは細胞が、周囲条件の下のバイオセンサを有する20時間の分析の後、さえ、充分に広げられる否定であることを示した。
これは、光学顕微鏡法像(示されないデータ)によって確かめられた。
これらの結果は、室温で、A431細胞が否定のようであることは(i)接着の最適の程度に到達することが可能であるように提案した;
細胞は、多数ステップによる界面と相互に作用する(ii)と、各々がそれ自身の特徴を有する;
そして、拡散移動ステップは検知体積内で明らかに質量を増やす(iii)。そして、それは界面を有する細胞の増加する接触を意味する。
ビンクリスチンの存在は、初期で全体の応答だけを抑制しなくて、また、細胞拡散移動(示されないデータ)の動態を減らした。
ビンクリスチンがある場合には、入射角の全体の変化は、約20%、ビンクリスチンの非存在下でそれより少なかった。
面白いことに、ビンクリスチンもPWHM値(示されないデータ)の動的な特徴を変えた。
ビンクリスチンの非存在下でとは異なり、それがプラトーに到達するまで、PWHMはまず最初に減少して、約3時間低いままで、その後増加した。そして、ビンクリスチンが主に細胞接着および拡散移動プロセスの間、初期のステップに影響を及ぼすことを示した。
これらの結果は、バイオセンサが洞察を界面を有する細胞の相互作用のために用意するために有能なだけではないことを示唆したまた、細胞接着および拡散移動プロセスを変えるそれらの能力のための化合物を差別化するために、しかし。
((c)EGFRシグナル伝達)
結果は、EGFによって媒介された静止A431細胞のDMRがEGFRチロシンキナーゼ活性、アクチン重合およびダイナミン活性を必要とすることを示して、主にMEKで進む。
平行の多パラメタ計測を使用しているEGFによって媒介されたEGFRシグナル伝達の光学シグニチャは、特徴づけられた。
角のシフトによって明らかにされるように、図84a(細胞応答)に示すように、EGFの高用量による起因性は特に面白かった。
32nMより上にEGFの高用量によって刺激されるときに、DMRシグナルの新しい位相は静止A431細胞のために観察された。
減少されたシグナルを有する短い遷移位相および長い減衰N−DMRが続く増加するシグナルを有する初期の速いP−DMRの他に、細胞の前の増加するシグナルを有するRP−DMR位相が最終的に同様レベルをそれらの起因性に示すプラトーに渡す不完全な回収が、16nMか32nMある。
1つの可能性は、細胞が経たEGFの高用量によって、後に刺激されるそれである離断プロセス(不完全な再付着プロセスが続く)。
しかし、パラメータが定常的なままのようである全ての三は、異なる供与量でEGFによって刺激となった(図85b;
PWHMだけは、示された)(EGF刺激作用が細胞の底一部内で横方向質量分布の不均質性を増加しないことを示すこと)。
これは、TR−ファロイジン(図85cおよびd)を有するアクチンフィラメントの染色パターンに矛盾している。
これらの像は、EGFが横方向大きさのアクチンフィラメントの有意な再配列を媒介することを示した。
外側塊再分布のいかなる不均質性も検出することができないことは、不斉再分布が主に検知体積の外側で起こるかもしれないことを示唆されるEGFによって引き金を引いた。
(b) ブラジキニンB2受容体シグナル伝達)
ブラジキニン(BK)は、***促進で反ミトーゲン効果を含んでいる多種多様な生理学的で病態生理学的応答のメディエータとして作用するように見える。
否定B1受容体以外の、A431細胞は、内生的ににブラジキニンB2受容体を発現する。
BK刺激作用に応答する静止A431細胞の光学シグニチャが特徴づけられたことをここに明らかにする、そして、A431細胞が動的質量再分布を有するBK刺激作用に応答することを分かった;
その動態、振幅および持続期間は、細胞培養条件、BKの服用および細胞のコンテクストに依存する。
図86において示したように、静止A431細胞のBK刺激作用はPWHM(起源のレベルへ遅い減衰が続く)の速い増加に結果としてなる。その一方で、ピーク強度はPWHMおよび角のシフトのそれらに対する反形であるダイナミック応答を引き起こした。
さらに、両方のパラメータの変化はまた、BK用量依存的である、そして、それらの動態および動態は類似を以前に報告されるDMRシグナルに示した。
これらの結果はEGFによって媒介された細胞応答と比較して、BK刺激作用が細胞の内容物のより有意な不斉再分布を導くことを示唆した。そして、順番に、それは細胞の底一部内で横方向質量分布の不均質性を増やす。
理論的解析が、測定される光学シグニチャが統合した応答であることを明らかにして、標識を必要とせずにそれらの天然型生育環境の細胞を検査するための読み出しのために使われる。
いくつかの細胞応答およびプロセスが接着および拡散移動を含んで、EGFRおよびブラジキニンB2受容体による離断および細胞シグナル伝達は、組織的に調査された。
多数の光学出力パラメータの平行および動態力学的計測は、細胞の底部分内で垂直で横方向大きさの刺激作用によって媒介された動的質量再分布のためのユニークシグニチャの同定を導いた。
細胞接着および拡散移動が、多数ステップを含むとわかった;
ビンクリスチンが、その初期のステップを妨げることによって細胞接着および拡散移動を調整することが可能であるとわかった。
予想外に、細胞の底部分の範囲内の最少で、EGFは明らかな不斉横質量再分布の引き金にならなかった。
これは、細胞の内容物(細胞移動のための重要なプロセス)のEGF−起因性非対称分布が細胞の底部分の細胞の最上部で起こることを示唆した。
しかし、バイオセンサ(例えば、それは、導波路構成を逆転させる)の侵入深度を増やすことは、かかる横方向再分布を検出することが可能でなければならない。
もかかわらず、多パラメタモニタリングは、刺激作用によって誘導した細胞現象をはっきりさせる為により多くの次元の大きさを加えなければならない。
(12.例12−終末点計測を使用している内存性GPCRに対する化合物の高いスループットスクリーニング)
バイオセンサ出力データがここに議論されるように、多くの異なるパラメータを使用して査定され得るという条件で、これらの高スループット方法は基礎を形成される。
そして、ここに議論されるように、死亡または増殖のような細胞または特定の細胞現象内のその特定の細胞または受容体またはシグナル伝達経路の転形は特定のシグニチャを有する。
ここに議論されるように、このシグニチャは一つ以上のバイオセンサ出力パラメータから成り立つ。
高スループット方法のため重要なことは、バイオセンサ出力パラメータデータ収集の期間中の時間点であり、すなわち、方法の期間中の時間点でバイオセンサ出力パラメータデータが細胞の状態の症候となり得、すなわち、シグナル伝達経路が活性化または不活性化され、または、細胞の死または細胞の増殖を示したので重要である。
シグニチャを定義するために用いるバイオセンサ出力パラメータの組み合わせがある所で、この点が、あることが可能である。
このように、動態力学的計測は、適用法をスクリーニングしている高量スループット(HT)のために快く従うようではない。
しかし、特定のリガンドによるDMRシグナル起因性の全体的な動態およびよく特徴づけられた動態に基づく、直ちにHTS適用法のための終末点計測を開発する。
2つのGPCR(A431細胞中のブラジキニンB2受容体、およびCHO細胞中のプロテアーゼ活性化受容体亜タイプ1(PAR1))の光学シグニチャに基づいて、2つの終末点計測は高いスループットスクリーニング法を開発するために使用された。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
2つの終末点間の差分は、ブラジキニン(ブラジキニンB2受容体作用薬)によって媒介されたP−DMR現象の総振幅を反映する。
B2受容体は、A431細胞において内生的に発現される。
細胞は、ブラジキニン刺激の前の静止状態になる。
この例では、384ウェルCoringEpicバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約90%の密集度でA431細胞を含む。
ウェルの半分は100nMでブラジキニンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液HBSSだけで処理された。
結果は、細胞がHBSS緩衝液によって扱ったところが非常に小さい振幅で応ずるだけであることを約800pmの波長の全体の変化の100nMブラジキニン結果によって処理されるその細胞に明らかにした(約−10pm)。
アッセイ窓は全く大きい(約810pm)、そして、アッセイ変数(varability)は小さい(ブラジキニンで処理される細胞のためのCVの約6%)。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
2つの終末点間の差分は、トロンビン(PAR1受容体作用薬)によって媒介されたP−DMR現象の総振幅を反映する。
ここで、異なる細胞は整列する−CHO細胞が使われた。
PAR1受容体は、CHO細胞において内生的に発現される。
細胞は、トロンビン促進の前に細胞を4時間のDMEM培地で培養することによる部分的に静止状態になる。
この例では、384ウェルCoringEpicバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約90%の密集度でCHO細胞を含む。
ウェルの半分は40ユニット/mlでトロンビンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液HBSSだけで処理された。
A431のB2およびCHO細胞のPAR1の作動薬−起因性活性化がGqシグナル伝達を導くので、このアッセイ結果の有意差はGq−タイプ光学シグニチャが両方の細胞株において少なくとも一般的であるということである。
類似した終末点計測を使用することによって、異なる細胞の異なる内因性の標的に対して、GPCRモジュレータをスクリーニングすることが可能である。
2つの時間点は、化合物添加(ベースライン点)前の右側と、化合物添加(測定された点)の後の5分であった。
CHO細胞は、異なる供与量でトロンビンで処理された。
結果は終末点計測を使用することによって、細胞が用量依存的にトロンビン促進に応答したことを示した。そして、12.5ユニット/mlの明らかなEC50を導いた。
このアッセイ結果が終末点計測がGPCRモジュレータの高いスループットスクリーニングを可能にするだけでなくて、孤立性の細胞応答を分析する実在の生理学的な条件
このアッセイ結果は、終末点計測がGPCRモジュレータの高いスループットスクリーニングを可能にするだけでなくて、実際の生理学的条件の内因性GPCRのためのGPCR作動薬の活性現象および効能の決定を可能することを示唆した。
離散的細胞応答または標識化された標的を分析する従来法と異なって、バイオセンサベースの細胞アッセイは、ポテンシャルリガンドの大規模で多数の標的に基づく選抜に適用できる。
内因性GPCRのためのGPCR作動薬の活性現象および効能の決定を可能にして、一旦ユニークなDMRシグニチャが同定されて、特性状態で細胞株の標的の特定のクラスによる特定のシグナル伝達経路に結合されると、化合物のライブラリがスクリーニングされて、化合物は、それらの光学シグニチャに基づく異なるカテゴリに分類され得る。
かかるスクリーニングは、化合物分類法に役立つ。
受容体−特性作動薬−起因性DMRシグナル上のかかる化合物を有する刺激作用に先行する効果が、検査されることができて、標的特異性の指示として使われる。
かかるスクリーニングは、標的に基づくスクリーニングに役立つ。
一旦導出構造が選ばれると、生体細胞上のそれの作用は開示された光学バイオセンサを使用して組織的に研究され得る。
たとえば、シグナル伝達経路の一組の標的の周知のモジュレータのパネルは使って導出構造−起因性DMRシグナル上の転形プロフィールを研究する。そして、特定の標的またはシグナル伝達経路にこのように導出構造の作用を結合する。
一旦リンケージが決められると、バイオセンサはそれから導出構造を最適化するために用いることが可能である。
標的による細胞シグナル伝達が複合しているので、それらが選択的に受容体または特定の経路の特定のオリゴマー形成状態を調整するだけであるように、導出構造が更に最適化されることができて、または、細胞の状態。
Claims (16)
- 角度測定システム又は波長測定システムを使用して細胞上の刺激性事象の効果を試験する方法であって、
共鳴導波路グレーティングの標識フリーバイオセンサを用意し、
前記標識フリーバイオセンサ上で細胞をインキュベートし、
インキュベートされた細胞に刺激性事象を与え、
前記標識フリーバイオセンサを通して前記角度測定システム又は波長測定システムから得られるバイオセンサ出力として、細胞内部、細胞表面、又はそれらの組み合わせからの指向性質量再分布を収集し、
前記指向性質量再分布を分析して細胞上の刺激性事象の効果を決定することを含む方法。 - 刺激性効果が前記バイオセンサ出力から同定される請求項1記載の方法。
- 刺激性事象は、細胞の生存又は増殖に影響を及ぼし、又は、細胞の吸収、分配、代謝、排出または毒性の作用を有する請求項1記載の方法。
- 刺激性事象は化合物を細胞培養に加えることを含み、かつ、
化合物が細胞のシグナル伝達経路細胞を修飾する請求項1記載の方法。 - 化合物が細胞上の細胞表面受容体を修飾する請求項4記載の方法。
- 細胞表面受容体がGq−共役型受容体、Gs−共役型受容体、Gi−共役型受容体、G12/13−共役型受容体、上皮増殖因子受容体(EGFR)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGF)または血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)である請求項5記載の方法。
- 前記バイオセンサ出力を集めることは前記バイオセンサ出力の動態に関連した前記バイオセンサ出力のパラメータを集めることを含み、かつ、
前記バイオセンサ出力の全体的な動態を分析することは、
相転移の完成で1つの位相から他の位相への変化率を分析すること、
前記バイオセンサ出力の出力が完了することにかかる時間の長さを分析すること、
前記バイオセンサの出力の全体的な位相にかかる時間の長さを分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)位相の全体の持続期間を分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)位相の全体の持続期間を分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)の総振幅を獲得するための速度を分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)の総振幅を獲得するための速度を分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)から正の指向性質量再分布(P−DMR)まで移行するために速度を分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)位相から負の指向性質量再分布(N−DMR)位相への、ネット−ゼロ位相から正の指向性質量再分布(P−DMR)位相への、ネット−ゼロ位相から負の指向性質量再分布(N−DMR)位相への、正の指向性質量再分布(P−DMR)位相からネット−ゼロ位相への、若しくは、負の指向性質量再分布(N−DMR)位相からネット−ゼロ位相への、遷移時間tを分析すること、
前記バイオセンサ出力の位相を分析すること、又は、これらの組み合わせの少なくとも1つを含む請求項1記載の方法。 - 位相を分析することは、相転移を分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナルを分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルを分析すること、
ネット−ゼロ指向性質量再分布(ネット−ゼロDMR)を分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナルの形を分析すること、
正の指向性質量再分布(P−DMR)シグナルの振幅を分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルの形を分析すること、
負の指向性質量再分布(N−DMR)シグナルの振幅を分析すること、
前記バイオセンサ出力によって産生される完全な曲線の形を分析すること、又は、これらの組み合わせの少なくとも1つを含む請求項7記載の方法。 - 細胞のインキュベートは細胞が20%〜99%の密集度で育てられる請求項1記載の方法。
- 前記バイオセンサ出力は、導波モードの共鳴ピークまたは導波モードの共鳴バンド像である請求項1記載の方法。
- 前記標識フリーバイオセンサが複数のウェルを有するマイクロプレートの底において包埋され、細胞で異なるタイプが各々の2つ以上のウェルで培養され、刺激性事象が2つ以上のウェルに提供され、刺激性事象が2つ以上のウェルにリガンドを受容体チロシンキナーゼに加えることを含み、前記バイオセンサ出力が2つ以上のウェルから集められ、前記バイオセンサ出力が細胞の異なるタイプの時間依存応答である請求項1記載の方法。
- 細胞が受容体チロシンキナーゼ(RTK)の高い発現量を有し、前記標識フリーバイオセンサが複数のウェルを有するマイクロプレートの底において包埋され、細胞が各々の2つ以上のウェルで培養され、刺激性事象が2つ以上のウェルに提供され、刺激性事象が2つ以上のウェルにリガンドをRTKに添加されることを含み、RTKに対するリガンドで異なる濃度が2つ以上の細胞に添加され、前記バイオセンサ出力が2つ以上のウェルから集められ、前記バイオセンサ出力が異なるウェルの細胞の用量および時間の依存応答である請求項1記載の方法。
- 前記標識フリーバイオセンサの複数が提供され、細胞が前記標識フリーバイオセンサのうちの2つ以上の各々に培養され、刺激性事象が2つ以上の前記標識フリーバイオセンサに与えられ、前記バイオセンサ出力が2つ以上の前記標識フリーバイオセンサから集められる請求項1記載の方法。
- 前記標識フリーバイオセンサが2つの領域を有し、第1領域が堆積された材料を含有しない混合物を有し、第2の領域が堆積された材料を含有する混合物を有し、細胞が前記標識フリーバイオセンサ上でインキュベートされたとき、第2の領域に堆積された細胞が材料によってトランスフェクションされる請求項1記載の方法。
- 前記標識フリーバイオセンサがバリアで物理的に分離され、ウェル内で区画を画定するバリアがマイクロプレートのウェルを画定しているバリアより低い請求項11記載の方法。
- 細胞が受容体チロシンキナーゼ(RTK)を有し、前記標識フリーバイオセンサ界面上の細胞付着および細胞の成長を見越す濃度で血清を含んでいる培地において懸濁され、細胞が前記標識フリーバイオセンサ界面に付着する請求項1記載の方法。
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