JP5112869B2 - Method for producing cytidine diphosphate choline - Google Patents
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Description
本発明は、医薬品として有用なシチジンジリン酸コリンの製造法に関する。 The present invention relates to a method for producing cytidine diphosphate choline useful as a pharmaceutical product.
シチジンジリン酸コリン（以下、CDP-コリンと略す）の製造法としては、化学的合成法、微生物菌体を用いてシチジン-5’-三リン酸（以下、CTPと略す）、シチジン-5’-二リン酸（以下、CDPと略す）またはシチジン-5’-一リン酸（以下、CMPと略す）から製造する方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３）等が知られているが、いずれも収率が低い、原料が高価である、などの問題がある。 Cytidine diphosphate choline (hereinafter abbreviated as CDP-choline) can be produced by chemical synthesis, cytidine-5'-triphosphate (hereinafter abbreviated as CTP), cytidine-5'- A method of producing from diphosphoric acid (hereinafter abbreviated as CDP) or cytidine-5′-monophosphoric acid (hereinafter abbreviated as CMP) (Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3) is known. , All have problems such as low yield and expensive raw materials.
微生物を用いて生産する方法においては、生産性を向上させるために遺伝子組換え微生物を利用して、ウリジン-5’-一リン酸（以下、UMPと略す）とコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法（特許文献４）、CMPとコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法（特許文献５）、オロット酸とコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法（特許文献６）、ウラシルとコリンまたはホスホリルコリンとから製造する方法（特許文献７）が報告されている。しかしながら、オロット酸やウラシルから製造する方法では、オロット酸やウラシルは水への溶解度が低いため、これら原料をCDP-コリンの生成蓄積を行う媒体へ添加する際には粉末のまま投入する必要があり、多大の手間を要する。オロット酸やウラシルのアルカリ性溶液中における溶解度が高いことは知られているが、オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液を該媒体に添加することによりCDP-コリンを効率よく製造できることは知られていない。
本発明の目的は、CDP-コリンの効率のよい製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an efficient process for producing CDP-choline.
本発明は、以下の（1）〜（7）に関する。
（1）オロット酸またはウラシルと、コリンまたはホスホリルコリンとからCDP-コリンを生成する活性を有する生体触媒を、媒体中でオロット酸またはウラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンに接触させ、媒体中にCDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体からCDP-コリンを採取するCDP-コリンの製造法において、オロット酸またはウラシルを、オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液として該媒体に添加することを特徴とするCDP-コリンの製造法。
（2）媒体のpHをCDP-コリンの製造に適したpHに維持するようにオロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液を添加することを特徴とする、上記（1）のCDP-コリンの製造法。
（3）生体触媒が微生物の培養物または該培養物の処理物を含有する生体触媒である、上記（1）または（2）のCDP-コリンの製造法。
（4）微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、バチルス（Bacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ヘモフィラス（Haemophilus）属およびサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（3）のCDP-コリンの製造法。
（5）微生物がコリネバクテリウム（Corynebacterium）属およびエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物から選ばれる微生物である、上記（3）のCDP-コリンの製造法。
（6）微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）およびエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属する微生物である、上記（3）のCDP-コリンの製造法。
（7）微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株およびエシェリヒア・コリMM294/pCKG55(FERM BP-3717)株である、上記（3）のCDP-コリンの製造法。The present invention relates to the following (1) to (7).
(1) A biocatalyst having an activity of producing CDP-choline from orotic acid or uracil and choline or phosphorylcholine is contacted with orotic acid or uracil and choline or phosphorylcholine in a medium, and CDP-choline is brought into the medium. CDP-choline characterized by adding orotic acid or uracil to the medium as an alkaline solution containing orotic acid or uracil in a method for producing CDP-choline in which CDP-choline is collected and collected and collected from the medium Manufacturing method.
(2) The method for producing CDP-choline according to (1) above, wherein an alkaline solution containing orotic acid or uracil is added so as to maintain the pH of the medium at a pH suitable for production of CDP-choline. .
(3) The method for producing CDP-choline according to (1) or (2) above, wherein the biocatalyst is a biocatalyst containing a microbial culture or a treated product of the culture.
(4) the microorganism is Escherichia (Escherichia) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Bacillus (Bacillus) genus Streptococcus (Streptococcus) genus Sinorhizobium (Sinorhizobium) genus, Haemophilus (Haemophilus) belonging to the genus and Saccharomyces (Saccharomyces) belonging to the genus The method for producing CDP-choline of (3) above, which is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms.
(5) the microorganism is a microorganism selected from the microorganisms belonging to Corynebacterium (Corynebacterium) genus and E. (Escherichia) genus, the preparation of CDP- choline in (3).
(6) the microorganism is a microorganism belonging to Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) and Escherichia coli (Escherichia coli), preparation of CDP- choline in (3).
(7) The method for producing CDP-choline according to (3) above, wherein the microorganism is Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21170 strain and Escherichia coli MM294 / pCKG55 (FERM BP-3717) strain.
本発明により、CDP-コリンを工業的に有利に製造する方法が提供される。 The present invention provides a method for producing CDP-choline in an industrially advantageous manner.
本発明に用いられるオロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液としては、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化リチウム溶液、水酸化カルシウム溶液、水酸化バリウム溶液またはアンモニア水をあげることができる。該アルカリ性溶液の規定度は0.01〜15規定が好ましく、0.1〜12規定がさらに好ましい。アルカリ性溶液中のオロット酸またはウラシルの濃度は1mmol/L〜2mol/Lが好ましく、10mmol/L〜1.6mol/Lがより好ましい。 Examples of the alkaline solution containing orotic acid or uracil used in the present invention include sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution, lithium hydroxide solution, calcium hydroxide solution, barium hydroxide solution or aqueous ammonia. The normality of the alkaline solution is preferably from 0.01 to 15 normal, more preferably from 0.1 to 12 normal. The concentration of orotic acid or uracil in the alkaline solution is preferably 1 mmol / L to 2 mol / L, more preferably 10 mmol / L to 1.6 mol / L.
オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液を、オロット酸またはウラシルとコリンまたはホスホリルコリンとからCDP-コリンを生成する活性（以下、CDP-コリン生成活性と略す）を有する生体触媒とコリンまたはホスホリルコリンとを含有する媒体に添加し、該媒体中で該生体触媒、オロット酸またはウラシル、およびコリンまたはホスホリルコリンを接触させることによって媒体中にCDP-コリンを生成蓄積させ、該媒体からCDP-コリンを採取することによって、CDP-コリンを製造することができる。 Contains an alkaline solution containing orotic acid or uracil and a biocatalyst having an activity to produce CDP-choline from orotic acid or uracil and choline or phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as CDP-choline producing activity) and choline or phosphorylcholine By adding the biocatalyst, orotic acid or uracil, and choline or phosphorylcholine in the medium to produce and accumulate CDP-choline in the medium, and collecting CDP-choline from the medium CDP-choline can be produced.
該生体触媒とコリンまたはホスホリルコリンを含有する媒体には、必要に応じてオロット酸またはウラシルや他の成分が添加されていてもよい。オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液を該媒体に添加する場合、該媒体のpHがCDP-コリンの製造に適したpHに維持されるように添加することが好ましい。該pHとしては、5〜10、好ましくは6〜8をあげることができる。該アルカリ性溶液は連続的または断続的に該媒体に添加することができる。 Orotic acid or uracil or other components may be added to the medium containing the biocatalyst and choline or phosphorylcholine as necessary. When an alkaline solution containing orotic acid or uracil is added to the medium, it is preferably added so that the pH of the medium is maintained at a pH suitable for the production of CDP-choline. The pH can be 5 to 10, preferably 6 to 8. The alkaline solution can be added to the medium continuously or intermittently.
本発明に用いられる生体触媒としては、CDP-コリン生成活性を有する生体触媒であれば、いずれでも用いることができる。
このような生体触媒としては、CDP-コリン生成活性を有する微生物の培養物、該培養物の処理物等をあげることができる。
微生物としては、元来CDP-コリン生成活性を有する微生物、および元来CDP-コリン生成活性はないが、CDP-コリンを生成する反応を担う酵素（以下、CDP-コリン生成酵素と略す）をコードするDNAで形質転換された微生物、または該活性を有する他の微生物の細胞を融合させて得られる微生物などをあげることができる。As the biocatalyst used in the present invention, any biocatalyst having CDP-choline producing activity can be used.
Examples of such a biocatalyst include a culture of a microorganism having CDP-choline producing activity, a treated product of the culture, and the like.
As a microorganism, it encodes a microorganism that originally has CDP-choline-producing activity and an enzyme that originally has no CDP-choline-producing activity but is responsible for the reaction that produces CDP-choline (hereinafter abbreviated as CDP-choline-producing enzyme). And microorganisms obtained by fusing cells of other microorganisms having the activity, or the like.
上記微生物としては、エシェリヒア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ヘモフィラス（Haemophilus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クラビバクター（Clavibacter）属、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属、ピメロバクター（Pimerobacter）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイセス（Schwanniomyces）属、ピヒア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属に属する微生物等をあげることができる。Examples of the above-mentioned microorganisms, Escherichia (Escherichia) genus Serratia (Serratia) genus Bacillus (Bacillus) genus Brevibacterium (Brevibacterium) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus, micro Agrobacterium (Microbacterium) genus Pseudomonas (Pseudomonas ) genus Streptococcus (Streptococcus) genus Sinorhizobium (Sinorhizobium) genus, Haemophilus (Haemophilus) genus Arthrobacter (Arthrobacter) genus, O Leo Agrobacterium (Aureobacterium) genus Cellulomonas (Cellulomonas) genus, Krabi Enterobacter (Clavibacter) genus , Kurt Agrobacterium (Curtobacterium) genus, Pimelobacter (Pimerobacter) genus Saccharomyces (Saccharomyces) sp., Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) genus, Cru Ibero-Mai Seth (Kluyveromyces) genus Trichosporon (Trichosporon) genus, Shiwanioma Seth (Schwanniomyces) the genus Pichia (Pichia) sp., Or Candida (Candida) microorganisms belonging to the genus.
エシェリヒア(Escherichia)属に属する微生物としては、Escherichia coli MM294、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichiac oli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli GI698およびEscherichia coli TB1等をあげることができる。セラチア(Serratia)属に属する微生物としては、例えば、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciensおよびSerratia marcescens等をあげることができる。バチルス(Bacillus)属に属する微生物としては、Bacillus subtilisおよびBacillus amyloliquefaciens等をあげることができる。ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物としては、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium saccharolyticum、Brevibacterium flavumおよびBrevibacterium lactofermentum等をあげることができる。コリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物としては、Corynebacterium glutamicum ATCC13032およびCorynebacterium glutamicum ATCC13869等のCorynebacterium glutamicum、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872およびCorynebacterium ammoniagenes ATCC21170等のCorynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870等のCorynebacterium acetoacidophilum等をあげることができる。ミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属する微生物としては、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等のMicrobacterium ammoniaphilum、Microbacterium lactiumおよびMicrobacterium imperiale等をあげることができる。シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物としては、Pseudomonas putida等をあげることができる。ストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する微生物としては、Streptococcus pneumoniae等をあげることができる。シノリゾビウム（Sinorhizobium）属に属する微生物としては、Sinorhizobium meliloti等をあげることができる。ヘモフィラス（Haemophilus）属に属する微生物としては、Haemophilus influenzae等をあげることができる。アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物としては、Arthrobacter citreusおよびArthrobacter globiformis等をあげることができる。オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属に属する微生物としては、Aureobacterium flavescens、Aureobacterium saperdaeおよびAureobacterium testaceum等をあげることができる。セルロモナス（Cellulomonas）属に属する微生物としては、Cellulomonas flavigenaおよびCellulomonas carta等をあげることができる。クラビバクター（Clavibacter）属に属する微生物としては、Clavibacter michiganensisおよびClavibacter rathayi等をあげることができる。クルトバクテリウム（Curtobacterium）属に属する微生物としては、Curtobacterium albidum、Curtobacterium citreumおよびCurtobacterium luteum等をあげることができる。ピメロバクター（Pimerobacter）属に属する微生物としては、Pimerobacter simplex等をあげることができる。Examples of the microorganisms belonging to Escherichia (Escherichia) species, Escherichia coli MM294, Escherichia coli XL1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101 , Escherichia coli No.49, it is possible to increase the Escherichiac oli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698 and Escherichia coli TB1 and the like. Examples of the microorganisms belonging to Serratia (Serratia) genus, for example, can be exemplified Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefacien s and Serratia marcescens, and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens . The Brevibacterium (Brevibacterium) microorganism belonging to the genus Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium saccharolyticum, the Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum and the like. The Corynebacterium (Corynebacterium) microorganism belonging to the genus, mention may be made of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and Corynebacterium glutamicum ATCC13869 such as Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872 and Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 or the like of the Corynebacterium ammoniagenes, the Corynebacterium acetoacidophilum such as Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 . Examples of the microorganisms belonging to the micro Agrobacterium (Microbacterium) the genus Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, etc. Microbacterium Ammoniaphilum, etc. Microbacterium Lactium and Microbacterium imperiale. Examples of microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida . Examples of microorganisms belonging to the genus Streptococcus include Streptococcus pneumoniae . Examples of the microorganism belonging to the genus Sinorhizobium include Sinorhizobium meliloti . Examples of microorganisms belonging to the genus Haemophilus include Haemophilus influenzae . The Arthrobacter (Arthrobacter) microorganism belonging to the genus or the like Arthrobacter citreus and Arthrobacter globiformis. Examples of microorganisms belonging to the genus Aureobacterium include Aureobacterium flavescens , Aureobacterium saperdae, Aureobacterium testaceum and the like. The Cellulomonas (Cellulomonas) microorganism belonging to the genus etc. Cellulomonas Flavigena and Cellulomonas carta. Examples of microorganisms belonging to the genus Clavibacter include Clavibacter michiganensis and Clavibacter rathayi . Examples of microorganisms belonging to the genus Kurtobacterium include Curtobacterium albidum , Curtobacterium citreum, and Curtobacterium luteum . Examples of microorganisms belonging to the genus Pimerobacter include Pimerobacter simplex .
サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する微生物としては、Saccharomyces cerevisiae等をあげることができる。シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属に属する微生物としては、Schizosaccharomyces pombe等をあげることができる。クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属に属する微生物としては、Kluyveromyces lactis等をあげることができる。トリコスポロン（Trichosporon）属に属する微生物としては、Trichosporon pullulans等をあげることができる。シワニオマイセス（Schwanniomyces）属に属する微生物としては、Schwanniomyces alluvius等をあげることができる。キャンディダ（Candida）属に属する微生物としては、Candida utilis等をあげることができる。 Saccharomyces cerevisiae etc. can be mention | raise | lifted as microorganisms which belong to Saccharomyces ( Saccharomyces ) genus. Examples of microorganisms belonging to the genus Schizosaccharomyces include Schizosaccharomyces pombe . Examples of microorganisms belonging to the genus Kluyveromyces include Kluyveromyces lactis . Examples of microorganisms belonging to the genus Trichosporon include Trichosporon pullulans . The Shiwaniomaisesu (Schwanniomyces) microorganism belonging to the genus, it is possible to increase the Schwanniomyces alluvius like. Examples of microorganisms belonging to the genus Candida include Candida utilis .
微生物としては、上記の微生物をあげることができるが、エシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、バチルス（Bacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ヘモフィラス（Haemophilus）属およびサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物が好ましく用いられ、エシェリヒア(Escherichia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属およびコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物がさらに好ましく用いられる。Examples of the microorganisms, but it is possible to raise the above-mentioned microorganisms, Escherichia (Escherichia) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Bacillus (Bacillus) genus Streptococcus (Streptococcus) genus Sinorhizobium (Sinorhizobium) genus, Haemophilus (Haemophilus) genus and Saccharomyces (Saccharomyces) a microorganism of the genus selected from the group consisting of microorganisms belonging to are preferably used, Escherichia (Escherichia) genus from the group consisting of Brevibacterium (Brevibacterium) genus and Corynebacterium (Corynebacterium) microorganism belonging to the genus The selected microorganism is more preferably used.
上記微生物のうち、元来CDP-コリン生成活性を有する微生物であってもCDP-コリン生成活性が充分に強くない場合には、該微生物に、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAを有する組換え体DNAを常法によって導入するか、該活性を有する他の微生物の細胞を融合させることにより、該活性の強化された微生物を作製して用いてもよい。
該活性が強化された微生物および該活性が付与された微生物としては、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAを以下に示す方法によって微生物に導入して得られる形質転換体が好ましく用いられる。Among the above microorganisms, if the CDP-choline producing activity is not sufficiently strong even if the microorganism originally has CDP-choline producing activity, the microorganism has a recombinant having a DNA encoding CDP-choline producing enzyme. Microorganisms with enhanced activity may be prepared and used by introducing body DNA by a conventional method or by fusing cells of other microorganisms having the activity.
As the microorganism having enhanced activity and the microorganism imparted with the activity, a transformant obtained by introducing DNA encoding CDP-choline synthase into the microorganism by the method described below is preferably used.
CDP-コリン生成酵素をコードするDNAとしては、例えば、オロット酸からオロチジン-5’-一リン酸（以下、OMPと略す）を生成する活性を有するオロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ[EC 2.4.2.10]、OMPからUMPを生成する活性を有するオロチジン-5’-モノリン酸デカルボキシラーゼ[EC4.1.1.23]、ウラシルからウリジンを生成する活性を有するウリジンホスホリラーゼ[EC 2.4.2.3]、ウリジンからUMPを生成する活性を有するウリジンキナーゼ[EC 2.7.1.48]、UMPからウリジン-5’-二リン酸（以下、UDPと略す）を生成する活性を有するウリジル酸・シチジル酸キナーゼ[EC2.7.1.48]、UDPからウリジン-5’-三リン酸（以下、UTPと略す）を生成する活性を有するヌクレオシド二リン酸キナーゼ[EC 2.7.4.6]、UTPからCTPを生成する活性を有するシチジン-5’-三リン酸シンセターゼ[EC 6.3.4.2]（以下、PyrGと略す）をコードするDNA、コリンからホスホリルコリンを生成する活性を有するコリンキナーゼ[EC 2.7.1.32]（以下、CKIと略す）をコードするDNAおよびCTPとホスホリルコリンからCDP-コリンを生成する活性を有するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ[EC 2.7.7.15]（以下、CCTと略す）をコードするDNA等をあげることができる。 Examples of DNA encoding CDP-choline synthase include, for example, orotic acid phosphoribosyltransferase [EC 2.4.2.10] having an activity of generating orotidine-5′-monophosphate (hereinafter abbreviated as OMP) from orotic acid, Orotidine-5'-monophosphate decarboxylase [EC4.1.1.23], which has the activity to generate UMP from OMP, uridine phosphorylase [EC 2.4.2.3], which has the activity to generate uridine from uracil, and UMP from uridine Uridine kinase with activity [EC 2.7.1.48], uridylate / cytidylate kinase with activity to generate uridine-5'-diphosphate (hereinafter abbreviated as UDP) from UMP [EC2.7.1.48], UDP Nucleoside diphosphate kinase [EC 2.7.4.6], which has the activity of generating uridine-5'-triphosphate (hereinafter abbreviated as UTP), and cytidine-5'-triphosphate, which has the activity of generating CTP from UTP Acid synthesizer DNA encoding [EC 6.3.4.2] (hereinafter abbreviated as PyrG), DNA encoding choline kinase [EC 2.7.1.32] (hereinafter abbreviated as CKI) having the activity of generating phosphorylcholine from choline, and CTP and phosphorylcholine And a DNA encoding choline phosphate cytidyltransferase [EC 2.7.7.15] (hereinafter abbreviated as CCT) having an activity of producing CDP-choline from the above.
CDP-コリン生成酵素をコードするDNAとしては、上記の酵素をコードするDNAがあげられ、PyrG、CKIまたはCCTをコードするDNAが好適に用いられる。
PyrGをコードするDNAは、Escherichia coliの染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている［J. Biol. Chem. , 261, 5568（1986）］。PyrGをコードするDNAを有する組換え体DNAとしては、Escherichia coliのベクターpUC8［Gene, 19, 25(1982)］のマルチクローニングサイトのSmaI-PstI部位にEscherichia coli由来のPyrGをコードするDNAを含む2426ベースペア(以下、bpと略す)のNruI-PstI断片が挿入されたプラスミドであるpMW6［Biosci.Biotechnol. Biochem., 61, 956 (1997)］などをあげることができる。Examples of DNA encoding CDP-choline synthase include DNA encoding the above enzyme, and DNA encoding PyrG, CKI or CCT is preferably used.
DNA encoding PyrG has been cloned from the chromosome of Escherichia coli and its entire base sequence has been determined [J. Biol. Chem., 261 , 5568 (1986)]. As a recombinant DNA having DNA encoding PyrG, DNA encoding PyrG derived from Escherichia coli at the Sma I- Pst I site of the multicloning site of Escherichia coli vector pUC8 [Gene, 19 , 25 (1982)] And pMW6 [Biosci. Biotechnol. Biochem., 61 , 956 (1997)], which is a plasmid into which a 2426 base pair (hereinafter abbreviated as bp) Nru I- Pst I fragment containing N is inserted.
CCTをコードするDNAは、その全塩基配列が決定されている［Eur. J. Biochem., 169, 477（1987）］。CCTをコードするDNAを有する組換え体DNAとしては、Escherichia coliのベクターpUC18［Gene, 33, 103（1985）］のマルチクローニングサイトのSmaI部位に酵母由来のCCTをコードするDNAを含む1296bpのDraI断片が挿入されたプラスミドpCC41［生化学, 60, 701 (1988)］などをあげることができる。The entire base sequence of DNA encoding CCT has been determined [Eur. J. Biochem., 169 , 477 (1987)]. As a recombinant DNA having a DNA encoding CCT, a 1296 bp DNA containing a DNA encoding CCT derived from yeast at the Sma I site of the multicloning site of Escherichia coli vector pUC18 [Gene, 33 , 103 (1985)] The plasmid pCC41 [Biochemistry, 60 , 701 (1988)] into which the Dra I fragment has been inserted can be mentioned.
CKIをコードするDNAも同様に酵母染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている［J. Biol. Chem., 264, 2053（1989）］。CKIをコードするDNAを有する組換え体DNAとしては、酵母とEscherichia coliのシャトルベクターYEpM4［Mol. Cell. Biol., 7, 29（1987）］に酵母由来のCKIをコードするDNAを含む2692bpのPstI-HindIII断片が挿入されたプラスミドpCK1D［J. Biol. Chem., 264, 2053（1989）］などをあげることができる。Similarly, DNA encoding CKI has been cloned from the yeast chromosome and its entire base sequence has been determined [J. Biol. Chem., 264 , 2053 (1989)]. As a recombinant DNA having a DNA encoding CKI, a yeast and Escherichia coli shuttle vector YEpM4 [Mol. Cell. Biol., 7 , 29 (1987)] containing a DNA encoding a yeast-derived CKI of 2692 bp pst I- Hin dIII plasmid fragment was inserted pCK1D [J. Biol. Chem. , 264, 2053 (1989)] and the like.
上記のプラスミドは、これらのプラスミドを保持した大腸菌から公知の方法[Nuc. Acids Res., 7, 1513 (1979)] に従い単離精製できる。
上記のようにして得られるプラスミドから、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition,Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に従って、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAを取得し、該DNAを発現ベクターに組み込み、組換え体DNAを作製し、上記微生物を宿主細胞として形質転換を行うことにより、CDP-コリン生成活性を有する生体触媒を取得することができる。The above plasmids can be isolated and purified from Escherichia coli carrying these plasmids according to a known method [Nuc. Acids Res., 7 , 1513 (1979)].
From the plasmid obtained as described above, for example, in accordance with Cold Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001), a DNA encoding CDP-choline synthase is obtained. Is incorporated into an expression vector, a recombinant DNA is prepared, and transformation is performed using the above microorganism as a host cell, whereby a biocatalyst having CDP-choline producing activity can be obtained.
例えば、PyrG、CCTまたはCKIをコードするDNAを上記プラスミドpMW6、プラスミドpCC41またはプラスミドpCK1Dより取得し、得られたDNAをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
また、必要に応じて、CDP-コリン生成酵素をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したDNAを調製する。該DNAはCDP-コリン生成酵素の効率的製造に有用である。For example, DNA encoding PyrG, CCT, or CKI is obtained from the above plasmid pMW6, plasmid pCC41, or plasmid pCK1D. Based on the obtained DNA, if necessary, an appropriate portion that includes the polypeptide-encoding portion is included. Prepare DNA fragments of appropriate length.
If necessary, a DNA in which the base sequence of the portion encoding CDP-choline synthase is substituted so that the codon is optimal for host cell expression is prepared. The DNA is useful for the efficient production of CDP-choline synthase.
該DNA断片、または全長DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAを、それぞれ別個に発現ベクターに挿入してもよいし、複数のDNAを同じ発現ベクターに挿入してもよい。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。A recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length DNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector. At this time, DNAs encoding CDP-choline synthase may be inserted into the expression vector separately, or a plurality of DNAs may be inserted into the same expression vector.
The recombinant vector is introduced into a host cell compatible with the expression vector.
宿主細胞としては、上記微生物をあげることができる。
発現ベクターとしては、該宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、CDP-コリン生成活性に関わる酵素をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞として、細菌等の原核生物を用いる場合は、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該DNA、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。Examples of the host cell include the above microorganisms.
As an expression vector, a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where DNA encoding an enzyme involved in CDP-choline production activity can be transcribed is used. .
When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell, a recombinant vector containing DNA encoding CDP-choline synthase is capable of autonomous replication in prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, A vector composed of the DNA and transcription termination sequence is preferred. A gene that controls the promoter may also be included.
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2[ファルマシア（Pharmacia）社製]、pSE280[インビトロジェン（Invitrogen）社製]、pGEMEX-1[プロメガ（Promega）社製]、pQE-8[キアゲン（QIAGEN）社製]、pKYP10（特開昭58-110600号）、pKYP200〔Agric.Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕, pBluescriptII SK(-)[ストラタジーン（Stratagene）社製]、pTrs30〔Escherichia coliJM109/pTrS30 （FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔Escherichia coliJM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調製〕、pGHA2〔Escherichia coli IGHA2（FERM BP-400）より調製、特開昭60-221091号〕、pGKA2〔Escherichia coli IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091号〕、pTerm2（米国特許4686191号、米国特許4939094号、米国特許5160735号）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pGEX[ファルマシア（Pharmacia）社製]、pETシステム[ノバジェン（Novagen）社製]等をあげることができる。Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 [manufactured by Invitrogen], pGEMEX-1 [Promega ( Promega), pQE-8 [QIAGEN], pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48 , 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53 , 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 , 4306 (1985)], pBluescriptII SK (-) (Stratagene), pTrs30 [ Escherichia coli JM109 / pTrS30 (prepared from FERM BP-5407)], pTrs32 [prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [prepared from Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400); No. -221091], PGKA2 [Escherichia coli IGKA2 prepared from (FERM BP-6798), JP 60-221091], PTerm2 (U.S. Pat. No. 4,686,191, U.S. Pat. No. 4,939,094, U.S. Patent 5,160,735 ), PSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J.Bacteriol., 172, 2392 (1990 ) ], pGEX [Pharmacia (Pharmacia) Co., Ltd.], and the like pET system [Novagen (Novagen) Co., Ltd.], and the like it can.
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、Escherichia coliやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrp を２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。Any promoter can be used as long as it functions in the host cell. For example, trp promoter (P trp), lac promoter, P L promoter, P R promoter, can be mentioned promoters derived from such T7 promoter, Escherichia coli, phage and the like. In addition, artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two P trp are connected in series (P trp × 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter can be used.
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、CDP-コリン生成酵素をコードするDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
In the recombinant vector of the present invention, a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of DNA encoding CDP-choline synthase, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394号）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 ( 1972)], the protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), or the methods described in Gene, 17 , 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168 , 111 (1979).
宿主細胞として酵母を用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。When yeast is used as the host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
As the promoter, any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.For example, a glycolytic gene promoter such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 Examples include promoters, gal 10 promoters, heat shock polypeptide promoters, MFα1 promoters, CUP 1 promoters, and the like.
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153,163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)記載の方法等をあげることができる。As a method for introducing the recombinant vector, any method for introducing DNA into yeast can be used. For example, electroporation method [Methods Enzymol., 194 , 182 (1990)], spheroplast method [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978)], lithium acetate method (J. Bacteriology, 153 , 163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978) Examples of the method can be given.
微生物がCDP-コリン生成活性の一部しか有していない場合、CDP-コリン生成活性が得られるように、適宜2種以上の微生物を組み合わせて、CDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。なお、微生物がCDP-コリン生成活性を有している場合でも、2種以上の微生物を組み合わせることができる。
2種以上の微生物の組合せとしては、上記微生物から選ばれるいずれの組合せでもよく、エシェリヒア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ヘモフィラス（Haemophilus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クラビバクター（Clavibacter）属、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属、ピメロバクター（Pimerobacter）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイセス（Schwanniomyces）属、ピヒア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する微生物から選ばれる、同一の属に属する微生物、あるいは異なる属に属する微生物の組合せがあげられる。When the microorganism has only a part of the CDP-choline producing activity, it can be used as a biocatalyst having CDP-choline producing activity by appropriately combining two or more kinds of microorganisms so that the CDP-choline producing activity can be obtained. Also good. Even when the microorganism has CDP-choline producing activity, two or more kinds of microorganisms can be combined.
As a combination of two or more microorganisms may be any combination selected from the above microorganisms, Escherichia (Escherichia) genus Serratia (Serratia) genus Bacillus (Bacillus) genus Brevibacterium (Brevibacterium) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus, micro Agrobacterium (Microbacterium) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus Streptococcus (Streptococcus) genus Sinorhizobium (Sinorhizobium) genus, Haemophilus (Haemophilus) genus Arthrobacter (Arthrobacter) genus, O Leo Agrobacterium ( Aureobacterium) genus Cellulomonas (Cellulomonas) genus, Krabi Enterobacter (Clavibacter) genus, Kurt Agrobacterium (Curtobacterium) genus, Pimelobacter (Pimerobacter) genus Saccharomyces (Saccharomyces) sp., Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) genus, Cru Lee Kluyveromyces Kluyveromyces) genus Trichosporon (Trichosporon) genus Shiwaniomaisesu (Schwanniomyces) genus Pichia (Pichia) sp is selected from microorganisms belonging to Candida (Candida) spp etc., microorganisms belonging to the same genus or a different genus of a microorganism belonging, There are combinations.
例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物とエシェリヒア属に属する微生物の組合せなどをあげることができ、具体的には、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170とEscherichia coli MM294/pCKG55株(FERM BP-3717)との組合せ（日本特許第3369236号、米国特許第6387667号）等をあげることができる。
CDP-コリン生成活性を有する生体触媒の一つである、CDP-コリン生成活性を有する微生物の培養物としては、上記の微生物を常法に従って培養して得られる培養物をあげることができる。For example, a combination of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium and a microorganism belonging to the genus Escherichia can be mentioned. Specifically, a combination of Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 and Escherichia coli MM294 / pCKG55 strain (FERM BP-3717) (Japan) Patent No. 3369236, US Pat. No. 6,387,667) and the like.
Examples of the culture of microorganisms having CDP-choline producing activity, which is one of the biocatalysts having CDP-choline producing activity, include cultures obtained by culturing the above microorganisms according to a conventional method.
該微生物が細菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合は、該微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。When the microorganism is a prokaryotic organism such as a bacterium or a eukaryotic organism such as yeast, the medium for culturing the microorganism contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can be cultured efficiently.
Any carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol Alcohols such as propanol can be used.
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。 Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3〜9に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is preferably 15 to 50 ° C., and the culture time is usually 16 hours to 7 days. The pH during the culture is preferably maintained at 3-9. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
該微生物が形質転換体であって、かつ、該微生物を形質転換するために用いた組換え体DNAが抗生物質耐性遺伝子を保有している場合は、該微生物を培養する培地に、該組換え体DNAが保有する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加してもよい。
生体触媒として2種以上の微生物の培養物または該培養物の処理物を用いる場合は、それぞれの微生物を上記方法に従って別々にあるいは同一の培地中で培養して得られる培養物等を用いることができる。When the microorganism is a transformant and the recombinant DNA used for transforming the microorganism has an antibiotic resistance gene, the recombinant is added to the medium in which the microorganism is cultured. Antibiotics corresponding to antibiotic resistance genes possessed by body DNA may be added.
When using a culture of two or more microorganisms or a treated product of the culture as a biocatalyst, a culture obtained by culturing each microorganism separately or in the same medium according to the above method may be used. it can.
2種以上の微生物を同一の培地中で培養する場合、これらの微生物を同時に培養しても、一つの微生物の培養中、あるいは培養終了後に残りの微生物を該培地中に培養してもよい。
微生物の培養物の処理物としては、上記の手法で得られる微生物の培養物を界面活性剤、有機溶剤またはリゾチーム等の細胞溶解酵素で処理して得られる処理物があげられる。界面活性剤、有機溶剤または細胞溶解酵素はそれぞれ単独で用いて該培養物を処理してもよいし、これらを組合せて処理してもよい。また、上記の手法で得られる微生物の培養物を濃縮機または乾燥機等で濃縮または乾燥処理して得られる該培養物の濃縮物もしくは乾燥物、該培養物をろ過もしくは遠心分離などで固液分離して得られる細胞、該細胞を乾燥機等で乾燥処理して得られる該細胞の乾燥物、該細胞を界面活性剤、有機溶剤、もしくはリゾチームなどの細胞溶解酵素、またはこれらを組合せて処理して得られる該細胞の処理物等も微生物の培養物の処理物としてあげることができる。When two or more kinds of microorganisms are cultured in the same medium, these microorganisms may be cultured at the same time, or the remaining microorganisms may be cultured in the medium during the culture of one microorganism or after the end of the culture.
The treated product of the microorganism culture includes a treated product obtained by treating the cultured microorganism obtained by the above-described method with a cell lytic enzyme such as a surfactant, an organic solvent or lysozyme. A surfactant, an organic solvent, or a cytolytic enzyme may be used alone to treat the culture, or a combination thereof may be treated. In addition, a concentrated or dried product of the culture obtained by concentrating or drying the microorganism culture obtained by the above-described method with a concentrator or dryer, etc., and filtering or centrifuging the culture Cells obtained by separation, a dried product of the cells obtained by drying the cells with a dryer, the cells, a cell lytic enzyme such as a surfactant, an organic solvent, or lysozyme, or a combination thereof The treated product of the cells obtained in this way can also be mentioned as a treated product of the microorganism culture.
該細胞をホモジェナイザー等で破砕した後、さらに塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理等、通常の酵素の精製手段を施して得られる粗酵素または精製酵素も該培養物の処理物としてあげることができる。
また、上記微生物の培養物の処理物を水不溶性の単体やゲルなどに固定化し、これを生体触媒として用いてもよい。Crude enzyme obtained by disrupting the cells with a homogenizer or the like and then subjecting the cells to conventional enzyme purification means such as salting out, isoelectric point precipitation, organic solvent precipitation, dialysis, and various chromatographic treatments. Or a purified enzyme can also be mentioned as a processed material of this culture.
Alternatively, the treated product of the microorganism culture may be immobilized on a water-insoluble simple substance or gel and used as a biocatalyst.
2種以上の微生物の培養物の処理物を用いる場合、該処理物を別々にCDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよく、これら処理物の混合物をCDP-コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。
生体触媒の使用量は、該生体触媒の比活性等により異なるが、例えば、酵素源として微生物の培養物または該培養物の処理物のいずれかを用いる場合でも、該培養物を遠心分離して得られる湿菌体として、塩化コリン1mgに対して、3〜300mg、好ましくは5〜200mg用いることが好ましい。When a treated product of a culture of two or more microorganisms is used, the treated product may be used separately as a biocatalyst having CDP-choline producing activity, and a mixture of these treated products may be used as a biocatalyst having CDP-choline producing activity. It may be used as a catalyst.
The amount of biocatalyst used varies depending on the specific activity of the biocatalyst. For example, even when either a microorganism culture or a treated product of the culture is used as an enzyme source, the culture is centrifuged. The obtained wet cells are used in an amount of 3 to 300 mg, preferably 5 to 200 mg, per 1 mg of choline chloride.
コリンまたはホスホリルコリンは、それらの塩として媒体中に添加されてもよい。コリンまたはホスホリルコリンの塩としては、例えば、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリンなどのハロゲン化コリン、重炭酸コリン、硫酸メチルコリン、クエン酸二水素コリン、重酒石酸コリン、塩化ホスホリルコリンなどのホスホリルコリンのハロゲン化物などがあげられるが、コリンまたはホスホリルコリンのハロゲン化物が好ましく用いられ、塩化コリン、塩化ホスホリルコリンがさらに好ましく用いられる。 Choline or phosphorylcholine may be added to the medium as their salts. Examples of choline or phosphorylcholine salts include choline halides such as choline chloride, choline bromide and choline iodide, choline bicarbonate, choline sulfate, choline dihydrogen citrate, choline bitartrate, and phosphorylcholine such as phosphorylcholine chloride. Halides and the like can be mentioned, and choline or phosphorylcholine halides are preferably used, and choline chloride and phosphorylcholine chloride are more preferably used.
コリンまたはホスホリルコリンもしくはそれらの塩、およびオロット酸またはウラシルは、化学合成して得てもよいし、発酵法などにより生物から得てもよい。また、必ずしも純粋に精製されたものでなくてもよい。また、いずれの基質も市販されており容易に入手可能である。
コリンまたはホスホリルコリンの濃度は、1 mmol/L〜1mol/Lが好ましく、10〜100mmol/Lがさらに好ましい。Choline or phosphorylcholine or a salt thereof, orotic acid or uracil may be obtained by chemical synthesis, or may be obtained from an organism by a fermentation method or the like. Moreover, it does not necessarily need to be purely purified. Any substrate is commercially available and can be easily obtained.
The concentration of choline or phosphorylcholine is preferably 1 mmol / L to 1 mol / L, more preferably 10 to 100 mmol / L.
必要に応じて媒体に添加される他の成分としては、CDP-コリンの生成に必要なエネルギー供与体、リン酸イオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、界面活性剤および有機溶剤などがあげられる。これらの成分は、生体触媒等から必要量が持ち込まれる場合には添加する必要はない。
エネルギー供与体としてはグルコース、フラクトース、シュクロースなどの糖、糖蜜、澱粉加水分解物など、グリシン、アラニンなどのアミノ酸が用いられる。これらは、0.02〜2.0mol/Lの濃度で用いられることが好ましい。Examples of other components added to the medium as needed include energy donors necessary for the production of CDP-choline, phosphate ions, magnesium ions, ammonium ions, surfactants, and organic solvents. These components do not need to be added when a necessary amount is brought in from a biocatalyst or the like.
Examples of energy donors include sugars such as glucose, fructose, and sucrose, molasses, starch hydrolysates, and amino acids such as glycine and alanine. These are preferably used at a concentration of 0.02 to 2.0 mol / L.
リン酸イオンとしては正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸などのポリリン酸、ポリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどの無機のリン酸塩などを用いることができる。これらのリン酸イオンは、10〜500mmol/Lの濃度で用いられることが好ましい。
マグネシウムイオンとしては硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどの無機のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウムなどの有機のマグネシウム塩を用いることができる。マグネシウムイオンは5〜200mmol/Lの濃度で用いられることが好ましい。Phosphate ions include inorganic phosphorous such as orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, tetrapolyphosphoric acid, polyphosphoric acid, polymetaphosphoric acid, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, monosodium phosphate, and disodium phosphate. Acid salts and the like can be used. These phosphate ions are preferably used at a concentration of 10 to 500 mmol / L.
As magnesium ions, inorganic magnesium salts such as magnesium sulfate, magnesium nitrate and magnesium chloride, and organic magnesium salts such as magnesium citrate can be used. Magnesium ions are preferably used at a concentration of 5 to 200 mmol / L.
アンモニウムイオンとしてはアンモニア水、アンモニアガス、各種無機あるいは有機のアンモニア塩、酵母エキス、コーンスチープリカーなどを用いることができる。またアンモニウムイオンに代えてグルタミンやグルタミンを含有するペプチドやカザミノ酸などの有機栄養源を用いることもできる。これらのアンモニウムイオンの濃度は10mmol/L〜2mol/Lの濃度で用いられることが好ましい。 As the ammonium ion, aqueous ammonia, ammonia gas, various inorganic or organic ammonia salts, yeast extract, corn steep liquor and the like can be used. Further, instead of ammonium ions, glutamine, a peptide containing glutamine, or an organic nutrient source such as casamino acid can also be used. These ammonium ions are preferably used at a concentration of 10 mmol / L to 2 mol / L.
界面活性剤としてはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（例えばラビゾールB-80、日本油脂社製）、ラウロイルザルコシネートなどの陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン・セチルエーテル（例えばノニオンP-208、日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、CDP-コリンの生成を促進するものであればいずれでも使用できる。これらは通常0.1〜100g/L、好ましくは1〜50g/Lの範囲で用いられる。 Surfactants include sodium dioctyl sulfosuccinate (for example, Ravizol B-80, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl sarcosinate, polyoxyethylene cetyl ether (for example, Nonion P-208, Nippon Oil & Fats). Any nonionic surfactant such as Alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, manufactured by NOF Corporation) can be used as long as it promotes the production of CDP-choline. it can. These are usually used in the range of 0.1 to 100 g / L, preferably 1 to 50 g / L.
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール等）、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド等があげられる。これらは通常、0.1〜100mL/L、好ましくは1〜50mL/Lの濃度で用いられる。
生体触媒、コリンまたはホスホリルコリンもしくはそれらの塩、およびオロット酸またはウラシルを接触させる媒体としては、生体触媒として使用する微生物を培養するための培地、該微生物の培養物、および培養上清等を用いてもよいし、水性媒体を用いてもよい。Examples of the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohols (methyl alcohol, ethyl alcohol, butyl alcohol, etc.), acetone, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and the like. These are usually used at a concentration of 0.1 to 100 mL / L, preferably 1 to 50 mL / L.
As a medium for contacting a biocatalyst, choline or phosphorylcholine or a salt thereof, and orotic acid or uracil, a medium for culturing a microorganism to be used as a biocatalyst, a culture of the microorganism, a culture supernatant, and the like are used. Alternatively, an aqueous medium may be used.
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液をあげることができる。
反応を阻害しなければ媒体に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等があげられる。Examples of the aqueous medium include buffers such as water, phosphate buffer, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid) buffer, and tris [tris (hydroxymethyl) aminomethane] hydrochloric acid buffer. be able to.
If the reaction is not inhibited, an organic solvent may be added to the medium. Examples of the organic solvent include acetone, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, xylene, methyl alcohol, ethyl alcohol, butanol and the like.
媒体中で生体触媒、オロット酸またはウラシル、およびコリンまたはホスホコリンを接触させ、該媒体中にCDP-コリンを生成蓄積させる場合、媒体中のpHは通常5〜10、好ましくは6〜8に維持し、通常20〜50℃で2〜48時間反応させる。
上記した方法によって、媒体中にCDP-コリンを生成蓄積させることができる。生成蓄積したCDP-コリンは、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析等の通常の単離精製手段により単離精製することができる。When a biocatalyst, orotic acid or uracil, and choline or phosphocholine are contacted in a medium to produce and accumulate CDP-choline in the medium, the pH in the medium is usually maintained at 5 to 10, preferably 6 to 8. The reaction is usually carried out at 20-50 ° C. for 2-48 hours.
By the method described above, CDP-choline can be generated and accumulated in the medium. The produced and accumulated CDP-choline can be isolated and purified by ordinary isolation and purification means such as ion exchange chromatography, adsorption chromatography, and salting out.
上記したCDP-コリンの製造法として、例えば、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170とEscherichia coli MM294/pCKG55株(FERM BP-3717)を生体触媒として用いてCDP-コリンを生産する方法（日本特許第3369236号、米国特許第6387667号）において、オロット酸またはウラシルをアルカリ性溶液として添加してCDP-コリンを製造する方法をあげることができる。As a method for producing CDP-choline, for example, a method of producing CDP-choline using, for example, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 and Escherichia coli MM294 / pCKG55 strain (FERM BP-3717) as a biocatalyst (Japanese Patent No. 3369236, US Patent) No. 6387667) includes a method for producing CDP-choline by adding orotic acid or uracil as an alkaline solution.
また、別の方法としては、WO99/49073に記載されているUMPとコリンからのCDP-コリンの製造法において、オロット酸またはウラシルからUMPを生成する活性を有する生体触媒を加え、オロット酸またはウラシルをアルカリ性溶液として添加してCDP-コリンを製造する方法をあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより限定されるものではない。As another method, in the method for producing CDP-choline from UMP and choline described in WO99 / 49073, a biocatalyst having an activity of generating UMP from orotic acid or uracil is added, and orotic acid or uracil is added. Can be added as an alkaline solution to produce CDP-choline.
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited thereby.
オロット酸またはウラシルをアルカリ性溶液として添加するCDP-コリンの生産
Escherichia coli MM294株に酵母由来のCCTおよびCKI遺伝子とEscherichia coli由来のPyrG遺伝子を組み込んだプラスミドpCKG55を導入したEscherichia coli MM294/pCKG55株（日本特許第3369236号、FERM BP-3717）をアンピシリン50mg/Lを含むL培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）10g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、NaCl 5g/Lを含みpHを7.2に調整した培地]200mLの入った2Lバッフル付き三角フラスコに接種し、25℃にて24時間220rpmにて回転振とう培養した。この培養液20mLを、グルコース5g/L（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）5g/L、Na2PO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NH4Cl 1g/L、MgSO4・7H2O 250mg/L（別殺菌）およびビタミンB1 4mg/L（別殺菌）の組成からなる2.5Lの液体培地（pH無調整）が入った5L容培養槽に接種し、培養温度28℃、攪拌600rpm、通気量2.5L/分の培養条件下、14％アンモニア水を用いてpH7.0に調整しつつ培養を行った。Production of CDP-choline by adding orotic acid or uracil as alkaline solution
Escherichia coli MM294 strain into which Escherichia coli MM294 / pCKG55 (Japanese Patent No. 3369236, FERM BP-3717) introduced with plasmid pCKG55 in which the CCT and CKI genes derived from yeast and the PyrG gene derived from Escherichia coli have been introduced is ampicillin 50 mg / L L medium containing 10g / L of Bactotryptone (Difco), 5g / L of yeast extract (Difco), adjusted to pH 7.2 with NaCl 5g / L] Triangle with 2L baffle containing 200mL The flask was inoculated and cultured with shaking at 220 rpm for 24 hours at 25 ° C. 20 mL of this culture solution, glucose 5 g / L (separate sterilization), peptone (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) 5 g / L, Na 2 PO 4 6 g / L, KH 2 PO 4 3 g / L, NH 4 Cl 1 g / L, Inoculate a 5L culture tank containing 2.5L liquid medium (pH unadjusted) consisting of 250mg / L MgSO 4 · 7H 2 O (separate sterilization) and vitamin B1 4mg / L (separate sterilization). Culturing was carried out while adjusting the pH to 7.0 with 14% aqueous ammonia under the culture conditions of 28 ° C., stirring at 600 rpm, and aeration rate of 2.5 L / min.
上記種培養液の上清中のグルコースが消費された時点で、250mLの培養物を無菌的に採取し、グルコース 5g/L（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）5g/L、Na2PO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NH4Cl 1g/L、MgSO4・7H2O 250mg/L（別殺菌）およびビタミンB1 4mg/L（別殺菌）の組成からなる2.5Lの液体培地（pH無調整）が入った5L容培養槽に接種し、培養温度28℃、攪拌600rpm、通気量2.5L/分の培養条件下、14％アンモニア水を用いてpH7.0に調整しつつ培養を行った。When the glucose in the supernatant of the seed culture solution is consumed, 250 mL of the culture is aseptically collected, glucose 5 g / L (separately sterilized), peptone (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) 5 g / L, Na 2 PO 4 6g / L, KH 2 PO 4 3g / L, NH 4 Cl 1g / L, MgSO 4 · 7H 2 O 250mg / L (separate sterilization) and vitamin B1 4mg / L (separate sterilization) 2.5 Inoculate a 5 L culture tank containing L liquid medium (pH unadjusted), and adjust to pH 7.0 using 14% ammonia water under culture conditions of culture temperature 28 ° C, stirring 600 rpm, aeration rate 2.5 L / min. Culture was performed while adjusting.
培養中、培養11時間目から24時間目までの間、グルコース 167g/L、ペプトン 167g/Lの組成からなるフィード液をペリスタポンプにより30mL/時間の速度にて添加した。
一方、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株を、グルコース 50g/L、ポリペプトン（大五栄養化学社製）10g/L、イーストエキス（大五栄養化学社製）10g/L、尿素 5g/L、(NH4)2SO4 5g/ L、KH2PO4 1g/ L、K2HPO4 3g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、CaCl2・2H2O 0.1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、ZnSO4・7H2O 10mg/L、MnSO4・4〜6H2O 20mg/L、L-システイン 20mg/L、D-パントテン酸カルシウム 10mg/L、ビタミンB1 5mg/L、ニコチン酸 5mg/L、およびビオチン 30μg/L（10規定水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整）の組成からなる液体培地200mLの入った2Lバッフル付き三角フラスコに接種し、28℃、24時間、220rpmで回転振とう培養した。この培養物 20mLを、グルコース 100g/L、ポリペプトン 10g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、CaCl2・2H2O 0.1g/L、FeSO4・7H2O 20mg/L、ZnSO4・7H2O 10mg/L、MnSO4・4〜6H2O 20mg/L、β-アラニン 15mg/L、L-システイン 20mg/L、ビオチン 0.1mg/L、尿素 2g/L（別殺菌）およびビタミンB1 5mg/L（別殺菌）（10規定水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整）の組成からなる2.5Lの液体培地が入った5L容培養槽に接種し、32℃、攪拌600rpm、通気量2.5L/分の培養条件下、濃アンモニア水でpHを6.8に調整しつつ種培養を行った。During the culture, a feed solution having a composition of glucose 167 g / L and peptone 167 g / L was added by a peristaltic pump at a rate of 30 mL / hour from the 11th to the 24th culture.
On the other hand, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain, glucose 50g / L, polypeptone (made by Daigo Nutrition Chemical) 10g / L, yeast extract (made by Daigo Nutrition Chemical) 10g / L, urea 5g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 5g / L, KH 2 PO 4 1g / L, K 2 HPO 4 3g / L, MgSO 4・ 7H 2 O 1g / L, CaCl 2・ 2H 2 O 0.1g / L, FeSO 4・ 7H 2 O 10mg / L, ZnSO 4 · 7H 2 O 10mg / L, MnSO 4 · 4~6H 2 O 20mg / L, L- cysteine 20 mg / L, D-calcium pantothenate 10 mg / L, vitamin B1 5mg / L, nicotinic acid 5mg Inoculate 2 L baffled Erlenmeyer flask containing 200 mL of liquid medium with a composition of 30 μg / L of biotin and 30 μg / L of biotin (adjusted to pH 7.2 using 10 N sodium hydroxide solution) at 28 ° C., 24 hours, 220 rpm Incubated with rotary shaking. The culture 20 mL, glucose 100 g / L, polypeptone 10g / L, KH 2 PO 4 1g / L, K 2 HPO 4 1g / L, MgSO 4 · 7H 2 O 1g / L, CaCl 2 · 2H 2 O 0.1g / L, FeSO 4 · 7H 2 O 20mg / L, ZnSO 4 · 7H 2 O 10mg / L, MnSO 4 · 4~6H 2 O 20mg / L, β- alanine 15 mg / L, L-cysteine 20 mg / L, biotin Contains 2.5 L of liquid medium consisting of 0.1 mg / L, urea 2 g / L (separate sterilization) and vitamin B1 5 mg / L (separate sterilization) (adjusted to pH 7.2 using 10N sodium hydroxide solution) 5 L culture tank was inoculated, and seed culture was performed while adjusting the pH to 6.8 with concentrated aqueous ammonia under the culture conditions of 32 ° C., stirring at 600 rpm, and aeration rate of 2.5 L / min.
上記種培養物の上清中のグルコースが消費された時点で、350mLの培養液を無菌的に採取し、グルコース 180g/L、KH2PO4 10g/L、K2HPO4 10g/L、MgSO4・7H2O 10g/L、CaCl2・2H2O 0.1g/L、FeSO4・7H2O 20mg/L、ZnSO4・7H2O 10mg/L、MnSO4・4〜6H2O 20mg/L、β-アラニン 15mg/L、グルタミン酸ナトリウム 1g/L、L-システイン 20mg/L、ビオチン 0.1mg/L、尿素 2g/L（別殺菌）およびビタミンB1 5mg/L（別殺菌）（10規定水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整）の組成からなる2.5Lの液体培地が入った5L容培養槽に接種し、32℃、攪拌600rpm、通気量2.5L/分の培養条件下、濃アンモニア水でpHを6.8に調整しつつ本培養を行った。培養液上清中のグルコースが消費された時点で培養を終了した。When glucose in the supernatant of the seed culture is consumed, 350 mL of the culture solution is aseptically collected, and glucose 180 g / L, KH 2 PO 4 10 g / L, K 2 HPO 4 10 g / L, MgSO 4・ 7H 2 O 10g / L, CaCl 2・ 2H 2 O 0.1g / L, FeSO 4・ 7H 2 O 20mg / L, ZnSO 4・ 7H 2 O 10mg / L, MnSO 4・4 ~ 6H 2 O 20mg / L L, β-alanine 15mg / L, sodium glutamate 1g / L, L-cysteine 20mg / L, biotin 0.1mg / L, urea 2g / L (separate sterilization) and vitamin B1 5mg / L (separate sterilization) (10 normal water) Adjust to pH 7.2 using sodium oxide solution) Inoculate a 5 L culture tank containing 2.5 L liquid medium with a composition of 32 ° C., stirring at 600 rpm, aeration rate of 2.5 L / min. The main culture was performed while adjusting the pH to 6.8 with aqueous ammonia. The culture was terminated when the glucose in the culture supernatant was consumed.
このようにして得られたEscherichia coli MM294/pCKG55株の培養液500mLとCorynebacterium ammoniagenes ATCC21170株の培養液185mLをそれぞれ3本の2L容培養槽に分注し、それぞれに60%(w/v)グルコース溶液を80mL、25%(w/v)MgSO4・7H2Oを25mL、25%(w/v)KH2PO4を160mL、さらに塩化コリンとキシレンをそれぞれ8.4g/L(60mM)、20ml/Lになるように添加した。さらに1本（ポット1）には粉末オロット酸 35mmol/Lを添加した。この混合液を、32℃にて攪拌800rpm、通気量0.2L/分の条件下、10規定の水酸化ナトリウム溶液にてpHを7.2に保ちつつ反応を行った。別の1本（ポット2）は、800mmol/Lのオロット酸を含む6規定の水酸化カリウム溶液にてpHを7.2に保ち、培養槽内にポット1と同量のオロット酸（35mmol/L）が添加された時点より、pH調整剤を10規定の水酸化ナトリウム溶液に切り替えpHを7.2に保ち、32℃にて攪拌800rpm、通気量0.2L/分の条件下反応を行った。残りの一本（ポット3）は、800mmol/Lのウラシルを含む6規定の水酸化カリウム溶液にてpHを7.2に保ち、培養槽内にポット1と同量のウラシル（35mmol/L）が添加された時点より、pH調整剤を10規定の水酸化ナトリウム溶液に切り替えpHを7.2に保ち、32℃にて攪拌800rpm、通気量0.2L/分の条件下反応を行った。これらの混合液を、32℃にて攪拌800rpm、通気量0.2L/分の条件下22時間反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離し、上清を水で100倍希釈後、高速液体クロマトグラフィー分析にてUV検出器により256nmの吸光度を測定することにより、CDP-コリンの生成量を定量した。結果を表1に示す。500 ml of the culture solution of Escherichia coli MM294 / pCKG55 strain obtained in this way and 185 mL of the culture solution of Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain were each dispensed into three 2L culture tanks, each with 60% (w / v) glucose 80 mL of solution, 25 mL of 25% (w / v) MgSO 4 7H 2 O , 160 mL of 25% (w / v) KH 2 PO 4, and 8.4 g / L (60 mM) and 20 mL of choline chloride and xylene, respectively It added so that it might become / L. In addition, 35 mmol / L of powdered orotic acid was added to one (pot 1). This mixture was reacted at 32 ° C. with stirring at 800 rpm and aeration rate of 0.2 L / min while maintaining the pH at 7.2 with 10 N sodium hydroxide solution. Another one (pot 2) was maintained at pH 7.2 with 6 normal potassium hydroxide solution containing 800 mmol / L orotic acid, and the same amount of orotic acid (35 mmol / L) as in pot 1 in the culture tank. From the time when was added, the pH adjuster was switched to a 10 N sodium hydroxide solution, the pH was maintained at 7.2, and the reaction was carried out at 32 ° C. under stirring at 800 rpm and aeration rate of 0.2 L / min. The remaining one (pot 3) is maintained at pH 7.2 with 6N potassium hydroxide solution containing 800mmol / L uracil, and the same amount of uracil (35mmol / L) as in pot 1 is added to the culture tank. From that point on, the pH adjuster was switched to a 10N sodium hydroxide solution, the pH was maintained at 7.2, and the reaction was carried out at 32 ° C. with stirring at 800 rpm and aeration rate of 0.2 L / min. These mixtures were reacted at 32 ° C. for 22 hours under the conditions of stirring at 800 rpm and aeration rate of 0.2 L / min. After completion of the reaction, the reaction solution was centrifuged, the supernatant was diluted 100 times with water, and the amount of CDP-choline produced was quantified by measuring the absorbance at 256 nm with a UV detector by high performance liquid chromatography analysis. . The results are shown in Table 1.
以上のとおり、CDP-コリンの製造法において、オロット酸またはウラシルを、オロット酸またはウラシルを含有するアルカリ性溶液として添加することにより、CDP-コリンの生成量が増加し、CDP-コリンを効率よく製造できた。 As described above, in the CDP-choline production method, adding orotic acid or uracil as an alkaline solution containing orotic acid or uracil increases the amount of CDP-choline produced and efficiently produces CDP-choline. did it.
本発明により、CDP-コリンを工業的に有利に製造する方法が提供される。 The present invention provides a method for producing CDP-choline in an industrially advantageous manner.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019007055A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | Recombinant microorganism for producing cytidine diphosphate and method for producing cytidine diphosphate |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5836791B2 (en) * | 2011-12-26 | 2015-12-24 | キリンホールディングス株式会社 | Beverage containing orotic acid and method for producing the same |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998011247A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates |
| JP2001103973A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-17 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Method for producing cytidine 5'-diphosphate choline |
| JP3369236B2 (en) * | 1992-01-30 | 2003-01-20 | 協和醗酵工業株式会社 | Method for producing choline cytidine diphosphate |
| WO2003095660A1 (en) * | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing cytidine 5’-diphocphate choline |
-
2006
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- 2006-08-23 WO PCT/JP2006/316451 patent/WO2007023830A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3369236B2 (en) * | 1992-01-30 | 2003-01-20 | 協和醗酵工業株式会社 | Method for producing choline cytidine diphosphate |
| WO1998011247A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates |
| JP2001103973A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-17 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Method for producing cytidine 5'-diphosphate choline |
| WO2003095660A1 (en) * | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing cytidine 5’-diphocphate choline |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019007055A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | Recombinant microorganism for producing cytidine diphosphate and method for producing cytidine diphosphate |
| CN109207415A (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-15 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | A method of producing the recombinant microorganism and production citicoline of citicoline |
| CN109207415B (en) * | 2017-07-07 | 2022-09-16 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | Recombinant microorganism for producing citicoline and method for producing citicoline |
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