JP5120838B2 - Method for detecting single nucleotide variants - Google Patents

Description

本発明は、一塩基変異体の検出方法に関する。具体的に、本発明は、一塩基変異体又はその正常型の部分配列と完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子との複合体を用いたキャピラリー電気泳動によって一塩基変異体を検出又は測定する手法において、検出対象とするサンプルに応じて、該手法による一塩基変異体の検出を可能にするキャピラリー電気泳動条件を設定する方法に関する。   The present invention relates to a method for detecting a single nucleotide variant. Specifically, the present invention detects a single nucleotide variant by capillary electrophoresis using a complex of a single nucleotide variant or a complementary nucleic acid fragment that is completely complementary to a normal partial sequence thereof and a water-soluble polymer. Alternatively, the present invention relates to a method for setting capillary electrophoresis conditions that enable detection of a single nucleotide variant by the method according to the sample to be detected.

一塩基多型又は一塩基変異（以下、「SNP」という。）は、生物の個体間又は細胞間におけるゲノム塩基配列中に存在する一塩基の差異を意味し、SNPのタイプに応じて、遺伝子に基づいて産生されるタンパク質の働きが変化する。したがって、SNPの検出は、生物における疾患の発症に関連する遺伝子を見つけるためのマーカーとして有用であるだけでなく、病因関連遺伝子の解析や予測、薬剤応答性や副作用の程度を調べる上でも非常に重要である。   Single nucleotide polymorphism or single nucleotide mutation (hereinafter referred to as “SNP”) means a single base difference in the genome sequence between organisms or between cells, depending on the type of SNP. The function of the protein produced based on this changes. Therefore, SNP detection is not only useful as a marker for finding genes related to the development of diseases in organisms, but it is also very useful for analysis and prediction of etiology-related genes, drug responsiveness, and the degree of side effects. is important.

SNPの検出のために、種々の方法が報告されている。主要な方法は、一塩基変異を含むDNA断片を特異的に増幅可能にするプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法であり、増幅産物は一般に電気泳動によってそのサイズに基づいて検出される。この方法以外に、いくつかの改良法も提案されている。例えば、特許文献１は、核酸の一塩基変異を特異的に認識して増幅するプライマーを使用する核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行ったのち、増幅産物を、それと結合可能なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出する方法を提案している。また、特許文献２は、サンプル核酸とハイブリダイズ可能なペプチド核酸プローブを利用する方法であって、サンプル核酸とプローブとの複合体をヌクレアーゼで処理し、ミスマッチ塩基の切断に基づいて一塩基多型を検出する方法を提案している。さらに、オリゴDNAチップによって大量のSNPを検出する方法も知られている（非特許文献１）。   Various methods have been reported for the detection of SNPs. The primary method is the polymerase chain reaction (PCR) method, which uses primers that allow specific amplification of DNA fragments containing single nucleotide mutations, and amplification products are generally detected on the basis of their size by electrophoresis. In addition to this method, several improved methods have been proposed. For example, Patent Document 1 discloses that a nucleic acid amplification reaction using a primer that specifically recognizes and amplifies a single nucleotide mutation of a nucleic acid is performed on a microfluidic device, and then an amplification product is bound to an oligonucleotide that can bind to the amplified product. A method for detection by hybridization is proposed. Patent Document 2 is a method using a peptide nucleic acid probe capable of hybridizing with a sample nucleic acid, wherein a complex of the sample nucleic acid and the probe is treated with a nuclease, and a single nucleotide polymorphism is obtained based on cleavage of the mismatched base. It proposes a method to detect. Furthermore, a method for detecting a large amount of SNP with an oligo DNA chip is also known (Non-Patent Document 1).

本発明者らは、近年、SNPをより簡便に検出する方法として、キャピラリー電気泳動法を用いる手法（以下、「ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法」という。）を提案している（非特許文献２）。この方法は、一塩基変異(SNP)の検出対象となる塩基変異部位を含む所与の長さの一本鎖DNA試料をPCR増幅して準備し、野生型（正常体）DNAの該塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な短い一本鎖核酸と水溶性高分子との複合体を導入したキャピラリー管を介して該一本鎖DNA試料を電気泳動し、一塩基変異体及び野生型のピーク検出を行うことを含む。   In recent years, the present inventors have proposed a technique using capillary electrophoresis (hereinafter referred to as “weak affinity capillary electrophoresis”) as a method for more easily detecting SNP (Non-patent Document 2). . In this method, a single-stranded DNA sample of a given length including a base mutation site to be detected for single nucleotide mutation (SNP) is prepared by PCR amplification, and the base mutation of wild-type (normal) DNA is prepared. The single-stranded DNA sample is electrophoresed through a capillary tube into which a complex of a short single-stranded nucleic acid and a water-soluble polymer that is completely complementary to the partial sequence including the site is introduced. Including performing peak detection of the mold.

しかしながら、検出対象とする一本鎖DNA試料によっては、野生型のピークと一塩基変異体のピークを明確に区別できないという問題が明らかになった。   However, depending on the single-stranded DNA sample to be detected, the wild type peak and the single-base mutant peak cannot be clearly distinguished.

特開2005-168350JP2005-168350 特開2004-33003JP2004-33003 中村祐輔編、SNP遺伝子多型の戦略、2000年、中山書店Nakamura Yusuke, SNP gene polymorphism strategy, 2000, Nakayama Shoten T. Anadaら, Electrophoresis 2002, 23, 2267-2273.T. Anada et al., Electrophoresis 2002, 23, 2267-2273.

本発明者らが提案したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法は、正常体の塩基変異部位を含む部分配列にハイブリダイズ可能な一本鎖核酸に、正常体との可逆的なハイブリダイゼーションを生じさせ、該一本鎖核酸に結合した水溶性高分子の分子量に依存して、正常体の泳動速度を制御することを原理としている。したがって、上記問題は、検出対象とする一本鎖DNA試料の天然配列、又は塩基変異部位近傍に生じた突然変異などに依存して、該一本鎖DNA自身が、検出されるべき塩基変異部位と二本鎖を形成してしまうような二次構造を形成することにより、上記相補核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨害していることに起因すると推定される。   The weak affinity capillary electrophoresis method proposed by the present inventors causes reversible hybridization with a normal form on a single-stranded nucleic acid capable of hybridizing to a partial sequence containing a base mutation site of a normal form, The principle is to control the migration rate of a normal body depending on the molecular weight of the water-soluble polymer bound to the single-stranded nucleic acid. Therefore, the above problem depends on the natural sequence of the single-stranded DNA sample to be detected or the mutation occurring in the vicinity of the base mutation site. It is presumed that the secondary structure that forms a double strand with the complementary nucleic acid fragment is hindered by forming a secondary structure.

そこで、本発明は、検出対象とする一本鎖DNA試料に応じて、上記手法による一塩基変異体の検出を可能にするキャピラリー電気泳動条件を設定し、かかる条件下で一塩基変異体を検出又は測定する方法を提供することを目的とする。   Therefore, the present invention sets capillary electrophoresis conditions that enable detection of single-base mutants by the above-described method according to the single-stranded DNA sample to be detected, and detects single-base mutants under such conditions. Alternatively, an object is to provide a method for measuring.

一般的に、一本鎖DNA試料による二次構造の形成は、一本鎖DNA試料を高温下におくことによって回避することができるが、ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動は、正常体とのハイブリダイゼーションを担保する必要があるため、かかる高温下では利用することができない。   In general, the formation of secondary structure by a single-stranded DNA sample can be avoided by placing the single-stranded DNA sample at a high temperature, but weak affinity capillary electrophoresis does not allow hybridization with a normal body. It must be secured and cannot be used at such high temperatures.

一方、正常体とのハイブリダイゼーションを担保するために、正常体の塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片の鎖長を長くすると、該相補核酸断片は一塩基変異体とのハイブリダイゼーションも生じてしまい、正常体の泳動速度の特異的な制御ができなくなるという不都合が生じる。   On the other hand, in order to ensure hybridization with the normal form, if the chain length of the complementary nucleic acid fragment that is completely complementary to the partial sequence containing the base mutation site of the normal form is increased, the complementary nucleic acid fragment is This also causes the disadvantage that specific control of the migration speed of a normal body cannot be performed.

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、緩衝液中に含まれる金属イオンの濃度、及びかかる金属イオン濃度下で一本鎖DNA試料が二次構造を生じない泳動温度を予め設定しておき、正常体（又は一塩基変異体）とハイブリダイズする相補核酸断片の長さを調節することによって、正常体、一塩基変異体、及び/又はその他のDNAを明確にピーク分離できることを見出し、本発明を完成させるに至った。   As a result of intensive studies, the present inventors set in advance a concentration of metal ions contained in the buffer solution and an electrophoresis temperature at which the single-stranded DNA sample does not generate secondary structure under such metal ion concentration. In addition, by adjusting the length of a complementary nucleic acid fragment that hybridizes with a normal form (or a single base mutant), it is found that normal, single base mutant, and / or other DNA can be clearly peak-separated, The present invention has been completed.

したがって、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）一塩基変異（SNP）を検出又は測定する方法であって、正常体及び一塩基変異体からなる一本鎖DNA試料、並びに/又はその他の核酸を含む試料を、正常体又は一塩基変異体の一塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子との複合体を充填したキャピラリー管を介して、キャピラリー電気泳動を実施することを含み、該方法を、以下のステップ：
(a)泳動緩衝液中に含まれるアルカリ土類金属イオン及び/又はアルカリ金属イオンからなる金属イオンの濃度を設定するステップ；
(b)ステップ(a)で設定した金属イオン濃度において、一塩基変異体及び正常体の熱安定性の最も高いホールディング構造の融解温度(T_fold)を決定し、前記泳動温度を、該融解温度（T_fold）より高い温度に設定するステップ；並びに
(c)前記金属イオン濃度及び温度条件下で、正常体又は一塩基変異体のいずれかと前記複合体から形成される二重鎖の解離定数K_dが下記の式１： Accordingly, the present invention includes the following features.
(1) A method for detecting or measuring a single nucleotide mutation (SNP), wherein a single-stranded DNA sample consisting of a normal substance and a single nucleotide mutant, and / or a sample containing other nucleic acids is converted into a normal substance or a single nucleotide. Performing capillary electrophoresis through a capillary tube filled with a complex of a complementary nucleic acid fragment and a water-soluble polymer that is completely complementary to a partial sequence containing a single nucleotide mutation site of the mutant, The following steps:
(a) a step of setting a concentration of an alkaline earth metal ion and / or a metal ion comprising an alkali metal ion contained in the electrophoresis buffer;
(b) At the metal ion concentration set in step (a), the melting temperature (T _fold ) of the single-base mutant and normal body having the highest thermal stability is determined, and the migration temperature is determined as the melting temperature. (T _fold ) setting a higher temperature; and
(c) Under the metal ion concentration and temperature conditions, the dissociation constant K _{d of the} double chain formed from either the normal form or the single base mutant and the complex is represented by the following formula 1:

[ここで、μDは、正常体、一塩基変異体又はその他の核酸の電気泳動移動度であり；μCは正常体又は一塩基変異体のいずれかと前記複合体とから形成される二重鎖の電気泳動移動度であり；μ1及びμ2は、それぞれμD＞μ1＞μ2＞μCを満たす任意の値であり、かつμ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値であり；[L]₀は前記相補的な核酸断片の総濃度である。]
を満たすような前記相補核酸断片の長さを設定するステップ；
によって設定した金属イオン濃度、泳動温度及び相補核酸断片長にて実施することを特徴とする、前記方法。

[Where μD is the electrophoretic mobility of a normal, single nucleotide variant or other nucleic acid; μC is the duplex formed from either the normal or single nucleotide variant and the complex. Electrophoretic mobility; μ1 and μ2 are arbitrary values satisfying μD>μ1>μ2> μC, respectively, μ1 is a value relatively close to μD, and μ2 is a value relatively close to μC [L] ₀ is the total concentration of the complementary nucleic acid fragments. ]
Setting the length of the complementary nucleic acid fragment to satisfy:
The method is carried out at a metal ion concentration, electrophoresis temperature and complementary nucleic acid fragment length set by the above.

（２）金属イオンの濃度を、イオン強度で12.4mM以下の範囲に設定することを特徴とする、（1）に記載の方法。
（３）金属イオンがナトリウムイオン及び/又はマグネシウムイオンからなることを特徴とする、（1）に記載の方法。
（４）ステップ(b)において、前記泳動温度を、前記融解温度(T_fold)より5℃以上高い温度に設定することを特徴とする、（1）に記載の方法。
（５）ステップ(c)が、
(c1)所与の長さのランダム配列のDNAを作製するステップ；
(c2)正常体又は一塩基変異体の塩基変異部位を含む部分配列と完全に相補的であり、かつ上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び泳動温度条件にて、該部分配列と形成する二重鎖の熱安定度定数が下記の式2： (2) The method according to (1), wherein the metal ion concentration is set to a range of 12.4 mM or less in terms of ionic strength.
(3) The method according to (1), wherein the metal ion comprises sodium ion and / or magnesium ion.
(4) The method according to (1), wherein in the step (b), the migration temperature is set to a temperature higher by 5 ° C. or more than the melting temperature (T _fold ).
(5) Step (c)
(c1) creating a random sequence of DNA of a given length;
(c2) Completely complementary to the partial sequence containing the base mutation site of the normal or single base mutant, and at the metal ion concentration and electrophoresis temperature conditions set in steps (a) and (b) above, The thermal stability constant of the double strand formed with the partial sequence is represented by the following formula 2:

を満たすような長さの核酸断片を作製し、該核酸断片と水溶性高分子との複合体を合成するステップ；
(c3)上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び泳動温度条件にて、前記ランダム配列のDNA、及び正常体又は一塩基変異体のいずれかとステップ(c2)で合成した複合体とから形成される二重鎖をキャピラリー電気泳動することによって、前記ランダム配列の電気泳動移動度μD、及び前記二重鎖の電気泳動移動度μCを決定するステップ；
(c4)ステップ(c3)で決定したμD及びμCに基づいて、下記の関係：
μD＞μ1＞μ2＞μC
[ここで、μ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値である。]
を満たす任意のμ1及びμ2の値を設定するステップ；
(c5)ステップ(c3)〜(c4)で決定したμD、μC、μ1及びμ2、並びにキャピラリー電気泳動に使用する相補的核酸の総濃度[L]₀を上記の式1に代入して、解離定数K_dの上限値及び下限値を決定するステップ；
(c6)正常体又は一塩基変異体、及び正常体又は一塩基変異体の一塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子の複合体、から形成される二重鎖の解離定数K_dが、ステップ(c5)で決定した範囲になるように、前記相補核酸断片の長さを設定するステップ；
を含む、（1）に記載の方法。

A step of producing a nucleic acid fragment having a length satisfying the above condition and synthesizing a complex of the nucleic acid fragment and a water-soluble polymer;
(c3) A complex synthesized in step (c2) with the DNA of the random sequence and either a normal or single nucleotide variant under the metal ion concentration and electrophoresis temperature conditions set in steps (a) and (b) above Determining the electrophoretic mobility μD of the random sequence and the electrophoretic mobility μC of the double strand by capillary electrophoresis of the duplex formed from the body;
(c4) Based on the μD and μC determined in step (c3), the following relationship:
μD>μ1>μ2> μC
[Wherein μ1 is a value relatively close to μD, and μ2 is a value relatively close to μC. ]
Setting any μ1 and μ2 values that satisfy:
(c5) μD, μC, μ1 and μ2 determined in steps (c3) to (c4), and the total concentration [L] ₀ of complementary nucleic acids used for capillary electrophoresis are substituted into Equation 1 above to dissociate Determining the upper and lower limits of the constant K _d ;
(c6) formed from a complex of a normal or single nucleotide variant, and a complementary nucleic acid fragment and a water-soluble polymer that are completely complementary to a partial sequence containing a single nucleotide mutation site of a normal or single nucleotide variant Setting the length of the complementary nucleic acid fragment such that the duplex dissociation constant K _d falls within the range determined in step (c5);
The method according to (1), comprising:

（６）ランダム配列の長さが、正常体又は一塩基変異体の一本鎖DNAの長さと同じであることを特徴とする、（5）に記載の方法。
（７）前記ステップ(c2)で作製する核酸断片の長さが20mer以上であることを特徴とする、（5）に記載の方法。
（８）正常体又は一塩基変異体の一本鎖DNAの長さが、20mer〜200merであることを特徴とする、（1）に記載の方法。
（９）前記水溶性高分子が、水溶性のビニル系ポリマーであることを特徴とする、（1）に記載の方法。
（１０）前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール（PEG）であることを特徴とする、（1）に記載の方法。
（１１）一塩基変異部位を含む、正常体又は一塩基変異体の塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子との複合体が、該相補核酸断片と水溶性高分子とを結合するリンカーを含むことを特徴とする、（1）に記載の方法。 (6) The method according to (5), wherein the length of the random sequence is the same as the length of the normal or single-base mutant single-stranded DNA.
(7) The method according to (5), wherein the nucleic acid fragment prepared in the step (c2) has a length of 20 mer or more.
(8) The method according to (1), wherein the length of the single-stranded DNA of a normal or single nucleotide variant is 20mer to 200mer.
(9) The method according to (1), wherein the water-soluble polymer is a water-soluble vinyl polymer.
(10) The method according to (1), wherein the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG).
(11) A complex of a complementary nucleic acid fragment and a water-soluble polymer that is completely complementary to a partial sequence including a base mutation site of a normal or single base mutant, including a single nucleotide mutation site, and the complementary nucleic acid fragment The method according to (1), comprising a linker that binds a water-soluble polymer.

本発明の方法によれば、従来のウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動において分離できなかった一本鎖DNA試料中の正常体と一塩基変異体とを、明確にピーク分離することができる。また、本発明の方法によって設定した相補核酸断片の長さは、電気泳動の間、相補核酸断片が、正常体（又は一塩基変異体）とほぼ完全にハイブリダイズしたままであり、かつ一塩基変異体（又は正常体）とは可逆的なハイブリダイゼーションを生じる長さとして設定されるため、該相補核酸断片の影響を全く受けないその他のDNA（例えば、PCRプライマーなどの不純物）との明確なピーク分離も同時に達成することができる。   According to the method of the present invention, it is possible to clearly separate peaks from normal and single base mutants in a single-stranded DNA sample that could not be separated by conventional weak affinity capillary electrophoresis. The length of the complementary nucleic acid fragment set by the method of the present invention is such that the complementary nucleic acid fragment remains almost completely hybridized with the normal form (or single base mutant) during electrophoresis, and the single base Since a mutant (or normal) is set as a length that causes reversible hybridization, it is clearly defined as other DNA (for example, impurities such as PCR primers) that are not affected by the complementary nucleic acid fragment at all. Peak separation can also be achieved simultaneously.

本明細書で使用する「正常体」又は「野生型」という用語は、検出対象となる塩基変異部位に一塩基変異を有しない、一本鎖DNAを指す。   As used herein, the term “normal” or “wild type” refers to a single-stranded DNA having no single-base mutation at the base mutation site to be detected.

本明細書で使用する「一塩基変異体」という用語は、検出対象となる塩基変異部位に一塩基変異を有する、一本鎖DNAを指す。   As used herein, the term “single nucleotide mutant” refers to a single-stranded DNA having a single base mutation at the base mutation site to be detected.

本明細書で使用する「塩基変異部位」という用語は、ゲノム又はcDNA鎖上のSNPの存在可能な部位を指す。   As used herein, the term “base mutation site” refers to a site where a SNP can exist on a genome or cDNA strand.

本明細書で使用する「アフィニティーリガンド」という用語は、所与の一本鎖核酸の部分配列（例えば上記正常体又は一塩基変異体の塩基変異部位を含む部分配列）に完全に相補的な相補核酸断片を指す。   As used herein, the term “affinity ligand” refers to a complement that is completely complementary to a partial sequence of a given single-stranded nucleic acid (for example, a partial sequence that includes the base mutation site of the normal or single nucleotide variant). Refers to a nucleic acid fragment.

本発明は、ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動において、一塩基変異体を検出又は測定する方法に関する。特に本発明は、検出対象とする一本鎖DNA試料中の正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を実現する、ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動条件を設定することを特徴とする。   The present invention relates to a method for detecting or measuring a single nucleotide variant in weak affinity capillary electrophoresis. In particular, the present invention is characterized by setting weak affinity capillary electrophoresis conditions for realizing a clear peak separation between normal and single nucleotide variants in a single-stranded DNA sample to be detected.

ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法による遺伝子変異の検出法
a.原理
本発明で使用するウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法は、公知の塩基配列を有する一本鎖核酸（例えば上記正常体、一塩基変異体など）を特異的に検出又は測定するために設計された方法であり、標的とする前記一本鎖核酸の電気泳動速度を特異的に制御することを基礎とする。具体的には、標的一本鎖核酸に対するアフィニティーリガンドと水溶性高分子からなる核酸高分子複合体を使用することを含む。この複合体は、標的とする前記一本鎖核酸に特異的に結合するため、前記複合体中の水溶性高分子の分子量に依存して、標的一本鎖核酸の泳動速度のみを特異的に制御する。 Detection method of gene mutation by weak affinity capillary electrophoresis
a. Principle The weak affinity capillary electrophoresis used in the present invention is designed to specifically detect or measure a single-stranded nucleic acid having a known base sequence (for example, the above-mentioned normal or single-base mutant). The method is based on specifically controlling the electrophoresis speed of the target single-stranded nucleic acid. Specifically, it includes using a nucleic acid polymer complex comprising an affinity ligand for a target single-stranded nucleic acid and a water-soluble polymer. Since this complex specifically binds to the target single-stranded nucleic acid, depending on the molecular weight of the water-soluble polymer in the complex, only the migration speed of the target single-stranded nucleic acid is specifically determined. Control.

この方法の最も注目すべき利点は、標的とする一本鎖核酸の分子量、電荷とは無関係に、水溶性高分子の分子量に従って標的一本鎖核酸の泳動速度のみを選択的にコントロールすることができるため、標的一本鎖核酸の明確な検出ピークを得ることができるという点である。また、試料中に含まれる標的一本鎖核酸以外のその他の核酸の検出ピークも同時に検出可能であるため、試料中に含まれる標的一本鎖核酸の割合を、それ以外の核酸に対するピーク比として定量することも可能である。   The most notable advantage of this method is that it selectively controls only the migration speed of the target single-stranded nucleic acid according to the molecular weight of the water-soluble polymer, regardless of the molecular weight and charge of the target single-stranded nucleic acid. Therefore, a clear detection peak of the target single-stranded nucleic acid can be obtained. In addition, since the detection peak of other nucleic acids other than the target single-stranded nucleic acid contained in the sample can be detected at the same time, the ratio of the target single-stranded nucleic acid contained in the sample is used as the peak ratio for other nucleic acids. It is also possible to quantify.

b．一本鎖DNA試料の調製
本発明のアフィニティーキャピラリー電気泳動に使用する一本鎖DNA試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって調製することができる。例えば、SNPの検出対象となる塩基変異部位を含む生物試料由来の鋳型核酸を調製し、該塩基変異部位を挟むようにアニーリング可能なPCRプライマーセットを用いてPCR増幅し、増幅した二本鎖DNAを一本鎖に分解し、一本鎖DNA試料を回収することによって調製することができる。 b. Preparation of single-stranded DNA sample The single-stranded DNA sample used for the affinity capillary electrophoresis of the present invention can be prepared by polymerase chain reaction (PCR). For example, a template nucleic acid derived from a biological sample containing a base mutation site to be detected by SNP is prepared, PCR amplified using a PCR primer set that can be annealed to sandwich the base mutation site, and amplified double-stranded DNA Can be prepared by decomposing a single-stranded DNA sample and recovering a single-stranded DNA sample.

前記鋳型核酸は、ゲノム上に検出されるべきSNPが存在する生物であればその起源は限定されない。生物は、非限定的に、原核生物（例えば細菌など）及び真核生物（例えば酵母、菌類、植物、動物など）を含む。また前記鋳型核酸はDNAであり、ゲノムDNAから誘導されるものであっても、RNAから誘導されるものであっても良い。本発明の鋳型核酸は常法に従って調製することができ、特別な方法を用いる必要はない。例えば、鋳型核酸がmRNAから誘導される場合は、所与の生物由来の組織又は細胞の破壊液から常法に従って全RNAを取得し、オリゴdTカラムにてmRNAを回収し、ランダムプライマーを使用する逆転写酵素の存在下でcDNA合成を行うことによって鋳型核酸試料を取得することができる。   The origin of the template nucleic acid is not limited as long as the SNP to be detected exists on the genome. Organisms include, but are not limited to, prokaryotes (eg, bacteria) and eukaryotes (eg, yeast, fungi, plants, animals, etc.). The template nucleic acid is DNA, and may be derived from genomic DNA or RNA. The template nucleic acid of the present invention can be prepared according to a conventional method, and it is not necessary to use a special method. For example, when template nucleic acid is derived from mRNA, total RNA is obtained from a tissue or cell disruption solution derived from a given organism according to a conventional method, mRNA is collected using an oligo dT column, and a random primer is used. A template nucleic acid sample can be obtained by performing cDNA synthesis in the presence of reverse transcriptase.

本発明で用いるPCRは、例えば、鋳型核酸試料、塩基変異部位を含む領域を増幅可能なプライマーセット、4種の塩基（dNTP）並びに耐熱性DNAポリメラーゼの存在下、変性、アニーリング及び伸長を１サイクルとして、通常20〜40サイクルを実施することを含む。変性は、二本鎖DNAを一本鎖に解離するための処理であり、例えば94〜98℃、10秒〜5分間の処理を行う。アニーリングは、一本鎖の鋳型DNAに、それに相補的なプライマーをアニーリングする処理であり、使用するプライマーに応じて設定されるTm値以下の温度、例えば50〜65℃で、5秒〜2分間の処理を行う。伸長は、鋳型DNAの配列に沿ってプライマーを伸長する反応であり、例えば72℃、15秒〜10分間の処理を行う。PCRの具体的操作については、例えば西郷薫及び佐野由美子共訳，分子生物学実験プロトコールIII，15章（1997年）丸善を参照することができる。PCRはサーマルサイクラー（例えばPerkin-Elmer製、Applied Biosystems製など）などの市販の装置を用いて実施し得る。PCR増幅反応後、増幅した二本鎖DNA産物は、当業者に周知の方法、例えばアガロース又はポリアクリルアミド電気泳動法、により精製することができる。   PCR used in the present invention is, for example, one cycle of denaturation, annealing, and extension in the presence of a template nucleic acid sample, a primer set that can amplify a region containing a base mutation site, four types of bases (dNTP), and a heat-resistant DNA polymerase. As usual, it includes carrying out 20 to 40 cycles. Denaturation is treatment for dissociating double-stranded DNA into single strands, for example, treatment at 94 to 98 ° C. for 10 seconds to 5 minutes. Annealing is a process of annealing a primer complementary to a single-stranded template DNA at a temperature below the Tm value set according to the primer used, for example, 50 to 65 ° C., 5 seconds to 2 minutes. Perform the process. The extension is a reaction for extending a primer along the sequence of the template DNA. For example, the extension is performed at 72 ° C. for 15 seconds to 10 minutes. For specific PCR operations, see, for example, Maruzen, translated by Jun Saigo and Yumiko Sano, Molecular Biology Experiment Protocol III, Chapter 15 (1997). PCR can be performed using a commercially available apparatus such as a thermal cycler (for example, manufactured by Perkin-Elmer, Applied Biosystems, etc.). After the PCR amplification reaction, the amplified double-stranded DNA product can be purified by methods well known to those skilled in the art, such as agarose or polyacrylamide electrophoresis.

増幅した二本鎖DNAの一本鎖への分解は、例えばλエクソヌクレアーゼなどのエクソヌクレアーゼによる酵素処理によって行うことができる。この場合、上記PCRに使用するPCRプライマーセットの正方向プライマー又は逆方向プライマーのいずれか一方の5'末端をリン酸化しておくことにより、一本鎖への分解を達成することができる。   Degradation of the amplified double-stranded DNA into single strands can be performed, for example, by enzymatic treatment with an exonuclease such as λ exonuclease. In this case, degradation into a single strand can be achieved by phosphorylating the 5 ′ end of either the forward primer or the reverse primer of the PCR primer set used for the PCR.

酵素処理条件は、使用するエクソヌクレアーゼの至適温度、至適pH又はその近位の値に設定するものとし、酵素量、処理時間は当業者が適宜設定することができる。例えば、λエクソヌクレアーゼを使用したときの酵素処理条件は、酵素量5U（70merの鋳型1pmolに対して）、至適温度37℃、反応時間1時間、至適pH 8.0である。なお、酵素量1Uとは、30℃で1分間当たりに1μmolの基質を反応させるのに必要な酵素量として定義される単位である。   The enzyme treatment conditions are set to the optimum temperature, optimum pH, or a value close to the exonuclease to be used, and the amount of enzyme and treatment time can be appropriately set by those skilled in the art. For example, the enzyme treatment conditions when λ exonuclease is used are an enzyme amount of 5 U (based on 1 pmol of a 70-mer template), an optimum temperature of 37 ° C., a reaction time of 1 hour, and an optimum pH of 8.0. The amount of enzyme 1U is a unit defined as the amount of enzyme required to react 1 μmol of substrate per minute at 30 ° C.

一本鎖DNA試料の回収は、当業者に公知の方法のいずれかによって実施することができる。例えば、このために、アガロースゲル精製、ポリアクリルアミドゲル精製、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿などを挙げることができる。また市販のキットにより本発明の一本鎖DNA試料を精製してもよく、これに限定されるものではないが、QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen)、Genopure Oligo(Bruker Daltonics)などがこの目的に使用できる。   The recovery of the single-stranded DNA sample can be performed by any method known to those skilled in the art. For this purpose, for example, agarose gel purification, polyacrylamide gel purification, phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation and the like can be mentioned. The single-stranded DNA sample of the present invention may be purified by a commercially available kit, but is not limited to this, but QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen), Genopure Oligo (Bruker Daltonics), etc. are used for this purpose. it can.

また調製した一本鎖DNA断片の検出/定量の便宜のため、該一本鎖DNAを標識することが好ましい。該標識は一般的には、上記PCRに使用するPCRプライマーセットの正方向プライマー又は逆方向プライマーのいずれか一方の5'末端をFITC標識することにより行うが、これに限定されるものではない。例えば、その他の放射性同位元素、酵素、蛍光物質等による標識を用いることもでき、この目的のために、これに限定されるものではないが、³²P、アルカリホスファターゼ、ローダミン、フルオレサミン、ダンシル、又はそれらの誘導体などが利用可能である。 In addition, for the convenience of detection / quantification of the prepared single-stranded DNA fragment, it is preferable to label the single-stranded DNA. The labeling is generally carried out by FITC labeling of either the forward primer or the reverse primer of the PCR primer set used for the PCR, but the present invention is not limited to this. For example, labels with other radioisotopes, enzymes, fluorescent materials, etc. can be used for this purpose, including but not limited to ³² P, alkaline phosphatase, rhodamine, fluorescamine, dansyl, or Their derivatives and the like can be used.

上記のようにして調製された試料は、正常体及び一塩基変異体からなる一本鎖DNA試料、並びにPCRプライマーなどの不純物を含む混合物であり、これを本発明のウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動に使用することができる。   Samples prepared as described above are single-stranded DNA samples consisting of normal and single nucleotide variants, and mixtures containing impurities such as PCR primers, which are used for the weak affinity capillary electrophoresis of the present invention. can do.

本発明の方法に使用し得る一本鎖DNA試料（すなわち正常体及び一塩基変異体）の長さに特に制限は無く、例えば20mer〜200mer、好ましくは40mer〜100mer、例えば60merの一本鎖DNA試料を使用することができる。かかる一本鎖DNA試料の長さは、上記PCRに使用するPCRプライマーの設計によって適宜設定することができる。   There is no particular limitation on the length of single-stranded DNA samples (that is, normal and single-base mutants) that can be used in the method of the present invention. For example, 20-mer to 200-mer, preferably 40-mer to 100-mer, such as 60-mer single-stranded DNA. Samples can be used. The length of the single-stranded DNA sample can be appropriately set depending on the design of the PCR primer used for the PCR.

c．核酸高分子複合体の作製
ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法で使用する核酸高分子複合体中のアフィニティーリガンドは、塩基変異部位を含む一本鎖DNA試料（すなわち正常体又は一塩基変異体）に完全に相補的な核酸断片である。使用し得る核酸断片は必ずしもDNAである必要はなく、RNA、DNA/RNAキメラ、他の人工核酸などであってもよい。 c. Preparation of nucleic acid polymer complex The affinity ligand in the nucleic acid polymer complex used in weak affinity capillary electrophoresis is completely applied to a single-stranded DNA sample containing a base mutation site (ie, normal or single base mutant). Complementary nucleic acid fragment. The nucleic acid fragment that can be used is not necessarily DNA, but may be RNA, DNA / RNA chimera, other artificial nucleic acid, or the like.

かかる核酸断片は、当業者に周知の方法、例えば適当な配列のクローニング及び制限酵素による切断、ホスホトリエステル法（例えばNarangら，1979年，Meth.Enzymol.，第68巻，p90〜99参照）、ホスホジエステル法（例えばBrownら，1979年、Meth.Enzymol.，第68巻，p109〜151参照）、エチルホスホアミダイト法（例えばBeaucageら，1981年，Tetrahedron Lett.，第22巻，p1859〜1862参照）などの方法により、直接的に合成することができる。また市販の自動DNA合成装置を使用することによって合成してもよい。   Such nucleic acid fragments can be obtained by methods well known to those skilled in the art, such as cloning of appropriate sequences and cleavage by restriction enzymes, phosphotriester method (see, eg, Narang et al., 1979, Meth. Enzymol., 68, p90-99). Phosphodiester method (see, for example, Brown et al., 1979, Meth. Enzymol., Vol. 68, p109-151), ethyl phosphoramidite method (eg, Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett., Vol. 22, p1859-1862) It can be directly synthesized by a method such as Moreover, you may synthesize | combine by using a commercially available automatic DNA synthesizer.

核酸高分子複合体中の水溶性高分子は、その分子量に依存して標的の一本鎖DNA試料の電気泳動速度を制御するために結合されるものであり、水溶性高分子であればいかなるものを用いてもよい。しかし、前記複合体に結合される高分子の分子量が均一でない場合には、標的の一本鎖DNA試料の検出ピークも均一にならない虞がある。したがって、本発明の方法に用いる水溶性高分子は、分子量範囲の狭い、好ましくは分子量を明確に規定し得る水溶性高分子、例えばリビング重合で合成可能な水溶性高分子（ビニル系ポリマーなど）、好ましくはポリエチレングリコール（PEG）を使用することが好ましい。水溶性高分子の好適な分子量は2,000〜100,000、より好ましくは2,000〜10,000である。   The water-soluble polymer in the nucleic acid polymer complex is bound to control the electrophoresis speed of the target single-stranded DNA sample depending on its molecular weight, and any water-soluble polymer can be used. A thing may be used. However, if the molecular weight of the polymer bound to the complex is not uniform, the detection peak of the target single-stranded DNA sample may not be uniform. Therefore, the water-soluble polymer used in the method of the present invention is a water-soluble polymer having a narrow molecular weight range, preferably a molecular weight that can be clearly defined, for example, a water-soluble polymer that can be synthesized by living polymerization (such as a vinyl polymer). Preferably, polyethylene glycol (PEG) is used. A suitable molecular weight of the water-soluble polymer is 2,000 to 100,000, more preferably 2,000 to 10,000.

前記核酸高分子複合体は、反応性官能基を有する前記アフィニティーリガンドと水溶性高分子とから、当業者に公知の方法、例えばマイケル付加反応（例えばM. P. Lutolf ら Bioconjugate Chemistry 2001, 12, 1051-1056.参照）をはじめ、ヒドラゾン結合形成反応、エーテル結合形成反応、チオエーテル結合反応、ジスルフィド結合形成反応、アミド結合形成反応、エステル結合形成反応、シッフ塩基形成反応、イミノ結合形成反応などにより合成することができる。前記官能基の組合せの例は、これに限定されるものではないが、マレイミド基とチオール基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基と水酸基、アクリル基とチオール基、メタクリル基とチオール基、ヒドラジド基とアミノ基、エポキシド基とアミノ基、エポキシド基と水酸基、エポキシド基とチオール基、ハロゲン化アルキル基とチオール基、ハロアシル基とアミノ基、ピリジルジスルフィド基とチオール基、活性エステル基とアミノ基などを含む。   The nucleic acid polymer complex is prepared from the affinity ligand having a reactive functional group and a water-soluble polymer by a method known to those skilled in the art, such as Michael addition reaction (for example, MP Lutolf et al. Bioconjugate Chemistry 2001, 12, 1051-1056). ), Hydrazone bond formation reaction, ether bond formation reaction, thioether bond reaction, disulfide bond formation reaction, amide bond formation reaction, ester bond formation reaction, Schiff base formation reaction, imino bond formation reaction, etc. it can. Examples of combinations of the functional groups include, but are not limited to, maleimide group and thiol group, carboxyl group and amino group, carboxyl group and hydroxyl group, acrylic group and thiol group, methacryl group and thiol group, hydrazide group And amino groups, epoxide groups and amino groups, epoxide groups and hydroxyl groups, epoxide groups and thiol groups, halogenated alkyl groups and thiol groups, haloacyl groups and amino groups, pyridyl disulfide groups and thiol groups, active ester groups and amino groups, etc. Including.

また前記核酸高分子複合体は、前記アフィニティーリガンドと水溶性高分子とを結合するリンカーにより連結されてもよい。リンカーは、例えば上記のマレイミド基やチオール基から誘導される官能基（コハク酸イミジル基、チオ基）を含むアルキレン鎖である。かかる目的に使用し得るリンカー及び該リンカーを用いた核酸高分子複合体の製造は当業者に公知である。   The nucleic acid polymer complex may be linked by a linker that binds the affinity ligand and the water-soluble polymer. The linker is, for example, an alkylene chain containing a functional group (imidyl succinate group, thio group) derived from the maleimide group or thiol group. A linker that can be used for such purposes and the production of a nucleic acid polymer complex using the linker are known to those skilled in the art.

上記のようにして合成した核酸高分子複合体は、当業者に公知の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、透析、限外濾過、ゲル電気泳動、超遠心分離などによって精製することができる。   The nucleic acid polymer complex synthesized as described above is prepared by methods known to those skilled in the art, such as size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, dialysis, ultrafiltration, gel electrophoresis, ultracentrifugation. It can be purified by.

d．電気泳動条件
一般的には以下の電気泳動条件を用いてアフィニティーキャピラリー電気泳動を実施することができる：塩濃度：[MgCl₂]=0〜10mM、泳動時間：3〜30分、電圧：5〜30kV、温度：15〜60^oC、キャピラリー管：内径25〜100μm、外径150〜500μm、長さ50〜100cm。例えばキャピラリー管の一例として、CEPコーティングキャピラリー（Agilent Technologies社製）を挙げることができる。また電気泳動装置の一例として、例えばP/ACEシステムMDQキャピラリー電気泳動システム（Beckman Coulter社製）を挙げることができる。 d. Electrophoresis conditions In general, affinity capillary electrophoresis can be performed using the following electrophoresis conditions: salt concentration: [MgCl ₂ ] = 0 to 10 mM, electrophoresis time: 3 to 30 minutes, voltage: 5 to 30 kV, temperature: 15-60 ^° C., capillary tube: inner diameter 25-100 μm, outer diameter 150-500 μm, length 50-100 cm. For example, a CEP coated capillary (manufactured by Agilent Technologies) can be cited as an example of a capillary tube. An example of the electrophoresis apparatus is a P / ACE system MDQ capillary electrophoresis system (manufactured by Beckman Coulter).

またピーク検出に使用できる装置として、これに限定されるものではないが、紫外可視光吸収検出器、蛍光検出器、レーザー励起蛍光検出器、示差屈折率検出器、円二色性検出器、電気伝導度検出器、レーザー振動検出器などを挙げることができる。   In addition, devices that can be used for peak detection are not limited to this, but UV-visible light absorption detectors, fluorescence detectors, laser excitation fluorescence detectors, differential refractive index detectors, circular dichroism detectors, electrical detectors, Examples thereof include a conductivity detector and a laser vibration detector.

本発明のウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の条件設定方法
本発明のウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動法は、上記の一般的な電気泳動条件において一塩基変異体の明確なピーク分離ができない一本鎖DNA試料をピーク分離するための特別な条件にて実施することを特徴とする。 Method for setting conditions for weak affinity capillary electrophoresis of the present invention The weak affinity capillary electrophoresis method of the present invention is for peaking a single-stranded DNA sample that cannot clearly separate single-base mutants under the general electrophoresis conditions described above. It is characterized by being carried out under special conditions for separation.

具体的には、本発明の一塩基変異体の検出/定量方法は、正常体に対するアフィニティーリガンドを用いたウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動を、泳動緩衝液中の金属イオン濃度を設定するステップ；電気泳動温度を設定するステップ；及び一塩基変異体とアフィニティーリガンド（すなわち相補核酸断片）とから形成される二重鎖の解離定数K_dが一定の範囲となるようにアフィニティーリガンドの長さを設定するステップ；によって設定した、金属イオン濃度、電気泳動温度及びアフィニティーリガンドの長さにて、実施することを特徴とする。 Specifically, the method for detecting / quantifying a single-base variant of the present invention comprises the step of setting a weak affinity capillary electrophoresis using an affinity ligand for a normal body, setting a metal ion concentration in an electrophoresis buffer; And setting the length of the affinity ligand so that the dissociation constant K _{d of the} duplex formed from the single nucleotide variant and the affinity ligand (ie, complementary nucleic acid fragment) is in a certain range; It is carried out at the metal ion concentration, electrophoresis temperature and affinity ligand length set by

より具体的には、本発明の電気泳動条件は、(a)泳動緩衝液中に含まれるアルカリ土類金属イオン及び/又はアルカリ金属イオンからなる金属イオンの濃度を設定するステップ；(b)一塩基変異体及び正常体の配列に基づき、ステップ(a)で設定した金属イオン濃度において、一塩基変異体及び正常体からなる一本鎖DNA試料が二次構造を生じない泳動温度を設定するステップ；並びに(c)前記金属イオン濃度及び温度条件下で、一塩基変異体と前記複合体から形成される二重鎖の解離定数K_dが下記の式1： More specifically, the electrophoresis conditions of the present invention are as follows: (a) a step of setting the concentration of an alkaline earth metal ion and / or a metal ion comprising an alkali metal ion contained in the electrophoresis buffer; A step of setting an electrophoretic temperature at which a single-stranded DNA sample composed of a single-base mutant and a normal form does not generate a secondary structure at the metal ion concentration set in step (a) based on the sequences of the base mutant and the normal And (c) the dissociation constant K _{d of the} duplex formed from the single-base mutant and the complex under the metal ion concentration and temperature conditions is represented by the following formula 1:

[ここで、μDは、正常体、一塩基変異体又はその他の不純物（例えばPCRプライマーなど）の電気泳動移動度であり；μCは正常体又は一塩基変異体のいずれかと前記複合体とから形成される二重鎖の電気泳動移動度であり；μ1及びμ2は、それぞれμD＞μ1＞μ2＞μCを満たす任意の値であり、かつμ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値であり；[L]₀は前記相補的な核酸断片の総濃度である。]
を満たすような正常体に対するアフィニティーリガンドの長さを設定するステップによって設定することができる。

[Where μD is the electrophoretic mobility of a normal, single nucleotide variant or other impurity (such as a PCR primer); μC is formed from either the normal or single nucleotide variant and the complex. Is the electrophoretic mobility of the double strands; μ1 and μ2 are arbitrary values satisfying μD>μ1>μ2> μC, respectively, and μ1 is relatively close to μD, and μ2 is relative [L] ₀ is the total concentration of the complementary nucleic acid fragments. ]
It can be set by the step of setting the length of the affinity ligand for a normal body that satisfies the above.

ステップ(a)は、泳動緩衝液中の塩濃度、すなわち金属イオンの濃度を設定するステップである。ここで設定し得る金属イオンの濃度は、特に制限はないが、例えば、イオン強度で12.4mM以下、好ましくは0.4mM〜12mM、より好ましくは0.4mM〜11.2mMの範囲に設定することができる。   Step (a) is a step of setting the salt concentration in the electrophoresis buffer, that is, the concentration of metal ions. The concentration of the metal ion that can be set here is not particularly limited, but can be set to, for example, an ionic strength of 12.4 mM or less, preferably 0.4 mM to 12 mM, more preferably 0.4 mM to 11.2 mM.

本発明に使用し得る金属イオンは、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン又はアルカリ金属イオンとアルカリ土類金属イオンの混合イオンである。例えば、本発明で使用し得るアルカリ金属イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられる。また本発明に使用し得るアルカリ土類金属イオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。   The metal ions that can be used in the present invention are alkali metal ions, alkaline earth metal ions, or mixed ions of alkali metal ions and alkaline earth metal ions. For example, examples of alkali metal ions that can be used in the present invention include sodium ions and potassium ions. Examples of alkaline earth metal ions that can be used in the present invention include magnesium ions and calcium ions.

ステップ(b)は、ステップ(a)で設定した金属イオン濃度において、正常体及び一塩基変異体が二次構造を生じない泳動温度を設定するステップである。具体的には、一塩基変異体及び正常体の熱安定性の最も高いホールディング構造の融解温度(T_fold)を決定し、前記泳動温度を、該融解温度（T_fold）より高い温度に設定するステップである。 Step (b) is a step of setting an electrophoretic temperature at which the normal form and the single-base mutant do not produce a secondary structure at the metal ion concentration set in step (a). Specifically, single nucleotide variants and to determine the melting temperature (T _fold) the highest holding structure of the heat stability of the normal body, the electrophoresis temperature, sets a temperature higher than said melting temperature (T _fold) It is a step.

上記融解温度（T_fold）は、例えば、正常体及び一塩基変異体の塩基配列、並びに緩衝液中の金属イオン濃度から、例えばWEB公開ソフトmfold(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)を使用することによって理論計算することができる。この場合、ステップ(a)で使用する緩衝液中の金属イオンを、ナトリウムイオンとマグネシウムイオンの混合イオンとし、かつその金属イオン濃度を、ナトリウムイオン濃度10mMに対して、マグネシウムイオンの濃度を0.6mM以下、好ましくは0.1mM〜0.5mMの範囲に設定することが好ましい。 The melting temperature (T _fold ) can be determined from, for example, the base sequence of normal and single nucleotide variants, and the metal ion concentration in the buffer, for example, the web open software mfold (http://www.bioinfo.rpi.edu/ It can be calculated theoretically by using applications / mfold /). In this case, the metal ion in the buffer used in step (a) is a mixed ion of sodium ion and magnesium ion, and the metal ion concentration is 0.6 mM with respect to the sodium ion concentration of 10 mM. Hereinafter, it is preferably set in the range of 0.1 mM to 0.5 mM.

好ましくは、泳動温度を、上記融解温度（T_fold）より5℃以上高く設定する。これにより、一本鎖DNA試料の完全なアンホールディング（unfolding）を達成することができる。泳動温度の上限は、上記融解温度（T_fold）より高い温度であれば特に制限はなく、使用する泳動装置が推奨する最高温度を設定してもよい。 Preferably, the electrophoresis temperature is set 5 ° C. or more higher than the melting temperature (T _fold ). Thereby, complete unfolding of the single-stranded DNA sample can be achieved. The upper limit of the electrophoresis temperature is not particularly limited as long as it is higher than the melting temperature (T _fold ), and the maximum temperature recommended by the electrophoresis apparatus to be used may be set.

ステップ(c)は、ステップ(a)及びステップ(b)で設定した泳動緩衝液中の金属イオン濃度及び泳動温度下で、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数（K_d）が上記式1を満たすような範囲となるように、アフィニティーリガンドの長さを設定するステップである。 Step (c) is the dissociation constant of the duplex formed from the single-base mutant and the affinity ligand at the metal ion concentration and migration temperature set in step (a) and step (b). This is a step of setting the length of the affinity ligand so that (K _d ) is in a range satisfying the above-mentioned formula 1.

以下、式１について説明する。   Hereinafter, Formula 1 will be described.

上記の正常体に対するアフィニティーリガンドは、正常体の塩基変異部位を含む部分配列と完全に相補的な配列からなる。すなわち、アフィニティーリガンドは、一塩基変異体の対応する部分配列と一塩基ミスマッチの関係にある。以下、説明の便宜のために、これを単に「アフィニティーリガンド」という。   The above-mentioned affinity ligand for the normal form consists of a sequence that is completely complementary to the partial sequence containing the base mutation site of the normal form. That is, the affinity ligand has a single base mismatch relationship with the corresponding partial sequence of the single base mutant. Hereinafter, for convenience of explanation, this is simply referred to as “affinity ligand”.

ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動において、試料に含まれる核酸の泳動速度は、アフィニティーリガンドに結合した水溶性高分子の分子量によってのみ制御可能であるため、試料中の正常体及び一塩基変異体の泳動速度は、専らアフィニティーリガンドとの結合力に依存している。したがって、ステップ(a)及びステップ(b)で設定した泳動緩衝液中の金属イオン濃度及び泳動温度下で、正常体と一塩基変異体とが、アフィニティーリガンドに対してそれぞれ異なる解離定数（K_d）を有し、その結果、アフィニティーリガンドと異なる程度で相互作用するようなアフィニティーリガンドの長さを設定することによって、両者の明確なピーク分離が可能になる。 In weak affinity capillary electrophoresis, the migration speed of the nucleic acid contained in the sample can be controlled only by the molecular weight of the water-soluble polymer bound to the affinity ligand, so the migration speed of normal and single nucleotide variants in the sample is Depends solely on the binding power to the affinity ligand. Therefore, under the metal ion concentration and electrophoresis temperature set in step (a) and step (b), the normal form and the single nucleotide mutant have different dissociation constants (K _d) for the affinity ligand. As a result, by setting the length of the affinity ligand so that it interacts with the affinity ligand to a different extent, it is possible to separate the peaks clearly.

ここで、正常体と一塩基変異体のみを含む試料において両者をピーク分離する場合には、正常体とは相互作用するが、一塩基変異体とは全く相互作用を生じないようなアフィニティーリガンドの長さを設定することによって両者の明確なピーク分離が可能であるが、実際の試料中には、アフィニティーリガンドと全く相互作用しない不純物（PCRプライマーなど）も混在しているため、このような不純物とのピーク分離（すなわち、一塩基変異体と該不純物とのピーク分離）も可能にする必要がある。   Here, in the case of separating both peaks in a sample containing only a normal form and a single base mutant, an affinity ligand that interacts with the normal form but does not interact with the single base form at all. Although it is possible to separate the peaks clearly by setting the length, impurities that do not interact with the affinity ligand at all (such as PCR primers) are also mixed in the actual sample. Separation (ie, peak separation of a single-base mutant and the impurity) should also be possible.

したがって、正常体及び一塩基変異体の明確なピーク分離を実現するアフィニティーリガンドの長さは、下記の式に示されるように、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数（K_d）が、正常体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数（「正常体の解離定数」とも称する）と、不純物とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数（「不純物の解離定数」とも称する）の間の値となるような長さである：
正常体の解離定数＜K_d＜不純物の解離定数
ここで、上記二重鎖の解離定数（K_d）は、下記式3のように表すことができる： Therefore, the length of the affinity ligand that achieves a clear peak separation between normal and single base mutants is the dissociation of the duplex formed from the single base mutant and the affinity ligand, as shown in the following formula: The constant (K _d ) is the dissociation constant of the double chain formed from the normal form and the affinity ligand (also referred to as “dissociation constant of normal form”), and the dissociation of the double chain formed from the impurity and the affinity ligand. The length is a value between constants (also referred to as “impurity dissociation constant”):
Normal body dissociation constant <K _d <impurity dissociation constant Here, the double chain dissociation constant (K _d ) can be expressed as in the following formula 3:

[ここで、[C]は、泳動中のある時点における、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の濃度であり；[D]は、前記時点における、上記二重鎖を形成していない一塩基変異体の濃度であり；[L]は、前記時点における、上記二重鎖を形成していないアフィニティーリガンドの濃度である。]

[Where [C] is the concentration of the duplex formed from the single base variant and the affinity ligand at a point in time during electrophoresis; [D] is the concentration of the duplex at that point in time; The concentration of the single-base variant that has not formed; [L] is the concentration of the affinity ligand that has not formed the duplex at the time point. ]

また、一塩基変異体の電気泳動移動度μ_fは、一塩基変異体の電気泳動移動度μDと、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の電気泳動移動度μCに、それぞれ時間のパラメーターα、βを乗じた値の和とみなすことができるから、 In addition, the electrophoretic mobility μ _f of the single base mutant is the electrophoretic mobility μD of the single base mutant and the electrophoretic mobility μC of the double strand formed from the single base mutant and the affinity ligand. Since it can be regarded as the sum of values multiplied by the time parameters α and β,

[ここで、α及びβは時間比率を表し、かつα＋β＝１である。]
と表すことができる。
時間比率を表すα及びβは、濃度比率と近似するとみなし得るため、

[Where α and β represent the time ratio and α + β = 1. ]
It can be expressed as.
Since α and β representing the time ratio can be considered to approximate the concentration ratio,

[ここで、t_Ｃは、電気泳動期間中に一塩基変異体がアフィニティーリガンドと二重鎖を形成している時間を示し；t_Ｄは、電気泳動期間中に一塩基変異体がアフィニティーリガンドと二重鎖を形成していない時間を示し；[D]₀は、一塩基変異体の総濃度を指す。]

[Where t _C indicates the time during which the single base mutant forms a duplex with the affinity ligand during the electrophoresis period; t _D indicates that the single base mutant forms the affinity ligand during the electrophoresis period. Indicates time not forming duplex; [D] ₀ refers to the total concentration of the single base variant. ]

と表すことができる。

It can be expressed as.

そして、上記の解離定数（K_d）は、上記式３〜６から、 And said dissociation constant ( _Kd ) from said Formula 3-6,

と表すことができる。

It can be expressed as.

ここで、アフィニティーリガンドの総濃度[L]₀は、上記[L]と[C]の総和に等しく、アフィニティーリガンドは一本鎖DNA試料の量に対して大過剰の量でキャピラリー管内に導入されるものであるから、実質的に[L]と[L]₀は同一であるとみなすことができる。したがって、上記式7は、 Here, the total concentration [L] ₀ of the affinity ligand is equal to the sum of the above [L] and [C], and the affinity ligand is introduced into the capillary tube in a large excess with respect to the amount of the single-stranded DNA sample. Therefore, [L] and [L] ₀ can be regarded as substantially the same. Therefore, the above equation 7 is

と表すことができる。

It can be expressed as.

一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の電気泳動度μCは、アフィニティーリガンドと二重鎖を形成した一塩基変異体の電気泳動移動度を指し、上述したように、電気泳動移動度は専らアフィニティーリガンドに結合された水溶性高分子の分子量に依存するため、アフィニティーリガンドと二重鎖を形成した正常体、或いは水溶性高分子の電気泳動移動度とみなすこともできる。また一塩基変異体の電気泳動移動度μDは、アフィニティーリガンドの相互作用を受けない核酸断片の電気泳動移動度を指すため、アフィニティーリガンドの相互作用を受けない正常体、不純物、或いはランダム配列の核酸断片の電気泳動移動度とみなすこともできる（すなわち、正常体、一塩基変異体、不純物又はランダム配列のDNAは、いずれもアフィニティーリガンドの相互作用を全く受けない場合には、その長さに関わらず同じ電気泳動移動度を示す）。   The electrophoretic mobility μC of a double strand formed from a single base mutant and an affinity ligand refers to the electrophoretic mobility of the single base mutant that has formed a double strand with an affinity ligand. Since the mobility depends exclusively on the molecular weight of the water-soluble polymer bound to the affinity ligand, it can be regarded as the electrophoretic mobility of a normal form or a water-soluble polymer that forms a double chain with the affinity ligand. In addition, the electrophoretic mobility μD of a single-base mutant refers to the electrophoretic mobility of a nucleic acid fragment that is not affected by the interaction of an affinity ligand. Therefore, a normal, impurity, or random sequence nucleic acid that is not affected by the interaction of an affinity ligand. It can also be regarded as the electrophoretic mobility of a fragment (ie, normal, single nucleotide variants, impurities or random sequence DNA, regardless of their length if they are not subject to any affinity ligand interaction at all). The same electrophoretic mobility).

したがって、ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動において、正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を実現する一塩基変異体の電気泳動移動度μ_fが採り得る上限値及び下限値をそれぞれμ1、μ2（μD＞μ1＞μ2＞μCである）と表した場合に、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数K_dの範囲を上記式１のように表すことができる。 Therefore, in weak affinity capillary electrophoresis, the upper and lower limits that can be taken by the electrophoretic mobility μ _f of the single-base mutant that achieves a clear peak separation between the normal and single-base mutant are μ1 and μ2 (μD, respectively). >Μ1>μ2> μC), the range of the dissociation constant K _d of the duplex formed from the single-base mutant and the affinity ligand can be expressed as in the above formula 1.

ここで、上記μC、μD、μ1及びμ2の数値は、例えば下記のステップを含むプレ実験を行うことによって具体的に求めることができる：
(c1)所与の長さのランダム配列のDNAを作製するステップ；
(c2)正常体の塩基変異部位を含む部分配列と完全に相補的であり、かつ上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び温度条件にて、該部分配列と形成する二重鎖の熱安定度定数が下記の式２： Here, the numerical values of μC, μD, μ1, and μ2 can be specifically obtained by performing a pre-experiment including the following steps, for example:
(c1) creating a random sequence of DNA of a given length;
(c2) The two partial sequences formed with the partial sequence are completely complementary to the partial sequence including the base mutation site of the normal form and under the metal ion concentration and temperature conditions set in steps (a) and (b) above. The thermal stability constant of the heavy chain is the following formula 2:

を満たすような長さの核酸断片を作製し、該核酸断片と水溶性高分子との複合体を合成するステップ；
(c3)上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び温度条件にて、前記ランダム配列のDNA、及び正常体とステップ(c2)で合成した複合体とから形成される二重鎖を、キャピラリー電気泳動することによって、前記ランダム配列の電気泳動移動度μD、及び前記二重鎖の電気泳動移動度μCを決定するステップ；
(c4)ステップ(c3)で決定したμD及びμCに基づいて、下記の関係：
μD＞μ1＞μ2＞μC
[ここで、μ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値である。]
を満たす任意のμ1及びμ2の値を設定するステップ。

A step of producing a nucleic acid fragment having a length satisfying the above condition and synthesizing a complex of the nucleic acid fragment and a water-soluble polymer;
(c3) A duplex formed from the DNA of the random sequence and the normal and the complex synthesized in step (c2) under the metal ion concentration and temperature conditions set in steps (a) and (b) above. Determining the electrophoretic mobility μD of the random sequence and the electrophoretic mobility μC of the double strand by capillary electrophoresis of the strands;
(c4) Based on the μD and μC determined in step (c3), the following relationship:
μD>μ1>μ2> μC
[Wherein μ1 is a value relatively close to μD, and μ2 is a value relatively close to μC. ]
Setting any μ1 and μ2 values that satisfy

ステップ(c1)は、不純物の電気泳動移動度μDを決定するために用いる、ランダム配列のDNAを調製するステップである。ここで、上記ランダム配列は、本発明のアフィニティーリガンドと相補的ではなく、アフィニティーリガンドとハイブリダイズすることができない配列である。   Step (c1) is a step of preparing DNA having a random sequence used for determining the electrophoretic mobility μD of impurities. Here, the random sequence is a sequence that is not complementary to the affinity ligand of the present invention and cannot hybridize with the affinity ligand.

ここで使用するランダム配列の長さに特に制限はない。本発明のウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動においては、上記のように、試料中に含まれる核酸の電気泳動移動度は、専らアフィニティーリガンドとの相互作用に依存し、DNAの電荷、サイズはほとんど無視できる程度にしか影響しないからである。例えば、上記ランダム配列のDNAは、20mer〜200mer、好ましくは40mer〜100mer、例えば60merの長さとすることができる。上記ランダム配列の長さは、正常体又は一塩基変異体の一本鎖DNAの長さと同じにすることが好ましい。   There is no particular limitation on the length of the random sequence used here. In the weak affinity capillary electrophoresis of the present invention, as described above, the electrophoretic mobility of the nucleic acid contained in the sample depends exclusively on the interaction with the affinity ligand, and the charge and size of the DNA are almost negligible. This is because it only affects. For example, the DNA of the random sequence can have a length of 20 mer to 200 mer, preferably 40 mer to 100 mer, for example 60 mer. The length of the random sequence is preferably the same as the length of single-stranded DNA of a normal or single nucleotide variant.

上記ランダム配列は、当業者に公知の方法で調製することができる。例えば、適当な配列のクローニング及び制限酵素による切断、ホスホトリエステル法（例えばNarangら，1979年，Meth.Enzymol.，第68巻，p90〜99参照）、ホスホジエステル法（例えばBrownら，1979年、Meth.Enzymol.，第68巻，p109〜151参照）、エチルホスホアミダイト法（例えばBeaucageら，1981年，Tetrahedron Lett.，第22巻，p1859〜1862参照）などの方法により、直接的に合成することができる。また市販の自動DNA合成装置を使用することによって合成してもよい。   The random sequence can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, cloning of appropriate sequences and cleavage with restriction enzymes, the phosphotriester method (see eg Narang et al., 1979, Meth. Enzymol., Vol. 68, p90-99), the phosphodiester method (eg Brown et al., 1979). , Meth. Enzymol., 68, p109-151), and the ethyl phosphoramidite method (see, for example, Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett., 22, p1859-1862). can do. Moreover, you may synthesize | combine by using a commercially available automatic DNA synthesizer.

ステップ(c2)は、アフィニティーリガンドと正常体とから形成される二重鎖、すなわち水溶性高分子、の電気泳動移動度μCを決定するために用いる、正常体に対するアフィニティーリガンドと水溶性高分子との複合体を合成するステップである。アフィニティーリガンドの合成方法、及び該アフィニティーリガンドと水溶性高分子との複合体の合成方法は上記の通りである。   Step (c2) is a step of determining the electrophoretic mobility μC of a duplex formed from an affinity ligand and a normal form, that is, a water-soluble polymer, This is a step of synthesizing the complex. The method for synthesizing the affinity ligand and the method for synthesizing the complex of the affinity ligand and the water-soluble polymer are as described above.

このアフィニティーリガンドの長さは、電気泳動期間中の正常体との完全なハイブリダイゼーションを担保するために、上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び温度条件にて、該アフィニティーリガンドと正常体とから形成される二重鎖の熱安定度定数K_aが、上記式2を満たすような値となる長さとする。なお、熱安定度定数K_aは、上記式8で決定される解離定数K_dの逆数として求めることができる。 In order to ensure complete hybridization with a normal body during the electrophoresis period, the length of this affinity ligand is the same as the affinity ligand at the metal ion concentration and temperature conditions set in steps (a) and (b) above. thermal stability constant K _a of the duplex formed from the ligand and a normal body, a length which is a value that satisfies the equation 2. The thermal stability constant K _a, can be determined as the reciprocal of the dissociation constant K _d determined by the formula 8.

上記式２を満たすアフィニティーリガンドの長さは、典型的には20mer以上であり、好ましくは20〜30mer、より好ましくは20〜25mer、さらに好ましくは20〜22merである。   The length of the affinity ligand satisfying the above formula 2 is typically 20 mer or more, preferably 20 to 30 mer, more preferably 20 to 25 mer, and still more preferably 20 to 22 mer.

ステップ(c3)は、上記電気泳動移動度μDとμCとを上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び温度条件にて実測するステップである。具体的には、ステップ(c2)で合成した複合体を充填したキャピラリー管を介して、ステップ(c1)で作製したランダム配列のDNAと正常体とをキャピラリー電気泳動し、ランダム配列のDNA及び正常体と上記アフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の移動時間を計測し、下記の式：
電気泳動移動度＝キャピラリー有効長÷移動時間÷単位長さあたりの印可電圧
によって、μD及びμCを決定する。 Step (c3) is a step of actually measuring the electrophoretic mobility μD and μC under the metal ion concentration and temperature conditions set in steps (a) and (b). Specifically, through the capillary tube filled with the complex synthesized in step (c2), the random sequence DNA prepared in step (c1) and the normal sequence were subjected to capillary electrophoresis, and the random sequence DNA and normal sequence were detected. The migration time of the duplex formed from the body and the affinity ligand is measured, and the following formula:
Electrophoretic mobility = capillary effective length ÷ movement time ÷ μD and μC are determined by applied voltage per unit length.

ステップ(c4)は、ステップ(c3)で決定したμD及びμCに基づいて、一塩基変異体及び正常体のピーク分離を可能にするμ_fの範囲、すなわちμ_fの上限値であるμ1と、μ_fの下限値であるμ2を決定するステップである。μ_fの値がμD＞μ_f＞μCを満たす場合に、一塩基変異体及び正常体のピーク分離が可能になるので、μ1及びμ2はμD＞μ1＞μ2＞μCを満たす任意の値を選択する。その際、選択可能なμ_fの範囲をなるべく広くするために、μ1とμ2の差がより大きいことが好ましい。また、μ1は相対的にμDに近い任意の値であり、μ2は相対的にμCに近い任意の値とする。 Step (c4) includes a based on μD and μC determined in step (c3), single nucleotide variants and scope of mu _f that allows the peak separation of the normal body, that is, the upper limit value of mu _f .mu.1, a step of determining a μ2 which is the lower limit of the mu _f. If the value of mu _f satisfies μD> μ _f> μC, since it is possible to peak separation of single nucleotide variants and normal body, the .mu.1 and .mu.2 select any value that satisfies μD>μ1>μ2> μC To do. At that time, in order to as wide as possible a range of selectable mu _f, it is preferably larger the difference μ1 and .mu.2. Further, μ1 is an arbitrary value relatively close to μD, and μ2 is an arbitrary value relatively close to μC.

次いで、上記ステップ（c1）〜（c4）によって決定したμD、μC、μ1及びμ2の値を上記式1に代入して、一塩基変異体及び正常体のピーク分離を可能にする、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数K_dの範囲を確定する。
一塩基変異体とアフィニティーリガンドとから形成される二重鎖の解離定数K_dは、アフィニティーリガンドの長さを変えることによって操作することができるため、アフィニティーリガンドの長さを、上記のように決定した二重鎖の解離定数K_dの範囲内になるように設定する。 Next, the values of μD, μC, μ1 and μ2 determined by the above steps (c1) to (c4) are substituted into the above formula 1 to enable single base mutation and normal form peak separation. The range of the dissociation constant K _d of the duplex formed from the body and the affinity ligand is determined.
Since the dissociation constant K _d of the duplex formed from the single nucleotide variant and the affinity ligand can be manipulated by changing the length of the affinity ligand, the length of the affinity ligand is determined as described above. The dissociation constant K _d of the double strand is set within the range.

かかる二重鎖の解離定数K_dは、例えば融解温度のDNA濃度依存性から熱力学量を求めることによって実験的に決定することができる。具体的には、100倍以上のDNA濃度範囲で融解温度を測定し（望ましくは10ポイント以上）、y軸に得られた融解温度の逆数、x軸に全DNA濃度をとることによって得られる直線の傾きとy切片の値から二重鎖形成のエンタルピー変化およびエントロピー変化の値を求めることによってK_dを決定することができる。具体的操作については、例えば杉本直己著，遺伝子とバイオテクノロジー，2章（1999年）丸善を参照することができる。 Such a double-strand dissociation constant K _d can be experimentally determined, for example, by determining a thermodynamic quantity from the DNA concentration dependence of the melting temperature. Specifically, a straight line obtained by measuring the melting temperature in the DNA concentration range of 100 times or more (preferably 10 points or more) and taking the reciprocal of the melting temperature obtained on the y-axis and the total DNA concentration on the x-axis. K _d can be determined by determining the value of enthalpy change and entropy change in double-strand formation from the slope of and the y-intercept value. For specific operations, see Naomi Sugimoto, Gene and Biotechnology, Chapter 2 (1999) Maruzen.

また二重鎖の解離定数K_dは、泳動緩衝液中の金属イオン濃度、泳動温度、一塩基変異体及びアフィニティーリガンドの配列、アフィニティーリガンドの長さに基づいて、理論計算してもよい。理論計算には、公知のソフトウェアの使用などが意図される。ただし、この場合には、上記のように実測したK_dの値と、使用したソフトウェアにより理論計算したK_dの値との整合性を確認した上で使用することが好ましい。これによりK_dを実測する手順が省略化され、本発明をより簡便に実施することが可能になる。 The double-strand dissociation constant K _d may be theoretically calculated based on the metal ion concentration in the electrophoresis buffer, the electrophoresis temperature, the sequence of the single base mutant and the affinity ligand, and the length of the affinity ligand. For the theoretical calculation, use of known software is intended. However, in this case, the value of the actually measured K _d as described above, be used after confirming the consistency with the value a K _d which is theoretically calculated by software used preferably. As a result, the procedure for actually measuring _Kd is omitted, and the present invention can be more easily implemented.

その後、上記工程(a)〜(c)によって設定した泳動緩衝液中の金属イオン濃度、泳動温度、及びアフィニティーリガンドの長さにて、上記ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動を行うことにより、一塩基変異体を明確に検出/定量することができる。   Thereafter, by performing the weak affinity capillary electrophoresis at the metal ion concentration, the electrophoresis temperature, and the length of the affinity ligand in the electrophoresis buffer set by the above steps (a) to (c), a single base mutant Can be clearly detected / quantified.

なお、上に説明したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の条件設定方法は、説明の便宜上、正常体に対するアフィニティーリガンドを用いた場合についてのみ説明がなされているが、一塩基変異体に対するアフィニティーリガンドを用い、正常体の解離定数（K_d）の範囲を決定することによって同様の結果を得ることができることは当業者に明らかであり、本発明の範囲内であるものとみなす。 In addition, for convenience of explanation, the condition setting method for weak affinity capillary electrophoresis described above has been described only for the case of using an affinity ligand for a normal body. It will be apparent to those skilled in the art that similar results can be obtained by determining the range of body dissociation constants (K _d ) and are considered to be within the scope of the present invention.

以下の実施例で本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

本実施例では、イネいもち病菌の農薬耐性に関連する、シタロン脱水酵素のコドン75部位のSNPを検出対象とした。   In this example, SNP at the codon 75 site of citalone dehydrase, which is related to the pesticide resistance of rice blast fungus, was detected.

一本鎖DNA試料の調製
イネの葉から綿棒でイネいもち病菌を採取した。これを健常なイネの葉の上に接種し、蛍光灯下のペトリ皿内で20℃で12時間保持した。このイネいもち病菌を凍結乾燥し、破砕機で液体窒素中でガラスビーズを用いて破砕した。得られた粉体を、50mM EDTA、100mM LiClおよび0.2％メルカプトエタノールを含む10mMトリス−塩酸緩衝液に懸濁させたのち、30分間65℃に加熱した。懸濁液を5分間13,000rpmで遠心分離して上澄みを分取し、10mgのRNA分解酵素を加えて、37℃で1時間インキュベートした。つづいて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:1）で3回抽出した。水層をクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）で2回抽出し、イソプロピルアルコールを加えてDNAのペレットを形成させた。このペレットを遠心分離で回収し、70％冷エタノールで洗浄して乾燥させた後、1mM EDTAを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に再懸濁させた。 Preparation of single-stranded DNA sample Rice blast fungus was collected from rice leaves with a cotton swab. This was inoculated on healthy rice leaves and kept at 20 ° C. for 12 hours in a Petri dish under fluorescent light. The rice blast fungus was lyophilized and crushed with glass beads in liquid nitrogen using a crusher. The obtained powder was suspended in 10 mM Tris-HCl buffer containing 50 mM EDTA, 100 mM LiCl and 0.2% mercaptoethanol, and then heated to 65 ° C. for 30 minutes. The suspension was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was separated, 10 mg of RNase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, it was extracted three times with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1). The aqueous layer was extracted twice with chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and isopropyl alcohol was added to form a DNA pellet. The pellet was collected by centrifugation, washed with 70% cold ethanol, dried, and resuspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM EDTA.

こうして得られた全DNAをテンプレートに用いて、望みの部位をPCRで増幅してサンプルDNAを調製することは容易に可能であるが、本項では化学合成した一本鎖DNAをサンプルに使用した例を以下に示す。   Although it is possible to easily prepare sample DNA by PCR amplification of the desired site using the total DNA thus obtained as a template, this section uses chemically synthesized single-stranded DNA for the sample. An example is shown below.

DNA-PEG複合体の合成
片末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（PEG）と5'末端にチオール基を有するDNAのマイケル付加反応によりDNA-PEG複合体を合成した。実施例に使用したPEGの分子量はいずれも20,000である。 Synthesis of DNA-PEG complex A DNA-PEG complex was synthesized by a Michael addition reaction of polyethylene glycol (PEG) having a maleimide group at one end and DNA having a thiol group at the 5 'end. The molecular weight of PEG used in the examples is 20,000.

まず、S-S結合形成を抑制する目的でDNA試料に添加されているDithiothreitol（DTT）を除去するために、5'末端チオール化DNA（HPLC精製品、つくばオリゴサービス）を10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 7.4）に溶解し、これをNAP5カラム（GE Healthcare）に通して溶出液を500μLずつ回収した。5'末端チオール化DNAの溶出は、溶出液のUV吸光度測定（260nm）によって追跡した。   First, in order to remove dithiothreitol (DTT) added to the DNA sample for the purpose of suppressing SS bond formation, 5'-terminal thiolated DNA (HPLC purified product, Tsukuba Oligo Service) was added to 10 mM Tris-HCl buffer ( It was dissolved in pH 7.4) and passed through a NAP5 column (GE Healthcare) to collect 500 μL of the eluate. The elution of the 5 ′ terminal thiolated DNA was followed by UV absorbance measurement (260 nm) of the eluate.

次に、回収したチオール化DNA溶出液に対し、脱酸素の目的でアルゴンガスのバブリングを5分間行った。Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride（TCEP）を10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）に溶解させて同様のバブリング操作を行ったのちに、DNAに対してモル当量になるようにDNA溶液に添加した。さらに、末端マレイミド化PEG（mPEG-MAL Mw 20,000 Da: NEKTAR）を同じく10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）に溶解させて同様のバブリング操作を行ったのちに、DNAに対して3モル当量になるように加えた。以上の混合液を室温で一晩攪拌することにより、DNA-PEG複合体を得た。   Next, the recovered thiolated DNA eluate was bubbled with argon gas for 5 minutes for the purpose of deoxygenation. Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) is dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and the same bubbling operation is performed. Added. Further, after dissolving the terminal maleimidated PEG (mPEG-MAL Mw 20,000 Da: NEKTAR) in the same 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and carrying out the same bubbling operation, 3 molar equivalents to DNA It was added to become. The above mixture was stirred overnight at room temperature to obtain a DNA-PEG complex.

DNA-PEG複合体の精製
DNA-PEG複合体溶液をSephadex G-100（Amersham Biosciences）を充填したゲルろ過カラムに通し、溶出液を500μLずつ，計35本回収した。DNA-PEG複合体の溶出は，プレートリーダー（Spectra Max Plus³⁸⁴: Molecular Devices）を用いて追跡し（260nm）、No.14-20のフラクションを回収して凍結乾燥した。 Purification of DNA-PEG complex
The DNA-PEG complex solution was passed through a gel filtration column filled with Sephadex G-100 (Amersham Biosciences), and 500 μL of the eluate was collected in a total of 35. The elution of the DNA-PEG complex was followed (260 nm) using a plate reader (Spectra Max Plus ³⁸⁴ : Molecular Devices), and the No. 14-20 fraction was collected and lyophilized.

得られた白色粉末を100〜200μLのMilliQ水に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー（Q Sepharose Fast Flow: Amersham Biosciences）により精製した。流速は1.0mL/min、カラム温度は40.0℃とした。キャリアAを10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）、キャリアBを1M NaClを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）として、0.0min（A:100％、B:0％）→15.0min（A:100％、B:0％）→20.0min（A:50％、B:50％）→40.0min（A:0％、B:100％）→50.0min（A:0％、B:100％）→60.0min（A:100％、B:0％）というグラジエント条件を採用した。吸収度変化（260nm）を追跡することにより、キャリアAの割合が44％となったときにDNA-PEG複合体の溶出が始まることを確認し、該当するフラクションを回収した。   The obtained white powder was dissolved in 100 to 200 μL of MilliQ water and purified by anion exchange chromatography (Q Sepharose Fast Flow: Amersham Biosciences). The flow rate was 1.0 mL / min and the column temperature was 40.0 ° C. Carrier A as 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), Carrier B as 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1 M NaCl, 0.0 min (A: 100%, B: 0%) → 15.0 min (A: 100%, B: 0%) → 20.0min (A: 50%, B: 50%) → 40.0min (A: 0%, B: 100%) → 50.0min (A: 0%, B : 100%) → 60.0min (A: 100%, B: 0%) Gradient condition was adopted. By tracking the change in absorbance (260 nm), it was confirmed that elution of the DNA-PEG complex started when the ratio of carrier A reached 44%, and the corresponding fraction was collected.

陰イオン交換クロマトグラフィーの回収溶液を遠心エバポレーションにより適量（4mL程度）まで濃縮した後、分画分子量8,000の透析膜（使用するDNAの分子量によって適当な分画分子量の透析膜を使用）を用いて透析（脱塩）を2日間行った。得られた溶液を凍結乾燥することによりDNA-PEG複合体を得た。   Concentrate the recovered solution of the anion exchange chromatography to an appropriate amount (about 4 mL) by centrifugal evaporation, and then use a dialysis membrane with a molecular weight cutoff of 8,000 (use a dialysis membrane with an appropriate molecular weight cutoff depending on the molecular weight of the DNA used). Dialysis (desalting) was performed for 2 days. The obtained solution was freeze-dried to obtain a DNA-PEG complex.

ウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動による一塩基変異体の検出
実施例で使用したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の分析条件は以下の通りである：
試料濃度： 各0.05μM、50μL
リガンド濃度： 5.0μM
泳動バッファー： 50mM トリスホウ酸塩（pH 7.4）
塩濃度： [NaCl]=10mM
0.1 mM≦[MgCl₂]≦0.6 mM
温度： 25℃≦T≦60℃
電圧： 15kV
キャピラリー電気泳動装置：P/ACEシステムMDQ（Beckman Coulter社製）
キャピラリー： CEPコーティングキャピラリー（Agilent Technologies社製）
内径75mm
有効長40cm
サンプル注入： 10秒につき0.5 psi
検出： Ex 488nm、Em 520nm
また、下記の実験1〜5で用いた、イネいもち病菌の農薬耐性に関連するシタロン脱水酵素の塩基変異部位を含む正常体、一塩基変異体の塩基配列は以下の通りである： Detection of single nucleotide variants by weak affinity capillary electrophoresis The analysis conditions of weak affinity capillary electrophoresis used in the examples are as follows:
Sample concentration: 0.05μM and 50μL each
Ligand concentration: 5.0μM
Running buffer: 50 mM trisborate (pH 7.4)
Salt concentration: [NaCl] = 10mM
0.1 mM ≦ [MgCl ₂ ] ≦ 0.6 mM
Temperature: 25 ℃ ≦ T ≦ 60 ℃
Voltage: 15kV
Capillary electrophoresis device: P / ACE system MDQ (Beckman Coulter)
Capillary: CEP coated capillary (Agilent Technologies)
Inner diameter 75mm
Effective length 40cm
Sample injection: 0.5 psi per 10 seconds
Detection: Ex 488nm, Em 520nm
In addition, the base sequences of normal and single base mutants containing the base mutation site of Citalon dehydrase related to pesticide resistance of rice blast fungus used in the following Experiments 1 to 5 are as follows:

正常体
FITC-5’-GAGTTCGTCGGCATGGTCTCGAGCAAGCAGGTGCTGGGCGACCCCACCCTCCGCACGCAG-3'（配列番号１） Normal
FITC-5'-GAGTTCGTCGGCATGGTCTCGAGCAAGCAG G TGCTGGGCGACCCCACCCTCCGCACGCAG-3 '(SEQ ID NO: 1)

一塩基変異体
FITC-5’-GAGTTCGTCGGCATGGTCTCGAGCAAGCAGATGCTGGGCGACCCCACCCTCCGCACGCAG-3'（配列番号２）
[ここで、下線部は塩基変異部位を示す。] Single nucleotide variants
FITC-5'-GAGTTCGTCGGCATGGTCTCGAGCAAGCAG A TGCTGGGCGACCCCACCCTCCGCACGCAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
[Here, the underlined portion indicates the base mutation site. ]

実験1
図１に実験1で使用したアフィニティーリガンドの塩基配列（18mer）（配列番号３）を示す。 Experiment 1
FIG. 1 shows the base sequence (18mer) (SEQ ID NO: 3) of the affinity ligand used in Experiment 1.

本発明の方法のステップ(a)〜(c)に基づいて設定したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の際の泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度及び二重鎖の熱安定度定数K_a（1/K_d）の範囲は、以下の通りである：
金属イオン濃度：[Na^＋]＝10 mM、[Mg^2＋]＝0.5 mM
T_fold＝43℃
電気泳動温度：60℃（＞43℃）
二重鎖の熱安定度定数K_a（＝1/K_d）の範囲：8.6×10⁴M^-1 ＜K_a ＜1.3×10⁶M^-1 Steps of the method of the present invention (a) ~ a metal ion concentration of the running buffer during Week affinity capillary electrophoresis set based (c), the electrophoresis temperature and duplex thermal stability constant K _a ( The range of 1 / K _d ) is as follows:
Metal ion concentration: [Na ⁺ ] = 10 mM, [Mg ²⁺ ] = 0.5 mM
T _fold = 43 ℃
Electrophoresis temperature: 60 ° C (> 43 ° C)
Range of thermal stability constant K _a (= 1 / K _d ) of double chain: 8.6 × 10 ⁴ M ⁻¹ < K _a < 1.3 × 10 ⁶ M ⁻¹

実験1で設定したアフィニティーリガンドの長さ（18mer）は、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとの結合定数K_a（＝１/K_d）が、ステップ(c)で決定した範囲よりも小さい値、すなわち4.0×10⁴M^-1（実測値）を示す長さである。これは、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとの結合力が、正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を可能にする範囲よりも弱いことを示す。 The length (18mer) of the affinity ligand set in Experiment 1 is a value in which the binding constant K _a (= 1 / K _d ) between the single-base mutant and the affinity ligand is smaller than the range determined in step (c). That is, the length indicates 4.0 × 10 ⁴ M ⁻¹ (actual measurement value). This indicates that the binding force between the single nucleotide variant and the affinity ligand is weaker than the range that allows clear peak separation between the normal and single nucleotide variants.

かかる条件にて実施したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを図１に示す。図１の泳動チャートに示されるように、一塩基変異体と不純物の検出ピークが重なり、両者が正しくピーク分離されていないことが分かる。この結果は、一塩基変異体がアフィニティーリガンドとほとんど相互作用していないことを示しており、アフィニティーリガンドの長さを、一塩基変異体とアフィニティーリガンドとの結合力が正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を可能にする範囲よりも弱くなるような長さに設定したことと一致する。   An electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis carried out under such conditions is shown in FIG. As shown in the electrophoresis chart of FIG. 1, it can be seen that the single-base mutant and the impurity detection peak overlap, and the peaks are not correctly separated. This result shows that the single-base mutant hardly interacts with the affinity ligand. The length of the affinity ligand and the binding strength between the single-base mutant and the affinity ligand are normal and single-base mutant. This is consistent with setting the length to be weaker than the range that allows clear peak separation.

実験2
図２に実験2で使用したアフィニティーリガンドの塩基配列（20mer）（配列番号４）を示す。 Experiment 2
FIG. 2 shows the base sequence (20mer) (SEQ ID NO: 4) of the affinity ligand used in Experiment 2.

本発明の方法のステップ(a)〜(c)に基づいて設定したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の際の泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度及び二重鎖の熱安定度定数K_a（＝1/K_d）の範囲は、実験1と同様である。 Steps of the method of the present invention (a) ~ a metal ion concentration of the running buffer during Week affinity capillary electrophoresis set based (c), the electrophoresis temperature and duplex thermal stability constant K _a ( = 1 / K _d ) is the same as in Experiment 1.

実験2で設定したアフィニティーリガンドの長さ（20mer）は、一塩基変異体とアフィニティーリガンドの結合定数K_a（＝１/K_d）が、ステップ（c）で決定した範囲内の値、すなわち3.4×10⁵M^-1（実測値）を示す長さである。 The length of the affinity ligand set in Experiment 2 (20 mer) is a value within the range determined by the binding constant K _a (= 1 / K _d ) of the single-base mutant and the affinity ligand in step (c), ie 3.4 This is a length indicating × 10 ⁵ M ⁻¹ (measured value).

かかる条件にて実施したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを図２に示す。図２の泳動チャートに示されるように、正常体、一塩基変異体及び不純物が明確にピーク分離できていることが分かる。   An electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis carried out under such conditions is shown in FIG. As shown in the electrophoresis chart of FIG. 2, it can be seen that normal, single-base mutant, and impurities can be clearly separated into peaks.

このように、設定した泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度において、アフィニティーリガンドの長さを調整することによって、正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を達成することができることが示された。   Thus, by adjusting the length of the affinity ligand at the set metal ion concentration and electrophoresis temperature in the electrophoresis buffer, it is possible to achieve a clear peak separation between normal and single nucleotide variants. Indicated.

実験3
図３に実験3で使用したアフィニティーリガンドの塩基配列（18mer）（配列番号３）を示す。 Experiment 3
FIG. 3 shows the base sequence (18mer) (SEQ ID NO: 3) of the affinity ligand used in Experiment 3.

本発明の方法のステップ(a)〜(c)に基づいて設定したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の際の泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度及び二重鎖の熱安定度定数K_a（＝1/K_d）の範囲は、以下の通りである：
金属イオン濃度：[Na^＋]＝10 mM、[Mg^2＋]＝0.5 mM
T_fold＝43℃
電気泳動温度：50℃（＞43℃）
二重鎖の熱安定度定数K_a（＝1/K_d）範囲：3.8×10⁴M^-1 ＜K_a ＜1.3×10⁶M^-1 Steps of the method of the present invention (a) ~ a metal ion concentration of the running buffer during Week affinity capillary electrophoresis set based (c), the electrophoresis temperature and duplex thermal stability constant K _a ( = 1 / K _d ) is as follows:
Metal ion concentration: [Na ⁺ ] = 10 mM, [Mg ²⁺ ] = 0.5 mM
T _fold = 43 ℃
Electrophoresis temperature: 50 ° C (> 43 ° C)
Double chain thermal stability constant K _a (= 1 / K _d ) range: 3.8 × 10 ⁴ M ⁻¹ < K _a < 1.3 × 10 ⁶ M ⁻¹

実験3で設定したアフィニティーリガンドの長さ（18mer）は、一塩基変異体と該アフィニティーリガンドの結合定数K_a（＝１/K_d）が、ステップ(c)で決定した範囲よりも大きい値、すなわち3.6×10⁷M^-1（実測値）を示す長さである。これは、一塩基変異体とアフィニティーリガンドの結合力が、正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を可能にする範囲よりも強いことを示す。 The length (18 mer) of the affinity ligand set in Experiment 3 is a value in which the binding constant K _a (= 1 / K _d ) between the single-base mutant and the affinity ligand is larger than the range determined in step (c), That is, it is a length indicating 3.6 × 10 ⁷ M ⁻¹ (actual measurement value). This indicates that the binding strength between the single base mutant and the affinity ligand is stronger than the range that allows clear peak separation between the normal form and the single base mutant.

かかる条件にて実施したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを図３に示す。図３の泳動チャートに示されるように、正常体と一塩基変異体の検出ピークが重なり、両者が正しくピーク分離されていないことが分かる。この結果は、アフィニティーリガンドが正常体と同程度に一塩基変異体とも相互作用していることを示しており、アフィニティーリガンドの長さを、一塩基変異体とアフィニティーリガンドの結合力が正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を可能にする理論値よりも強くなるような長さに設定したことと一致する。   FIG. 3 shows an electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis performed under such conditions. As shown in the electrophoresis chart of FIG. 3, it can be seen that the detection peaks of the normal and single nucleotide mutants overlap, and the peaks are not correctly separated. This result shows that the affinity ligand interacts with the single base mutant as much as the normal body, and the length of the affinity ligand is the same as the binding capacity between the single base mutant and the affinity ligand. This is consistent with setting the length to be stronger than the theoretical value that enables clear peak separation of single nucleotide variants.

実験4
図４に実験4で使用したアフィニティーリガンドの塩基配列（16mer）（配列番号５）を示す。 Experiment 4
FIG. 4 shows the base sequence (16mer) (SEQ ID NO: 5) of the affinity ligand used in Experiment 4.

本発明の方法のステップ(a)〜(c)に基づいて設定したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の際の泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度及び二重鎖の熱安定度定数K_a（＝1/K_d）の範囲は、実験3と同様である。 Steps of the method of the present invention (a) ~ a metal ion concentration of the running buffer during Week affinity capillary electrophoresis set based (c), the electrophoresis temperature and duplex thermal stability constant K _a ( = 1 / K _d ) is the same as in Experiment 3.

実験4で設定したアフィニティーリガンドの長さ（16mer）は、一塩基変異体と該アフィニティーリガンドの結合定数K_a（＝１/K_d）が、ステップ(c)で決定した範囲内の値、すなわち2.8×10⁵M^-1（実測値）を示す長さである。 The length of the affinity ligand set in Experiment 4 (16 mer) is a value within the range determined by the binding constant K _a (= 1 / K _d ) of the single base mutant and the affinity ligand in step (c). It is a length indicating 2.8 × 10 ⁵ M ⁻¹ (measured value).

かかる条件にて実施したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを図４に示す。図４の泳動チャートに示されるように、正常体、一塩基変異体及び不純物が明確にピーク分離できていることが分かる。   FIG. 4 shows an electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis performed under such conditions. As shown in the electrophoresis chart of FIG. 4, it can be seen that normal, single-base mutant, and impurities can be clearly separated into peaks.

このように、設定した泳動緩衝液中の金属イオン濃度、電気泳動温度において、アフィニティーリガンドの長さを調整することによって、正常体と一塩基変異体の明確なピーク分離を達成することができることが示された。   Thus, by adjusting the length of the affinity ligand at the set metal ion concentration and electrophoresis temperature in the electrophoresis buffer, it is possible to achieve a clear peak separation between normal and single nucleotide variants. Indicated.

実験5
実験5では、本発明のステップ(b)で設定する泳動温度として、正常体及び一塩基変異体の熱安定性の最も高いホールディング構造の融解温度（T_fold）よりも低い温度を設定したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動について比較検討した。 Experiment 5
In Experiment 5, the weak affinity in which the electrophoresis temperature set in step (b) of the present invention was set to a temperature lower than the melting temperature (T _fold ) of the holding structure with the highest thermal stability of normal and single nucleotide mutants. A comparative study was conducted on capillary electrophoresis.

泳動緩衝液中の金属イオン濃度は、上記実験1〜4と同じであり、したがって、正常体と一塩基変異体の上記融解温度（T_fold）は43℃である。またアフィニティーリガンドは、上記実験4と同じものを用いた。 The concentration of metal ions in the electrophoresis buffer is the same as in Experiments 1 to 4 above, and thus the melting temperature (T _fold ) of normal and single base variants is 43 ° C. The same affinity ligand as that used in Experiment 4 was used.

泳動温度を、30℃、40℃又は50℃に設定して実施したウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャート結果を図５に示す。   FIG. 5 shows the electrophoresis chart results of weak affinity capillary electrophoresis performed at the electrophoresis temperature set to 30 ° C., 40 ° C. or 50 ° C.

図５に示されるように、T_foldよりも低い30℃、40℃にて実施した電気泳動においては、正常体と一塩基変異体とをピーク分離できていないが分かる。これは、T_foldよりも低い温度において、正常体及び一塩基変異体のホールディング構造がとけずに、アフィニティーリガンドと十分に相互作用できないことに起因していると考えられる。 As shown in FIG. 5, in electrophoresis performed at 30 ° C. and 40 ° C. lower than T _fold , it can be seen that normal and single nucleotide mutants could not be separated into peaks. This is considered to be due to the fact that the holding structure of the normal form and the single-base mutant cannot be fully interacted with the affinity ligand at a temperature lower than T _fold .

一方、T_foldよりも高い50℃にて実施した電気泳動においては、実験4と同様に、正常体と一塩基変異体とを明確にピーク分離できており、泳動温度として少なくともT_fold以上の温度を設定する必要があることが示唆された。 On the other hand, in electrophoresis performed at 50 ° C. higher than T _fold , normal peak and single nucleotide mutant were clearly separated as in Experiment 4, and the electrophoresis temperature was at least T _fold or higher. It was suggested that it is necessary to set.

図１は、実験1で用いたアフィニティーリガンドの塩基配列、及び該アフィニティーリガンドを用いたウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを示す。FIG. 1 shows the base sequence of the affinity ligand used in Experiment 1 and the electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis using the affinity ligand. 図２は、実験2で用いたアフィニティーリガンドの塩基配列、及び該アフィニティーリガンドを用いたウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを示す。FIG. 2 shows the base sequence of the affinity ligand used in Experiment 2 and the electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis using the affinity ligand. 図３は、実験3で用いたアフィニティーリガンドの塩基配列、及び該アフィニティーリガンドを用いたウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを示す。FIG. 3 shows the base sequence of the affinity ligand used in Experiment 3 and the electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis using the affinity ligand. 図４は、実験4で用いたアフィニティーリガンドの塩基配列、及び該アフィニティーリガンドを用いたウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動の泳動チャートを示す。FIG. 4 shows the base sequence of the affinity ligand used in Experiment 4 and the electrophoresis chart of weak affinity capillary electrophoresis using the affinity ligand. 図５は、実験4と同じ実験条件下、30℃、40℃及び50℃の泳動温度にてウィークアフィニティーキャピラリー電気泳動を実施することにより得られた各泳動チャートを示す。FIG. 5 shows each electrophoresis chart obtained by performing weak affinity capillary electrophoresis under the same experimental conditions as those in Experiment 4 and at electrophoresis temperatures of 30 ° C., 40 ° C. and 50 ° C.

Claims (10)

一塩基変異（SNP）を検出又は測定する方法であって、正常体及び一塩基変異体からなる一本鎖DNA試料、並びに/又はその他の核酸を含む試料を、正常体又は一塩基変異体の一塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子との複合体を充填したキャピラリー管を介して、キャピラリー電気泳動を実施することを含み、該方法を、以下のステップ：
(a)泳動緩衝液中に含まれるアルカリ土類金属イオン及び/又はアルカリ金属イオンからなる金属イオンの濃度を設定するステップ；
(b)ステップ(a)で設定した金属イオン濃度において、一塩基変異体及び正常体の熱安定性の最も高いホールディング構造の融解温度(T_fold)を決定し、前記泳動温度を、該融解温度（T_fold）より高い温度に設定するステップ；並びに
(c)前記金属イオン濃度及び温度条件下で、正常体又は一塩基変異体のいずれかと前記複合体から形成される二重鎖の解離定数K_dが下記の式１：

[ここで、μDは、正常体、一塩基変異体又はその他の核酸の電気泳動移動度であり；μCは正常体又は一塩基変異体のいずれかと前記複合体とから形成される二重鎖の電気泳動移動度であり；μ1及びμ2は、それぞれμD＞μ1＞μ2＞μCを満たす任意の値であり、かつμ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値であり；[L]₀は前記相補的な核酸断片の総濃度である。]
を満たすような前記相補核酸断片の長さを設定するステップ；
によって設定した金属イオン濃度、泳動温度及び相補核酸断片長にて実施することを特徴とし、
ステップ(c)が、
(c1)所与の長さのランダム配列のDNAを作製するステップ；
(c2)正常体又は一塩基変異体の塩基変異部位を含む部分配列と完全に相補的であり、かつ上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び泳動温度条件にて、該部分配列と形成する二重鎖の熱安定度定数が下記の式2：

を満たすような長さの核酸断片を作製し、該核酸断片と水溶性高分子との複合体を合成するステップ；
(c3)上記ステップ(a)及び(b)で設定した金属イオン濃度及び泳動温度条件にて、前記ランダム配列のDNA、及び正常体又は一塩基変異体のいずれかとステップ(c2)で合成した複合体とから形成される二重鎖をキャピラリー電気泳動することによって、前記ランダム配列の電気泳動移動度μD、及び前記二重鎖の電気泳動移動度μCを決定するステップ；
(c4)ステップ(c3)で決定したμD及びμCに基づいて、下記の関係：
μD＞μ1＞μ2＞μC
[ここで、μ1は相対的にμDに近い値であり、μ2は相対的にμCに近い値である。]
を満たす任意のμ1及びμ2の値をピーク分離が可能になるように設定するステップ；
(c5)ステップ(c3)〜(c4)で決定したμD、μC、μ1及びμ2、並びにキャピラリー電気泳動に使用する相補的核酸の総濃度[L] ₀ を上記の式1に代入して、解離定数K _d の上限値及び下限値を決定するステップ；
(c6)正常体又は一塩基変異体、及び正常体又は一塩基変異体の一塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子の複合体、から形成される二重鎖の解離定数K _d が、ステップ(c5)で決定した範囲になるように、前記相補核酸断片の長さを設定するステップ；
を含む、前記方法。 A method for detecting or measuring a single nucleotide mutation (SNP), wherein a single-stranded DNA sample consisting of a normal substance and a single nucleotide mutant, and / or a sample containing other nucleic acid Performing capillary electrophoresis through a capillary tube filled with a complex of a complementary nucleic acid fragment that is completely complementary to a partial sequence containing a single nucleotide mutation site and a water-soluble polymer, the method comprising the steps of: Steps:
(a) a step of setting a concentration of an alkaline earth metal ion and / or a metal ion comprising an alkali metal ion contained in the electrophoresis buffer;
(b) At the metal ion concentration set in step (a), the melting temperature (T _fold ) of the single-base mutant and normal body having the highest thermal stability is determined, and the migration temperature is determined as the melting temperature. (T _fold ) setting a higher temperature; and
(c) Under the metal ion concentration and temperature conditions, the dissociation constant K _{d of the} double chain formed from either the normal form or the single base mutant and the complex is represented by the following formula 1:

[Where μD is the electrophoretic mobility of a normal, single nucleotide variant or other nucleic acid; μC is the duplex formed from either the normal or single nucleotide variant and the complex. Electrophoretic mobility; μ1 and μ2 are arbitrary values satisfying μD>μ1>μ2> μC, respectively, μ1 is a value relatively close to μD, and μ2 is a value relatively close to μC [L] ₀ is the total concentration of the complementary nucleic acid fragments. ]
Setting the length of the complementary nucleic acid fragment to satisfy:
Metal ion concentration set by, and characterized in that it is performed at a migration temperature and complementary nucleic acid fragment length,
Step (c)
(c1) creating a random sequence of DNA of a given length;
(c2) Completely complementary to the partial sequence containing the base mutation site of the normal or single base mutant, and at the metal ion concentration and electrophoresis temperature conditions set in steps (a) and (b) above, The thermal stability constant of the double strand formed with the partial sequence is represented by the following formula 2:

A step of producing a nucleic acid fragment having a length satisfying the above condition and synthesizing a complex of the nucleic acid fragment and a water-soluble polymer;
(c3) A complex synthesized in step (c2) with the DNA of the random sequence and either a normal or single nucleotide variant under the metal ion concentration and electrophoresis temperature conditions set in steps (a) and (b) above Determining the electrophoretic mobility μD of the random sequence and the electrophoretic mobility μC of the double strand by capillary electrophoresis of the duplex formed from the body;
(c4) Based on the μD and μC determined in step (c3), the following relationship:
μD>μ1>μ2> μC
[Wherein μ1 is a value relatively close to μD, and μ2 is a value relatively close to μC. ]
Setting any μ1 and μ2 values that satisfy the conditions such that peak separation is possible;
(c5) μD, μC, μ1 and μ2 determined in steps (c3) to (c4), and the total concentration [L] ₀ of complementary nucleic acids used for capillary electrophoresis are substituted into Equation 1 above to dissociate Determining the upper and lower limits of the constant K _d ;
(c6) formed from a complex of a normal or single nucleotide variant, and a complementary nucleic acid fragment and a water-soluble polymer that are completely complementary to a partial sequence containing a single nucleotide mutation site of a normal or single nucleotide variant Setting the length of the complementary nucleic acid fragment such that the duplex dissociation constant K _d falls within the range determined in step (c5);
Including the method. 金属イオンの濃度を、イオン強度で12.4mM以下の範囲に設定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。   2. The method according to claim 1, wherein the concentration of the metal ions is set to a range of 12.4 mM or less in terms of ionic strength. 金属イオンがナトリウムイオン及び/又はマグネシウムイオンからなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, characterized in that the metal ions consist of sodium ions and / or magnesium ions. ステップ(b)において、前記泳動温度を、前記融解温度(T_fold)より5℃以上高い温度に設定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein in step (b), the migration temperature is set to a temperature higher by 5 ° C. or more than the melting temperature (T _fold ). ランダム配列の長さが、正常体又は一塩基変異体の一本鎖DNAの長さと同じであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1 , wherein the length of the random sequence is the same as the length of the single-stranded DNA of a normal form or a single nucleotide variant. 前記ステップ(c2)で作製する核酸断片の長さが20mer以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1 , wherein the nucleic acid fragment prepared in the step (c2) has a length of 20 mer or more. 正常体又は一塩基変異体の一本鎖DNAの長さが、20mer〜200merであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the length of the single-stranded DNA of a normal form or a single-base mutant is 20mer to 200mer. 前記水溶性高分子が、水溶性のビニル系ポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the water-soluble polymer is a water-soluble vinyl polymer. 前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール（PEG）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG). 一塩基変異部位を含む、正常体又は一塩基変異体の塩基変異部位を含む部分配列に完全に相補的な相補核酸断片と水溶性高分子との複合体が、該相補核酸断片と水溶性高分子とを結合するリンカーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。   A complex of a complementary nucleic acid fragment and a water-soluble polymer that is completely complementary to a partial sequence containing a base mutation site of a normal or single base mutant containing a single nucleotide mutation site is The method of claim 1, comprising a linker that joins the molecule.

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