JP5113036B2 - Hydrophilic carbon cluster - Google Patents

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Description

本発明は、親水性炭素クラスター、炭素クラスター分散物、親水性炭素クラスターの製造方法、および親水性炭素クラスターを用いた固相合成方法に関する。   The present invention relates to a hydrophilic carbon cluster, a carbon cluster dispersion, a method for producing a hydrophilic carbon cluster, and a solid phase synthesis method using the hydrophilic carbon cluster.

カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンおよびフラーレン等のナノメートルスケールの微細構造を有する炭素クラスターは、新しい電子材料、触媒、光材料、ナノテクノロジー等への応用が期待されているナノ構造黒鉛（グラファイト）物質である（Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５４，５６、Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３，６０３、Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９９，３０９，１６５）。例えば、カーボンナノチューブは、その構造によって金属にも半導体にもなることができ、ナノメートルサイズのデバイスを作るための研究が行われている。
しかしながら、医療用途などへの応用を図るためには、炭素クラスターの水に対する分散性の乏しさが問題となる。そこで、水性溶媒への分散化の方法が検討されている。最近では、界面活性剤や水溶性高分子などの溶解補助剤を用いて非共有結合により錯形成させ、水分散溶液を調製する方法などが開発されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２，２９７，５９３、Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔ．２００３，２，３３８）。しかしこれらの溶解補助剤は水溶液中で炭素クラスターから解離しやすく、また生体に対する毒性を有するものも多い。また、特開２００５−１０４７６２号公報には、カーボンナノチューブを多糖類のβ−１，３−グルカンと複合体化することによって、安定的に水性溶媒中へ可溶化させる方法が開示され、特開２００５−２８５６０号公報には、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを用いてカーボンナノチューブを可溶化する方法が開示されている。しかし、これらの手法では多量の溶解補助剤を必要とすることから、炭素クラスターの特性を大きく改変してしまうと考えられる。さらに、特開２００３−０９５６２４号公報には、カルボニル基などの酸素官能基を導入し、さらにその化学修飾を行うことで、親水性カーボンナノホーンを調製する方法が開示されている。しかし、この方法は、カーボンナノホーンを酸化処理するものであり、当該方法ではアミノ基を導入することはできない。
固相合成法は、固体表面に有機化合物を導入し、その上で化学修飾を行う方法である。固相担体のろ別操作により反応試剤・溶媒を分離し、続く担体からの切り出しにより目的化合物の単離を可能とする手法である。化合物を簡便に精製・単離できることから、さまざまな有機化合物の合成に利用されている。現在では、ポリスチレン樹脂やガラス粒子を固相担体として、ペプチドやＤＮＡの合成、また近年では多種の化合物を合成するコンビナトリアル化学で利用されている。
固相合成において汎用される固相担体は、通常マイクロメートルサイズの樹脂粒子（ビーズ）であり、反応は穏やかに振盪することで実施される。固体表面上での反応であることに加え、物理的に弱く、激しい撹拌操作ができないことから、反応効率が低い場合がある。また、固相合成法で得られた反応生成物を解析するためは、担体からの切り出しを行う必要があり、各反応段階での反応の成否の確認が煩雑である。このため最近では，固相担体上での化合物の直接解析法の開発が注目されている。Carbon clusters with nanometer-scale microstructures such as carbon nanotubes, carbon nanohorns and fullerenes are nanostructured graphite (graphite) materials that are expected to be applied to new electronic materials, catalysts, optical materials, nanotechnology, etc. (S. Iijima, et al., Nature, 1991, 354, 56, S. Iijima et al., Nature, 1993, 363, 603, S. Iijima et al., 1999, Chem. Phys. Lett., 1999, 309, 165). For example, carbon nanotubes can be either metals or semiconductors depending on their structure, and research is being conducted to make nanometer-sized devices.
However, the lack of dispersibility of carbon clusters in water is a problem for application to medical uses. Therefore, a method for dispersing in an aqueous solvent has been studied. Recently, a method has been developed in which a complex is formed by noncovalent bonding using a solubilizing agent such as a surfactant or a water-soluble polymer to prepare an aqueous dispersion (O'Connell, MJ et al.). al., Science 2002, 297, 593, Zheng, M. et al., Nature Mat. 2003, 2, 338). However, these solubilizers are easily dissociated from carbon clusters in an aqueous solution, and many of them have toxicity to living bodies. Japanese Patent Laid-Open No. 2005-104762 discloses a method of stably solubilizing a carbon nanotube in an aqueous solvent by complexing it with a β-1,3-glucan polysaccharide. 2005-28560 discloses a method for solubilizing carbon nanotubes using DNA and oligonucleotides. However, since these methods require a large amount of solubilizing agent, it is considered that the characteristics of the carbon cluster are greatly modified. Furthermore, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-095624 discloses a method for preparing hydrophilic carbon nanohorns by introducing an oxygen functional group such as a carbonyl group and further performing chemical modification thereof. However, this method oxidizes carbon nanohorn, and this method cannot introduce an amino group.
The solid phase synthesis method is a method in which an organic compound is introduced onto the surface of a solid and then chemically modified. In this method, the reaction reagent / solvent is separated by filtration of the solid phase carrier, and then the target compound can be isolated by excision from the carrier. Since compounds can be easily purified and isolated, they are used in the synthesis of various organic compounds. At present, they are used in the synthesis of peptides and DNA using polystyrene resin or glass particles as a solid support, and in recent years in combinatorial chemistry for synthesizing various compounds.
The solid phase carrier widely used in the solid phase synthesis is usually micrometer-sized resin particles (beads), and the reaction is carried out by gently shaking. In addition to the reaction on the solid surface, the reaction efficiency may be low because it is physically weak and cannot be vigorously stirred. Moreover, in order to analyze the reaction product obtained by the solid phase synthesis method, it is necessary to cut out from the carrier, and confirmation of the success or failure of the reaction at each reaction stage is complicated. For this reason, recently, the development of a direct analysis method for compounds on a solid support has attracted attention.

本発明の課題は、炭素クラスターの特性を大きく改変することなく、炭素クラスターを親水性炭素クラスターに変換する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、炭素クラスターに金属アミドを作用させることにより水性溶媒に分散可能な親水性炭素クラスターを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する、親水性炭素クラスター。
（２）アミノ基が無置換アミノ基である、（１）記載の親水性炭素クラスター。
（３）炭素クラスターがチューブ状炭素クラスターである、（１）または（２）記載の親水性炭素クラスター。
（４）炭素クラスターがカーボンナノホーンであり、置換または無置換アミノ基が少なくとも円錐の末端キャップの炭素原子に結合している、（３）記載の親水性炭素クラスター。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターが水性溶媒に分散している、炭素クラスター分散物。
（６）炭素クラスターに金属アミドを反応させることを含む、炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する親水性炭素クラスターの製造方法。
（７）炭素クラスターがチューブ状炭素クラスターである、（６）記載の方法。
（８）金属アミドがアルカリ金属アミドである、（６）または（７）記載の方法。
（９）炭素クラスターの炭素原子に結合したアミノ基を化学修飾することをさらに含む、（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターからなる有機化合物の固相合成に使用するための担体。
（１１）有機化合物の固相合成に使用するための担体であって、
（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターのアミノ基に固相合成用のリンカー分子が共有結合した構造を有する、前記担体。
（１２）（１０）または（１１）に記載の担体を用いて有機化合物を固相合成する方法。
（１３）有機化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、（１２）記載の方法。
本発明により、炭素クラスターの特性を大きく改変することなく、炭素クラスターを親水性炭素クラスターに変換することができる。また、得られた親水性炭素クラスターを固相合成に用いることにより、溶液反応と同様の条件で合成反応および生成物の分析を実施することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００６−０４２８７２号の請求の範囲、明細書および図面に記載された内容を包含する。An object of the present invention is to provide a method for converting a carbon cluster into a hydrophilic carbon cluster without greatly modifying the properties of the carbon cluster.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a hydrophilic carbon cluster dispersible in an aqueous solvent can be produced by allowing a metal amide to act on the carbon cluster, and the present invention is completed. It came to.
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A hydrophilic carbon cluster having a structure in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to a carbon atom of the carbon cluster.
(2) The hydrophilic carbon cluster according to (1), wherein the amino group is an unsubstituted amino group.
(3) The hydrophilic carbon cluster according to (1) or (2), wherein the carbon cluster is a tubular carbon cluster.
(4) The hydrophilic carbon cluster according to (3), wherein the carbon cluster is carbon nanohorn, and the substituted or unsubstituted amino group is bonded to at least a carbon atom of a conical end cap.
(5) A carbon cluster dispersion in which the hydrophilic carbon cluster according to any one of (1) to (4) is dispersed in an aqueous solvent.
(6) A method for producing a hydrophilic carbon cluster having a structure in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to a carbon atom of the carbon cluster, which comprises reacting the carbon cluster with a metal amide.
(7) The method according to (6), wherein the carbon cluster is a tubular carbon cluster.
(8) The method according to (6) or (7), wherein the metal amide is an alkali metal amide.
(9) The method according to any one of (6) to (8), further comprising chemically modifying an amino group bonded to a carbon atom of the carbon cluster.
(10) A carrier for use in solid phase synthesis of an organic compound comprising the hydrophilic carbon cluster according to any one of (1) to (4).
(11) A carrier for use in solid phase synthesis of organic compounds,
The carrier having a structure in which a linker molecule for solid phase synthesis is covalently bonded to the amino group of the hydrophilic carbon cluster according to any one of (1) to (4).
(12) A method for solid-phase synthesis of an organic compound using the carrier according to (10) or (11).
(13) The method according to (12), wherein the organic compound is a polypeptide or a polynucleotide.
According to the present invention, a carbon cluster can be converted into a hydrophilic carbon cluster without greatly modifying the characteristics of the carbon cluster. Further, by using the obtained hydrophilic carbon cluster for solid-phase synthesis, synthesis reaction and product analysis can be performed under the same conditions as solution reaction.
This specification includes the contents described in the claims, specification and drawings of Japanese Patent Application No. 2006-028772 which is the basis of the priority of the present application.

図１は、カーボンナノホーン凝集物（ＮＨＡ）から、円錐の末端キャップにアミノ基を有するアミノ化ＮＨＡ２を製造する工程、アミノ化ＮＨＡ２のアミノ基を１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンによりジニトロフェニルアミノ基に変換してアミノ化ＮＨＡ３を製造する工程、およびアミノ化ＮＨＡ２から蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４を製造する工程の概略を示す。
図２は、未処理ＮＨＡ（上）およびアミノ化ＮＨＡ２（下）のＩＲスペクトルを示す。３２００ｃｍ−１付近の幅広いシグナルはアミノ化ＮＨＡ２中のアミノ基の存在を示す。
図３の（Ａ）は、アミノ化ＮＨＡ２のＴＥＭ画像を示す。カーボンナノホーンの円錐形の形状が保持されていることがわかる。スケールバーは２ｎｍを表す。（Ｂ）は、１．０ｍｇ／ｍＬおよび０．２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアミノ化ＮＨＡ２の水溶液、ならびに未処理ＮＨＡの写真を示す（左から右へ）。（Ｃ）はアミノ化ＮＨＡ２の水溶液（０．２０ｍｇ／ｍＬ）のＤＬＳデータを示す。（Ｄ）は、マイカ上に析出したアミノ化ＮＨＡ２のＡＦＭ画像を示す。スケールバーは５００ｎｍを表す。
図４は、ＡＦＭによるアミノ化ＮＨＡ２のサイズ分析の結果を示す。
図５の（Ａ）は、濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ２のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。２６０ｎｍの吸収はＮＨＡの黒鉛構造のプラズモン吸収に相当する。（Ｂ）は濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ３のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。挿入図は、アミノ化ＮＨＡ３およびアミノ化ＮＨＡ２の差スペクトルを示す。３５０ｎｍの吸収はジニトロフェニルアミノ基に相当し、ＮＨＡ上のアミノ基の存在を立証するものである。（Ｃ）は、濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ４のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。挿入図は、アミノ化ＮＨＡ４およびアミノ化ＮＨＡ２の差スペクトルを示す。５００ｎｍの吸収はオレゴングリーン４８８に相当する。
図６の（Ａ）は、セファクリル５００ＨＲ（樹脂体積：１７ｍＬ、検出：２６０ｎｍ）により溶離されたアミノ化ＮＨＡ２（０．２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ）のクロマトグラムを示す。分画の位置は、左から順に、分画２２：赤、２３：橙、２４：緑および２７：青の色で表される。（Ｂ）は、分画のＤＬＳ分析の代表的データを示す。分画を表す色はＡと同じであり、上から順に、分画２２：赤、２３：橙、２４：緑および２７：青の色で表される。
図７は、アミノ化ＮＨＡ２を溶離した後のカラムの写真を示す。（Ａ）は、セファクリル１００ＨＲを用いた場合、（Ｂ）はセファクリル５００ＨＲを用いた場合、（Ｃ）はセファクリル１０００ＳＦを用いた場合のカラムの写真を示す。アミノ化ＮＨＡ２は、セファクリル５００ＨＲのカラムから溶離したが、他のカラムからは溶離しなかった。
図８は、蛍光染料の存在を示すアミノ化ＮＨＡ４の励起（赤）および発光（青）スペクトルを示す。
図９は、（Ａ）は３Ｔ３細胞とＨｅＬａ細胞を粒子とともに培養したときの生存率を示す。この生存率はＢｒａｄｆｏｒｄ法をもちいて算出した。（Ｂ）は３Ｔ３細胞を培養した時の写真を示す。左の写真はアミノ化ＮＨＡ２が入っておらず、中央と右の写真はそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬの濃度でアミノ化ＮＨＡ２が添加されたものである。
図１０は、実施例１１で合成したＮ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＨＭＰ−ＡＮの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
図１１は、実施例１２で合成したＮ−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＨＭＰ−ＡＮの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。FIG. 1 shows a process for producing an aminated NHA2 having an amino group at a conical end cap from carbon nanohorn aggregates (NHA). The amino group of the aminated NHA2 is dinitrophenyl-treated with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. The outline of the process of converting to an amino group and producing aminated NHA3 and the process of producing fluorescently labeled aminated NHA4 from aminated NHA2 are shown.
FIG. 2 shows the IR spectra of untreated NHA (top) and aminated NHA2 (bottom). A broad signal around 3200 cm −1 indicates the presence of an amino group in the aminated NHA2.
FIG. 3A shows a TEM image of aminated NHA2. It can be seen that the conical shape of the carbon nanohorn is maintained. The scale bar represents 2 nm. (B) shows a photograph of an aqueous solution of aminated NHA2 at concentrations of 1.0 mg / mL and 0.20 mg / mL and untreated NHA (from left to right). (C) shows DLS data of an aqueous solution of aminated NHA2 (0.20 mg / mL). (D) shows an AFM image of aminated NHA2 deposited on mica. The scale bar represents 500 nm.
FIG. 4 shows the results of size analysis of aminated NHA2 by AFM.
FIG. 5A shows a UV-vis spectrum of aminated NHA2 at a concentration of 0.02 mg / mL. The absorption at 260 nm corresponds to the plasmon absorption of the graphite structure of NHA. (B) shows the UV-vis spectrum of aminated NHA3 at a concentration of 0.02 mg / mL. The inset shows the difference spectrum of aminated NHA3 and aminated NHA2. The absorption at 350 nm corresponds to a dinitrophenylamino group and proves the presence of an amino group on NHA. (C) shows the UV-vis spectrum of aminated NHA4 at a concentration of 0.02 mg / mL. The inset shows the difference spectrum of aminated NHA4 and aminated NHA2. Absorption at 500 nm corresponds to Oregon Green 488.
FIG. 6 (A) shows a chromatogram of aminated NHA2 (0.2 mg / mL, 0.5 mL) eluted with Sephacryl 500HR (resin volume: 17 mL, detection: 260 nm). The positions of the fractions are represented in the order of fractions 22: red, 23: orange, 24: green, and 27: blue in order from the left. (B) shows representative data of DLS analysis of fractions. The color representing the fraction is the same as A, and is represented in the order of fractions 22: red, 23: orange, 24: green, and 27: blue in order from the top.
FIG. 7 shows a photograph of the column after eluting the aminated NHA2. (A) shows a photograph of a column when Sephacryl 100HR is used, (B) shows a case where Sephacryl 500HR is used, and (C) shows a column when Sephacryl 1000SF is used. Aminated NHA2 eluted from the Sephacryl 500HR column but not from the other columns.
FIG. 8 shows the excitation (red) and emission (blue) spectra of aminated NHA4 indicating the presence of a fluorescent dye.
FIG. 9 (A) shows the survival rate when 3T3 cells and HeLa cells were cultured with particles. This survival rate was calculated using the Bradford method. (B) shows a photograph when 3T3 cells are cultured. The photo on the left does not contain aminated NHA2, and the photos on the center and on the right show the addition of aminated NHA2 at concentrations of 0.1 mg / mL and 1 mg / mL, respectively.
FIG. 10 shows the 1 H NMR spectrum of N-Fmoc-Gly-HMP-AN synthesized in Example 11.
FIG. 11 shows the 1 H NMR spectrum of N-Fmoc-Ala-HMP-AN synthesized in Example 12.

本発明において炭素クラスターとは、炭素−炭素間結合の種類を問わず、通常は数個から数百個の炭素原子が結合または凝集して形成されている集合体をさす。ただし、必ずしも１００％炭素のみで構成されているものに限られず、他原子が混在しているものも包含する。このような場合も含めて、炭素原子が多数を占める集合体を炭素クラスターと称する。炭素クラスターには、球殻状炭素クラスター、例えば、フラーレン、およびチューブ状炭素クラスター、例えば、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンおよびカーボンファイバー、ならびにこれらを化学的に修飾した誘導体およびこれらの凝集物が含まれる。
チューブ状炭素クラスターの１つであるカーボンナノチューブは、２〜数十層のグラファイト状の炭素が積み重なってできた多重のチューブであり、各層の両端がフラーレンのように閉じた構造を有する。カーボンナノチューブとしては、単層のチューブからなる単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）、および２つ以上の層が同心円的に重なっている多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）が知られているが、本発明においてはいずれも使用できる。カーボンナノチューブおよびその誘導体は、公知の製造方法で得ることができ、例えば、アーク放電法（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１６，ｎｏ．１２，２００２，ｐ．１０３５−１０４４）、熱分解法（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ｖｏｌ．１０５，ｎｏ．３５，２００１，ｐ．８２９７−８３０１）、レーザ蒸発法（Ｃａｒｂｏｎ ｖｏｌ．３３，ｎｏ．７，１９９５，ｐ．９０３−９１４）、気相合成法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．３０６，ｎｏ．５７００，２００４，ｐ．１３６２−１３６４）などにより得ることができる。カーボンナノチューブの平均繊維長（電子顕微鏡写真の画像解析から求めた長軸長の数平均から求めることができる）は、１０〜１００μｍであることが好ましく、直径は０．８〜２０ｎｍであることが好ましい。
カーボンナノホーンは、カーボンナノチューブのようにチューブ径が一定ではなく、チューブ径が連続的に増加する中空円錐状の、つまり、角（ホーン）状の構造を有する（特開２００１−６４００４号公報）。カーボンナノホーンは、カーボンナノチューブと同様の方法により製造できる。例えば、上記特許公報にも開示されているように、固体状炭素単体物質に対して、不活性ガス雰囲気中で、レーザ光を照射して炭素レーザ蒸発させることにより、球状粒子が集合した構造体として得ることができる。この球状粒子は、単層のカーボンナノチューブの先端が円錐状に閉じたものの集合体であって、ダリヤの花に似た形状を持つものや、つぼみ、たね状のものも存在する。
一実施形態として、カーボンナノホーンの好ましい製造方法について以下に説明する。固体状炭素単体物質に対して、不活性ガス雰囲気中で、レーザ光を照射して炭素レーザ蒸発させ、すす状物質として、球状物質が集合した粉体を得る。炭素レーザ蒸発は、Ａｒ（アルゴン）、Ｈｅ（ヘリウム）等の希ガスをはじめとする反応不活性なガス雰囲気中において、高出力ＣＯ２ガスレーザ光等のレーザ光を固体状炭素単体物質の表面に対して適当な角度で照射して行う。固体物質としての炭素単体物質としては、例えば丸棒状焼結炭素や圧縮成形炭素等を用いることができる。すす状物質は、適当な基板上に堆積して回収することや、ダストバッグによる微粒子回収の方法によって回収することができる。不活性ガスを反応容器内で流通させて、不活性ガスの流れによりこのすす状物質を回収することができる。得られたすす状物質は、カーボンナノホーン構造体が集合して球状粒子を形成し、この球状粒子が多数集合している粒子である。これを単一または複数個が集合した状態の球状粒子とすることができる。この場合には、溶媒として例えばエタノールに懸濁し、超音波撹拌とデカンテーション等を行うこと、また必要により繰り返すことにより、単一の、または複数個の集合状態の上記球状粒子が回収できる。
カーボンナノチューブおよびカーボンナノホーンなどのチューブ状炭素クラスターは、市販のものを使用してもよく、例えば、本荘ケミカル（株）、（株）東京プログレスシステム、（株）サイエンスラボラトリーズ、（株）カーボン・ナノテク・リサーチ・インスティチュート（ＣＮＲＩ）、米・Ｈｙｐｅｒｉｏｎ社などの混合品、精製品が挙げられる。
フラーレンは、炭素原子のネットワークに、グラファイトに見られる６員環のほかに５員環を含む球殻状炭素分子である。例えば、Ｃ３６、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８０、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ８６、Ｃ８４、Ｃ８８、Ｃ９０、Ｃ９２、Ｃ９４、Ｃ９６、および一分子中の炭素数が９６を超え且つ最大凝集塊径が３０ｎｍ以下の高次フラーレン、ならびにこれらの２種以上の混合物が挙げられる。中でもＣ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ８２が好ましく用いられる。これらのフラーレンは、公知の方法によって合成することができる。
例えば、Ｃ３６の製造方法はＮｅｗ Ｄａｉａｍｏｎｄ．ｖｏｌ．１６，ｎｏ．２，２０００，ｐ．３０−３１に記載されている。Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ９０およびＣ９６の製造方法としては、Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｈｅｍ．，９４，８６３４（１９９０）にアーク放電法による製造方法が記載され、また、Ｚ．Ｐｈｙｓ．Ｄ，４０，４１４（１９９７）にオーブン・レーザ法による製造方法がそれぞれ記載されている。また、一分子中の炭素数が９６を超え且つ最大凝集塊径が３０ｎｍ以下の高次フラーレンは、上記したアーク放電法の副成物として得ることができる。
フラーレンの市販品としては、Ｃ６０、Ｃ７０ではフロンティアカーボン（株）製、ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＭＴＲ ＬＩＭＩＴＥＤ社製のものなどが挙げられ、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８４ではＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＭＴＲ ＬＩＭＩＴＥＤ社製のものなどが挙げられる。本発明では、炭素数の異なるフラーレンの混合物を用いてもよく、その市販品としては、フロンティアカーボン（株）、（株）サイエンスラボラトリーズ、（株）東京プログレスシステム、ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＭＴＲ ＬＩＭＩＴＥＤ社製のＣ６０／Ｃ７０の混合物が挙げられる。
炭素クラスターの誘導体には、炭素クラスターを官能基で化学的に修飾したものが含まれる。炭素クラスターを化学的に修飾する官能基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、カルボキシル、ヒドロキシル、エポキシ、オキセンタンなどが挙げられる。炭素クラスターの誘導体には、炭素クラスターを金属元素で化学的に修飾したものも含まれる。炭素クラスターを化学的に修飾する金属元素としては、公知のものを用いることができ、例えば、Ｌｉ、ＮａおよびＫなどのアルカリ金属、Ｂｅ、ＭｇおよびＣａなどのアルカリ土類金属、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎなどの遷移金属が挙げられる。
本発明の親水性炭素クラスターは、上記炭素クラスターを構成する炭素原子に置換または無置換のアミノ基が結合した構造を有する。以下、本発明の親水性炭素クラスターを、アミノ化炭素クラスターと称する場合がある。置換または無置換のアミノ基は−ＮＲ１Ｒ２で表され、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルから選択される。上記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルは置換されていてもよい。
本明細書において、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ１−６アシルは、それぞれ記載の数の炭素原子を含んでいるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基およびアシル基を意味し、直鎖状でも分岐状でもよい。
本明細書においてアリールは、５〜２０個の炭素原子、好ましくは６〜１４個の炭素原子、さらに好ましくは６〜１０個の炭素原子を含んでいる芳香族の単環式または多環式炭化水素環基を意味する。アリールの例としては、特に制限されないが、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニル、アントラセニル、フェナントレニル、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびフェナントリジニルなどを挙げることができる。
本明細書においてヘテロアリールは、芳香族の単環式環基または多環式環基を意味し、ここで、該芳香族の単環式環基または多環式環基は、５〜２０個の炭素原子、好ましくは５〜１０個の炭素原子を含み、その際、１個以上の環炭素、好ましくは、１〜４個の環炭素が、それぞれ、酸素原子、窒素原子または硫黄原子などのヘテロ原子で置き換えられている。好ましいヘテロアリールには、５〜６員の単環式ヘテロアリールおよび８〜１０員の二環式ヘテロアリールが包含される。ヘテロアリールの例としては、特に制限されないが、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、インダゾリル、ピリダジル、ピリジル、ピロリル、ピラゾリル、ピラジニル、キノキサリル、ピリミジニル、ピリダジニル、フリル、チエニル、トリアゾリル、チアゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、オキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキノリニル、イソインドリル、アクリジニルおよびベンゾイソオキサゾリルなどを挙げることができる。
本明細書においてシクロアルキルは、３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、さらに好ましくは３〜１０個の炭素原子を有する、単環式または多環式の非芳香族炭化水素環基を意味する。
Ｒ１およびＲ２に関し、上記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、メルカプト、シアノ、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルチオ等が挙げられる。
本発明のアミノ化炭素クラスターにおいては、好ましくはＲ１およびＲ２のいずれかが水素原子であり、より好ましくは双方が水素原子である。
炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造とは、炭素クラスターを構成する炭素原子に置換または無置換アミノ基が共有結合していることを意味する。
置換または無置換アミノ基は、炭素クラスターにおける反応性の高い部位に優先的に結合していると考えられる。５員環や７員環等の、グラファイト中の６員環とは異質の局所的な結合構造が存在すると、有限の曲率が生まれるために、物質の幾何学的形状が変わるのみならず、新しい電子構造が生じ、反応性や反応速度が大きくなると考えられる。
カーボンナノチューブ表面は通常、６員環のグラファイト構造で覆われているが、この６員環の中に５員環や７員環が混じるとチューブの径が狭くなったり、あるいは広がったりすることが知られている。円錐状のカーボンナノホーンは、ホーンの径が連続的に変化するため、カーボンナノチューブに比べて表面のグラファイト構造が不規則となりやすく、アミノ基を付加しやすい。カーボンナノホーンの円錐の末端キャップ部分も反応性が高いことから、炭素クラスターがカーボンナノホーンである場合、置換または無置換アミノ基は、少なくともカーボンナノホーンの円錐の末端キャップに存在する炭素原子に結合していると考えられる。
本発明の親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基の量は、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌ．Ａ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｖｏｌ．４，ｐｐ２５５６−２５５７，１９９５）で測定した場合、通常０．１〜０．３μｍｏｌ／ｍｇ、好ましくは０．２１〜０．２７μｍｏｌ／ｍｇである。これは、炭素クラスターの表面積で通常１００〜５００ｎｍ２、好ましくは２００〜４００ｎｍ２にアミノ基１個の密度に相当する。
本発明者らはまた、親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基がニンヒドリンと反応することを見いだした。従って、親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基は、ニンヒドリン呈色反応（Ｍａｄｅｌｅｉｎｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｒａｃｙ，Ｒ．Ｔ．；Ｎｏｒｍａｎ，Ｈ．Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９９１，４７，８７９１−８８３０）を用いて簡便に定量できる。通常のアミノ酸との反応と同様に、反応の初段階でアミノ基とニンヒドリンとの反応からイミンが生成する。アミノ化炭素クラスターの炭素骨格上にはアミノ基のほかに水素原子またはそこから平衡で生じる負電荷が存在すると考えられている。このためイミン部位をもつ炭素クラスターからは，炭素骨格上の負電荷からの反応によりイミン部位の脱離が進行することが可能となる。この反応により生じた２−イミノ−１，３−インダジオンがもう一分子のニンヒドリンと反応することでｒｕｈｅｍａｎｎ紫が生成する。
具体的には、アミノ化炭素クラスターをエタノール／ピペリジン混合溶媒中、ニンヒドリン水和物、フェノールおよびシアン化カリウムと混合し、反応後、炭素クラスター由来の化合物をメンブランろ紙（細孔径０．２μｍ）により除去すると、紫色の溶液が得られる。この溶液の紫外可視スペクトルにおける５７０ｎｍの吸収の値からアミノ基を定量することができる。
本発明において親水性とは、本発明のアミノ化炭素クラスターが、水性溶媒に分散または溶解可能であることを意味する。本発明の親水性炭素クラスターは、１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水に分散させることができる。
本発明の親水性炭素クラスターは、親水性であるという性質を除き、置換または無置換アミノ基を導入する前の炭素クラスターの性質、例えば、三次元構造、凝集構造、機能等を維持している。
本発明の親水性炭素クラスターを水性溶媒に分散させることにより、炭素クラスター分散物が得られる。超音波処理を行うことにより、より効率的に分散させることができる。炭素クラスター分散物は、水性溶媒中に炭素クラスターが均一に分散しているものであればよく、炭素クラスターの水性溶液も包含される。本発明の炭素クラスター分散物は、通常０．００１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度、好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で炭素クラスターを含有する。水性溶媒は水を主成分とする溶媒であれば制限されず、水を通常５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上含有する。水性溶媒は、水に加えて、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を含んでいてもよい。
本発明の炭素クラスター分散物は、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した場合、通常、平均粒径１０〜５０００ｎｍ、好ましくは１００〜３００ｎｍ、より好ましくは１２０〜２５０ｎｍの粒子を含有する。また、粒子は好ましくは球状の形を有する。本発明の炭素クラスター分散物は、粒子のサイズ分布が小さいという点で有利である。従って、標準粒子として好適に使用できる。粒径分布の範囲は、通常５０〜５００ｎｍ、好ましくは９０〜１６０ｎｍである。
本発明はまた、親水性炭素クラスターの製造方法に関する。本発明者らは、炭素クラスターに金属アミドを反応させることにより、炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合してなる親水性炭素クラスターを製造できることを見出した。炭素クラスターと金属アミドは、通常、溶媒中で混合して反応させる。
金属アミドは、ＮＨ−イオンの塩と考えることができ、好ましくはアルカリ金属アミドおよびアルカリ土類金属アミドを用いる。金属アミドは、ＭＮＲ１Ｒ２またはＭ（ＮＲ１Ｒ２）２で表される。ここで、Ｒ１およびＲ２は上記のとおりであり、好ましくは水素原子である。Ｍは、金属、好ましくはアルカリ金属（例えば、Ｌｉ、ＮａまたはＫ）またはアルカリ土類金属（例えば、Ｂｅ、ＭｇまたはＣａ）を表す。アルカリ金属アミドとしては、好ましくは、ナトリウムアミド（ＮａＮＨ２）、カリウムアミド（ＫＮＨ２）、リチウムアミド（ＬｉＮＨ２）およびリチウムジエチルアミド（（Ｃ２Ｈ５）２ＮＬｉ）などが挙げられる。アルカリ土類金属アミドとしては、好ましくは、マグネシウムアミド（Ｍｇ（ＮＨ２）２）およびカルシウムアミド（Ｃａ（ＮＨ２）２）などが挙げられる。好ましくは、ナトリウムアミドを用いる。
反応溶媒は、炭素クラスターを分散可能なものであれば特に制限されないが、例えば、液体アンモニア、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどが使用できる。沸点が低く反応後容易に除去できることから、液体アンモニアを溶媒として用いるのが好ましい。反応温度は、溶媒の沸点以下の温度であれば特に制限されないが、通常−７８〜１８０℃である。反応時間は、通常１〜６時間、好ましくは３〜４時間である。大量合成の場合は、通常３〜９時間、より好ましくは５〜７時間である。炭素クラスターと金属アミドとの混合比は、特に制限されないが、炭素クラスター１ｇに対し、金属アミドを、通常１〜５ｇ、より好ましくは１〜３ｇ加える。大量合成する場合は、炭素クラスター１ｇに対し、金属アミドを、通常２〜６ｇ、より好ましくは２〜５ｇ加える。得られた粗生成物は、当技術分野で通常用いられる方法により精製できる。
上記方法により得られたアミノ化炭素クラスターは、結合したアミノ基をさらに化学修飾することができる。そのようなアミノ基の化学修飾としては、アミド化、アルキル化、アリール化、アジ化、ジアゾ化などが挙げられる。
本発明のアミノ化炭素クラスターは、有機化合物の固相合成における固相担体に利用することができる。本発明の固相合成用担体は、好ましくは本発明のアミノ化炭素クラスターのアミノ基に固相合成用のリンカー分子が共有結合した構造を有する。本発明の固相合成用担体は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの合成において行われるように、例えば、合成する有機化合物の構造単位を連続的に添加する固相合成において出発点として用いることが可能である。
本発明の固相合成用担体は、有機化合物として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを固相合成するために好適に用いられる。また、コンビナトリアルケミストリーにおいて好適に用いられる。固相合成においては、合成する有機化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの構造単位、例えばアミノ酸、ヌクレオシドおよびこれらの誘導体が連続的に結合される。
本明細書においてポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合を形成してできる化合物をさし、オリゴペプチドも包含される。ここでアミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基の両方をもつ有機化合物であれば特に制限されないが、好ましくはα−アミノ酸である。ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも包含され、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）およびその誘導体が包含される。核酸誘導体には、当技術分野で公知のものが包含され、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型、メチルホスホノチオエート型、フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、多環式糖骨格型、ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型および環拡張修飾塩基型の核酸、ＰＮＡ、ＰＲＮＡなど（ゲノムケミストリー、関根光雄・齋藤烈編、講談社サイエンティフィク、２００３年；Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ著，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年；ＷＯ ９２／２０７０２；ＷＯ ０１／９６３５５；ＷＯ ０１／９６３５６など）が挙げられる。
リンカー分子は、リンカーを形成するために共有結合を介して炭素クラスターに結合されうる分子を意味する。リンカー分子は炭素クラスターに結合される前の化学種をさし、リンカーは炭素クラスターに結合された後の化学種をさす。リンカー分子は、炭素クラスター上のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基またはその保護形態および有機分子を結合することが可能な反応性基またはその保護形態を含む。リンカー分子は、通常、炭素クラスター上のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基と有機分子を結合することが可能な反応性基とが二価の有機基で接続された構造を有する。
炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、カルボキシル基、ヒドロキシル基、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イミダゾール基、イソチオシアネート基、イソシアネート基などが挙げられる。
合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基は、結合する有機分子の種類により適宜決定される。有機化合物としてポリペプチドを合成する場合であって、その構造単位であるアミノ酸またはその保護形態（例えば、カルボキシル基またはアミノ基を保護したもの）をリンカーに結合する場合は、アミノ酸のカルボキシル基またはアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基が好ましい。アミノ酸のカルボキシル基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）などが挙げられる。アミノ酸のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基としては、カルボキシル基、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イミダゾール基、イソチオシアネート基、イソシアネート基などが挙げられる。有機化合物としてポリヌクレオチドを合成する場合であって、その構造単位であるヌクレオシドまたはその保護形態（例えば、塩基のアミノ基を保護したもの）をリンカーに結合する場合は、ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基と共有結合を形成する反応性基が好ましい。ヒドロキシル基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基などが挙げられる。
当業者であれば適当な保護基を選択することにより反応性基を保護形態とすることができる。各反応性基の保護基については、例えば、例えば、ハリソン・アンド・ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ）著、「有機合成法概論」（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ），１２４−１３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ出版，１９７１を参照されたい。こうした保護基はリンカー上での反応中に除去される。
リンカー分子の２つの反応性基またはその保護形態を結合する二価の有機基は、目的の固相合成反応を妨げないものであれば特に制限されない。有機基は、例えば、二価の脂肪族基、二価の環式基、または脂肪族基と環式基の組み合わせである二価の炭化水素基（酸素、窒素、硫黄および珪素などを含んでいてもよい）である。脂肪族基には、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が包含される。環式基には、脂環式基、芳香族基およびヘテロ環式基が包含される。ここで脂環式基は、脂肪族基の特性に似た特性を有する環式炭化水素基をさし、芳香族基は、一核芳香族炭化水素基または多核芳香族炭化水素基をさし、ヘテロ環式基は、環中の原子の一個以上が炭素以外の元素（酸素、窒素、硫黄および珪素など）で置換された環式炭化水素基を意味する。
リンカー分子における二価の有機基は、好ましくは芳香環を含むものである。芳香環を含むことにより、固相合成後の有機化合物の担体から切り離しが容易になる。芳香環としては、ベンゼン環、フェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環またはピレン環などが挙げられる。
リンカー分子は、炭素クラスターに結合されると、合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基またはその保護形態を有するリンカーとなる。
好ましいリンカー分子として、以下の式Ｉ：
Ｘ−Ｒ１−Ａ−Ｒ２−Ｙ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基またはその保護形態であり、好ましくはハロゲン、より好ましくはフッ素である。
Ｒ１は、直接結合または置換もしくは無置換の二価の脂肪族基、好ましくは置換もしくは無置換のＣ１−６アルキレンまたはＣ２−６アルケニレンであり、
Ａは、置換または無置換の芳香環、好ましくは置換または無置換のフェニレン基であり、好ましくは１，４−フェニレン基であり、
Ｒ２は、直接結合または置換もしくは無置換の二価の脂肪族基、好ましくは置換もしくは無置換のＣ１−６アルキレンまたはＣ２−６アルケニレンであり、
Ｙは、合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基であり、ポリペプチドを合成する場合は、好ましくはヒドロキシル基またはその保護形態であり、ポリヌクレオチドを合成する場合は、好ましくはカルボキシル基またはその保護形態である］
で表される分子が挙げられる。ヒドロキシル基の保護基としては、アセチル基、ベンジル基、シリル基、テトラヒドロピレニル基、メチル基、モノメトキシメチル基などが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物などのカルボン酸誘導体を形成し得る基が挙げられる。エステルを形成し得る基としては、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基などが挙げられる。具体的には、ベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
Ｒ１、ＡおよびＲ２における置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選ばれるハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換のＣ１−１０アルキル基、置換または無置換のＣ２−１０アルケニル基、置換または無置換のＣ５−１０シクロアルキル基、置換または無置換のＣ１−１０アルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基またはカルボキシル基等を挙げることができる。
Ａで表される芳香環、好ましくはフェニレン基は、電子吸引性の置換基を有することが好ましい。電子吸引性の置換基としては、例えば、ニトロ基、ニトロソ基、カルボニル基、カルボキシル基、シアノ基、トリアルキルアンモニウム基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。
また、リンカー分子として、固相合成において一般に用いられるベンジルアルコール官能基を与えるものを用いてもよい（例えば、Ｗａｎｇら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９５，１３２８（１９７３）およびＲｉｎｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８，３７８７（１９８７））。
リンカー分子の具体例としては、さらに、２−（４−フルオロ−２−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピラン、ポリエチレンオキシドをもつフルオロニトロベンゼン、コハク酸無水物などが挙げられる。
式（Ｉ）のリンカー分子が、アミノ化炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成すると、以下の式（ＩＩ）
−ＮＨ−Ｒ１−Ａ−Ｒ２−Ｙ （ＩＩ）
［式中、−ＮＨ−は炭素クラスターの炭素に結合し、Ｒ１、Ａ、Ｒ２およびＹは、式Ｉについて定義したとおりである］
で表されるリンカーが結合してなる固相合成用担体が得られる。固相合成を実施する前は、反応性基Ｙは通常保護された形態である。
固相合成における副反応を防ぐため、本発明のアミノ化炭素クラスターにリンカー分子を反応させた後、炭素クラスター上に残存する遊離のアミノ基は保護（キャッピング）することが好ましい。アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、例えば、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル）基およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基およびモノまたはジ置換トリチル基が挙げられる。
本発明の有機化合物の固相合成法は、本発明の固相合成用担体を出発点として、合成する有機化合物の構造単位を順次反応させて結合させることを含む。
有機化合物としてポリペプチドを固相合成する場合の一実施形態を以下に説明する。まず、リンカーの反応性基（例えばヒドロキシル基またはアミノ基）が保護されている場合はそれを脱保護し、第一アミノ酸のカルボキシル基と共有結合させる。通常、アミノ酸のアミノ基は、Ｆｍｏｃ基などの保護基で保護されている。第一アミノ酸を結合した後、所望のポリペプチドを体系的に合成する。この合成は、脱保護と結合を繰り返し行うことにより実施する。最後に結合されたアミノ酸上の保護基は、Ｎ末端アミノ基を遊離させるために、適当な処理によって、例えば、Ｂｏｃ基の場合にはトリフルオロ酢酸を用いるような酸加水分解によって、またはＦｍｏｃ基の場合にはピペリジンを用いるような塩基処理によって、定量的に除去する。最後に結合されたアミノ酸のＮ末端と次に結合するアミノ酸のＣ末端との結合は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｈｅｅｈａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７，１０６７）またはその誘導体、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵなどの縮合試薬によって実施できる。
本発明の固相合成用担体に結合しているポリペプチドとアミノ酸との縮合反応は、カイザーテストによって確認できる。カイザーテストは、ａ）５％ニンヒドリンのエタノール溶液、ｂ）８０％フェノールのエタノール溶液、ｃ）０．２ｍＭシアン化カリのピリジン溶液を各々５滴ずつ加え、沸騰水中で５分間加熱することによって実施する。この操作で溶液が青色の場合は縮合反応を続行し、溶液が黄色になればアミノ基を脱保護して次のアミノ酸との縮合反応を行う。このサイクルを必要な回数繰り返すことにより、目的とする配列を有し、かつ所望の長さのポリペプチドを得ることができる。
ポリペプチドの最後の脱保護および担体からの切り離しは、無水ＨＦ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９６５，３８，４９２１）などの強酸、トリフルオロ酢酸、トリス（トリフルオロ酢酸）ホウ素（Ｐｌｅｓｓら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７３，４６，１６０９）、トリフルオロメタンスルホン酸およびメタンスルホン酸などのスルホン酸（Ｙａｊｉｍａら，Ｊ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１９７４，１０７）、ならびに前記化合物とクレゾールの混合溶液を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドを固相合成する方法は当技術分野で周知であり、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、トリエステル法などの手法を利用することができる。固相合成の出発点として、アミノ化炭素クラスターにリンカー分子が共有結合してなる担体を用いることを除き、公知の手法に従って固相合成を実施すればよい。
ポリヌクレオチドを固相合成する場合の一実施形態としてホスホロアミダイト法による合成方法について以下に説明する。まず、種々の官能基を保護したヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、リンカーを介して炭素クラスターに結合されたヌクレオシドを縮合させて、ヌクレオシドホスファイトトリエステル体を得る。次に未反応の５’−水酸基を保護した後、酸化してヌクレオシドホスフェートトリエステル体を得る。次いで、鎖伸長生成物の５’−水酸基の保護基を除去し、５’−水酸基保護体とする。以下、同様にして目的とする長さにヌクレオチド鎖を伸長した後、すべての保護基の除去および生成したポリヌクレオチドの担体からの切り離しを行う。核酸塩基部の保護基としてはベンゾイル基やイソブチリル基のようなアシル基を使用でき、インターヌクレオチド部の保護基としては２−シアノエチル基を使用できる。
アミノ化炭素クラスターは、汎用の固相担体と異なり物理的に強く、激しい撹拌操作が可能であることから、高い反応効率で固相合成反応を実施できる。さらに本発明者らは、溶媒への分散性の良いアミノ化炭素クラスターを固相合成用担体に利用することで、既存の樹脂製担体では実現不可能な分析が可能であることを見いだした。通常の樹脂製固相担体は、数百マイクロメートルの大きさであることから溶媒中に分散して自由運動することはない。このため、担体上の有機化合物を直接検出することは困難である。これまでに，担体上のリンカー部位に柔軟なＰＥＯ鎖を導入することで担持された部位の運動性を確保し、ＮＭＲで検出する手法などが開発されているが、固体ＮＭＲを利用するものであり、その感度・分解能は溶液スペクトルとは比較にならない。本発明のアミノ化炭素クラスターは、溶液中に単粒子分散し巨大な分子として振る舞うことから、小分子の自由運動に近い運動性をもつことが推測される。本発明者らは、溶液１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより本発明の固相合成用担体上のアミノ酸部位が検出・同定できることを見いだした。これまで固相合成法で得られた反応生成物を解析するためは担体からの切り出しを行う必要があり、各反応段階での反応の成否の確認が煩雑であったが、本発明のアミノ化炭素クラスターを用いることにより反応生成物の切り出しを行うことなく各反応段階での反応の成否の確認を担体上で実施することが可能になる。In the present invention, the carbon cluster refers to an aggregate formed by bonding or aggregation of several to several hundred carbon atoms, regardless of the type of carbon-carbon bond. However, it is not necessarily limited to only 100% carbon, but also includes a mixture of other atoms. Including such a case, an aggregate in which a large number of carbon atoms occupy is referred to as a carbon cluster. Carbon clusters include spherical shell carbon clusters, such as fullerenes, and tubular carbon clusters, such as carbon nanotubes, carbon nanohorns and carbon fibers, and chemically modified derivatives and aggregates thereof.
A carbon nanotube, which is one of the tube-like carbon clusters, is a multiple tube formed by stacking two to several tens of layers of graphite-like carbon and has a structure in which both ends of each layer are closed like fullerene. As the carbon nanotube, a single-walled carbon nanotube (SWCNT) composed of a single-walled tube and a multi-walled carbon nanotube (MWCNT) in which two or more layers are concentrically overlapped are known. Can also be used. Carbon nanotubes and derivatives thereof can be obtained by known production methods, such as arc discharge method (Acc. Chem. Res. Vol. 16, no. 12, 2002, p. 1035-1044), thermal decomposition method ( J. Phys. Chem. B vol.105, no.35, 2001, p.8297-8301), laser evaporation method (Carbon vol.33, no.7, 1995, p.903-914), vapor phase synthesis method (Science vol. 306, no. 5700, 2004, p. 1362-1364). The average fiber length of carbon nanotubes (which can be determined from the average number of major axis lengths determined from image analysis of electron micrographs) is preferably 10 to 100 μm, and the diameter is preferably 0.8 to 20 nm. preferable.
The carbon nanohorn has a hollow cone shape, that is, a horn-like structure in which the tube diameter is not constant like the carbon nanotube and the tube diameter continuously increases (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-64004). Carbon nanohorns can be produced by the same method as carbon nanotubes. For example, as disclosed in the above patent publication, a structure in which spherical particles are gathered by irradiating a solid carbon simple substance with a laser beam in an inert gas atmosphere and evaporating the carbon laser. Can be obtained as These spherical particles are aggregates of single-walled carbon nanotubes whose tips are closed in a conical shape, and there are particles having a shape resembling a dahlia flower, buds, and ridges.
As one embodiment, a preferable method for producing carbon nanohorn will be described below. The solid carbon simple substance is irradiated with laser light in an inert gas atmosphere to evaporate the carbon laser to obtain a powder in which spherical substances are aggregated as the soot-like substance. Carbon laser evaporation is a high-power CO 2 in a reaction inert gas atmosphere including rare gases such as Ar (argon) and He (helium). 2 Laser light such as gas laser light is irradiated at an appropriate angle with respect to the surface of the solid carbon simple substance. As the carbon simple substance as the solid substance, for example, round bar-like sintered carbon, compression molded carbon, or the like can be used. The soot-like substance can be collected by being deposited on an appropriate substrate or collected by a dust bag. The soot-like substance can be recovered by flowing the inert gas through the reaction vessel and flowing the inert gas. The obtained soot-like substance is a particle in which carbon nanohorn structures are aggregated to form spherical particles, and a large number of these spherical particles are aggregated. This can be made into a spherical particle in a state where a single or a plurality are gathered. In this case, the spherical particles in a single or a plurality of aggregated states can be recovered by suspending in, for example, ethanol as a solvent, performing ultrasonic stirring and decantation, and repeating as necessary.
Commercially available tubular carbon clusters such as carbon nanotubes and carbon nanohorns may be used. For example, Honjo Chemical Co., Ltd., Tokyo Progress System Co., Ltd., Science Laboratories Co., Ltd., Carbon Nanotech Co., Ltd. -Mixed products such as Research Institute (CNRI), US-Hyperion, and refined products.
Fullerenes are spherical shell-like carbon molecules that contain a 5-membered ring in addition to the 6-membered ring found in graphite in the network of carbon atoms. For example, C36, C60, C70, C76, C78, C80, C82, C84, C86, C84, C88, C90, C92, C94, C96, and the number of carbon atoms in one molecule exceeds 96 and the maximum aggregate diameter is 30 nm. The following higher-order fullerenes and mixtures of two or more of these may be mentioned. Of these, C60, C70, C76, and C82 are preferably used. These fullerenes can be synthesized by a known method.
For example, the manufacturing method of C36 is New Diamond. vol. 16, no. 2, 2000, p. 30-31. As a method for producing C60, C70, C76, C78, C82, C84, C90 and C96, J. Phy. Chem. , 94, 8634 (1990) describe a production method by an arc discharge method. Phys. D, 40, 414 (1997) describe the production method by the oven laser method. Further, a high-order fullerene having more than 96 carbon atoms in one molecule and a maximum aggregate diameter of 30 nm or less can be obtained as a by-product of the arc discharge method described above.
Commercially available fullerenes include C60 and C70 manufactured by Frontier Carbon Co., Ltd., MATERIALS TECHNOLOGIES RESEARCH MTR LIMITED, and C76, C78 and C84 manufactured by MATERIALS TECHNOLOGIES RESEARCH MTR LIMITED, etc. It is done. In the present invention, a mixture of fullerenes having different carbon numbers may be used, and as commercially available products thereof, Frontier Carbon Co., Ltd., Science Laboratories, Inc., Tokyo Progress System Co., Ltd., MATERIALS TECHNOLOGIES RESEARCH MTR LIMITED, manufactured by A mixture of C60 / C70 is mentioned.
Derivatives of carbon clusters include those obtained by chemically modifying carbon clusters with functional groups. Examples of functional groups that chemically modify carbon clusters include C 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Alkynyl, carboxyl, hydroxyl, epoxy, oxentane and the like can be mentioned. Carbon cluster derivatives include those obtained by chemically modifying carbon clusters with metal elements. As the metal element for chemically modifying the carbon cluster, known elements can be used, for example, alkali metals such as Li, Na and K, alkaline earth metals such as Be, Mg and Ca, Ti, V, Examples include transition metals such as Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, and Zn.
The hydrophilic carbon cluster of the present invention has a structure in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to the carbon atom constituting the carbon cluster. Hereinafter, the hydrophilic carbon cluster of the present invention may be referred to as an aminated carbon cluster. A substituted or unsubstituted amino group is -NR 1 R 2 Where R 1 And R 2 Each independently represents a hydrogen atom, halogen, hydroxyl, C 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Alkynyl, C 1-6 Alkoxy, C 1-6 Selected from acyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl. C above 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Alkynyl, C 1-6 Alkoxy, C 1-6 Acyl, aryl, heteroaryl and cycloalkyl may be substituted.
In this specification, C 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Alkynyl, C 1-6 Alkoxy and C 1-6 Acyl means an alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group and acyl group each containing the indicated number of carbon atoms and may be linear or branched.
As used herein, aryl is an aromatic monocyclic or polycyclic carbon containing 5-20 carbon atoms, preferably 6-14 carbon atoms, more preferably 6-10 carbon atoms. A hydrogen ring group is meant. Examples of aryl include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, indenyl, azulenyl, fluorenyl, anthracenyl, phenanthrenyl, tetrahydronaphthyl, indanyl and phenanthridinyl.
In the present specification, heteroaryl means an aromatic monocyclic ring group or a polycyclic ring group, and the aromatic monocyclic ring group or polycyclic ring group is 5 to 20 in number. Of carbon atoms, preferably 5 to 10 carbon atoms, wherein one or more ring carbons, preferably 1 to 4 ring carbons, such as an oxygen atom, a nitrogen atom or a sulfur atom, respectively. It is replaced with a heteroatom. Preferred heteroaryls include 5-6 membered monocyclic heteroaryl and 8-10 membered bicyclic heteroaryl. Examples of heteroaryl include, but are not limited to, imidazolyl, quinolyl, isoquinolyl, indolyl, indazolyl, pyridazyl, pyridyl, pyrrolyl, pyrazolyl, pyrazinyl, quinoxalyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, furyl, thienyl, triazolyl, thiazolyl, carbazolyl, carbolinyl, List tetrazolyl, benzofuranyl, oxazolyl, benzoxazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, furazanyl, oxadiazolyl, benzimidazolyl, benzothienyl, quinolinyl, benzotriazolyl, benzothiazolyl, isoquinolinyl, isoindolyl, acridinyl and benzoisoxazolyl Can do.
Cycloalkyl as used herein is monocyclic or polycyclic non-aromatic having 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 12 carbon atoms, more preferably 3 to 10 carbon atoms. It means a hydrocarbon ring group.
R 1 And R 2 With respect to C above 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 2-6 Alkynyl, C 1-6 Alkoxy, C 1-6 Substituents in acyl, aryl, heteroaryl and cycloalkyl include halogen, hydroxyl, nitro, amino, mercapto, cyano, isocyanate, carboxyl, C 1-6 Alkyl, C 2-6 Alkenyl, C 1-6 Alkoxy, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, aryl, heteroaryl, C 1-6 Alkylamino, C 1-6 Examples include alkylthio.
In the aminated carbon cluster of the present invention, preferably R 1 And R 2 Is a hydrogen atom, more preferably both are hydrogen atoms.
The structure in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to the carbon atom of the carbon cluster means that the substituted or unsubstituted amino group is covalently bonded to the carbon atom constituting the carbon cluster.
The substituted or unsubstituted amino group is considered to be preferentially bonded to a highly reactive site in the carbon cluster. When there is a local bond structure that is different from the 6-membered ring in graphite, such as a 5-membered ring or 7-membered ring, a finite curvature is created, so that not only the geometrical shape of the material changes but also a new one. It is thought that an electronic structure is generated, and the reactivity and reaction rate are increased.
The surface of carbon nanotubes is usually covered with a 6-membered ring graphite structure, but if a 5-membered or 7-membered ring is mixed in this 6-membered ring, the diameter of the tube may be reduced or expanded. Are known. Conical carbon nanohorns have a horn diameter that changes continuously, and therefore the surface graphite structure is more likely to be irregular than carbon nanotubes, and amino groups are more likely to be added. Since the carbon nanohorn cone end cap portion is also highly reactive, when the carbon cluster is carbon nanohorn, the substituted or unsubstituted amino group is bonded to at least the carbon atom present in the carbon nanohorn cone end cap. It is thought that there is.
The amount of the substituted or unsubstituted amino group contained in the hydrophilic carbon cluster of the present invention is determined according to the method of Sanger (Paquette, LA Eds. Wiley, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis Vol. 4, pp 2556-2557, 1995). Is usually 0.1 to 0.3 μmol / mg, preferably 0.21 to 0.27 μmol / mg. This is usually 100 to 500 nm in terms of the surface area of the carbon cluster. 2 , Preferably 200-400 nm 2 Corresponds to the density of one amino group.
The inventors have also found that substituted or unsubstituted amino groups contained in the hydrophilic carbon cluster react with ninhydrin. Therefore, the substituted or unsubstituted amino group contained in the hydrophilic carbon cluster has a ninhydrin color reaction (Madeleine, MJ; Tracy, RT; Norman, HN Tetrahedron. 1991, 47, 8791-). 8830) can be easily quantified. Similar to the reaction with ordinary amino acids, imine is formed from the reaction of the amino group and ninhydrin at the initial stage of the reaction. On the carbon skeleton of the aminated carbon cluster, it is considered that in addition to the amino group, a hydrogen atom or a negative charge generated in equilibrium from the hydrogen atom exists. For this reason, from the carbon cluster having an imine moiety, the elimination of the imine moiety can proceed by a reaction from a negative charge on the carbon skeleton. The 2-imino-1,3-indazione produced by this reaction reacts with another molecule of ninhydrin to produce ruhemann purple.
Specifically, the aminated carbon cluster is mixed with ninhydrin hydrate, phenol and potassium cyanide in an ethanol / piperidine mixed solvent, and after the reaction, the compound derived from the carbon cluster is removed with a membrane filter paper (pore diameter 0.2 μm). A purple solution is obtained. The amino group can be quantified from the absorption value at 570 nm in the ultraviolet-visible spectrum of this solution.
In the present invention, hydrophilic means that the aminated carbon cluster of the present invention can be dispersed or dissolved in an aqueous solvent. The hydrophilic carbon cluster of the present invention can be dispersed in water at a concentration of 1 mg / mL or more.
The hydrophilic carbon cluster of the present invention maintains the properties of the carbon cluster before introducing a substituted or unsubstituted amino group, for example, a three-dimensional structure, an aggregated structure, a function, etc., except for the property of being hydrophilic. .
A carbon cluster dispersion can be obtained by dispersing the hydrophilic carbon cluster of the present invention in an aqueous solvent. By performing ultrasonic treatment, it can be more efficiently dispersed. Any carbon cluster dispersion may be used as long as carbon clusters are uniformly dispersed in an aqueous solvent, and an aqueous solution of carbon clusters is also included. The carbon cluster dispersion of the present invention usually contains carbon clusters at a concentration of 0.001 to 2 mg / mL, preferably 0.001 to 1 mg / mL. The aqueous solvent is not limited as long as it is a solvent containing water as a main component, and usually contains 50% by weight or more, preferably 70% by weight or more of water. The aqueous solvent may contain alcohol, dimethyl sulfoxide (DMSO), tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF) and the like in addition to water.
When measured by dynamic light scattering (DLS), the carbon cluster dispersion of the present invention usually contains particles having an average particle size of 10 to 5000 nm, preferably 100 to 300 nm, more preferably 120 to 250 nm. Also, the particles preferably have a spherical shape. The carbon cluster dispersion of the present invention is advantageous in that the particle size distribution is small. Therefore, it can be suitably used as standard particles. The range of the particle size distribution is usually 50 to 500 nm, preferably 90 to 160 nm.
The present invention also relates to a method for producing hydrophilic carbon clusters. The present inventors have found that a hydrophilic carbon cluster in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to a carbon atom can be produced by reacting the carbon cluster with a metal amide. Carbon clusters and metal amides are usually mixed and reacted in a solvent.
The metal amide can be considered as a salt of NH- ion, and preferably an alkali metal amide and an alkaline earth metal amide are used. Metal amide is MNR 1 R 2 Or M (NR 1 R 2 ) 2 It is represented by Where R 1 And R 2 Is as described above, preferably a hydrogen atom. M represents a metal, preferably an alkali metal (eg Li, Na or K) or an alkaline earth metal (eg Be, Mg or Ca). The alkali metal amide is preferably sodium amide (NaNH 2 ), Potassium amide (KNH) 2 ), Lithium amide (LiNH 2 ) And lithium diethylamide ((C 2 H 5 ) 2 NLi) and the like. The alkaline earth metal amide is preferably magnesium amide (Mg (NH 2 ) 2 ) And calcium amide (Ca (NH 2 ) 2 ) And the like. Preferably, sodium amide is used.
The reaction solvent is not particularly limited as long as it can disperse carbon clusters. For example, liquid ammonia, chlorobenzene, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, and the like can be used. It is preferable to use liquid ammonia as a solvent since it has a low boiling point and can be easily removed after the reaction. Although reaction temperature will not be restrict | limited especially if it is the temperature below the boiling point of a solvent, Usually, it is -78-180 degreeC. The reaction time is usually 1 to 6 hours, preferably 3 to 4 hours. In the case of mass synthesis, it is usually 3 to 9 hours, more preferably 5 to 7 hours. The mixing ratio of the carbon cluster and the metal amide is not particularly limited, but usually 1 to 5 g, more preferably 1 to 3 g of the metal amide is added to 1 g of the carbon cluster. In the case of mass synthesis, 2 to 6 g, more preferably 2 to 5 g of metal amide is added to 1 g of carbon cluster. The resulting crude product can be purified by methods commonly used in the art.
The aminated carbon cluster obtained by the above-described method can further chemically modify the bound amino group. Examples of such chemical modification of the amino group include amidation, alkylation, arylation, azidation, diazotization and the like.
The aminated carbon cluster of the present invention can be used as a solid phase carrier in solid phase synthesis of organic compounds. The solid phase synthesis carrier of the present invention preferably has a structure in which a linker molecule for solid phase synthesis is covalently bonded to the amino group of the aminated carbon cluster of the present invention. The carrier for solid phase synthesis of the present invention can be used as a starting point in solid phase synthesis in which, for example, structural units of organic compounds to be synthesized are continuously added, as in the synthesis of polypeptides and polynucleotides. It is.
The carrier for solid phase synthesis of the present invention is suitably used for solid phase synthesis of polypeptides and polynucleotides as organic compounds. Further, it is suitably used in combinatorial chemistry. In solid-phase synthesis, organic compounds to be synthesized, for example, structural units of polypeptides and polynucleotides, such as amino acids, nucleosides, and derivatives thereof are successively linked.
As used herein, a polypeptide refers to a compound formed by amino acids forming a peptide bond, and includes oligopeptides. The amino acid is not particularly limited as long as it is an organic compound having both an amino group and a carboxyl group, but is preferably an α-amino acid. Polynucleotides also include oligonucleotides, including nucleic acids (DNA and RNA) and derivatives thereof. Nucleic acid derivatives include those known in the art, and phosphorothioate type, phosphorodithioate type, phosphorodiamidate type, methylphosphonate type, methylphosphonothio, in which the oxygen atom of the phosphate site is substituted with a sulfur atom. Ate type, substituent-modified type on furanose ring, pyranose type with 1-carbon increase in sugar ring skeleton, polycyclic sugar skeleton type, pyrimidine C-5 position modified base type, purine C-7 position modified base type and ring Extended modified base type nucleic acid, PNA, PRNA, etc. (Genome Chemistry, Mitsuo Sekine, Takeshi Saito, Kodansha Scientific, 2003; Peptidenlucic acids, 2nd ed. PE Nielsen, Horizon Bioscience, 2004; WO 92/01702; WO 01/96355; WO 01/96 56, etc.) and the like.
A linker molecule refers to a molecule that can be bound to a carbon cluster via a covalent bond to form a linker. The linker molecule refers to the chemical species before binding to the carbon cluster, and the linker refers to the chemical species after binding to the carbon cluster. The linker molecule includes a reactive group that can form a covalent bond with an amino group on the carbon cluster or a protected form thereof and a reactive group that can bind an organic molecule or a protected form thereof. The linker molecule usually has a structure in which a reactive group capable of forming a covalent bond with an amino group on a carbon cluster and a reactive group capable of binding an organic molecule are connected by a divalent organic group.
Examples of the reactive group capable of forming a covalent bond with the amino group of the carbon cluster include halogen (fluorine, chlorine, bromine and iodine), carboxyl group, hydroxyl group, active ester group, epoxy group, aldehyde group, carbodiimide group, Examples thereof include an imidazole group, an isothiocyanate group, and an isocyanate group.
The reactive group capable of bonding the structural unit of the organic compound to be synthesized is appropriately determined depending on the type of the organic molecule to be bonded. When synthesizing a polypeptide as an organic compound and binding a structural unit of an amino acid or a protected form thereof (for example, a carboxyl group or amino group protected) to a linker, the amino acid carboxyl group or amino acid A reactive group capable of forming a covalent bond with the group is preferred. Examples of the reactive group capable of forming a covalent bond with the carboxyl group of an amino acid include an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, and halogen (fluorine, chlorine, bromine and iodine). Examples of the reactive group capable of forming a covalent bond with the amino group of the amino acid include a carboxyl group, an active ester group, an epoxy group, an aldehyde group, a carbodiimide group, an imidazole group, an isothiocyanate group, and an isocyanate group. When synthesizing a polynucleotide as an organic compound and binding a structural unit nucleoside or a protected form thereof (for example, a protected amino group of a base) to a linker, the 3′-hydroxyl group of the nucleoside Reactive groups that form covalent bonds with are preferred. Examples of the reactive group capable of forming a covalent bond with the hydroxyl group include a carboxyl group, an amino group, a halogen (fluorine, chlorine, bromine and iodine), an epoxy group, an aldehyde group, and a carbodiimide group.
A person skilled in the art can make a reactive group into a protected form by selecting an appropriate protecting group. For protecting groups of each reactive group, for example, Harrison and Harrison, "Introduction to Organic Synthesis" (Compendium of Organic Synthetic Methods), 124-131, John Wiley and Sons, See 1971. Such protecting groups are removed during the reaction on the linker.
The divalent organic group that binds the two reactive groups of the linker molecule or the protected form thereof is not particularly limited as long as it does not interfere with the target solid phase synthesis reaction. The organic group includes, for example, a divalent aliphatic group, a divalent cyclic group, or a divalent hydrocarbon group that is a combination of an aliphatic group and a cyclic group (including oxygen, nitrogen, sulfur, silicon, and the like). May be). Aliphatic groups include alkylene groups, alkenylene groups and alkynylene groups. Cyclic groups include alicyclic groups, aromatic groups and heterocyclic groups. Here, the alicyclic group refers to a cyclic hydrocarbon group having characteristics similar to those of an aliphatic group, and the aromatic group refers to a mononuclear aromatic hydrocarbon group or a polynuclear aromatic hydrocarbon group. The heterocyclic group means a cyclic hydrocarbon group in which one or more atoms in the ring are substituted with an element other than carbon (such as oxygen, nitrogen, sulfur and silicon).
The divalent organic group in the linker molecule preferably contains an aromatic ring. By including an aromatic ring, separation from the organic compound carrier after solid-phase synthesis is facilitated. Examples of the aromatic ring include a benzene ring, a phenanthrene ring, a fluorene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring, and a pyrene ring.
When the linker molecule is bonded to the carbon cluster, it becomes a linker having a reactive group or a protected form thereof capable of bonding the structural unit of the organic compound to be synthesized.
Preferred linker molecules include the following formula I:
X-R 1 -AR 2 -Y (I)
[Where:
X is a reactive group capable of forming a covalent bond with the amino group of the carbon cluster or a protected form thereof, preferably halogen, more preferably fluorine.
R 1 Is a direct bond or a substituted or unsubstituted divalent aliphatic group, preferably a substituted or unsubstituted C 1-6 Alkylene or C 2-6 Alkenylene,
A is a substituted or unsubstituted aromatic ring, preferably a substituted or unsubstituted phenylene group, preferably a 1,4-phenylene group,
R 2 Is a direct bond or a substituted or unsubstituted divalent aliphatic group, preferably a substituted or unsubstituted C 1-6 Alkylene or C 2-6 Alkenylene,
Y is a reactive group capable of binding a structural unit of an organic compound to be synthesized. When synthesizing a polypeptide, Y is preferably a hydroxyl group or a protected form thereof, and when synthesizing a polynucleotide, Preferred is a carboxyl group or a protected form thereof]
The molecule | numerator represented by is mentioned. Examples of the hydroxyl protecting group include an acetyl group, a benzyl group, a silyl group, a tetrahydropyrenyl group, a methyl group, and a monomethoxymethyl group. Examples of the protecting group for the carboxyl group include groups capable of forming carboxylic acid derivatives such as esters, acid halides, and acid anhydrides. Examples of the group capable of forming an ester include an alkoxy group, an aralkyloxy group, and an aryloxy group. Specific examples include a benzyloxy group and a t-butoxy group.
R 1 , A and R 2 Examples of the substituent in the group include a halogen selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted amino group, a nitro group, a cyano group, a substituted or unsubstituted C 1-10 Alkyl group, substituted or unsubstituted C 2-10 Alkenyl group, substituted or unsubstituted C 5-10 A cycloalkyl group, substituted or unsubstituted C 1-10 An alkoxy group, a substituted or unsubstituted alkoxycarbonyl group, a carboxyl group, etc. can be mentioned.
The aromatic ring represented by A, preferably the phenylene group, preferably has an electron-withdrawing substituent. Examples of the electron-withdrawing substituent include a nitro group, a nitroso group, a carbonyl group, a carboxyl group, a cyano group, a trialkylammonium group, and a trifluoromethyl group.
In addition, as a linker molecule, one that gives a benzyl alcohol functional group generally used in solid phase synthesis may be used (for example, Wang et al., J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328 (1973) and Rink et al., Tetrahedron Letters, 28, 3787 (1987)).
Specific examples of the linker molecule further include 2- (4-fluoro-2-nitrobenzyloxy) tetrahydropyran, fluoronitrobenzene having polyethylene oxide, succinic anhydride, and the like.
When the linker molecule of formula (I) forms a covalent bond with the amino group of the aminated carbon cluster, the following formula (II)
-NH-R 1 -AR 2 -Y (II)
[Wherein, —NH— binds to carbon of carbon cluster, and R 1 , A, R 2 And Y are as defined for Formula I]
A carrier for solid-phase synthesis formed by binding a linker represented by Prior to performing solid phase synthesis, the reactive group Y is usually in a protected form.
In order to prevent side reactions in solid phase synthesis, it is preferable to protect (capping) the free amino group remaining on the carbon cluster after the linker molecule is reacted with the aminated carbon cluster of the present invention. The amino-protecting group is not particularly limited, and examples thereof include an acyl group, a carbamate group, a trialkylsilyl group, a phthalyl group, a carboxyalkylcarbonyl group, a tosyl group, a trifluoroacetyl group, a trityl group, a benzyloxycarbonyl group, Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) group, Boc (t-butoxycarbonyl) group, benzyloxycarbonyl group, Npys (3-nitro-2-pyridylsulfenyl) group and p-methoxybenzyloxycarbonyl group and mono or A disubstituted trityl group may be mentioned.
The solid-phase synthesis method of the organic compound of the present invention includes sequentially reacting and bonding the structural units of the organic compound to be synthesized using the carrier for solid-phase synthesis of the present invention as a starting point.
One embodiment in the case of solid-phase synthesis of a polypeptide as an organic compound will be described below. First, when a reactive group (for example, hydroxyl group or amino group) of the linker is protected, it is deprotected and covalently bonded to the carboxyl group of the first amino acid. Usually, the amino group of an amino acid is protected with a protecting group such as an Fmoc group. After binding the first amino acid, the desired polypeptide is systematically synthesized. This synthesis is performed by repeated deprotection and coupling. The protecting group on the last bound amino acid is removed by suitable treatment to liberate the N-terminal amino group, for example by acid hydrolysis such as with trifluoroacetic acid in the case of the Boc group, or the Fmoc group. In this case, it is quantitatively removed by a base treatment using piperidine. The coupling between the N-terminus of the last coupled amino acid and the C-terminus of the next coupled amino acid can be accomplished in several ways. For example, it can be carried out with a condensation reagent such as dicyclohexylcarbodiimide (Sheehan et al., J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067) or a derivative thereof, HATU, TBTU, HBTU, etc.
The condensation reaction between the polypeptide bound to the solid phase synthesis carrier of the present invention and the amino acid can be confirmed by a Kaiser test. The Kaiser test was performed by adding 5 drops each of a) 5% ninhydrin in ethanol, b) 80% phenol in ethanol, and c) 0.2 mM potassium cyanide in pyridine, and heating in boiling water for 5 minutes. To do. In this operation, when the solution is blue, the condensation reaction is continued, and when the solution turns yellow, the amino group is deprotected and the condensation reaction with the next amino acid is performed. By repeating this cycle as many times as necessary, a polypeptide having a desired sequence and having a desired length can be obtained.
Final deprotection of the polypeptide and release from the carrier can be achieved using strong acids such as anhydrous HF (Sakakibara et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), trifluoroacetic acid, tris (trifluoroacetic acid) boron. (Pless et al., Helv. Chim. Acta, 1973, 46, 1609), sulfonic acids such as trifluoromethane sulfonic acid and methane sulfonic acid (Yajima et al., J Chem. Soc., Chem. Comm., 1974, 107), and It can be performed using a mixed solution of the compound and cresol.
Methods for solid-phase synthesis of polynucleotides are well known in the art, and for example, techniques such as phosphoramidite method, H-phosphonate method, triester method and the like can be used. As a starting point for solid-phase synthesis, solid-phase synthesis may be performed according to a known technique except that a carrier in which a linker molecule is covalently bonded to an aminated carbon cluster is used.
A synthesis method using the phosphoramidite method will be described below as an embodiment in the case of solid-phase synthesis of a polynucleotide. First, a nucleoside phosphite triester is obtained by condensing a nucleoside 3′-phosphoramidite with various functional groups protected and a nucleoside bonded to a carbon cluster via a linker. Next, after protecting the unreacted 5′-hydroxyl group, it is oxidized to obtain a nucleoside phosphate triester. Next, the 5′-hydroxyl protecting group of the chain extension product is removed to obtain a 5′-hydroxyl protected product. In the same manner, after extending the nucleotide chain to the desired length in the same manner, all protecting groups are removed and the produced polynucleotide is separated from the carrier. An acyl group such as a benzoyl group or an isobutyryl group can be used as the protecting group for the nucleic acid base portion, and a 2-cyanoethyl group can be used as the protecting group for the internucleotide portion.
Since aminated carbon clusters are physically strong and can be vigorously stirred unlike general-purpose solid phase carriers, solid phase synthesis reactions can be carried out with high reaction efficiency. Furthermore, the present inventors have found that an analysis that cannot be realized with an existing resin carrier is possible by using an aminated carbon cluster with good dispersibility in a solvent as a carrier for solid phase synthesis. Since a normal resin solid support has a size of several hundreds of micrometers, it does not move freely by being dispersed in a solvent. For this reason, it is difficult to directly detect the organic compound on the carrier. So far, a method has been developed to secure the mobility of the supported site by introducing a flexible PEO chain into the linker site on the carrier and detect it by NMR, but it uses solid NMR. Yes, its sensitivity and resolution are not comparable to solution spectra. Since the aminated carbon cluster of the present invention is dispersed as a single particle in a solution and behaves as a huge molecule, it is presumed to have a mobility close to the free motion of a small molecule. We have a solution 1 It was found that the amino acid site on the solid phase synthesis carrier of the present invention can be detected and identified by 1 H NMR spectrum. Until now, in order to analyze the reaction product obtained by the solid-phase synthesis method, it was necessary to cut out from the support, and it was complicated to confirm the success or failure of the reaction at each reaction stage. By using the carbon cluster, it is possible to confirm the success or failure of the reaction at each reaction stage on the carrier without cutting out the reaction product.

実施例１ 親水性アミノ化ＮＨＡ２の合成
カーボンナノホーン凝集物（ＮＨＡ）（２００ｍｇ）およびナトリウムアミド（２００ｍｇ）の液体アンモニア（３２０ｍＬ）中の混合物を、ドライアイス冷却器を付けたフラスコ中で３時間還流した（−３３℃）。アンモニアを除去すると黒色の固体が得られた。粗物質をさらに飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）により洗浄し、濾過し、２５℃、０．２ｍｍＨｇで１２時間乾燥して、アミノ化ＮＨＡ２（２０５ｍｇ）の黒色の固体を得た（図１）。ＮＨＡは吸収性が高いので、アミノ化ＮＨＡ２の正確な重量を算出するのは困難であった。反応は、１．００ｇのＮＨＡの量まで容易にスケールアップすることができ、１．０３ｇのアミノ化ＮＨＡ２が得られた。
減衰全反射（ＡＴＲ）装置を付けたＡＳＩ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＲＥＡＣＴ ＩＲ１０００により、未処理ＮＨＡおよびアミノ化ＮＨＡ２のＩＲスペクトルを得た（図２）。ＩＲスペクトルは、３２２０ｃｍ−１に幅広い吸収を有し、これはＮＨＡ上にアミノ基が存在することを示している。
また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＭ２１００Ｆ，ＪＥＯＬ）を用いてアミノ化ＮＨＡ２の構造を分析した（図３Ａ）。ＴＥＭによる分析により、カーボンナノホーンの円錐形の構造ならびにその凝集した構造が反応の前後で同じように存在していることが示された。
実施例２ アミノ化ＮＨＡ２の分散液の調製および解析
アミノ化ＮＨＡ２（１．００ｍｇ）を水（５．００ｍＬ）中で２分間音波処理（３．８ｋＨｚ；ＵＳ−３、Ａｓ Ｏｎｅ Ｃｏ．）すると灰色の透明な溶液が得られた（図３Ｂ中）。溶液中に視認できる粒子は存在せず、濾過しても膜（孔径０．２μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ）上に物質は付着しなかった。アミノ化ＮＨＡ２の濃度はさらに１．０ｍｇ／ｍＬ以上まで上げることが可能であるが、溶液の色が濃くなりすぎて、視認できる粒子の存在を判定することができなくなった（図３Ｂ左）。反応により得られたすべての粗物質が水に溶解した。これは反応によりＮＨＡが定量的に親水性の形に変換したことを示している。
溶液中の粒子のサイズを動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ）により分析した（図３Ｃ）。ＤＬＳの研究により、アミノ化ＮＨＡ２の水溶液は平均サイズ１３４±５ｎｍの粒子を含有することが示された。サイズの範囲は７０ｎｍ〜５００ｎｍであって、先のＴＥＭの結果と一致した。
溶液をマイカ上に析出させ、粒子をさらにＡＦＭ（ＪＳＰＭ−４２００、ＪＥＯＬ）により分析した（図３Ｄ）。ＡＦＭによる分析により、粒子は球状の形を有することが示され、よく単離された粒子の観察により、ＮＨＡが溶液中で単一の粒子として存在することが確認された。ＡＦＭによる固体粒子の高さ分析は、９５ｎｍのより小さい平均サイズを示した（図４）。これはＡＦＭの条件下では水和層が除去されるためであると考えられる。
実施例３ Ｓａｎｇｅｒの方法によるアミノ化ＮＨＡ上のアミノ基の定量
アミノ化ＮＨＡ２におけるアミノ基の量を、Ｓａｎｇｅｒの方法を用いて証明および定量した（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｖｏｌ．４，ｐｐ ２５５６−２５５７，Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌ．Ａ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ，１９９５，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）。すなわち、アミノ化ＮＨＡ２のアミノ基を１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンによりジニトロフェニルアミノ基に変換し、その量をＵＶ−ｖｉｓ差スペクトルにより定量した。
アミノ化ＮＨＡ２（５．００ｍｇ）を、ＮａＨＣＯ３（０．１０Ｍ、１００μＬ）の塩基性水溶液およびエタノール（５０μＬ）中で、６０℃で２０分間、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（１．００ｍｇ）と混合した。反応混合物を濾過すると黒色の固体が得られた。上記黒色の固体をさらに水（１．０ｍＬ）およびエタノール（１．０ｍＬ）により洗浄し、減圧乾燥してジニトロフェニルアミノ化ＮＨＡ３（５．２８ｍｇ）を得た（図１）。
ジニトロフェニルアミノ化ＮＨＡ３（１．００ｍｇ）の水溶液の吸収スペクトルは、３５５ｎｍにジニトロフェニル基に相当するピークを有していた（図５Ｂ）。出発物質はいずれも３５５ｎｍに吸収を有しないことから、ナトリウムアミドとの反応によりＮＨＡにアミノ基が導入されたことが立証された。また、報告されているジニトロフェニルアミノ基のモル吸収係数の値（１６０００〜１８０００Ｍ−１・ｃｍ−１）から、アミノ基の量は約０．２２μｍｏｌ／ｍｇと算出された。ＮＨＡの表面積はあらかじめ３０８ｍ２／ｇであると算出されているので（Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．；Ｋａｎｅｋｏ，Ｋ．；Ｋｏｋａｉ，Ｆ．；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．；Ｙｕｄａｓａｋａ，Ｍ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２０００，３３１，１４−２０）、これは３００ｎｍ２の面積に１個のアミノ基が存在することを示している。
実施例４ カラムクロマトグラフィーによるアミノ化ＮＨＡ２の分画
炭素粒子を標準化するために最も困難な問題の一つは、均一なサイズの粒子を得ることである。本発明者らは、分離のためのゲル浸透クロマトグラフィーを研究した結果、ポリアクリルアミドを基礎とするゲル（セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ）が媒体として適していることが見出された。そこで、セファクリル５００ＨＲのカラムによりアミノ化ＮＨＡ２の水溶液を溶離した。
アミノ化ＮＨＡ２（０．２０ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍＬ）の水溶液をセファクリル５００ＨＲのカラム（樹脂体積：１７ｍＬ、カラム直径：１ｃｍ、カラム高さ：２２ｃｍ）に流し、０．５ｍＬ／分の流速で水により溶離した。ＵＶ検出器（２６０ｎｍで検出、ＵＶ−２０７５、ＪＡＳＣＯ）を用いてクロマトグラムを得て（図６Ａ）、溶離液を０．２５ｍＬの分画として集めた。それぞれの分画の粒子のサイズをＤＬＳにより分析した（図６Ｂ）。フラクションの２６０ｎｍのＵＶ吸収により、流した粒子の９２％がカラムから溶離したことが示された。
また、図６Ｂの典型的なデータに示されるように、粒子はサイズにより分画された。分画２２、２３、２４および２７における粒子の平均サイズは、それぞれ１９８±１７、１４８±１、１３４±６および１２７±７ｎｍであった。
異なる孔径を有するゲル（セファクリル１００ＨＲまたは１０００ＳＦ）を用いた場合には、溶離した粒子の量が０％および１％に減少した（図７）。
実施例５ 蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４の合成
アミノ化ＮＨＡ２（０．４０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＬ）の水溶液に、２−（２，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−Ｎ−［５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−ペンチル］−テレフタルアミド酸（２．８ｍｇ、オレゴングリーン４８８−Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のメタノール（２０ｍｌ）溶液を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過すると黒色の固体が得られた。上記黒色の固体を水（２０ｍＬ）およびメタノール（２０ｍＬ）によりさらに洗浄し、減圧乾燥して蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４（８．２３ｍｇ）を得た（図１）。アミノ化ＮＨＡ４をＵＶ−ｖｉｓ差スペクトルにより分析した（図５Ｃ）。発色団の吸収係数（８４０００Ｍ−１・ｃｍ−１）から、オレゴングリーン４８８の量は０．０１７μｍｏｌ／ｍｇであると算出された。
同じ反応条件でアミノ化ＮＨＡ２をオレゴングリーン４８８のメチルエステルにより処理した場合には、得られたＮＨＡは蛍光染料の吸収および励起を示さなかった（図８）。この結果により、アミノ化ＮＨＡ４の蛍光は物理吸着された染料によるものではなく、共有結合した染料によるものであることが確認された。
実施例６ 細胞毒性試験
およそ２ｘ１０４個の細胞を９６穴のプレートを用いて１０％の牛胎児血清と１％のペニシリンとストレプトマイシンを含む培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中、３７℃、加湿条件下２４時間培養した。０．０５ｍｇ／ｍＬの割合でアミノ化ＮＨＡ２を含む新しい培地に交換した後４８時間培養した。細胞を溶かした後遠心分離し、タンパク質分解酵素阻害剤とクマシーブリリアントブルーＧ−２５０を加え、５９５ｎｍの吸収からタンパク質を定量し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）コントロール実験と比較することで毒性を算出した。
上記と同様の実験を石英粒子と二酸化チタン粒子とでおこなったところ、アミノ化ＮＨＡ２は石英粒子の１０分の１程度の毒性を示したが、一般的に無毒とされる二酸化チタン粒子に比べると毒性を示した（図９）。本実施例により、構造特性が完全に明確となったナノチューブ粒子と既存粒子との毒性の比較が行われた。この実施例により本発明で調製される親水化炭素クラスターがナノチューブ粒子の標準物質として利用できることが示された。
実施例７ アミノ化カーボンナノホーン凝集物の大量合成
カーボンナノホーン凝集物（１．５０ｇ）を液体アンモニア（２．４Ｌ）へ分散させた後、ナトリウムアミド（３．００ｇ）を加えた。ドライアイスコンデンサーを取り付けたフラスコで−３３℃、反応混合物を還流攪拌した。６時間攪拌した後、３０℃の湯浴で穏やかに加熱することで１時間かけてアンモニアを留去し、黒色固体を得た。この粗生成物を飽和塩化アンモニウム水溶液（３００ｍＬ）に分散させ、親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ別した後、ろ紙上に残った目的生成物を超純水（３００ｍＬ）で洗浄した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ）１２時間室温で乾燥させ、アミノナノホーン凝集物を黒色固体として得た（１．５２ｇ）。
実施例８ アミノナノホーン凝集物へのベンジルアルコール連結（リンカー）部の導入
（黒丸はカーボンナノホーンを示す）
４−フルオロ−３−ニトロベンジルアルコール（１．００ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（０．６９０ｍＬ，７．６０ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム六水和物（１４．１ｍｇ，５８．４μｍｏｌ）を６０℃で攪拌し、４時間後室温下に戻した。反応混合物をそのままシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：塩化メチレン）により精製した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ）１２時間室温で乾燥させ、２−（４−フルオロ−３−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピランの薄い黄色い液体を得た（１．４５ｇ，９７％）：ＩＲ（ｎｅａｔ）３０７０（ｗ），２９４４（ｍ），２８７１（ｍ），１６２２（ｍ），１５９３（ｍ），１５３８（ｓ），１３４９（ｓ），１２５４（ｍ），１２０１（ｍ），１１２３（ｓ），１０７９（ｍ），１０３６（ｍ），９７５（ｍ），９０６（ｍ），８３３（ｍ），８１８（ｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．５６−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．８９（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．５８（ｍ，１Ｈ），３．８５−３．８９（ｍ，１Ｈ），４．５２−４．５４（ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ），４．７１−４．７３（ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７９−４．８２（ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．６３（ｍ，１Ｈ），８．１（ｄｄ，Ｊ＝２，４Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１９．２（ＣＨ２），２５．３（ＣＨ２），３０．４（ＣＨ２），６２．３（ＣＨ２），６７．０（ＣＨ２），９８．３（ＣＨ），１１８．２（ＣＨ），１２４．８（Ｃ），１３４．３（ＣＨ），１３５．７（ＣＨ），１５３．７（Ｃ−Ｃｌ），１５５．８（Ｃ−ＮＯ２）；Ａｎａｌ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ４Ｆ：Ｃ，２５．０７；Ｈ，５．５３；Ｎ，５．４９．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５６．２７；Ｈ，５．６８；Ｎ，５．３１。
２−（４−フルオロ−３−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピラン（１３ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（７５０ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）、アミノナノホーン凝集物（５０４ｍｇ；アミノ基の量：０．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）中混合し、６０℃で２０時間加熱攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、水（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）、トルエン（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ・１０時間・室温）、さらに乾燥し、目的生成物を黒色固体として得た（５１０ｍｇ）。
実施例９ ベンジルアルコール連結（リンカー）部の導入後の残存アミノ基の保護
実施例８で合成したリンカー導入後のカーボンナノホーン（４５０ｍｇ；アミノ基の量：１２μｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（２．０ｍｇ，１７μｍｏｌ）をＤＭＦ（２３ｍＬ）中混合し、この溶液へ無水酢酸（５７μＬ，０．６１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミン（２７μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール，２．５ｍｇ，１８μｍｏｌ）を加え、室温下２時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ×３）、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１３時間・室温）下、さらに乾燥し、残存アミノ基をアセチル化したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（４５１ｍｇ）。
実施例１０ ベンジルアルコール連結（リンカー）部のＴＨＰ保護基の除去
実施例９で合成したリンカー付きカーボンナノホーン（４１０ｍｇ，ＴＨＰの量：７６μｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１０ｍｇ，５８μｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）中混合し、４０℃で４時間加熱攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下溶媒を留去し、目的生成物であるベンジルアルコール部位をもつカーボンナノホーンを黒色固体として得た（４１０ｍｇ）。
実施例１１ ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護グリシンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃグリシン（１１０ｍｇ，０．３６ｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５２ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５０ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護グリシン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃグリシン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した（図１０）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ３．６９（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．３８（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．７５（ｂｒ ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９３（ｂｒ ｍ，１Ｈ）．
実施例１２ ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護アラニンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン（１１０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５１ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５３ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護アラニン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃアラニン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した（図１１）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ１．０５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），４．１１−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．２７（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３８（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｂｒ ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９８（ｂｒ ｍ，１Ｈ）．
実施例１３ ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護バリンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリン（１２０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５１ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５０ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護バリン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃバリン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ１．００（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），２．２５（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．１１−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．３８（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６−７．７７（ｂｒ ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９８（ｂｒ ｍ，１Ｈ）．
実施例１４ カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護グリシンからの保護基の除去
Ｆｍｏｃ保護グリシンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したグリシン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（３０ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．５ｍｇ，５．７ｍｇ）。
実施例１５ カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護アラニンからの保護基の除去
Ｆｍｏｃ保護アラニンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したアラニン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（２９ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．５ｍｇ，５．７ｍｇ）。
実施例１６ カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護バリンからの保護基の除去
Ｆｍｏｃ保護バリンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したバリン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（２９ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．３ｍｇ，４．９ｍｇ）。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。 Example 1 Synthesis of Hydrophilic Aminated NHA2 A mixture of carbon nanohorn aggregates (NHA) (200 mg) and sodium amide (200 mg) in liquid ammonia (320 mL) was refluxed in a flask equipped with a dry ice condenser for 3 hours. (−33 ° C.). Removal of ammonia gave a black solid. The crude material was further washed with saturated aqueous NH 4 Cl (100 mL), filtered, and dried at 25 ° C. and 0.2 mm Hg for 12 hours to give aminated NHA 2 (205 mg) as a black solid (FIG. 1). Since NHA is highly absorbent, it was difficult to calculate the exact weight of aminated NHA2. The reaction could be easily scaled up to an amount of 1.00 g NHA, yielding 1.03 g aminated NHA2.
IR spectra of untreated NHA and aminated NHA2 were obtained with an ASI Applied Systems REACT IR1000 equipped with an attenuated total reflection (ATR) device (FIG. 2). The IR spectrum has a broad absorption at 3220 cm −1 , indicating the presence of amino groups on NHA.
Further, the structure of aminated NHA2 was analyzed using a transmission electron microscope (TEM; JEM2100F, JEOL) (FIG. 3A). Analysis by TEM showed that the conical structure of carbon nanohorn as well as its aggregated structure existed before and after the reaction.
Example 2 Preparation and Analysis of Aminated NHA2 Dispersion Gray Aminated NHA2 (1.00 mg) sonicated in water (5.00 mL) for 2 minutes (3.8 kHz; US-3, As One Co.) A clear solution was obtained (in FIG. 3B). There were no visible particles in the solution, and no substance adhered to the membrane (pore size 0.2 μm, Advanced) even after filtration. The concentration of aminated NHA2 can be further increased to 1.0 mg / mL or more, but the color of the solution becomes too dark to determine the presence of visible particles (left in FIG. 3B). All the crude material obtained from the reaction was dissolved in water. This indicates that NHA was quantitatively converted to a hydrophilic form by the reaction.
The size of the particles in the solution was analyzed by dynamic light scattering (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern) (FIG. 3C). DLS studies have shown that an aqueous solution of aminated NHA2 contains particles with an average size of 134 ± 5 nm. The size range was 70 nm to 500 nm, which was consistent with the previous TEM results.
The solution was deposited on mica and the particles were further analyzed by AFM (JSPM-4200, JEOL) (FIG. 3D). Analysis by AFM showed that the particles had a spherical shape, and observation of well-isolated particles confirmed that NHA was present as a single particle in solution. Solid particle height analysis by AFM showed a smaller average size of 95 nm (FIG. 4). This is considered to be because the hydration layer is removed under the conditions of AFM.
Example 3 Quantification of amino groups on aminated NHA by Sanger's method The amount of amino groups in aminated NHA2 was verified and quantified using Sanger's method (Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis Vol. 4, pp 2556-). 2557, Paquette, LA Eds. Wiley, 1995, Chichester). That is, the amino group of aminated NHA2 was converted to a dinitrophenylamino group with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, and the amount was quantified by a UV-vis difference spectrum.
Aminated NHA2 (5.00 mg) was added to 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (1...) In a basic aqueous solution of NaHCO 3 (0.10 M, 100 μL) and ethanol (50 μL) at 60 ° C. for 20 minutes. 00 mg). The reaction mixture was filtered to give a black solid. The black solid was further washed with water (1.0 mL) and ethanol (1.0 mL) and dried under reduced pressure to obtain dinitrophenylaminated NHA3 (5.28 mg) (FIG. 1).
The absorption spectrum of the aqueous solution of dinitrophenyl aminated NHA3 (1.00 mg) had a peak corresponding to a dinitrophenyl group at 355 nm (FIG. 5B). None of the starting materials had an absorption at 355 nm, thus demonstrating that an amino group was introduced into NHA by reaction with sodium amide. Moreover, the amount of amino groups was calculated to be about 0.22 μmol / mg from the reported value of the molar absorption coefficient of dinitrophenylamino groups (16000 to 18000 M −1 · cm −1 ). Since the surface area of NHA has been calculated to be 308 m 2 / g in advance (Murata, K .; Kaneko, K .; Kokai, F .; Takahashi, K .; Yudasaka, M .; Iijima, S. Chem. Phys Lett. 2000, 331, 14-20), which indicates that there is one amino group in an area of 300 nm 2 .
Example 4 One of the most difficult problems to standardize the fractionated carbon particles of aminated NHA2 by column chromatography is to obtain particles of uniform size. As a result of studying gel permeation chromatography for separation, the present inventors have found that a gel based on polyacrylamide (Sephacryl 500HR) is suitable as a medium. Therefore, an aqueous solution of aminated NHA2 was eluted with a Sephacryl 500HR column.
An aqueous solution of aminated NHA2 (0.20 mg / mL, 0.50 mL) was passed through a Sephacryl 500HR column (resin volume: 17 mL, column diameter: 1 cm, column height: 22 cm), and water was added at a flow rate of 0.5 mL / min. Eluted with. A chromatogram was obtained using a UV detector (detection at 260 nm, UV-2075, JASCO) (FIG. 6A) and the eluent was collected as a 0.25 mL fraction. The particle size of each fraction was analyzed by DLS (FIG. 6B). The UV absorption of the fraction at 260 nm showed that 92% of the flowed particles eluted from the column.
Also, as shown in the typical data in FIG. 6B, the particles were fractionated by size. The average particle size in fractions 22, 23, 24 and 27 were 198 ± 17, 148 ± 1, 134 ± 6 and 127 ± 7 nm, respectively.
When gels with different pore sizes (Sephacryl 100HR or 1000SF) were used, the amount of eluted particles was reduced to 0% and 1% (FIG. 7).
Example 5 Synthesis of fluorescently labeled aminated NHA4 To an aqueous solution of aminated NHA2 (0.40 mg / mL, 20 mL) was added 2- (2,7-difluoro-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthene-9. -Il) -N- [5- (2,5-dioxopyrrolidin-1-yloxycarbonyl) -pentyl] -terephthalamic acid (2.8 mg, Oregon Green 488-X, Invitrogen) in methanol (20 ml) Was added and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction mixture was filtered to give a black solid. The black solid was further washed with water (20 mL) and methanol (20 mL) and dried under reduced pressure to obtain fluorescently labeled aminated NHA4 (8.23 mg) (FIG. 1). Aminated NHA4 was analyzed by UV-vis difference spectrum (FIG. 5C). From the absorption coefficient of the chromophore (84000 M −1 · cm −1 ), the amount of Oregon Green 488 was calculated to be 0.017 μmol / mg.
When the aminated NHA2 was treated with the methyl ester of Oregon Green 488 under the same reaction conditions, the resulting NHA showed no absorption and excitation of the fluorescent dye (FIG. 8). From this result, it was confirmed that the fluorescence of the aminated NHA4 was not caused by the physically adsorbed dye but by the covalently bonded dye.
Example 6 Cytotoxicity test Approximately 2 × 10 4 cells were cultured at 37 ° C. in a medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin and streptomycin (Dulbeco's modified Eagle's medium) using a 96-well plate. The culture was performed under humidified conditions for 24 hours. The medium was replaced with a new medium containing aminated NHA2 at a rate of 0.05 mg / mL, and cultured for 48 hours. Toxicity was calculated by lysing the cells, centrifuging, adding a protease inhibitor and Coomassie Brilliant Blue G-250, quantifying the protein from the absorption at 595 nm (Bradford method) and comparing it with a control experiment.
When an experiment similar to the above was performed with quartz particles and titanium dioxide particles, aminated NHA2 showed about one-tenth the toxicity of quartz particles, but compared with titanium dioxide particles that are generally non-toxic. Toxicity was shown (Figure 9). By this example, the toxicity of nanotube particles whose structural characteristics were completely clarified was compared with existing particles. This example shows that the hydrophilized carbon cluster prepared in the present invention can be used as a standard for nanotube particles.
Example 7 Large-scale synthesis of aminated carbon nanohorn aggregates Carbon nanohorn aggregates (1.50 g) were dispersed in liquid ammonia (2.4 L), and then sodium amide (3.00 g) was added. The reaction mixture was stirred at reflux at −33 ° C. in a flask equipped with a dry ice condenser. After stirring for 6 hours, the ammonia was distilled off over 1 hour by gently heating in a 30 ° C. hot water bath to obtain a black solid. The crude product was dispersed in a saturated aqueous ammonium chloride solution (300 mL), and filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then the target product remaining on the filter paper was washed with ultrapure water (300 mL). It was made to dry at room temperature under reduced pressure (0.2mmHg) for 12 hours, and the amino nanohorn aggregate was obtained as a black solid (1.52g).
Example 8 Introduction of benzyl alcohol linkage (linker) moiety into amino nanohorn aggregates
(Black circle indicates carbon nanohorn)
4-Fluoro-3-nitrobenzyl alcohol (1.00 g, 5.84 mmol), 3,4-dihydro-2H-pyran (0.690 mL, 7.60 mmol), aluminum chloride hexahydrate (14.1 mg, 58 4 μmol) was stirred at 60 ° C., and returned to room temperature after 4 hours. The reaction mixture was purified directly by silica gel chromatography (eluent: methylene chloride). Drying at room temperature under reduced pressure (0.2 mmHg) for 12 hours gave a pale yellow liquid of 2- (4-fluoro-3-nitrobenzyloxy) tetrahydropyran (1.45 g, 97%): IR (neat) 3070 (W), 2944 (m), 2871 (m), 1622 (m), 1593 (m), 1538 (s), 1349 (s), 1254 (m), 1201 (m), 1123 (s), 1079 (M), 1036 (m), 975 (m), 906 (m), 833 (m), 818 (m); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.56-1.68 (m, 4H), 1 .75-1.80 (m, 2H), 1.85-1.89 (m, 1H), 3.36-3.58 (m, 1H), 3.85-3.89 (m, 1H) , 4.52-4.54 (d, J = 13 Hz, 1H) 4.71-4.73 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 4.79-4.82 (d, J = 13 Hz, 1H), 7.60-7.63 (m, 1H), 8 .1 (dd, J = 2, 4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 19.2 (CH 2 ), 25.3 (CH 2 ), 30.4 (CH 2 ), 62.3 ( CH 2), 67.0 (CH 2 ), 98.3 (CH), 118.2 (CH), 124.8 (C), 134.3 (CH), 135.7 (CH), 153.7 (C-Cl), 155.8 ( C-NO 2); Anal Calcd for C 12 H 14 NO 4 F: C, 25.07; H, 5.53; N, 5.49. Found: C, 56.27; H, 5.68; N, 5.31.
2- (4-Fluoro-3-nitrobenzyloxy) tetrahydropyran (13 mg, 5.5 mmol), potassium carbonate (750 mg, 5.5 mmol), amino nanohorn aggregate (504 mg; amount of amino group: 0.11 mmol) Mix in DMF (25 mL) and stir at 60 ° C. for 20 hours. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with water (10 mL × 3), methanol (10 mL × 3), and toluene (10 mL × 3). The product was further dried under reduced pressure (0.2 mmHg · 10 hours · room temperature) to obtain the desired product as a black solid (510 mg).
Example 9 Protection of residual amino group after introduction of benzyl alcohol linkage (linker) moiety
Carbon nanohorn (450 mg; amount of amino group: 12 μmol) after introduction of the linker synthesized in Example 8 and dimethylaminopyridine (2.0 mg, 17 μmol) were mixed in DMF (23 mL), and acetic anhydride (57 μL, 0.61 mmol), diisopropylamine (27 μL, 0.15 mmol), and HOBt (1-hydroxybenzotriazole, 2.5 mg, 18 μmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), then saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (10 mL × 3), DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), methanol (10 mL × 3) Washed with. Further drying was performed under reduced pressure (0.2 mmHg · 13 hours · room temperature) to obtain a carbon nanohorn having a residual amino group acetylated as a black solid (451 mg).
Example 10 Removal of THP protecting group in benzyl alcohol linking (linker) part
Carbon nanohorn with a linker synthesized in Example 9 (410 mg, amount of THP: 76 μmol) and p-toluenesulfonic acid monohydrate (10 mg, 58 μmol) were mixed in methanol (15 mL), and heated and stirred at 40 ° C. for 4 hours. did. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). The solvent was distilled off under reduced pressure (0.2 mmHg · 12 hours · room temperature) to obtain carbon nanohorn having a benzyl alcohol moiety as a target product as a black solid (410 mg).
Example 11 Introduction of Fmoc-protected glycine into benzyl alcohol moiety (synthesis of N-Fmoc-Gly-HMP-AN)
In this reaction, DMF distilled in the presence of ninhydrin was used to completely remove the amine remaining in the solvent. N-Fmoc glycine (110 mg, 0.36 mol) was dissolved in a mixed solvent of methylene chloride (3.0 mL) and DMF (0.5 mL), and DIC (N, N′-diisopropylcarbodiimide, 28 μL, 0.18 mmol) was dissolved. It added at 0 degreeC and stirred for 20 minutes at the same temperature. DMF (2.5 mL) was added to the white solid obtained after distilling off the solvent under reduced pressure and dissolved again. This solution was mixed with carbon nanohorn having a benzyl alcohol part (52 mg, amount of hydroxyl group: 95 μmol), Stir at room temperature for 3 hours. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). Further drying was performed under reduced pressure (0.2 mmHg · 12 hours · room temperature) to obtain carbon nanohorn bound to Fmoc-protected glycine as a black solid (50 mg). 1.0 mg of the synthesized Fmoc-protected glycine / carbon nanohorn complex was dispersed in deuterated DMF (0.5 mL), and the signals of the Fmoc glycine part and the benzyl alcohol linker part were detected and identified by measuring 1 H NMR ( FIG. 10).
1 H NMR (400 MHz, DMF-d 7 ) δ 3.69 (s, 1H), 3.89 (m, 2H), 3.94 (m, 1H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.30-7.38 (brm, 2H), 7.42-7.45 (brm, 2H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.70- 7.75 (brm, 1H), 7.78-7.93 (brm, 1H).
Example 12 Introduction of Fmoc-protected alanine into benzyl alcohol moiety (synthesis of N-Fmoc-Ala-HMP-AN)
In this reaction, DMF distilled in the presence of ninhydrin was used to completely remove the amine remaining in the solvent. N-Fmoc-L-alanine (110 mg, 0.36 mmol) was dissolved in a mixed solvent of methylene chloride (3.0 mL) and DMF (0.5 mL), and DIC (N, N′-diisopropylcarbodiimide, 28 μL,. 18 mmol) was added at 0 ° C. and stirred at the same temperature for 20 minutes. DMF (2.5 mL) was added to the white solid obtained after distilling off the solvent under reduced pressure and dissolved again. This solution was mixed with carbon nanohorn having a benzyl alcohol part (51 mg, amount of hydroxyl group: 95 μmol), Stir at room temperature for 3 hours. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). Further drying was performed under reduced pressure (0.2 mmHg · 12 hours · room temperature) to obtain carbon nanohorn bound to Fmoc-protected glycine as a black solid (53 mg). 1.0 mg of the synthesized Fmoc-protected alanine / carbon nanohorn complex was dispersed in deuterated DMF (0.5 mL), and 1 H NMR was measured to detect and identify signals of the Fmoc alanine part and the benzyl alcohol linker part ( FIG. 11).
1 H NMR (400 MHz, DMF-d 7 ) δ 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 3.68 (s, 1H), 4.11-4.12 (m, 2H), 4. 27 (m, 1H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34-7.38 (brm, 2H), 7.42-7.45 (brm, 2H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.76 (brm, 1H), 7.78-7.98 (brm, 1H).
Example 13 Introduction of Fmoc-protected valine into benzyl alcohol moiety (synthesis of N-Fmoc-Val-HMP-AN)
In this reaction, DMF distilled in the presence of ninhydrin was used to completely remove the amine remaining in the solvent. N-Fmoc-L-valine (120 mg, 0.36 mmol) was dissolved in a mixed solvent of methylene chloride (3.0 mL) and DMF (0.5 mL), and DIC (N, N′-diisopropylcarbodiimide, 28 μL,. 18 mmol) was added at 0 ° C. and stirred at the same temperature for 20 minutes. DMF (2.5 mL) was added to the white solid obtained after distilling off the solvent under reduced pressure and dissolved again. This solution was mixed with carbon nanohorn having a benzyl alcohol part (51 mg, amount of hydroxyl group: 95 μmol), Stir at room temperature for 3 hours. The reaction mixture was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). Further drying was performed under reduced pressure (0.2 mmHg · 12 hours · room temperature) to obtain carbon nanohorn bound to Fmoc-protected glycine as a black solid (50 mg). 1.0 mg of the synthesized Fmoc-protected valine / carbon nanohorn complex was dispersed in deuterated DMF (0.5 mL), and 1 H NMR was measured to detect and identify signals of the Fmoc valine part and the benzyl alcohol linker part.
1 H NMR (400 MHz, DMF-d 7 ) δ 1.00 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 2.25 (br m, 1H), 4.11-4.12 (m, 2H), 4 .29 (m, 1H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.30-7.38 (br m, 2H), 7.42-7.45 (br m, 2H) 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.76-7.77 (brm, 1H), 7.78-7.98 (brm, 1H).
Example 14 Removal of protecting group from Fmoc protected glycine on carbon nanohorn
Carbon nanohorn (30 mg) linked with Fmoc-protected glycine was dispersed in 50% piperidine / DMF (1.5 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). Further drying was performed under reduced pressure (0.2 mmHg · room temperature · 12 hours) to obtain a glycine / carbon nanohorn complex from which the Fmoc protecting group was removed as a black solid (30 mg). The N- (9-fluorenylmethyl) piperidine obtained in the filtrate was concentrated and then purified by silica gel column chromatography (eluent: 1: 1 ethyl acetate / chloroform) to obtain a white solid (1. 5 mg, 5.7 mg).
Example 15 Removal of protecting group from Fmoc protected alanine on carbon nanohorn
Carbon nanohorn (30 mg) linked with Fmoc-protected alanine was dispersed in 50% piperidine / DMF (1.5 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). It further dried under reduced pressure (0.2 mmHg * room temperature * 12 hours), and obtained the alanine carbon nanohorn complex which removed the Fmoc protecting group as a black solid (29 mg). The N- (9-fluorenylmethyl) piperidine obtained in the filtrate was concentrated and then purified by silica gel column chromatography (eluent: 1: 1 ethyl acetate / chloroform) to obtain a white solid (1. 5 mg, 5.7 mg).
Example 16 Removal of protecting groups from Fmoc protected valine on carbon nanohorns
Carbon nanohorn (30 mg) linked with Fmoc-protected valine was dispersed in 50% piperidine / DMF (1.5 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was filtered through a hydrophilic membrane filter (pore size 0.2 μm), and then washed with DMF (10 mL × 3), methylene chloride (10 mL × 3), and methanol (10 mL × 3). It was further dried under reduced pressure (0.2 mmHg · room temperature · 12 hours) to obtain a valine / carbon nanohorn complex from which the Fmoc protecting group had been removed as a black solid (29 mg). The N- (9-fluorenylmethyl) piperidine obtained in the filtrate was concentrated and then purified by silica gel column chromatography (eluent: 1: 1 ethyl acetate / chloroform) to obtain a white solid (1. 3 mg, 4.9 mg).
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Claims (3)

チューブ状炭素クラスターに金属アミドを反応させることを含む、チューブ状炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する親水性チューブ状炭素クラスターの製造方法。 A method for producing a hydrophilic tubular carbon cluster having a structure in which a substituted or unsubstituted amino group is bonded to a carbon atom of a tubular carbon cluster, which comprises reacting the tubular carbon cluster with a metal amide. 金属アミドがアルカリ金属アミドである、請求の範囲第１項記載の方法。The method of claim 1 wherein the metal amide is an alkali metal amide. チューブ状炭素クラスターの炭素原子に結合したアミノ基を化学修飾することをさらに含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 The method according to claim 1 or 2 , further comprising chemically modifying an amino group bonded to a carbon atom of the tubular carbon cluster.
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