JP5118056B2 - ポリヌクレオチド増幅 - Google Patents
ポリヌクレオチド増幅 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5118056B2 JP5118056B2 JP2008542554A JP2008542554A JP5118056B2 JP 5118056 B2 JP5118056 B2 JP 5118056B2 JP 2008542554 A JP2008542554 A JP 2008542554A JP 2008542554 A JP2008542554 A JP 2008542554A JP 5118056 B2 JP5118056 B2 JP 5118056B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- cdna
- rna
- tail
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 103
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 102
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 146
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 145
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 145
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 85
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 77
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 50
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 44
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 29
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 claims description 14
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 claims description 10
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 7
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 7
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 2
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 claims 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 48
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 25
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 23
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 19
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 12
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 12
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 11
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 5
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 4
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 3
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- DAZMQARMQFEKQY-UHFFFAOYSA-L oxalate;tetramethylazanium Chemical compound C[N+](C)(C)C.C[N+](C)(C)C.[O-]C(=O)C([O-])=O DAZMQARMQFEKQY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000004726 Connectin Human genes 0.000 description 1
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 101100013786 Mus musculus Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 108020005161 RNA Caps Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N isatin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NC2=C1 JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 230000002024 thermoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/131—Terminal transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/179—Modifications characterised by incorporating arbitrary or random nucleotide sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2539/00—Reactions characterised by analysis of gene expression or genome comparison
- C12Q2539/10—The purpose being sequence identification by analysis of gene expression or genome comparison characterised by
- C12Q2539/113—Differential Display Analysis [DDA]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Amaraら,1997,Nucleic Acids Res.25,3465−3470 Barnes,1994,PNAS 91,2216−2220 Behrら,1999,Electrophoresis 20,1492−1507 Carninciら,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95,520−524 Clark,1988,Nucleic Acids Res.16,9677−9686 Di Giustoら,2004 Nucleic Acids Res.32,e32 1−8 Frohmanら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 85,8998−9002 Furuichiら,1975,Nature 253,374−375 Gundersonら,2004 Genome Res.14,870−877 Hawkinsら,2003,Biotechniques 34,768−773 Hellerら,2001,Methods Mol.Biol.162,293−305 Irieら,2000,Electrophoresis 21,367−374 Jinら,2004,RNA.10,1695−1697 Kovarovaら,2000,Nucleic Acids Res.28,e70i−e70iii Liangら,1992,Science 257,967−971 Magnusdottirら,2001,Methods Mol.Biol.162,323−331 Matzら,1997,Nucleic Acids Res.25,2541−2542 Mizunoら,1999,Nucleic Acids Res.27,1345−1349 Morrisら,2001,Methods Mol.Biol.162,307−321 Prasharら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93,659−663 Prasharら,1999,Methods Enzymol.303,258−272 Rebagliatiら,1985,Cell 42,769−777 Schmidtら,1999,Nucleic Acids Res.27,e31 Spiessら,2002,Anal.Biochem.301,168−174 Skerra,1992,Nucleic Acids Res.20,3551−54 Thielら,1997,Anal.Biochem.252,62−70 Welshら,1992,Nucleic Acids Res.20,4965−4970 Wittwerら,1997a,Biotechniques 22,130−138 Wittwerら,1997b,Biotechniques 22,176−181 Xieら,2001,Methods Mol.Biol.162,67−83 Yangら,2005,Biochem.Biophys.Res.Commun.328,265−272
b)3’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写cDNAの3’末端にテール付加する工程、
c)1対のプライマーを用いてcDNAを増幅する工程
を特徴とし、第1の(3’)プライマーは、cDNAの5’末端に特異的であり、第2の(5’)プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部、およびcDNAの3’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の1〜10ヌクレオチド(即ち、次の1もしくは2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチド)、好ましくは1〜5ヌクレオチド、さらに一層好ましい3〜5ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法を提供する。当然ながら、第2のプライマーは、テール特異的領域(相補体)の上流にある1〜10ヌクレオチド領域のさらに上流にある、より特異的なヌクレオチドも含みうる。
1)各cDNAは、1プライマー対だけによりミスプライミングなしに増幅されるであろう。したがって、重複せずにトランスクリプトームの完全な包含に達することができる。
2)規定したかかるプール内の各cDNA配列は、対応RNAから翻訳されるタンパク質の全アミノ酸配列をコードすることであろう、さらに、
3)その遺伝子上にある転写開始部位を規定されたい(異なる転写開始部位を有し得る同じ遺伝子から転写されるRNA分子は、異なり得ると思われる)。
特質(1)を元のDDと比較すると、後者の場合、任意プライマーは、特定のcDNAに非相補的、1回相補的、2回以上相補的のいずれかの性質を有していると言うことができる。したがって、各cDNAは、まったく表現できないか、または1回もしくは2回以上表現できる。制限酵素が含まれる代替的手順を用いた場合、各制限酵素は、特定のcDNAをまったく切断しないか、または1回もしくは2回以上切断することになろう。したがって、真に完全なトランスクリプトームの包含には達することができない。さらに、mRNAが、ディスプレー中に少なくとも1回表現される確率の増加は、重複の増加を意味するであろう。
a)RNAの試料を取得(または提供)し、RNA分子全体を逆転写することにより、全長cDNAを創製するか、または全長cDNAの試料を取得(もしくは提供)する工程、
b)3’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで該転写cDNAの3’末端にテール付加する工程、
c)1対のプライマーを用いてcDNAを増幅する工程
を含み、第1の(3’)プライマーは、該cDNAの5’末端に特異的であり、第2の(5’)プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部、およびcDNAの3’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の1〜100ヌクレオチド、好ましくは次の1〜50ヌクレオチド、特に好ましくは次の1〜20ヌクレオチド、特別に好ましくは次の1〜10ヌクレオチド(即ち、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチド)に特異的であり、さらに、特に好ましくは1〜100ヌクレオチド範囲内の上流部にある、非特異的なウォブルヌクレオチドも含むことが好ましいが、そのヌクレオチド範囲内の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドが、cDNAのヌクレオチドに特異的であり、かつ該方法が、さらに好ましくは上記に規定した通りである方法が提供される。
本発明に記載のポリヌクレオチド増幅操作の一例の概要は、図1に示されている。逆転写用のアンカー付加プライマーは、VまたはVNy部と組み合わさって、RT反応を首尾よくプライミングするのに十分高い特異性および融解温度を有する式dTxVまたはdTxVNy(xはデオキシチミジレート(「dT」)の反復数を規定する)であって、Vはデオキシグアニレート(「dG」)、デオキシアデニレート(「dA」)、デオキシシチジレート(「dC」)のいずれかであり、NはdA、dC、dGまたはdTから独立に選択されるヌクレオチドy個の配列であり、アンカー付加プライマーのために複数の塩基が使される場合はyがその数を規定し、yの増加は、逆転写物の亜集団を増加させることになる前記の式に従うことができる。かかる合成cDNAの3’末端のポリNテールによるテール付加は、末端トランスフェラーゼを用いて行うことができ、Nは、逆転写プライマーで表示した「N」とは独立に、dT、dA、dCまたはdGから選択される均一なヌクレオチドの配列を表す。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって規定されるVNy配列で所望により予備選択される、cDNAプールの増幅は、末端トランスフェラーゼが付加するヌクレオチドのような末端配列(cDNAの3’であり、元のmRNAの5’末端に対応)およびポリT配列(cDNAの5’であり、元のmRNAの3’ポリAテールに相補的)を選択し、さらに、Nが、やはりdT、dA、dCまたはdGから独立に選択され、テールに直接隣接する塩基y個により異なるmRNA集団を規定するヌクレオチド数個の配列である、オリゴdNy配列を選択することによって、cDNAの5’および3’末端にハイブリッド形成するプライマーを用いて行われる。
試料中に存在する全mRNA分子は、ヒトまたはマウスの肝臓などの特性が十分に決定された組織でも未知であり、その個数はおそらく数千であるので、その試料中に存在する全RNA分子が検出されることを示すために、人工的に合成したmRNA分子14種のプールを使用する手法を選定した。この目的のために、マウスGAPDH遺伝子(GenBank受入:NC_000072)由来のゲノムDNAの長さが異なる配列を、標準的PCRで増幅した。固定化したT7ポリメラーゼプロモーターを有する5’プライマーを使用した。そのプロモーターの後に、5’末端で各mRNAを規定すると思われる塩基4個の組合せを導入した。3’末端用に選定したプライマーは、GAPDH特異配列の後に、ポリAテールの上流でこうした分子を規定すると思われる塩基4個の組合せを含んでいた。この4塩基の後に、21dT、または1種のRNAでは22dTをポリAテールに対して導入した。得られたPCR産物は、ゲルで精製し、7−メチルグアノシン(キャップ)を含めて標準的T7 RNA転写を行った。かかるT7反応産物は、再びゲルで精製した。取得したかかる合成mRNA分子の混合物を、逆転写(RT)用の出発物質として使用した。開示した方法がmRNA分子の5’ならびに3’末端に特異的であることを示すために、分子14種中7種は、5’末端に一定配列、および3’末端に可変配列を有し、7種の分子は、3’末端に一定配列、および5’末端に可変配列を有していた。生成した人工的mRNA分子の配列に関しては、表1を参照されたい。
マウス肝臓の総RNA(13μg)を、実施例2における人工的RNAセット全体に対する場合と同一条件下で、逆転写し、テール付加し、PCRで増幅した。
予備増幅を、実施例3のように生成した精製テール付加cDNA2.5μl、50mM Tris(pH8.8)、14mM (NH4)2SO4、4mM MgCl2、各dNTP0.2mM、プライマーdT(21)0.2μM、プライマーdA(21)0.2μM、Taqポリメラーゼ0.5単位およびPfuポリメラーゼ0.03単位を含有する反応混合物10μl中で実施した。試料を93℃、30秒間変性し、93℃で10秒、42℃で30秒、72℃で11分のサイクルを11回行い、最終伸長工程を72℃で2分行った。該反応混合物を、H2O990μl添加することにより1mlに希釈した。該希釈液2.5μlは、最終の2サイクルを省略した違いはあるが、実施例3と同じPCR条件を用いた次のPCRで使用した。図4で分かるように、各プライマー組合せに対して個別のバンド形成を認めることができる。この実施例で使用するような予備増幅工程は、脳のような組織の非常に複雑なRNA混合物を分離するのに必要と思われる、RNA1試料当たり768種の反応を伴うまさに大きなディスプレーに対して、総RNA500ngで原料を提供するのに十分であることを示している。RNAの使用量は、予備増幅中のサイクルを増加することによって、容易に削減することができる。したがって、ディスプレーの感度は、限られた量のRNAしか利用できない最も厳しい用途さえも満足させるはずである。さらに、プライマー対当たりのバンド量は、実施例3と比べて増加した。実施例3、4双方の識別的PCR工程に用いた高いアニーリング温度が、極度に高い厳密度を示すので、予備増幅工程を使用しない場合には、いくつかの少量転写物はわずかに検出限界に達しない恐れがある。
RNAがキャップもポリAテールも有していない、この例ではマイクロRNA(miRNA)の場合の本発明に記載のポリヌクレオチド増幅操作の一例の概要を図6に示す。
Claims (62)
- 試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
a)RNAの試料を取得し、RNA分子全体を逆転写することにより、全長cDNAを作製するか、または全長cDNAの試料を取得する工程、
b)3’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写cDNAの3’末端にテール付加する工程、
c)1対のプライマーを用いてcDNAを増幅する工程を特徴とし、第1の(3’)プライマーが、cDNAの5’末端に特異的であり、第2の(5’)プライマーが、ポリヌクレオチドテールの上流部およびcDNAの3’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の1〜10ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法。 - RNAまたはmRNAの3’ポリAテールおよびポリAテールの上流にある次の1〜10ヌクレオチドに特異的である、プライマーが、逆転写に用いられ、ならびに/あるいは、第1の増幅プライマーが、RNAまたはmRNAの3’ポリAテールに相補的である、cDNAの5’ポリT配列、および5’ポリT配列の下流にある次の1〜10ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 3’末端のテール付加が、末端トランスフェラーゼを用いて行われることを特徴とする請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅がPCRによって行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、増幅産物がその長さにしたがって分離される、追加工程を含む方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法であって、増幅産物の同一性または配列を決定する、追加工程を含む方法。
- 増幅産物の同一性または配列がチップ上の自動工程によって決定される、請求項6記載の方法。
- 試料が、ある標本由来の全RNAまたはmRNAを含有する、請求項1〜7記載のいずれか1項に記載の方法。
- 高厳密度条件が、逆転写および/または増幅の工程に用いられる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 逆転写および/または増幅の選択性が、トレハロース、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、シュウ酸テトラメチルアンモニウム、ホルムアミドおよびオリゴ遮断剤の利用、またはポリメラーゼ連鎖反応中のジメチルスルホキシドの利用により増加させることによって、ミスプライミングの発生を減少させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 逆転写が、モロニーマウス白血病ウィルス、AMV、HIV−1、HIV−2に由来する逆転写酵素(RT)によって行われ、ここで、該RTのRNase H活性が、存在するか、減少するかまたは存在しないところの、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 逆転写または増幅に用いられるプライマーが、ウォブル置換を有し、ここでウォブル塩基は任意の正規核酸塩基と塩基対を形成しうるユニバーサル塩基による置換を表している、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- プライマーおよびRNAまたはcDNAのヌクレオチド間のミスマッチに反応するポリメラーゼを用いる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法であって、該ポリメラーゼが、ミスマッチしたエキソヌクレアーゼ耐性プライマーを伸長させず、該プライマーが、エキソヌクレアーゼに耐性であるところの、方法。
- 逆転写中に鋳型RNAまたはmRNAの5’キャップに応じて、オリゴdCの3’配列を有するcDNAを生成する請求項1〜13のいずれか1項記載の方法であって、オリゴdCのキャップ依存的3’配列が、増幅中にオリゴdC配列に特異的な第2プライマーにより完全に転写されたcDNAを単離するために用いられる、方法。
- cDNAの3’末端のテール付加が、dCが存在しないことを特徴とするポリヌクレオチド配列を用いて行われる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅反応に用いられるDNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tf1 DNAポリメラーゼ、aTaq DNAポリメラーゼ、SequenaseまたはKlentaqならびに/あるいはPFU、Ultma、Vent、Deep Vent、PWOおよびTliの各ポリメラーゼまたはイー・コリエキソヌクレアーゼIIIから選択される、プルーフリーディング活性を有する酵素である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のRNAまたはcDNAが、PCRによって前増幅されるか、あるいはRNA試料が、規格化またはサブトラクトされる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅反応に用いられるプライマーが、一般式dPxdGyHNz(式中:Pxは、3’末端のcDNAに付加した配列に相補的なヌクレオチドを表し、dGはデオキシグアニレートであり、yは整数であり、Hは、dTまたはdAまたはdCのいずれかであり、Nは、長さzを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、dA、dC、dGまたはdTから独立して選択され、zは、0〜10の整数である)によって特徴付けられる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- yが2〜5の整数である、請求項18記載の方法。
- zが0〜5の整数である、請求項18記載の方法。
- 増幅がPCRにより行われ、PCRプライマーが、cDNAの3’または5’オリゴヌクレオチド末端配列の末端に適切に配置することを可能とする、アンカー配列を含有する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅プライマーまたは逆転写プライマーが、RNAポリメラーゼのプロモーターを含有し、プロモーターが、T7またはT3またはSP6 RNAポリメラーゼによって転写を促進する、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅プライマーおよび/または増幅産物が、レポーター基によって標識化され、該レポーター基が、DNAを検出するために用いられる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 任意のヌクレオチドが、転写後であるが(例えば、ポリA)テール付加の前にRNAまたはmRNAの3’末端に付加され、逆転写および/またはPCR用のプライマーが、任意配列に対応するウォブルを有する配列を含有するところの、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅産物が、生成され、異なる長さを有し、異なる5’もしくは3’末端配列のRNAまたは全長cDNAを認識する異なるプライマーを用いることによって、RNAと比較してその5’および/または3’末端の所定数のヌクレオチドまで特異的に増大する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- ポリAテールまたはテール配列を有しない、RNAまたはmRNA試料が用いられ、テールが、逆転写前に合成的に付加される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 2種のcDNAプール間の相違点の検出が、増幅工程中またはその終わりに行われる、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 5’プライマーまたは3’プライマーまたは5’−3’プライマー対が、固体支持体上にスポットおよび/または結合するところの、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- スポットまたは固体支持体が、所定の2次元または3次元領域に局在する、請求項28記載の方法。
- かかる領域が、領域に局在されるプライマーまたはプライマー対の同一性を解読する情報を含有する、請求項29記載の方法。
- 逆転写および増幅の工程が一工程で行われる、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 末端トランスフェラーゼによって付加されるポリヌクレオチドテールが、鋳型RNAまたはmRNAの5’キャップに応じて、逆転写中に生成される、オリゴdCの3’配列の後方にあるリボヌクレオチドからなり、第2の増幅プライマー(5’プライマー)が、リボヌクレオチドおよびオリゴdCおよびオリゴdC配列の上流にある1〜10ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- テールが、逆転写酵素の鋳型交換能によりcDNAに付加され、第2の増幅プライマー(5’プライマー)が、そのように付加されたテールおよびオリゴdCおよびオリゴdC配列の上流にある1〜10ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- テールがキャップ依存的手法においてcDNAに付加される、請求項33記載の方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とするメッセンジャーRNAの発現レベルを測定する方法であって、増幅産物の分離および/または同定を含む方法。
- 請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法に用いるキットであって、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素または異種ポリメラーゼの混合物、ポリメラーゼが必要とする補因子または金属イオンの塩、cDNAの3’末端またはRNAの対応する5’末端に選択的である、式dPxdGydTNz、dPxdGydANzおよびdPxdGydCNz(式中:dPxはcDNAの3’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、dGはデオキシグアニレートであり、yは整数であり、Nは、長さzを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、dA、dC、dGまたはdTから独立して選択され、zは、0〜10の整数である)で示され、およびcDNAの5’末端またはRNAの対応する3’末端に選択的であるプライマーを含む少なくとも3種のプライマー、ならびに末端トランスフェラーゼおよびさらなる緩衝物質を含む、キット。
- DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、請求項36記載のキット。
- 金属イオンがMg 2+ またはMn 2+ である、請求項36記載のキット。
- yが2〜5の整数である、請求項36記載のキット。
- zが0〜5の整数である、請求項36記載のキット。
- 少なくとも3種のプライマーがRNAまたはcDNAの第1、第2、第3、第4および/または第5の末端ヌクレオチドに選択的である、請求項36記載のキット。
- 所定の領域中に少なくとも2個の、異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含み、5’プライマーが、3’ポリヌクレオチドテールの上流部および3’ポリヌクレオチドテールの上流の隣の1〜10個のヌクレオチドに特異的であり、式dPxdGydTNz、dPxdGydANzおよびdPxdGydCNz(式中:dPxはcDNAの3’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、dGはデオキシグアニレートであり、yは整数であり、Nは、長さzを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、dA、dC、dGまたはdTから独立して選択され、zは、0〜10の整数である)を含む固体表面。
- チップである、請求項42記載の固体表面。
- チップがガラスチップである、請求項43記載の固体表面。
- 所定の領域がスポットである、請求項42記載の固体表面。
- 少なくとも9個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項42記載の固体表面。
- 少なくとも20個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項42記載の固体表面。
- 少なくとも60個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項42記載の固体表面。
- yが2〜5の整数である、請求項42記載の固体表面。
- zが0〜5である、請求項42記載の固体表面。
- 所定の領域中に少なくとも2個の、一般式dPxdGydTNz、dPxdGydANzおよびdPxdGydCNz(式中:dPxはcDNAの3’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、dGはデオキシグアニレートであり、yは整数であり、Nは、長さzを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、dA、dC、dGまたはdTから独立して選択され、zは、0〜10の整数である)またはその相補体を含む異なる5’プライマーおよび3’プライマーを含む、固体表面。
- チップである、請求項51記載の固体表面。
- チップがガラスチップである、請求項52記載の固体表面。
- 所定の領域がスポットである、請求項51記載の固体表面。
- 少なくとも9個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項51記載の固体表面。
- 少なくとも20個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項51記載の固体表面。
- 少なくとも60個の異なる5’プライマーおよび3’プライマーまたはプライマー対を含む、請求項51記載の固体表面。
- yが2〜5の整数である、請求項51記載の固体表面。
- zが0〜5である、請求項51記載の固体表面。
- プライマーが、以下の配列:AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT GA、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GC、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT GT、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT CA、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT AG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT AA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG ATA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG ACA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG AGA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG AAA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG GTA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG CTA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG TTAの1つを含むプライマーから選択される、請求項51記載の固体表面。
- 試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
a)RNAの試料を取得し、RNA分子全体を逆転写することにより、全長cDNAを作製するか、または全長cDNAの試料を取得する工程、
b)3’末端の後方にあるポリヌクレオチドテールで転写cDNAの3’末端にテール付加する工程、
c)該cDNAを1対のプライマーを用いて増幅する工程を特徴とし、第1の(3’)プライマーが、cDNAの5’末端に特異的であり、第2の(5’)プライマーが、ポリヌクレオチドテールの上流部およびcDNAの3’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の1〜100ヌクレオチドに特異的であり、さらに、1〜100ヌクレオチド範囲内の上流部にある、非特異的なウォブルヌクレオチドも含み、少なくとも1個のヌクレオチドが、cDNAのヌクレオチドに特異的である方法であるところの、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。 - RNAの3’テール(付加されていてもよい3’テール)またはmRNAおよび3’テールの上流にある、次の1〜100ヌクレオチドに特異的である、プライマーが逆転写に用いられ、ならびに/あるいは、第1の増幅プライマーが、RNAまたはmRNAの3’テールに相補的である、cDNAの5’テール、および5’テールの下流にある、次の1〜100ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0192305A AT502823B1 (de) | 2005-11-29 | 2005-11-29 | Polynukleotid-amplifikation |
ATA1923/2005 | 2005-11-29 | ||
PCT/AT2006/000494 WO2007062445A1 (en) | 2005-11-29 | 2006-11-29 | Polynucleotide amplification |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009517052A JP2009517052A (ja) | 2009-04-30 |
JP2009517052A5 JP2009517052A5 (ja) | 2010-01-14 |
JP5118056B2 true JP5118056B2 (ja) | 2013-01-16 |
Family
ID=37814243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008542554A Active JP5118056B2 (ja) | 2005-11-29 | 2006-11-29 | ポリヌクレオチド増幅 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9394564B2 (ja) |
EP (1) | EP1954829B1 (ja) |
JP (1) | JP5118056B2 (ja) |
KR (1) | KR101327376B1 (ja) |
CN (1) | CN101316937B (ja) |
AT (2) | AT502823B1 (ja) |
CA (1) | CA2630573C (ja) |
DE (1) | DE602006014860D1 (ja) |
WO (1) | WO2007062445A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2491131A1 (en) * | 2009-10-21 | 2012-08-29 | Riboxx GmbH | Method for exponential amplification of rna using thermostable rna-dependent rna polymerase |
EP2333104A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | Lexogen GmbH | RNA analytics method |
EP2354243A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-10 | Lexogen GmbH | Complexity reduction method |
ME02678B (me) | 2010-08-23 | 2017-06-20 | Univ Texas | Antitijela na ox-40 i postupci njihove primjene |
CA3080686C (en) * | 2010-10-22 | 2023-10-10 | Cold Spring Harbor Laboratory | Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information |
EP2492674A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-29 | Lexogen GmbH | Biosensor array formed by junctions of functionalized electrodes |
EP2492673A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-29 | Lexogen GmbH | Biosensor array formed by junctions of functionalized electrodes |
CN103160575B (zh) * | 2011-12-15 | 2014-10-01 | 王荣芳 | SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断及肝硬化诊断中的应用 |
PL2828399T3 (pl) * | 2012-03-22 | 2017-07-31 | Lgc Genomics Limited | Układ wykrywający do reakcji łańcuchowej polimerazy z użyciem oligonukleotydów zawierających grupę tiofosforanową |
EP2684954A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-15 | Lexogen GmbH | 5´ protection dependent amplification |
EP2912197B1 (en) * | 2012-10-24 | 2019-08-07 | Takara Bio USA, Inc. | Template switch-based methods for producing a product nucleic acid |
KR101922125B1 (ko) | 2012-11-29 | 2018-11-26 | 삼성전자주식회사 | 표적 핵산을 표지하는 방법 |
EP2921556A1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-23 | Lexogen GmbH | Copy number preserving RNA analysis method |
CN106978506A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-07-25 | 武汉爱基百客生物科技有限公司 | 一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法 |
EP3673064A4 (en) * | 2017-08-24 | 2021-05-26 | Takara Bio USA, Inc. | METHOD OF PRODUCING NUCLEIC ACIDS USING STIMULUS MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES |
CN108949937A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-12-07 | 翌圣生物科技(上海)有限公司 | 一步法rt-pcr预混试剂 |
CA3106677A1 (en) * | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Dana-Farber Cancer Institue, Inc. | Dna amplification method for probe generation |
DK3899037T3 (da) * | 2018-12-19 | 2023-11-06 | Illumina Inc | Fremgangsmåder til forbedring af polynukleotidklyngeklonalitetsprioritet |
WO2020184551A1 (ja) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | 東洋紡株式会社 | 核酸の生成および増幅 |
US20210381067A1 (en) * | 2020-06-08 | 2021-12-09 | Ampliwise Inc. | Nucleic acid amplification and detection with attenuaiting probe |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990001065A1 (en) * | 1988-07-26 | 1990-02-08 | Genelabs Incorporated | Rna and dna amplification techniques |
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
EP0592626B1 (en) * | 1992-03-11 | 2003-01-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | METHODS TO CLONE mRNA |
CA2223104A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Jonathan P. Duvick | Pcr-based cdna subtractive cloning method |
US6395887B1 (en) * | 1995-08-01 | 2002-05-28 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS |
US5962271A (en) * | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
WO1997029211A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs |
US5932451A (en) * | 1997-11-19 | 1999-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Method for unbiased mRNA amplification |
US6287825B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-09-11 | Molecular Staging Inc. | Methods for reducing the complexity of DNA sequences |
US20020012922A1 (en) | 1998-11-04 | 2002-01-31 | Hilbush Brian S. | Simplified method for indexing and determining the relative concentration of expressed messenger RNAs |
US6224565B1 (en) * | 1998-11-13 | 2001-05-01 | Sound Surgical Technologies, Llc | Protective sheath and method for ultrasonic probes |
DE19920611A1 (de) * | 1999-05-05 | 2000-11-09 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur 5'-Cap-abhängigen Anreicherung von cDNAs |
AU1075701A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-23 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly |
EP1186673A3 (en) * | 2000-09-11 | 2003-03-26 | Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) | Calibration of molecular array data |
WO2002028876A2 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Riken | Oligonucleotide linkers comprising a variable cohesive portion and method for the preparation of polynucleotide libraries by using said linkers. |
US7290274B1 (en) * | 2000-10-20 | 2007-10-30 | Scientific-Atlanta, Inc. | Context sensitive television menu |
AU2002218000A1 (en) * | 2000-11-01 | 2002-05-15 | Genomic Solutions, Inc. | Compositions and systems for identifying and comparing expressed genes (mrnas) in eukaryotic organisms |
CA2437737A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Stephen D. Ginsberg | Methods and compositions of amplifying rna |
US20030077611A1 (en) | 2001-10-24 | 2003-04-24 | Sention | Methods and systems for dynamic gene expression profiling |
EP1369480A1 (en) | 2002-06-05 | 2003-12-10 | Bioneer Corporation | Process for preparation of full-length cDNA and anchor used for the same |
WO2004087952A2 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Vib Vzw | Genes regulated by hydrogen peroxide stress |
-
2005
- 2005-11-29 AT AT0192305A patent/AT502823B1/de active
-
2006
- 2006-11-29 DE DE602006014860T patent/DE602006014860D1/de active Active
- 2006-11-29 JP JP2008542554A patent/JP5118056B2/ja active Active
- 2006-11-29 EP EP06827949A patent/EP1954829B1/en active Active
- 2006-11-29 WO PCT/AT2006/000494 patent/WO2007062445A1/en active Search and Examination
- 2006-11-29 AT AT06827949T patent/ATE470726T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-11-29 US US12/095,485 patent/US9394564B2/en active Active
- 2006-11-29 CN CN200680044723.5A patent/CN101316937B/zh active Active
- 2006-11-29 CA CA2630573A patent/CA2630573C/en active Active
- 2006-11-29 KR KR1020087015868A patent/KR101327376B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AT502823A4 (de) | 2007-06-15 |
CA2630573A1 (en) | 2007-06-07 |
CN101316937B (zh) | 2016-05-25 |
DE602006014860D1 (de) | 2010-07-22 |
EP1954829B1 (en) | 2010-06-09 |
ATE470726T1 (de) | 2010-06-15 |
US9394564B2 (en) | 2016-07-19 |
EP1954829A1 (en) | 2008-08-13 |
CA2630573C (en) | 2016-03-15 |
CN101316937A (zh) | 2008-12-03 |
AT502823B1 (de) | 2007-06-15 |
WO2007062445A1 (en) | 2007-06-07 |
JP2009517052A (ja) | 2009-04-30 |
US20090311754A1 (en) | 2009-12-17 |
KR20080080600A (ko) | 2008-09-04 |
KR101327376B1 (ko) | 2013-11-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5118056B2 (ja) | ポリヌクレオチド増幅 | |
US20210071171A1 (en) | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation | |
US8999677B1 (en) | Method for differentiation of polynucleotide strands | |
KR102398479B1 (ko) | 카피수 보존 rna 분석 방법 | |
US20170016056A1 (en) | Accurate detection of rare genetic variants in next generation sequencing | |
US20210024920A1 (en) | Integrative DNA and RNA Library Preparations and Uses Thereof | |
JP2022082574A (ja) | Rnaおよびdnaからの核酸ライブラリーの作製 | |
US20220267848A1 (en) | Detection and quantification of rare variants with low-depth sequencing via selective allele enrichment or depletion | |
CN109415762B (zh) | 通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法 | |
KR20230124636A (ko) | 멀티플렉스 반응에서 표적 서열의 고 감응성 검출을위한 조성물 및 방법 | |
KR20230028450A (ko) | 앰플리콘 포괄적 풍부화 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091117 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091117 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120417 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120711 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120719 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120816 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120925 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121018 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5118056 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151026 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |