JP5128826B2

JP5128826B2 - 新規なメチル化カテキン及びそれを含む組成

Info

Publication number: JP5128826B2
Application number: JP2007028419A
Authority: JP
Inventors: 万里山本; 雅信切田; 大樹本間; 豊一横田
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Asahi Group Holdings Ltd
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Asahi Group Holdings Ltd
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2027-02-07
Also published as: WO2008096586A1; US20100324312A1; EP2119712A4; JP2008189628A; EP2119712A1; CN101605772A

Description

本発明はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートまたはそれらの異性体を基質とした、新規なメチル化カテキン及びその製造方法を提供することを目的とする。

近年、生活環境の変化によりアレルギー患者は急増しているが、アレルギー疾患の治療は長期に渡ることから、副作用がなく日常摂取しても問題がないアレルギー軽減化が強く望まれている。茶は嗜好飲料として多くの人に飲用されており、その主要成分の一つであるエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「EGCG」と略することがある）は、抗アレルギー作用等（非特許文献１）の多くの生理機能が知られている。最近になり、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートやエピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート等は、EGCGと比較してさらに抗アレルギー活性が高いカテキン類であることが判明した（特許文献１、非特許文献２）。

EGCGをメチル化する方法としては、非特許文献３、特許文献２、特許文献３に記載の方法があるが、いずれも化学合成・修飾法によるものであり、EGCGのガロイル基の３位、４位、５位のヒドロキシ基を特異的にメチル化することが非常に困難であった。また、メチル化カテキン生合成酵素を用いて部位特異的かつ高効率にメチル化カテキンを生合成できる方法があるが、EGCGの少なくとも１箇所のヒドロキシ基がメチル化された化合物に関しての請求であり、実施例においても２箇所までをメチル化することしか記載されていない。
特開2000-159670公報特開昭61-145177号公報特開2002-255810号公報 Matsuo, N.et al.,Allergy 1997,52,p58-64 Sano M, Suzuki M ,Miyase T, Yoshino K, Maeda-Yamamoto M.,J.Agric.Food Chem.,47(5),1906-1910(1999) J.Biochem.55,p205(1964)

本発明は天然物由来のEGCGを基質とし酵素反応法を用いることで、これまでに知られているエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートやエピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート等のメチル化カテキンよりさらに抗アレルギー作用の高い新規なメチル化カテキン及びその製造方法を提供することにある。

本発明者らは、特許文献４（特開２００６−１４１２４２号公報）に記載の方法でメチル化カテキン合成酵素遺伝子を単離した。この遺伝子を大腸菌に形質転換することにより、メチル化カテキン合成酵素を得るに至った。

本発明は、下記のとおりである。
（１）化学式Ｉ

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_６は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ_１〜Ｒ_６の少なくとも３ヶ所以上がメチル基を表す）で示されるエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体またはその異性体。

（２）化学式II

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_５は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ_１〜Ｒ_５の少なくとも３ヶ所以上がメチル基を表す）で示されるエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体またはその異性体。

（３）エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体がエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートである（１）に記載のエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体。

（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。

（５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする抗アレルギー剤。

（６）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする飲食品。

（７）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品。

（８）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする化粧品。

（９）化学式III

で示されるエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート及びその異性体、化学式IV

で示されるエピカテキン−３−Ｏ−ガレート及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種を基質として、メチル化カテキン生合成酵素を反応させることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。

本発明の製造方法を用いることによって、EGCG等のカテキン類を基質として効率的に新規なメチル化カテキンを製造できる。さらに本発明によって得られた新規なメチル化カテキンは、抗アレルギー、抗がん、抗肥満、動脈硬化予防、血圧上昇抑制、抗菌等に優れており、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等さまざまな商品へ応用することができる。

本発明における新規なメチル化カテキンは化学式ＩにおいてＲ_１〜Ｒ_６の少なくとも３ヶ所以上がメチル基を示す化合物、又は化学式IIにおいてＲ_１〜Ｒ_５の少なくとも３ヶ所以上がメチル基を示す化合物である。

メチル化カテキンを生合成する酵素（以下、「メチル化カテキン生合成酵素」と呼ぶことがある）は、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート及びそれらの異性体を基質として、前記化学式（Ｉ）、化学式（II）及びそれらの異性体から選ばれた少なくとも１種のメチル化カテキンを生合成する酵素である。本酵素は特開２００６−１４１２４２号公報に記載の方法で取得することができる。

メチル化カテキン生合成酵素タンパク質をpH4.5〜8.5好ましくはpH6.5〜8の緩衝液に懸濁し、EGCGにS-adenosyl-L- methionine (SAM)を加え、5〜60℃好ましくは、20〜40℃で反応させることにより、本発明の新規なメチル化カテキンを含む酵素反応液を得ることができる。

得られた酵素反応液を濃縮し、カテキン類化合物を抽出することが可能な溶媒等を用いることで、新規なメチル化カテキンを含むカテキン類化合物を抽出することができる。また合成吸着剤を充填したカラムに供して吸着させて洗浄し、適当な溶媒を用いて溶出させることによって、新規なメチル化カテキンを製造することが可能である。さらに得られたカテキン類化合物を分取HPLCを用いて、本発明の新規なメチル化カテキンを製造し、得ることができる。

化学式Ｉ、IIで示される化合物及びその異性体は、抗アレルギー作用を有しているので、抗アレルギー剤として有用である。

本発明の飲食品、医薬品、医薬部外品及び化粧品は上記抗アレルギー剤として有用な化学式Ｉ、IIで示される化合物及びその異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有するものである。

飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等飲料（これらの飲料の濃縮原液および調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ギョーザの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠果、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂加工食品；ソース、タレ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品を挙げることができる。

医薬品及び医薬部外品としては、錠剤、液剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等が挙げられる。

化粧品としては、洗顔クリーム、化粧水、パック、美容液等の基礎化粧品類；ファンデーション、口紅、アイカラー等のメイクアップ化粧品類；ネイルエナメル、石鹸、入浴剤、サンスクリーン剤、デオドラントスプレー等のボディ化粧品類；シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアームース等の頭髪用化粧品類；育毛剤、養毛剤、ヘアトニック等の頭皮用化粧品類；香水、オーデコロン等の芳香用化粧品類を挙げることができる。

これらを製造するにあたり通常用いられる補助的な原料や添加物と共に添加することができる。

このような原料および添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニット、デキストリン、クエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。

実施例
以下実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

（エピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートの単離精製）
（酵素反応）
特開２００６−１４１２４２号公報記載の方法で製造したメチル化カテキン生合成酵素の粗酵素液を用いて、酵素反応を行った。酵素反応液（100mM Tris-HCl(pH7.4)、0.2mM MgCl₂、25μM EGCG、50μM SAM、粗酵素液の量は酵素反応液の１／５）を調製し、30℃にて16時間行った後、反応液中の濃度が0.04NになるようにHClを添加して反応を停止させた。反応液を55℃湯温中にて30分間保温し、遠心分離（7,000rpm×10min）後の上清をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液に等量の酢酸エチルを加えて振とうした後、遠心分離（7,000rpm×10min）により有機層を回収し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固し、35(v/v)％メタノールに溶解した。得られた35(v/v)％メタノール溶解液を分取HPLCにて測定し、分取を行った。
分取HPLC条件
カラム：Inertsil ODS-3（20mm×250mm、ジーエルサイエンス社）
Inertsil ODS-3 ガードカラム（20mm×50mm、ジーエルサイエンス社）
移動相：35(v/v)％メタノール
流速：12mL/min、検出器：UV280nm、
以上の条件で40min前後のピーク画分を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥して化合物粉末を得た。

精製した化合物の分子式をTOF-MS（飛行時間型質量分析）を用い、構造式をNMR（核磁気共鳴）を用いて決定した。
TOF-MS測定
「UPLC/TOF-MS条件」
HPLC：ACQUITY UPLC（ウォーターズ社）
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18（50 x 2.1 mm、1.7 mm：ウォーターズ社）
移動相：A液‐メタノール B 液‐0.1(v/v)％ギ酸水溶液
10(v/v)%A液（0 min）→ 50(v/v)％A液（5 min）
流速：0.6 mL/min、カラム温度：40℃、注入量：5 mL
検出器：LCT Premier（ウォーターズ社）
イオン源：ESI（ポジティブ、ネガティブ）、コーン電圧：30 V、キャピラリー電圧：2500 V
イオン源温度：120℃、デソルベーション温度：300℃、MSスキャン：m/z 100-1000

ポジティブイオンモードの測定で、[M+H]⁺=501、ネガティブイオンモードの測定で[M-H]^-=499のシグナルが観測されたことから、整数分子量を500と決定した。また、高分解能質量分析の結果より、分子式をC₂₅H₂₄O₁₁と決定した。
NMR測定
精製した化合物をCD₃ODに溶解した。NMR測定にはXWIN-NMR AV 600（Bruker Biospin社）を用い、各種NMRスペクトル（1H、13C、HSQC、HMBC、COSY）を測定した。表１に測定結果を示した。その結果、化合物をエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートと決定した。

（エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートからエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートへの変換効率）
エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートからエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートへの変換効率の確認を行った。酵素反応液（100mM Tris-HCl(pH7.4)、0.2mM MgCl_2、粗酵素液の量は酵素反応液の１／５）を調製し、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 10mgに対してSAMを10mg,20mg又は50mg添加した後、30℃にて反応させた。反応開始0.25,0.5,1,2,3,4,8時間後に経時的に反応液5mLを回収し、反応液中の濃度が0.04NになるようにHClを添加して反応を停止させた。酢酸エチルを8mL加えた後攪拌し、遠心分離(3000rpm×5min)により有機層を回収し200μlの1%アスコルビン酸を添加、吸引濃縮を行った上でHPLCにてエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成量を測定した。その結果、反応時間の経過とともにエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成量は増加し、さらにSAMの添加量が多いほど、変換効率は増す傾向であった。変換効率の推移を図１に示す。

（エピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートのヒスタミン遊離抑制効果）
マウスマスト細胞からのヒスタミン遊離抑制作用を指標にエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートの効果を確認した。比較対象としてエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートとそれと比較して高い抗アレルギー作用を有することが知られているエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートを用いた。マウスマスト細胞はBMMC（マウス骨髄誘導マスト細胞）を用い、10％非動化FBS（牛胎児血清）、10％D₁₁培養上清（IL-3の給源として）、5mMグルタミン酸Na、50μM 2-メルカプトエタノール添加RPMI1640培地で培養した。細胞（1×10⁷cells/mL）は、抗DNP−マウスIgE抗体で一晩感作した後、翌日Tyrode液に遊離させて披験試料とともに10分インキュベート後、DNP−HAS（抗原）を添加して脱顆粒を誘発し（20分）、上清中のヒスタミン量を液体クロマトグラフ法で測定した。抗アレルギー性はコントロールである蒸留水との相対値の低いものほど高いと判断した。その結果、図２に示されるようにエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートは比較対象のエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート及びエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートと比較して、さらに高いヒスタミン遊離抑制効果を示した。

これらの結果ら、抗アレルギー作用の高い新規なメチル化カテキンを取得できたことが明らかとなった。

本発明の新規なメチル化カテキン（化学式ＩのＲ_１〜Ｒ_６の少なくとも３ヶ所以上がメチル化されたもの、又は化学式IIのＲ_１〜Ｒ_５の少なくとも３ヶ所以上がメチル化されたもの）は、EGCG類のカテキン類を基質とし、メチル化カテキン生合成酵素を用いることで効率的に製造できる。さらに製造された新規なメチル化カテキンは抗アレルギーに非常に優れており、本発明は極めて有用である。

エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートからエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレートへの変換効率を示すグラフ。図１中、１はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 10mgに対してSAM 10mg添加を示し、２はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 10mgに対してSAM 20mg添加、３はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 10mgに対してSAM 50mg添加を示す。マウスマスト細胞におけるヒスタミン遊離抑制効果を示すグラフ。図２中、１はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 12.5μg/mL、２はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート 25μg/mLを示し、３はエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート 12.5μg/mL、４はエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート 25μg/mLを示し、５はエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレート 12.5μg/mL、６はエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３、５−Ｏ−ジメチル）ガレート 25μg/mLを示す。

Claims

エピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート。
請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートを含むことを特徴とする組成物。
請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートを含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートを含むことを特徴とする飲食品。
請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートを含むことを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートを含むことを特徴とする化粧品。
エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを基質として、メチル化カテキン生合成酵素を反応させることを特徴とする請求項１に記載のエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの製造方法。