JP5105216B2

JP5105216B2 - Implantable putty-like material

Info

Publication number: JP5105216B2
Application number: JP53591498A
Authority: JP
Inventors: ジェイダミエン、クリストファー
Original assignee: ジンマーオーソバイオロジックス，インコーポレーテッド
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2018-02-12
Also published as: AU6654598A; JP2001521414A; EP1019027A4; CA2280966A1; WO1998035653A1; CA2280966C; EP1019027A1

Description

発明の属する技術分野
本発明は、活性化合物を患者に与えるための移植可能なパテ状材料に関するものである。
従来の技術
各種の移植材料が、患者に活性物質を付与するのに使われてきた。例えば、この種の材料は、骨の修復にも用いることができる。典型的には、これらの材料を所望の部位に移植して、骨の成長を促す。この種の材料は、移植部位に固着し、順応する性質を持ち、骨の成長を助長するのが理想である。
米国特許第５，３１４，４７６号及び第５，０７３，３７３号は、脱灰骨粒子及びグリセリンのようなポリヒドロキシ化合物、あるいはオリゴ糖を含む変形容易な形体維持性骨形成組成物を開示している。
米国特許第５，４０５，３９０号および第５，２３６，４５６号には、脱灰や熱により改質された骨組織由来の表面接着性骨形成組成物が示されている。この組成物は、粉末、粘稠な液体の形、あるいは直接注入により投与される。
米国特許第５，２４６，４５７号は、燐酸カルシウム塩と再構成された原線維アテロペプチドコラーゲンを含有する骨修復組成物を示している。この化合物には、如何なる生物学的活性成分も含まれていない。物理的および取り扱い特性は、熱、湿潤混合物の飽和、コラーゲンの特殊な架橋を含め、多くの硬化過程により改善されている。
米国特許第４，４４０，７５０号では、脱灰骨粉と天然のアテロペプタイドコラーゲン繊維を含む骨形成組成物を開示している。このコラーゲン繊維は、実質的に生理的ｐＨとイオン強度を有する連続水相で再構成されている。
米国特許第４，９７５，５２６号は、蛋白抽出脱灰骨粉と基質内の粒子間空隙を増加させる膨潤剤とを含有する基質材料を示している。
米国特許第４，３９４，３７０号では、骨欠損を治療する骨移植材料が示されている。この材料は、コラーゲンと脱灰骨粒子とを含有し、スポンジ状である。
上記を含め、現在知られている移植用材料は、粘着性、弾力性及び所望の形状への成形性といった組織特性において受け入れ難い。さらに、米国特許第５，３１４，４７６号や第５，０７３，３７３号で開示されているような、他のペースト状材料は、前記のようにグリセリンのごとき有機溶媒を必要とする。
したがって、改善された取り扱い特性を有し、かつ有機溶媒を必要としない骨誘導物質が必要である。
課題を解決するための手段
本発明のひとつの実施の形態は、コラーゲンと水とを含有するパテ状材料であって、パテ状材料が約3.0〜約6.0のｐＨを有する。本発明の材料は、優れた物理的性質と取り扱い特性を有する。パテ状材料のコラーゲンは、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）、およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選択できる。このパテ状材料は、酸を加えて成形できる。酸は、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサルチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サルチル酸（salicylic acid）、および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選択する。また、このパテ状材料は活性成分を含むことができる。活性成分は、例えば骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質、および抗ウイルス性化合物からなる群から選択される。
本発明の他の実施形態は骨形成組成物で、コラーゲン、骨誘導物質、および酸を含有している。この骨形成組成物は、コラーゲン100mgあたり約0.05mmol〜約2.3mmolの酸を含有する。
また、本発明の他の実施形態は、牛腱Ｉ型コラーゲン、アスコルビン酸、水、骨成長蛋白、および脱灰骨材を含む骨形成組成物にある。
さらに、本発明の他の実施形態は、コラーゲンと酸と水とを混合してゲルを得、ゲルに脱灰骨材を加えて骨形成パテを得、骨形成パテのｐＨ値が約6.0以下である工程を含む方法で製造される組成物にある。
また、本発明の他の実施形態は、コラーゲンと、酸と、骨誘導物質と、水とを混合してゲルを形成し、ゲルを減圧凍結乾燥させる工程を有する乾燥骨誘導組成物の製造方法にある。
本発明の他の実施形態は、患者への活性化合物の投与方法にあり、この投与方法は、コラーゲンと酸とを混合して、ｐＨ値が約3.0〜約6.0である組成物を得ることにより担体を調製し、担体に活性物質を入れ、担体を患者の体内の所望の部位に移植するステップを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのアスコルビン酸の揮発性を示す。
第２図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのリンゴ酸の揮発性を示す。
第３図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からの酢酸の揮発性を示す。
第４図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からの乳酸の揮発性を示す。
第５図は、減圧凍結乾燥工程における移植材料からのグリコール酸の揮発性を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、コラーゲンと水とを含有する材料組成物に関する。本発明の材料は、パテ状粘稠物で、所望の形に成形できる。また、本発明は、骨の形成を誘起するといった生物学的反応または活動を刺激し、引き起すために、体内にこの材料を移植する方法に関する。特に、本発明の材料は、骨欠損がある人や動物に移植するのに適しており、欠損が治療するように骨組織の再生を誘導するためのものである。
本発明のコラーゲン成分としては、原線維コラーゲン、アテロペプチドコラーゲン、テロペプチドコラーゲン、またはトロポコラーゲンが好ましく、各種の哺乳動物から集めることができる。アテロペプチドコラーゲンとトロポコラーゲンを作る方法は、米国特許第４，４４０，７５０号（Glowacki et al）に記載されており、その全文をここに挿入する。このコラーゲンは、好ましくは哺乳類コラーゲンである。このコラーゲンは、さらに好ましくは、牛Ｉ型コラーゲンおよび豚牛Ｉ型コラーゲンからなる群から選ばれる。もっとも望ましいのは、精製された原線維牛腱Ｉ型コラーゲンである。本発明の材料または組成物におけるコラーゲンの望ましい量は、（水を加えない状態での）約1重量%〜約10重量%であり、さらに望ましくは約2重量%〜約8重量%であり、最も望ましいのは約3重量%〜約5重量%である。
本発明の材料及び組成物は、約3〜約6のｐＨを有し、望ましくは約3.5〜約5の間で、最も望ましいのは約3.8〜約4.6である。材料のｐＨは、「Orion Co.（Boston, MA）」から出されている「Ross平坦表面電極」を使用し、材料表面に平坦なｐＨ電極を置き測定する。材料のｐＨ値が上記値内にあれば、その材料は、弾力性があり練り生地状のパテ状粘稠性といった優れた物質的な特性を有していることが分かる。高いｐＨでは、材料は湿った砂のように脆くなる。パテ状の粘性は、高い接着性、取り扱い易さ、成形容易性といった多くの利点があるので望ましい。また本発明の材料は接着性であるので、接着性の低い材料に比べて、移植した部位に活性化合物を長く保持する利点を提供するものと考えられる。
本発明の材料の望ましいｐＨ値は、酸をコラーゲンに加え、材料を形成することによって達成される。本発明において使用される用語「酸」は、水より低いpKa値を有する化合物を言い、用語「酸性プロトン」とは、そのpKa値が水より低いプロトンを意味する。本発明に用いる好適な酸は、フェノール（phenols）類やカルボン酸（carboxylic acids）類といった有機酸、及び塩酸（hydrochloric acid）、燐酸（phosphoric acid）、硫酸（sulfuric acid）といった無機酸を含む。酸は、好ましくは有機酸、塩酸もしくは燐酸であり、酢酸（acetic acid）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、アスパラギン酸（aspartic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、塩酸（hydrochloric acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、燐酸（phosphoric acid）、サルチル酸（salicylic acid）、および酒石酸（tartaric acid）からなる群から選択される。さらに望ましい酸としては、アスコルビン酸（すなわちビタミンC）、酢酸、アセチルサルチル酸、安息香酸塩、クエン酸、グルタミン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、サルチル酸、および塩酸からなる群から選択される。最も望ましい酸は、アスコルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、および乳酸からなる群から選択される。
酸は、望ましい物理的特性を持つ材料を製造するのに、適度な量で加えるべきである。材料中に存在する酸の好ましい量は、コラーゲン１００ｍｇ当たり、約0.05ミリモル当量（以後「eq. mmol」という）から約2.30eq. mmolであり、さらに好ましくはコラーゲン１００ｍｇ当たり約0.1eq. mmolから約1.5eq. mmolであり、最も望ましくは、コラーゲン１００ｍｇ当たり約0.2eq. mmolから約1.5eq. mmolである。ここで用語「ミリモル当量」とは、酸一分子中にある酸性プロトンの数で除したmmolでの酸の量を言う。例えば、リンゴ酸などのいくつかの酸は、一分子あたり二つの等価の酸性プロトンを有している。従って、一分子当たり二つの酸性プロトンを有するリンゴ酸、その他の酸の好ましい量は、一分子あたり一つの酸性プロトンを有する酸の半分の量となる。例えば、リンゴ酸は2つの酸性プロトンを有しているのに対して酢酸はたった一つしか酸性プロトンを持たないことから、５mmolのリンゴ酸と１０mmolの酢酸とは、両方とも１０eq. mmolの酸と表すことができる。
材料中に存在する酸の量を決める他の方法は、コラーゲンコラーゲン１００ｍｇあたりの酸の量である。かくして、例えばアスコルビン酸を含有する材料組成物にあっては、約100mgのコラーゲンに対して約20mgから約200mgまでのアスコルビン酸を添加するのが望ましく、さらに望ましくは約100mgのコラーゲンあたり約26mgから約131mgまでのアスコルビン酸であって、最も望ましいのは約100mgのコラーゲンあたり約65mgから約131mgまでのアスコルビン酸である。酸の量は、その分子量によって変わることを考慮すべきである。材料が減圧凍結乾燥される場合には凍結乾燥中に酸が蒸発し、乾燥固体が水で再構成される際、ｐＨと材料の粘稠性に影響を及ぼす。例えば、アスコルビン酸やリンゴ酸を含む材料は、処理中にこれらの酸の揮発量が少ないため、減圧凍結乾燥に特に適している。減圧凍結乾燥工程中の酸揮発量は、約30%以下が望ましく、さらに望ましくは約15%以下であり、最も望ましいのは約5%以下である。
既述のように、本発明の材料と組成物は、移植後の接着性や形体保持性のごとき、優れた物理的特性を有している。このような物理的特性のひとつの尺度は、本発明の材料及び組成物が少なくとも約10グラム（g）、望ましくは少なくとも約20g、さらに望ましくは少なくとも約30gのピーク対抗力を持つことである。ここで用いる「ピーク対抗力（ピーク力）」とは、Texture Technologies Corp.（Scarsdale, New York）製のTA.XT2 Texture Analyzer装置またはこれと同等の装置を使用し、破断点まで引っ張った時に材料によって与えられた力の最大値を言う。試験片は「SMS/Kieffer molding form and press（TA-105a Texture Technologies）」または同等の装置により、長さ53mm、高さ4mm、一辺の幅4mm、他辺の幅2.5mmの台形柱形状に製作する。
この種の物理的特性の他の尺度は、本発明の材料及び組成物が好ましくは約2mmから約25mm、さらに好ましくは約3mmから約25mm、最も望ましいのは約5mmから約25mmの伸張長を持つことである。ここで用いる「伸張長（extensibility）」は、ピーク対抗力テストと同一装置及び同一試験片サイズを用いて、材料が破断するまで、材料を引っ張るプルーブが移動した距離を言う。
また、本発明の材料は活性成分の有効量を含むことができる。「活性成分」とは、生物活性を有する如何なる化合物または化合物の混合の混合物をも意味する。代表的な活性成分は、骨誘導物質、成長因子、ホルモン、抗生物質、および抗ウイルス性化合物を含む。骨誘導物質の詳細は後述する。成長因子としては、線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor：以下「bFGF」）と変換成長因子ベータ（transforming growth factor beta：以下「TGF-beta」）とをあげることができる（「Cuevas et al., Basic Fibroblast Growth Factor（FGF）Promotes Cartilage Repair In Vivo, Biochem Biophys Res Commun 156:611-618, 1988」参照）。これらの成長因子は、軟骨刺激及び血管形成剤とも言われている。例えば、bFGFは、骨芽細胞の再生速度を促進するが、一方で同時にそれらの活性を抑制することも知られている。（「Frenkel S, Singh IJ; The effects of fibroblast growth factor on osteogenesis in the chick embryo. In: Fundamentals of bone growth: Methodology and applications. Ed. AD Dixon, BG Sarnat, D. Hoyte, CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 245-259, 1990」）この作用は投与量に依存しており、投与量が多すぎても少なすぎても活性は低下し、その中間域が活性を刺激する（「Aspenberg P, Thorngren KG, Lohmander LS; Dose-dependent stimulation of bone induction by basic fibroblast growth factor in rats. Acta Orthop Scand 62:481-484, 1991」）
「効果量」なる用語は、望ましくない副作用を起こすことなく、望ましい作用を発揮させるに十分な活性成分の量を言う。ある場合には、望ましい作用を得ることと、望ましくない作用の強さを抑えることのバランスをとる必要もある。使用された活性成分の量は、活性成分のタイプと本発明組成物の使用目的によって変わることも認識しておく必要がある。本発明の材料が骨形成材料を含む場合にあっては、骨誘導物質の量はパテ状材料組成物の総重量に対し、望ましくは約0.1重量%から約10重量%であり、さらに望ましくは約0.25重量%から約4重量%であり、最も望ましいのは約0.35重量%から約1.6重量%である。
ここで、「骨誘導物質」とは、体内に移植された際、骨の形成を誘導することができる如何なる物質（すなわち、骨形成特性を持っている物質）を意味し、脱灰骨基質や骨誘導因子を含む。「骨誘導因子」とは、骨の形成を誘導することができる天然の蛋白、（遺伝子）組換えもしくは合成蛋白、さらには蛋白混合物をいう。例えば、この骨誘導因子なる語は、米国特許第５，５６３，１２４号（「Damien et al.」）で骨成長因子として説明されている物質を意味する。本発明がもっとも意図する用途は、人体への使用に係わり、同様に本発明の製品および方法は動物にも働くことに注目すべきである。骨形成の誘導は、骨芽細胞、破骨細胞や類骨基質を伴う新たな骨の形成を示す組織学的評価によって測定可能である。例えば、骨誘導因子の骨誘導能は、テストする物質を沈着させた基質を用いる試験により示すことができる。物質沈着基質は実験動物の皮下に移植する。次いで、移植片を取り出し、骨芽細胞、破骨細胞や類骨基質の存在を含めて、骨形成の有無を顕微鏡観察する。この好適な手順は、米国特許第５，２９０，７６３号の実施例５で説明されている。
骨形成能の程度を評価する一般的に認められた基準はないものの、ある種のファクターは、骨形成を示すものとして広く知られている。そのようなファクターとしては米国特許第５，５６３，１２４号の実施例1の表3で示されているスケール0-8がある。このスケールの0-4部分は、米国特許第５，２９０，７６３号で述べられている採点システムと一致するが、スコア0-4に限定される。スケールの残りの部分、スコア5-8は、骨形成熟度の付加的レベルを示している。拡張されたスケールは、米国特許第５，２９０，７６３号には述べられてないが、コラーゲンの再吸収を考慮したファクターをも含んでいる。
本発明の好適な骨誘導因子は、骨から自然に生成する蛋白の精製またはDNAの組み換えにより製造することができる。ここで使われている用語「組み換え製造骨誘導因子（recombinantly produced osteoinductive factors）」は、DNA組み換え技術で用いた骨誘導因子の製造を意味する。例えば、骨形成能を有する蛋白をコード化する核酸は、蛋白に結合して抗体を生み出すことにより同定できる。この抗体は、親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）を使って、生成された特定の骨形成蛋白の集団を分画するのに使用できる。アミノ酸の配列は、精製された蛋白を配列することにより同定できる。DNAオリゴヌクレオチド（oligonucleotides）は、既知のアミノ酸鎖から合成することができる。オリゴヌクレオチドは、骨形成蛋白をコード化する核酸を同定するために、例えば牛属のDNAから作られたゲノムDNA（genomic DNA）および／またはcDNAライブラリのいずれかを選別するのに使用できる。正当なオリゴヌクレオチドは、適切なｃDNAにハイブリッド化し、それによって骨形成蛋白コード化遺伝子をコードするcDNAを同定する。
骨形成蛋白に結合した抗体は、またcDNA発現ライブラリを選別するのに直接利用できる。例えば、骨形成蛋白をコード化する真核細胞のｃDNA（eukaryotic cDNA）鎖は、細菌発現ベクター内に組み込むことができる。発現ベクターは「E.coli」といった細菌内に形質転換でき、転換発現ベクターを発現し、骨形成蛋白を産生する。この形質転換された細菌は、細菌を溶解し、放射能でラベルされた抗体に細菌を接触させることにより、骨形成蛋白を発現させるために選別することができる。
組換え骨誘導因子は、核酸を細胞に入れる種々の方法を用いて、前記方法により同定された遺伝子を細胞に導入させることにより製造できる。導入後、細胞は、導入された核酸の発現により、組換え骨誘導因子を製造する。得られた骨誘導因子は、細胞から回収できる。
多くの骨から自然に生成する蛋白または組換え骨誘導因子は文献に記述されており、本発明にも適している。組換え技術により作られた骨誘導因子は、いろいろなところで製造されてきた。「Creative Biomolecules of Hopkinton（Massachusetts, USA）」では「Osteogenic Protein 1」または「OP1」と称する骨誘導因子を製造している。「Genetics Institute of Cambridge（Massachusetts, USA）」では、「Bone Morphogenetic Proteins骨形成因子1-13（i.e., BMP 1-13）」と称する一連の骨誘導因子を製造しており、このうちいくつかは、米国特許第５，１０６，７４８号、第５，６５８，８８２号またはPCT国際公開ＷＯ９６／３９１７０に記載されている。精製された骨誘導因子も、各社で開発されてきた。「Collagen Corporation of Palo Alto（California, USA）」は、骨形成能を有すると考えられる精製蛋白混合物を開発、米国特許第４，７７４，２２８号、第４，７７４，３２２号、第４，８１０，６９１号、および第４，８４３，０６３号に記載されている。「Marshall Urist of the University of California」は、骨形成能があると考えられる精製蛋白混合物を開発、これは米国特許第４，４５５，２５６号、第４，６１９，９８９号、第４，７６１，４７１号、第４，７９５，８０４号に記載されている。「International Genetic Engineering（Inc. of Santa Monica, California, USA）」は、骨形成能があると考えられる精製蛋白混合物を開発、米国特許第４，８０４，７４４号に記載されている。前記すべての特許は、参考までにここに挙げた。
本発明の望ましい骨誘導因子およびその製法は、関連米国特許第５，２９０，７６３号に詳述されている。この骨誘導因子は、高い骨形成能を有し、かつ精製された骨誘導因子であることから、特に望ましい。米国特許第５，２９０，７６３号の骨誘導因子は、適当な担体上に付着させ、ラットの皮下に移植すると、約３マイクログラムで骨誘導活性を示す。ひとつの実施例では、骨誘導因子は、米国特許第５，５６３，１２４号の図1に示されたゲル分離プロフィールをもつ蛋白の骨誘導活性混合物である。このゲル分離プロフィールは、SDS-PAGEを使って得られたものである。最初の欄は、既知の分子量の標準値についてSDS-PAGEを行うことによって得られた分子量目盛である。第２欄は、２−メルカプトメタノール（2-mercaptoethanol）によって希釈した本発明による蛋白混合物についてのSDS-PAGEプロフィールを示す。第３欄は、本発明における希釈しない蛋白混合物についてのSDS-PAGEプロフィールを示している。ここに示されたSDS-PAGEプロフィールを備えた蛋白混合物は高い骨誘導活性を持つことがわかっておるが、ここに示されたものからわずかに異なるSDS-PAGEプロフィールを持つ蛋白混合物もまた有効あると予測される。例えば、効果のある蛋白混合物は、ここに示されたものからプラスマイナス5KDまで分子量の異なる蛋白を含むことができ、示したものより多くのあるいは少ない蛋白を含むことができる。したがって、この中の希釈または非希釈SDS-PAGEプロフィールで検出されたすべての蛋白のバンドを実質的に含むプロフィールをもつ蛋白混合物も、本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
また、本発明の望ましい骨誘導因子の別な実施例は、加水分解すると、約20.7〜約26.1mol％の酸性アミノ酸（acidic amino acids）、約11.3.約15.7mol％のヒドロキシアミノ酸（hydroxy amino acids）、約37.6〜約42.4mol％の脂肪族アミノ酸（aliphatic amino acids）、約5.8〜約7.9mol％の芳香族アミノ酸（aromatic amino acids）および約13.3〜約19.9mol％の塩基性アミノ酸（basic amino acids）持つ骨誘導活性蛋白混合物を含んでいる。より詳細には、好ましい骨誘導因子は、約20.7〜約26.1（望ましくは約23.4）mol％のＡＳＰ（＋ＡＳＮ）およびＧＬＵ（＋ＧＬＮ）；約11.3〜約15.7（望ましくは約13.5）mol％のＳＥＲおよびＴＨＲ；約37.6〜約42.4（望ましくは約40.0）mol％のＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＶＡＬ、ＭＥＴ、ＩＬＥ、およびＬＥＵ；約5.8〜約7.9（望ましくは約6.8）mol％のＴＹＲおよびＰＨＥ；ならびに約13.3〜約19.9（望ましくは約16.6）mol％のＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳのアミノ酸組成物を有する。望ましい骨誘導因子の更なる実施例は、表1に示すものに近いアミノ酸組成物を有する蛋白混合物である。

さらに別の望ましい骨誘導因子の実施例としては、米国特許第５，２９０，７６３号所載の精製工程のどれかによって得られた蛋白混合物である。
本発明の材料は、典型的にはコラーゲンと水と酸とを混合することにより誘導される。上述したように、本材料は、活性成分といった他の物質もまた含有することができる。本材料は、透析、照射（例えばガンマ放射線の使用）、濾過、化学的処理（例えばエチレンオキサイドを使用）または既知の殺菌方法により殺菌することができる。また、ゲルでもよい材料は、殺菌する前に乾燥固体に減圧凍結乾燥する。化学的処理により殺菌するに際にも、殺菌する前に組成物を減圧凍結乾燥して固体とするのが望ましい。減圧凍結乾燥では水を除去し、殺菌に使用される薬品（例えばエチレンオキサイド）と水との間で起こり得る如何なる化学的反応をも防止する。本発明の他の方法は、無菌環境下で本発明の材料を製造するにあり、それによって別の殺菌工程を必要としない。
本発明の材料は、また脱灰骨材を含むこともできる。微粒子状の脱灰骨材を製造する方法は、米国特許第４，４４０，７５０号（Glowacki et al.）に記載されている。別な脱灰骨材は、骨を摩粉し、0.6M（Mol）のHCl溶液により脱灰し、リン酸塩緩衝液（phosphate buffered solution）で洗浄し、エタノールで洗浄し、これを乾燥する。また、脱灰骨材は例えば「AlloSource（Denver, CO）」といった民間の骨組織バンクから入手することもできる。
本発明の材料は、本材料の成分を入れたキットの一部とすることもできる。このようなキットは、使用の直前に、本発明の材料や組成物を調合するヘルスケアの専門家にとって特に有用である。このようなキットは、本発明の種々の材料や組成物の成分を入れてあるのに加えて、オプションとしてステアラーのような混合器を付けて、成分原料混合用容器を入れておく。さらに、この種のキットは、予め計量され、シールされたパッケージでもって、成分原料を収納することができる。このシールされたパッケージは、無菌的にシールし、成分量は、このどこかで述べた割合であらかじめ計量しておくこともできる。
本発明の他の面としては、広く上記した材料及び組成物を体内に移植する方法を含む。上述したように、本発明の大部分の使用は、人体への適用に関する。この方法は、しかしながら、広く他の動物、特に哺乳類に適用できる。本発明で使用されているように「移植（implanting）」という用語は、本発明の材料及び組成物を活性成分の作用を発揮させたい部位に配置することを言う。本発明のこの実施例では、材料は、活性成分用担体（delivery vehicle）として機能する。このような移植方法は、外科的処置または、注射器の使用を含めて、既知の方法のどれかを使用し、本製品の注入を含むことができる。
骨形成組成物を含む本発明の製品に関しては、本材料または方法は、骨の形成が必要な場合は、どのような用途にも使用できる。このような用途としては、人工股関節置換術、人工膝関節置換術、脊椎固定術、歯根欠損部の修復、骨粗鬆症の治療、骨腫瘍による欠損部の修復、頭蓋顎顔面欠損部の修復、骨折の修復などにおける骨形成の誘導がある。
人工股関節置換術にあっては、人の股関節が適切に機能しない場合、股関節が置換される。大腿骨近位端の骨頭の部分を外科的に切除して球関節を置換する。人工骨頭の部分は、本来の骨頭の部分が切除された大腿骨近位端に挿入するスパイクとは反対側に機能的ボール端を有している。スパイクには、スパイクの周りの骨成長が大腿骨内でスパイクを固定できるようにポーラスコーティーングされた表面がある。本発明の材料は、スパイクと、スパイクが挿入される大腿骨の空隙との間にコーティーングしたり埋め込んだりされる。関節のソケット部分は、人工的ソケット部分を本来の臼蓋に挿入することにより置換される。
人工ソケット部分は人工骨頭にサイズが合うように設けられている。本来のソケット部分が接する人工ソケット部分の表面に、ポーラスコーティーングされた表面を設けることができる。本発明の材料は、人工ソケット部分を置換することにより、人工と本来の部分の間に材料があるように、本来のソケット部分の空隙内へ挿入される。この方法により、骨が形成され、人工ソケット部分が本来の臼蓋部分に固定される。
本発明の材料は、人工膝関節置換術における使用にも適している。人工膝関節には、大腿骨と、大腿骨の遠位端および外科的に設けられた脛骨端とへ挿入される脛骨コンポーネントとからそれぞれ構成されている。本発明の材料は、大腿骨および／または人工の脛骨コンポーネントとの間、および大腿骨と脛骨との間にコーティーングまたは埋め込む。この方法により、人工物と骨との間に骨を形成し、人工物が固定される。
本発明の材料は、実質的に二つの椎体を互いに固定する脊椎固定術における使用にも適している。この材料は、例えば、隣接した棘突起と横突起との間に、組成物に沿って骨が形成されることにより、この隣接した棘突起と横突起とがそれぞれ固定され、この固定により隣接した二つの椎体が連結されるように適用される。
本発明の材料は、メタルケージまたはそれに匹敵するインプラントを使用して、実質的に二つの椎体を互いに固定する脊椎固定術における使用にも適している。このような場合、ケージは二つの椎体の間の椎間板内で置換され、本発明の材料はこのケージ周りに詰め込まれ、ケージ内外に骨形成されることにより二つの椎体が固定して、脊椎が安定するようにする。
実施例
本実施例においては、他に述べる場合を除き、以下に示す一般的手順が使われる。
牛脱灰骨材は、牛の骨を約125μm〜約850μmの粒度になるまで磨砕して調製した。これは、0.6MのHCl溶液で脱灰し、リン酸塩緩衝溶液により洗浄し、さらにエタノールで漱ぎ乾燥した。
パテ状材料は、次の試験仕様を有する「TA-XT2 Texture Analyzer」を使用して試験した。
pre-test speed＝2.0mm/sec
test speed＝3.3mm/sec
post test speed＝10.0mm/s
distance＝30mm
trigger force＝3g
パテ状物質のｐＨは、Boston, Orion Co.（Boston, MA）.製のロス平面表面電極（Ross flat surface electrode）を用いて測定した。
実施例１
本実施例は、コラーゲンと脱灰骨材とを組み合わせて製造された材料の粘度に及ぼす酸の影響を示す。
各酸およびそのモル濃度をテストするにあたり、精製された牛腱Ｉ型コラーゲン100mgと7.4のmLの酸水溶液とを混合してゲルを調製した。ゲルは減圧凍結乾燥し、次いで水と約2.1gから約2.4gの脱灰骨材とに混合した。得られた組成物は、接着力、弾性、成形性といった特性マニュアル試験により、その物理的特性について定性的に評価した。各ゲルは、許容可能な物理的特性を有するものと、そうでないものに分けた。アスコルビン酸や安息香酸塩のごときいくつかの酸は、許容できる物理的特性を有する組成物の製造において有用な濃度範囲が広かったが、酢酸や乳酸のごとき他の酸では、パテ状の粘稠さをもつ組成物の製造に好適な量の範囲は狭かった。ゲルが最初から許容できる物理的特性を持つことが分かっている場合には、先にエチレンオキサイドにより殺菌処理してから再評価した。表２は、試験した組成物の定性的評価を要約したものである。

「N/R」は「記録せず」、「N/A」は「不適（テスト不能）」、「Y/N」は「許容すれすれ」
実施例２
本実施例は、組成物を減圧凍結乾燥する間の酸の消失量と、エチレンオキサイドによる殺菌の前後における得られた材料の物理的特性を示す。
水100mLでテストされた1M溶液の酸の500μLからなる対照溶液を、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。減圧凍結乾燥間における酸損失量を試験するために、試料は実施例１の手順を用いて調製した。但し、凍結後脱灰骨材は添加しなかった。得られた材料を（100mLにつき1gの減圧凍結乾燥された組成物となる比率で）水に溶かし、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。酢酸で作られた一つを除き、本材料は引き続きイソプロピルアルコール（2-propanol）で処理し、以下のとおり滴定した。コラーゲンと酸の混合物からなる減圧凍結乾燥試料は、イソプロピルアルコール中で細断し、再減圧凍結乾燥して、酸の大部分を取り除いた。すなわち、この酸は、処理後に試料を滴定した結果から明らかなように、2度目の減圧凍結乾燥により除かれている。アスコルビン酸、リンゴ酸、酢酸、乳酸およびグリコール酸で作られた材料の滴定結果の曲線は、第１図〜第５図においてそれぞれ示す。試料中の酸の消失量と酸の残存量は、表３に示す。

これらの結果は、アスコルビン酸、クエン酸、およびリンゴ酸は、比較的低い揮発性を示し、酢酸が最も揮発性が高かった。
実施例３
本実施例は、種々の酸を含有する移植材料の生物学的活性を示す。
100mgのコラーゲンと、所定のモル濃度の酸水溶液7.4mLと、米国特許第５，２９０，７６３号に記載された所定の量の骨成長蛋白（BGP）を混合してゲルを得た。ゲルは減圧凍結乾燥され、減圧凍結乾燥されたゲルのいくらかはエチレンオキサイドと接触させて殺菌した。約15mgの減圧凍結乾燥されたゲルは、1.14mLの水および173mgのラット脱灰骨材と混合した。得られた材料は、金型に入れて、直径7mm、厚さ2mmのディスクを12枚から15枚成形した。ディスクを冷凍し、夜通し減圧凍結乾燥し、ラットの皮下に移植した。28日後にラットを殺し、組織スライドは移植後の組織で作られた。マゼンダ（Acid fuchsin）およびSanderson’s Rapid Bone Stainまたはトルイジンブルー（toluidine blue）を使用して、移植後組織スライドを着色し、骨および軟骨形成の観察に供した。被験酸の型と濃度、BGPの添加量、ゲルのエチレンオキサイド曝露の有無は、表4に示した。

50mMおよび100mMの乳酸、並びに10mM、20mM、30mM、50mM及び100mMのアスコルビン酸により得られた材料は、良好で完全な小骨形成を示した。骨は、移植後組織全体にわたって認められた。全般的に骨の成熟した縁と、柔軟組織内にポケットがあった。50mMのリンゴ酸、50mMのグリコール酸、50mMのクエン酸および25mMの安息香酸で作られた材料の結果は、まばらな島から完全な小骨まで変化していた。50mMのアスコルビン酸によるものではBGP投与に対する骨誘導反応の感受性は、５０ｍＭのアスコルビン酸で評価した。結果は、BGP０μgでは骨形成が認められず、35μgにおいて、顕著な量の骨成長が起こっていた。この結果は、またエチレンオキサイド曝露後骨誘導反応が、酸のモル濃度とは逆相関して現れることを示している。３０ｍＭと５０ｍＭのアスコルビン酸をコラーゲンとＢＧＰの混合物に加えて、エチレンオキサイドに曝露しない場合、アスコルビン酸自体は別にエチレンオキサイドに曝露していても、良好な骨の形成が観察された。エチレンオキサイドへの曝露の如何に関わらず、10mMおよび20mMアスコルビン酸を使って作られたサンプルでは、良好な骨形成が認められた。
実施例４
本実施例は、脱灰骨基質の添加直前に、減圧凍結乾燥されたコラーゲン材に対する酸性緩衝液の添加効果を示す。
実施例１で述べたように、酸性溶液でコラーゲンを調製し、この材料を減圧凍結乾燥する代わりに、コラーゲン試料を希釈された揮発性酸（例えば酢酸）で調製し、減圧凍結乾燥した。この材料は、水でもどすと、再構成主観的には取扱い難い性質になるが、以下の実施例に述べるような方法を使って客観的にテストすることができなかった。同じ組成物でも水の代わりに酸性緩衝液を添加してもどすと、得られた材料はパテ状となり、主観的にも十分であるが、以下の実施例に述べる実験方法を用いて試験可能であった。20、30、50、および100mMのアスコルビン酸、50mMのクエン酸、50mMのリンゴ酸および50mMの乳酸を含めて、各種の酸性緩衝液は、減圧凍結乾燥されたコラーゲンをもどす酸性緩衝液として使用し、望ましい物理的特性を持つ材料をうることができる。
実施例５
本実施例は、材料の伸張長及びピーク対抗力（peak force）に対する異なった酸の効果を示す。
ゲルは、実施例4の手順を用いて調製及び減圧凍結乾燥された。減圧凍結乾燥ゲルは、使用まで冷凍保存した。
物理的特性テストするための試料は、減圧凍結乾燥されたゲルに6mLの水を付加することによって調製した。粒度約125μmから約850μmの牛脱灰骨材約1.75gを添加して、混合し、特記しないかぎり約5分間放置した。次いで、このパテを「SMS/Kieffer成形金型（TA-105a Texture Technologies）」に入れ、プレスした。これにより長さ53mm、高さ4mm、一辺の幅4mm、他辺の幅2.5mmの台形柱の試験片を作成した。表５は、種々の酸溶液を有するパテ状材料についてのピーク力とピーク力にいたる距離を示す。測定には、「TA-XT2 texture analyzer」を使用した。テスト速度（すなわち検知器の移動速度）は2.0mm／sec、引っ張り強度は5.0gであった。

理論的に拘束されるものではないが、50mMの酢酸試料の低い値は、減圧凍結乾燥プロセスの間に約85%が失われる、酢酸の揮発性に起因するものと考えられる。
実施例６
本実施例は、パテ状材料の物理的特性に及ぼす異なった酸濃度の影響を示す。
種々の濃度のアスコルビン酸およびクエン酸溶液を用いて試料を調製し、実施例５の手順にしたがってテストした。結果を表６に示す。一般的には、酸の濃度が増すと、パテ状材料の伸張長も長く。

実施例７
本実施例は、ｐＨに対する調製時間の影響並びにパテ状材料のピーク力までの距離とピーク力を示す。
50mMのアスコルビン酸、50mMのクエン酸酸、および100mMのクエン酸溶液を使った試料を調製し、実施例5の手順を用いテストした。パテ状材料の放置時間は2、5、10、および20分とした。結果を表7に示す。

放置時間を2、5、および10分のパテ状材料については、ピーク力までの距離は略同等であった。重要なのは、パテ状物質の組成物のｐＨが、表８に示すように放置時間によりわずかに変化したことである。

実施例８
本実施例は、パテ状材料の物理的特性に対し、エチレンオキサイド殺菌が及ぼす影響を示す。
20mMおよび50mMのアスコルビン酸、50mMおよび100mMのクエン酸溶液を使った試料は、実施例５の手順により調製、「MMC（Erie, PA）」によりエチレンオキサイドで殺菌した。ピーク力までの比較距離およびピーク力を表９に示す。

実施例９
本実施例は、ガンマ放射線に曝露して殺菌したために生じるパテ状材料の物理的特性の変化を示す。
20mM、50mMおよび100mMのアスコルビン酸溶液を使った試料を、実施例５の手順で調製し、「Sterigenics（Charlotte, NC）」により1.0Mradのガンマ放射線で照射した。ピーク力までの比較距離とピーク力を表１０に示す。

50mMまたは100mMのアスコルビン酸で調製された試料は、ガンマ放射線に曝露された後でもパテ状の風合いをとどめていた。
当該技術分野の通常の知識を有する者であれば、多くの変更や修正が本発明の望ましい態様に対して加えられ、かかる変更や修正が本発明の精神から外れることなしには、なされ得ないことを了解するだろう。したがって、添付された請求項は、本発明の真の精神と範囲にあるようなすべてのこのような均等な変更を包含するつもりである。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an implantable putty material for providing an active compound to a patient.
Conventional technology
Various implant materials have been used to provide active substances to patients. For example, this type of material can also be used for bone repair. Typically, these materials are implanted at the desired site to promote bone growth. Ideally, this type of material should adhere to and adapt to the implant site and promote bone growth.
U.S. Pat. Nos. 5,314,476 and 5,073,373 disclose deformable form-retaining osteogenic compositions comprising decalcified bone particles and polyhydroxy compounds such as glycerin, or oligosaccharides. ing.
US Pat. Nos. 5,405,390 and 5,236,456 show surface-adhesive osteogenic compositions derived from bone tissue that have been modified by decalcification and heat. The composition can be administered in powder, viscous liquid form, or by direct injection.
US Pat. No. 5,246,457 shows a bone repair composition containing calcium phosphate salt and reconstituted fibrillar atelopeptide collagen. This compound does not contain any biologically active ingredients. Physical and handling properties have been improved by a number of hardening processes, including heat, saturation of the wet mixture, and special crosslinking of the collagen.
U.S. Pat. No. 4,440,750 discloses an osteogenic composition comprising demineralized bone meal and natural atelopeptide collagen fibers. The collagen fibers are reconstituted with a continuous aqueous phase having substantially physiological pH and ionic strength.
U.S. Pat. No. 4,975,526 shows a matrix material containing protein extracted demineralized bone meal and a swelling agent that increases interparticle voids in the matrix.
U.S. Pat. No. 4,394,370 shows a bone graft material for treating bone defects. This material contains collagen and demineralized bone particles and is sponge-like.
Including the above, currently known implantable materials are unacceptable in terms of tissue properties such as adhesion, elasticity, and moldability to a desired shape. Further, other pasty materials, such as those disclosed in US Pat. Nos. 5,314,476 and 5,073,373, require an organic solvent such as glycerin as described above.
Accordingly, there is a need for osteoinductive materials that have improved handling properties and do not require organic solvents.
Means for solving the problem
One embodiment of the present invention is a putty-like material containing collagen and water, the putty-like material having a pH of about 3.0 to about 6.0. The material of the present invention has excellent physical properties and handling characteristics. The putty-like material collagen can be selected from the group consisting of fibrillar collagen, atelopeptide collagen, telopeptide collagen, and tropocollagen. This putty-like material can be formed by adding acid. Acids include ascorbic acid, acetic acid, acetyl salicylic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid, glycolic acid ), Lactic acid, malic acid, salicylic acid, and hydrochloric acid. The putty-like material can also contain an active ingredient. The active ingredient is selected, for example, from the group consisting of osteoinductive substances, growth factors, cartilage inducing factors, angiogenic factors, hormones, antibiotics, and antiviral compounds.
Another embodiment of the invention is an osteogenic composition comprising collagen, osteoinductive material, and acid. The osteogenic composition contains from about 0.05 mmol to about 2.3 mmol acid per 100 mg collagen.
In addition, another embodiment of the present invention resides in an osteogenic composition comprising bovine tendon type I collagen, ascorbic acid, water, bone growth protein, and demineralized aggregate.
Furthermore, in another embodiment of the present invention, collagen, acid and water are mixed to obtain a gel, demineralized aggregate is added to the gel to obtain a bone formation putty, and the pH value of the bone formation putty is about 6.0 or less. It is in the composition manufactured by the method including the process which is.
In another embodiment of the present invention, a method for producing a dry osteoinductive composition comprising a step of mixing collagen, an acid, an osteoinductive substance, and water to form a gel and freeze-drying the gel under reduced pressure. It is in.
Another embodiment of the invention resides in a method for administering an active compound to a patient, the method comprising administering a collagen and an acid to obtain a composition having a pH value of about 3.0 to about 6.0. The method includes the steps of preparing a carrier, placing the active substance in the carrier, and implanting the carrier at a desired site in the patient's body.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the volatility of ascorbic acid from the transplanted material in the vacuum freeze-drying process.
FIG. 2 shows the volatility of malic acid from the transplant material in the vacuum freeze-drying process.
FIG. 3 shows the volatility of acetic acid from the implant material during the vacuum freeze-drying process.
FIG. 4 shows the volatility of lactic acid from the transplant material in the vacuum freeze-drying process.
FIG. 5 shows the volatility of glycolic acid from the graft material in the vacuum freeze-drying process.
Detailed Description of the Invention
The present invention relates to a material composition containing collagen and water. The material of the present invention is a putty-like viscous material and can be formed into a desired shape. The invention also relates to a method of implanting this material in the body to stimulate and cause a biological response or activity, such as inducing bone formation. In particular, the material of the present invention is suitable for implantation into a person or animal with a bone defect and is intended to induce the regeneration of bone tissue so that the defect is treated.
The collagen component of the present invention is preferably fibrillar collagen, atelopeptide collagen, telopeptide collagen, or tropocollagen, and can be collected from various mammals. Methods for making atelopeptide collagen and tropocollagen are described in US Pat. No. 4,440,750 (Glowacki et al), the entire text of which is inserted here. This collagen is preferably mammalian collagen. The collagen is more preferably selected from the group consisting of bovine type I collagen and porcine type I collagen. Most preferred is purified fibrillar bovine tendon type I collagen. The desired amount of collagen in the material or composition of the present invention is from about 1% to about 10% by weight (with no added water), more preferably from about 2% to about 8% by weight, Most desirable is from about 3% to about 5% by weight.
The materials and compositions of the present invention have a pH of about 3 to about 6, desirably between about 3.5 and about 5, and most desirably about 3.8 to about 4.6. The pH of the material is measured using a “Ross flat surface electrode” from “Orion Co. (Boston, Mass.)” With a flat pH electrode on the material surface. If the pH value of the material is within the above value, it can be seen that the material has excellent material properties such as elasticity and kneaded dough-like putty-like consistency. At high pH, the material becomes brittle like wet sand. Putty-like viscosity is desirable because it has many advantages such as high adhesion, ease of handling, and ease of molding. Also, since the material of the present invention is adhesive, it is believed to provide the advantage of holding the active compound longer at the site of implantation compared to materials with poor adhesion.
The desired pH value of the material of the present invention is achieved by adding acid to the collagen to form the material. As used herein, the term “acid” refers to a compound having a lower pKa value than water, and the term “acidic proton” means a proton whose pKa value is lower than water. Suitable acids for use in the present invention include organic acids such as phenols and carboxylic acids, and inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid. The acid is preferably an organic acid, hydrochloric acid or phosphoric acid. Acetic acid, ascorbic acid, aspartic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid ( From glutamic acid, glycolic acid, hydrochloric acid, lactic acid, malic acid, phosphoric acid, salicylic acid, and tartaric acid Selected from the group consisting of Further desirable acids are selected from the group consisting of ascorbic acid (ie vitamin C), acetic acid, acetylsalicylic acid, benzoate, citric acid, glutamic acid, glycolic acid, lactic acid, malic acid, salicylic acid, and hydrochloric acid. The most desirable acid is selected from the group consisting of ascorbic acid, citric acid, malic acid, and lactic acid.
The acid should be added in an appropriate amount to produce a material with the desired physical properties. A preferred amount of acid present in the material is from about 0.05 millimolar equivalents (hereinafter referred to as “eq. Mmol”) to about 2.30 eq. Mmol per 100 mg collagen, more preferably from about 0.1 eq. 1.5 eq. Mmol, most desirably from about 0.2 eq. Mmol to about 1.5 eq. Mmol per 100 mg of collagen. As used herein, the term “mmol equivalent” refers to the amount of acid in mmol divided by the number of acidic protons in the acid molecule. For example, some acids such as malic acid have two equivalent acidic protons per molecule. Therefore, the preferred amount of malic acid with two acidic protons per molecule and other acids is half that of an acid with one acidic proton per molecule. For example, malic acid has two acidic protons whereas acetic acid has only one acidic proton, so 5 mmol malic acid and 10 mmol acetic acid are both 10 eq. Mmol acid. It can be expressed as.
Another way of determining the amount of acid present in the material is the amount of acid per 100 mg of collagen collagen. Thus, for example, in material compositions containing ascorbic acid, it is desirable to add from about 20 mg to about 200 mg ascorbic acid, more preferably from about 26 mg per about 100 mg collagen to about 100 mg collagen. Up to about 131 mg ascorbic acid, most preferred from about 65 mg to about 131 mg ascorbic acid per about 100 mg collagen. It should be taken into account that the amount of acid depends on its molecular weight. When the material is lyophilized under reduced pressure, the acid evaporates during lyophilization and affects the pH and material consistency as the dried solid is reconstituted with water. For example, materials containing ascorbic acid or malic acid are particularly suitable for lyophilization under reduced pressure because of the low volatility of these acids during processing. The amount of acid volatilization during the vacuum freeze-drying step is desirably about 30% or less, more desirably about 15% or less, and most desirably about 5% or less.
As described above, the materials and compositions of the present invention have excellent physical properties such as adhesion and shape retention after transplantation. One measure of such physical properties is that the materials and compositions of the present invention have a peak resistance of at least about 10 grams (g), desirably at least about 20 grams, and more desirably at least about 30 grams. “Peak resistance” (peak force) as used here is the material when the TA.XT2 Texture Analyzer device manufactured by Texture Technologies Corp. (Scarsdale, New York) or an equivalent device is used and pulled to the breaking point. Say the maximum of the force given by. Specimens are manufactured in a trapezoidal column shape with a length of 53mm, height of 4mm, width of 4mm on one side, and width of 2.5mm on the other side using "SMS / Kieffer molding form and press (TA-105a Texture Technologies)" or equivalent equipment. To do.
Another measure of this type of physical property is that the materials and compositions of the present invention preferably have an extension length of about 2 mm to about 25 mm, more preferably about 3 mm to about 25 mm, and most preferably about 5 mm to about 25 mm. Is to have. As used herein, “extensibility” refers to the distance traveled by the probe pulling the material until it breaks using the same equipment and the same specimen size as the peak resistance test.
The material of the present invention can also contain an effective amount of the active ingredient. “Active ingredient” means any compound or mixture of compounds having biological activity. Exemplary active ingredients include osteoinductive substances, growth factors, hormones, antibiotics, and antiviral compounds. Details of the osteoinductive substance will be described later. Examples of growth factors include fibroblast growth factor (“bFGF”) and transforming growth factor beta (“TGF-beta”) (“Cuevas et al ., Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Promotes Cartilage Repair In Vivo, Biochem Biophys Res Commun 156: 611-618, 1988 ”). These growth factors are also referred to as cartilage stimuli and angiogenic agents. For example, bFGF is known to promote the regeneration rate of osteoblasts, but at the same time suppress their activity. ("Frenkel S, Singh IJ; The effects of fibroblast growth factor on osteogenesis in the chick embryo.In: Fundamentals of bone growth: Methodology and applications.Ed. AD Dixon, BG Sarnat, D. Hoyte, CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 245-259, 1990 ") This effect is dose-dependent, with too little or too little dose reducing activity, and its midrange stimulates activity (" Aspenberg P, Thorngren KG, Lohmander LS; Dose-dependent stimulation of bone induction by basic fibroblast growth factor in rats. Acta Orthop Scand 62: 481-484, 1991 '')
The term “effective amount” refers to the amount of active ingredient sufficient to exert a desired action without causing undesirable side effects. In some cases it may also be necessary to balance obtaining the desired action and reducing the intensity of the undesirable action. It should also be recognized that the amount of active ingredient used will vary depending on the type of active ingredient and the intended use of the composition of the present invention. When the material of the present invention includes an osteogenic material, the amount of osteoinductive material is desirably from about 0.1 wt% to about 10 wt%, more preferably from the total weight of the putty-like material composition. From about 0.25% to about 4% by weight, most preferably from about 0.35% to about 1.6% by weight.
As used herein, the term “bone-inducing substance” means any substance that can induce bone formation when transplanted into the body (ie, a substance having osteogenic properties). Contains osteoinductive factors. “Osteogenic factor” refers to a natural protein that can induce bone formation, a (gene) recombinant or synthetic protein, and a protein mixture. For example, the term osteoinductive factor refers to a substance described as a bone growth factor in US Pat. No. 5,563,124 (“Damien et al.”). It should be noted that the most intended use of the present invention relates to use on the human body, as well as the products and methods of the present invention also work on animals. Induction of bone formation can be measured by histological evaluation showing the formation of new bone with osteoblasts, osteoclasts and osteoid matrix. For example, the osteoinductive ability of the osteoinductive factor can be demonstrated by a test using a substrate on which the substance to be tested is deposited. The substance deposition substrate is implanted subcutaneously in experimental animals. The graft is then removed and examined for the presence or absence of bone formation, including the presence of osteoblasts, osteoclasts and osteoid matrix. This preferred procedure is described in Example 5 of US Pat. No. 5,290,763.
Although there are no generally accepted criteria for assessing the degree of osteogenic ability, certain factors are widely known as indicative of osteogenesis. Such factors include scale 0-8 shown in Table 3 of Example 1 of US Pat. No. 5,563,124. The 0-4 portion of this scale is consistent with the scoring system described in US Pat. No. 5,290,763, but is limited to a score of 0-4. The rest of the scale, scores 5-8, indicate an additional level of bone formation maturity. The expanded scale is not described in US Pat. No. 5,290,763, but also includes factors that allow for resorption of collagen.
The preferred osteoinductive factor of the present invention can be produced by purifying a protein naturally produced from bone or by recombination of DNA. As used herein, the term “recombinantly produced osteoinductive factors” refers to the production of osteoinductive factors used in DNA recombination techniques. For example, a nucleic acid encoding a protein having bone forming ability can be identified by binding to the protein and generating an antibody. This antibody can be used to fractionate a specific population of generated bone morphogenetic proteins using affinity chromatography. The amino acid sequence can be identified by sequencing the purified protein. DNA oligonucleotides can be synthesized from known amino acid chains. Oligonucleotides can be used to screen either genomic DNA and / or cDNA libraries made from bovine DNA, for example, to identify nucleic acids encoding bone morphogenetic proteins. Legitimate oligonucleotides hybridize to the appropriate cDNA, thereby identifying the cDNA encoding the bone morphogenetic protein encoding gene.
Antibodies bound to bone morphogenetic proteins can also be used directly to screen cDNA expression libraries. For example, a eukaryotic cDNA chain encoding a bone morphogenetic protein can be incorporated into a bacterial expression vector. The expression vector can be transformed into bacteria such as “E. coli” and expresses the converted expression vector to produce bone morphogenetic protein. The transformed bacteria can be screened for expressing bone morphogenetic proteins by lysing the bacteria and contacting the bacteria with a radiolabeled antibody.
The recombinant osteoinductive factor can be produced by introducing the gene identified by the above-described method into a cell using various methods for introducing a nucleic acid into the cell. After the introduction, the cell produces a recombinant osteoinductive factor by expressing the introduced nucleic acid. The resulting osteoinductive factor can be recovered from the cells.
Proteins that are naturally produced from many bones or recombinant osteoinductive factors have been described in the literature and are also suitable for the present invention. Osteoinductive factors made by recombinant techniques have been produced in various places. “Creative Biomolecules of Hopkinton (Massachusetts, USA)” produces an osteoinductive factor called “Osteogenic Protein 1” or “OP1”. The “Genetics Institute of Cambridge (Massachusetts, USA)” produces a series of osteoinductors called “Bone Morphogenetic Proteins Osteogenic Factor 1-13 (ie, BMP 1-13), some of which are U.S. Pat. Nos. 5,106,748, 5,658,882 or PCT International Publication WO 96/39170. Purified osteoinductive factors have also been developed by various companies. “Collagen Corporation of Palo Alto (California, USA)” developed a purified protein mixture believed to have osteogenic potential, US Pat. Nos. 4,774,228, 4,774,322, and 4,810. 691, and 4,843,063. “Marshall Urist of the University of California” has developed a purified protein mixture believed to be capable of osteogenesis, which is disclosed in US Pat. Nos. 4,455,256, 4,619,989, 4,761, No. 471, No. 4,795,804. “International Genetic Engineering (Inc. of Santa Monica, California, USA)” developed a purified protein mixture believed to be capable of osteogenesis and is described in US Pat. No. 4,804,744. All the above patents are listed here for reference.
The preferred osteoinductive factor of the present invention and its method of preparation are described in detail in related US Pat. No. 5,290,763. This osteoinductive factor is particularly desirable because it has a high osteogenic ability and is a purified osteoinductive factor. The osteoinductive factor of US Pat. No. 5,290,763 exhibits osteoinductive activity in about 3 micrograms when deposited on a suitable carrier and implanted subcutaneously in rats. In one embodiment, the osteoinductive factor is an osteoinductive active mixture of proteins having the gel separation profile shown in FIG. 1 of US Pat. No. 5,563,124. This gel separation profile was obtained using SDS-PAGE. The first column is a molecular weight scale obtained by performing SDS-PAGE on a known standard value of molecular weight. The second column shows the SDS-PAGE profile for the protein mixture according to the invention diluted with 2-mercaptoethanol. The third column shows the SDS-PAGE profile for the undiluted protein mixture in the present invention. Protein mixtures with the SDS-PAGE profile shown here are known to have high osteoinductive activity, but protein mixtures with a slightly different SDS-PAGE profile from those shown are also effective It is predicted. For example, an effective protein mixture can include proteins with different molecular weights from those shown here to plus or minus 5 KD, and can contain more or less proteins than those shown. Accordingly, protein mixtures having profiles that substantially include all protein bands detected in the diluted or undiluted SDS-PAGE profiles therein are also considered to be within the scope of the present invention.
Also, another embodiment of the preferred osteoinductive factor of the present invention is that when hydrolyzed, about 20.7 to about 26.1 mol% acidic amino acids, about 11.3. About 15.7 mol% hydroxy amino acids. ), About 37.6 to about 42.4 mol% aliphatic amino acids, about 5.8 to about 7.9 mol% aromatic amino acids, and about 13.3 to about 19.9 mol% basic amino acids. acids) containing osteoinductive active protein mixture. More particularly, preferred osteoinductive factors are about 20.7 to about 26.1 (desirably about 23.4) mol% ASP (+ ASN) and GLU (+ GLN); about 11.3 to about 15.7 (desirably about 13.5) mol% SER. About 37.6 to about 42.4 (desirably about 40.0) mol% ALA, GLY, PRO, VAL, MET, ILE, and LEU; about 5.8 to about 7.9 (desirably about 6.8) mol% TYR and PHE; And about 13.3 to about 19.9 (desirably about 16.6) mol% of HIS, ARG and LYS amino acid compositions. A further example of a desirable osteoinductive factor is a protein mixture having an amino acid composition close to that shown in Table 1.

Yet another example of a desirable osteoinductive factor is a protein mixture obtained by any of the purification steps described in US Pat. No. 5,290,763.
The material of the present invention is typically derived by mixing collagen, water and acid. As mentioned above, the material can also contain other substances such as active ingredients. The material can be sterilized by dialysis, irradiation (eg using gamma radiation), filtration, chemical treatment (eg using ethylene oxide) or known sterilization methods. Also, the material that may be a gel is lyophilized to a dry solid under reduced pressure before sterilization. Also when sterilizing by chemical treatment, it is desirable to freeze-dry the composition into a solid before sterilization. Vacuum freeze drying removes water and prevents any chemical reaction that may occur between the chemicals used for sterilization (eg, ethylene oxide) and water. Another method of the present invention is to produce the material of the present invention in an aseptic environment, thereby eliminating the need for a separate sterilization step.
The material of the present invention can also include demineralized aggregate. A method for producing particulate demineralized aggregate is described in US Pat. No. 4,440,750 (Glowacki et al.). Another demineralized aggregate is to grind the bone, decalcify with 0.6M (Mol) HCl solution, wash with phosphate buffered solution, wash with ethanol and dry it . Demineralized aggregate can also be obtained from private bone tissue banks such as “AlloSource (Denver, CO)”.
The material of the present invention can also be part of a kit containing the components of the material. Such kits are particularly useful for health care professionals who formulate the materials and compositions of the present invention just prior to use. In such a kit, in addition to the ingredients of the various materials and compositions of the present invention, a mixer such as a steerer is optionally attached, and a component raw material mixing container is placed. In addition, this type of kit can contain the ingredient ingredients in a pre-weighed and sealed package. The sealed package can be sealed aseptically and the amount of ingredients can be pre-weighed at the rate stated elsewhere.
Other aspects of the invention include methods of implanting the materials and compositions broadly described above into the body. As mentioned above, most uses of the present invention relate to application to the human body. This method, however, is widely applicable to other animals, particularly mammals. As used in the present invention, the term “implanting” refers to placing the materials and compositions of the present invention at the site where the action of the active ingredient is desired. In this embodiment of the invention, the material functions as a delivery vehicle for the active ingredient. Such implantation methods can include injection of the product using any of the known methods, including surgical procedures or the use of syringes.
With respect to the products of the invention comprising an osteogenic composition, the material or method can be used for any application where bone formation is required. Such applications include hip replacement, knee replacement, spinal fusion, root defect repair, osteoporosis treatment, bone tumor repair, craniomaxillofacial defect repair, fracture repair There is induction of bone formation in repair and the like.
In artificial hip joint replacement, when a person's hip joint does not function properly, the hip joint is replaced. Surgically remove the head of the femur proximal end to replace the ball joint. The prosthetic head portion has a functional ball end opposite the spike that is inserted into the proximal femur where the original femoral head portion was excised. The spike has a surface that is porous coated so that bone growth around the spike can fix the spike within the femur. The material of the present invention is coated or embedded between the spike and the femoral space into which the spike is inserted. The socket part of the joint is replaced by inserting the artificial socket part into the original acetabulum.
The artificial socket portion is provided to fit the size of the artificial bone head. A porous coated surface can be provided on the surface of the artificial socket portion with which the original socket portion contacts. The material of the present invention is inserted into the gap in the original socket portion so that there is material between the artificial and original portion by replacing the artificial socket portion. By this method, bone is formed and the artificial socket part is fixed to the original acetabular part.
The material of the present invention is also suitable for use in knee replacement. Each knee prosthesis is composed of a femur and a tibial component that is inserted into the distal end of the femur and a surgically provided tibial end. The material of the present invention is coated or implanted between the femur and / or artificial tibial component and between the femur and the tibia. By this method, a bone is formed between the artificial object and the bone, and the artificial object is fixed.
The materials of the present invention are also suitable for use in spinal fusion procedures that substantially fix two vertebral bodies together. In this material, for example, a bone is formed along the composition between the adjacent spinous process and the transverse process, so that the adjacent spinous process and the transverse process are fixed, respectively. It is applied so that the two vertebral bodies are connected.
The material of the present invention is also suitable for use in spinal fusion where a metal cage or comparable implant is used to substantially fix two vertebral bodies together. In such a case, the cage is replaced in the intervertebral disc between the two vertebral bodies, the material of the present invention is packed around the cage, and the two vertebral bodies are fixed by bone formation inside and outside the cage, Allow the spine to stabilize.
Example
In this embodiment, the general procedure shown below is used, unless otherwise stated.
Bovine demineralized aggregate was prepared by grinding bovine bone to a particle size of about 125 μm to about 850 μm. This was decalcified with 0.6 M HCl solution, washed with phosphate buffer solution, and further rinsed with ethanol and dried.
The putty-like material was tested using a “TA-XT2 Texture Analyzer” having the following test specifications.
pre-test speed = 2.0mm / sec
test speed = 3.3mm / sec
post test speed = 10.0mm / s
distance = 30mm
trigger force = 3g
The pH of the putty material was measured using a Ross flat surface electrode manufactured by Boston, Orion Co. (Boston, MA).
Example 1
This example shows the effect of acid on the viscosity of materials produced by combining collagen and demineralized aggregate.
In testing each acid and its molar concentration, a gel was prepared by mixing 100 mg of purified bovine tendon type I collagen with 7.4 mL of an aqueous acid solution. The gel was lyophilized under reduced pressure and then mixed with water and about 2.1 g to about 2.4 g of demineralized aggregate. The obtained composition was qualitatively evaluated for its physical characteristics by a characteristic manual test such as adhesive strength, elasticity and moldability. Each gel was divided into those with acceptable physical properties and those that were not. Some acids, such as ascorbic acid and benzoate, have a broad concentration range useful in making compositions with acceptable physical properties, while other acids, such as acetic acid and lactic acid, have a putty-like consistency. The range of amounts suitable for the production of a thick composition was narrow. If the gel was known to have acceptable physical properties from the beginning, it was first sterilized with ethylene oxide and re-evaluated. Table 2 summarizes the qualitative evaluation of the compositions tested.

“N / R” is “not recorded”, “N / A” is “inappropriate (untestable)”, “Y / N” is “allowable”
Example 2
This example shows the amount of acid lost during lyophilization of the composition and the physical properties of the resulting material before and after sterilization with ethylene oxide.
A control solution consisting of 500 μL of 1 M acid acid tested with 100 mL water was titrated with 1 N sodium hydroxide solution. Samples were prepared using the procedure of Example 1 to test the amount of acid loss during vacuum lyophilization. However, no decalcified aggregate was added after freezing. The resulting material was dissolved in water (at a rate of 1 g of vacuum lyophilized composition per 100 mL) and titrated with 1N sodium hydroxide solution. Except for one made with acetic acid, the material was subsequently treated with 2-propanol and titrated as follows. A vacuum lyophilized sample consisting of a mixture of collagen and acid was chopped in isopropyl alcohol and lyophilized again under reduced pressure to remove most of the acid. That is, this acid is removed by second freeze-drying as is apparent from the result of titration of the sample after the treatment. Curves of titration results for materials made with ascorbic acid, malic acid, acetic acid, lactic acid and glycolic acid are shown in FIGS. 1-5, respectively. Table 3 shows the amount of acid lost and the amount of acid remaining in the sample.

These results indicated that ascorbic acid, citric acid, and malic acid showed relatively low volatility, with acetic acid being the most volatile.
Example 3
This example demonstrates the biological activity of implants containing various acids.
A gel was obtained by mixing 100 mg of collagen, 7.4 mL of a predetermined molar acid aqueous solution, and a predetermined amount of bone growth protein (BGP) described in US Pat. No. 5,290,763. The gel was lyophilized under reduced pressure, and some of the lyophilized gel was sterilized by contacting with ethylene oxide. Approximately 15 mg of vacuum lyophilized gel was mixed with 1.14 mL of water and 173 mg of rat demineralized aggregate. The obtained material was put in a mold and 12 to 15 disks having a diameter of 7 mm and a thickness of 2 mm were formed. The discs were frozen and lyophilized under reduced pressure overnight and implanted subcutaneously in rats. Rats were killed after 28 days and tissue slides were made of the transplanted tissue. Post-transplant tissue slides were colored using Magenta (Acid fuchsin) and Sanderson's Rapid Bone Stain or toluidine blue and subjected to observation of bone and cartilage formation. Table 4 shows the type and concentration of the test acid, the amount of BGP added, and whether or not the gel was exposed to ethylene oxide.

Materials obtained with 50 mM and 100 mM lactic acid and 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM and 100 mM ascorbic acid showed good and complete ossification. Bone was found throughout the tissue after transplantation. There were generally mature bone edges and pockets in soft tissue. Results for materials made with 50 mM malic acid, 50 mM glycolic acid, 50 mM citric acid and 25 mM benzoic acid varied from sparse islets to complete ossicles. In the case of 50 mM ascorbic acid, the sensitivity of the osteoinductive response to BGP administration was evaluated with 50 mM ascorbic acid. As a result, no bone formation was observed at 0 μg BGP, and a significant amount of bone growth occurred at 35 μg. This result also shows that the osteoinductive response after exposure to ethylene oxide appears inversely related to the molar concentration of acid. When 30 mM and 50 mM ascorbic acid was added to the collagen and BGP mixture and not exposed to ethylene oxide, good bone formation was observed even though ascorbic acid itself was exposed to ethylene oxide separately. Regardless of the exposure to ethylene oxide, good bone formation was observed in samples made with 10 mM and 20 mM ascorbic acid.
Example 4
This example shows the effect of adding an acidic buffer to a collagen material freeze-dried under reduced pressure immediately before the addition of demineralized bone matrix.
As described in Example 1, instead of preparing collagen with an acidic solution and lyophilizing the material under reduced pressure, a collagen sample was prepared with diluted volatile acid (eg, acetic acid) and lyophilized under reduced pressure. This material, when reconstituted with water, becomes difficult to handle subjectively by reconstruction, but could not be objectively tested using the method described in the following examples. Even if the same composition is added with an acidic buffer instead of water, the resulting material will be putty-like and subjectively sufficient, but it can be tested using the experimental methods described in the following examples. there were. Various acidic buffers, including 20, 30, 50, and 100 mM ascorbic acid, 50 mM citric acid, 50 mM malic acid, and 50 mM lactic acid, are used as acidic buffers to restore the lyophilized collagen under reduced pressure. A material with desirable physical properties can be obtained.
Example 5
This example shows the effect of different acids on the stretch length and peak force of the material.
The gel was prepared and lyophilized under reduced pressure using the procedure of Example 4. The vacuum lyophilized gel was stored frozen until use.
Samples for physical property testing were prepared by adding 6 mL of water to a vacuum lyophilized gel. About 1.75 g of beef demineralized aggregate with a particle size of about 125 μm to about 850 μm was added, mixed, and left for about 5 minutes unless otherwise specified. Next, this putty was placed in an “SMS / Kieffer Mold (TA-105a Texture Technologies)” and pressed. Thus, a trapezoidal column test piece having a length of 53 mm, a height of 4 mm, a width of 4 mm on one side, and a width of 2.5 mm on the other side was prepared. Table 5 shows the peak force and the distance to peak force for putty-like materials with various acid solutions. For the measurement, a “TA-XT2 texture analyzer” was used. The test speed (that is, the moving speed of the detector) was 2.0 mm / sec, and the tensile strength was 5.0 g.

Without being bound by theory, the low value of the 50 mM acetic acid sample is believed to be due to the volatility of acetic acid, with approximately 85% being lost during the vacuum lyophilization process.
Example 6
This example shows the effect of different acid concentrations on the physical properties of putty-like materials.
Samples were prepared using various concentrations of ascorbic acid and citric acid solutions and tested according to the procedure of Example 5. The results are shown in Table 6. In general, as the acid concentration increases, the stretch length of the putty-like material increases.

Example 7
This example shows the effect of preparation time on pH as well as the distance to peak force and peak force of putty-like materials.
Samples were prepared using 50 mM ascorbic acid, 50 mM citric acid, and 100 mM citric acid solution and tested using the procedure of Example 5. The leave time of the putty-like material was 2, 5, 10, and 20 minutes. The results are shown in Table 7.

For putty-like materials with a standing time of 2, 5, and 10 minutes, the distance to the peak force was approximately the same. What is important is that the pH of the composition of the putty-like substance slightly changed with the standing time as shown in Table 8.

Example 8
This example demonstrates the effect of ethylene oxide sterilization on the physical properties of putty-like materials.
Samples using 20 mM and 50 mM ascorbic acid, 50 mM and 100 mM citric acid solutions were prepared by the procedure of Example 5 and sterilized with ethylene oxide by “MMC (Erie, PA)”. Table 9 shows the comparative distance to the peak force and the peak force.

Example 9
This example shows the change in physical properties of the putty-like material resulting from sterilization by exposure to gamma radiation.
Samples using 20 mM, 50 mM and 100 mM ascorbic acid solutions were prepared by the procedure of Example 5 and irradiated with 1.0 Mrad of gamma radiation by “Sterigenics (Charlotte, NC)”. Table 10 shows the comparative distance to the peak force and the peak force.

Samples prepared with 50 mM or 100 mM ascorbic acid remained putty-like after exposure to gamma radiation.
Those skilled in the art will appreciate that many changes and modifications can be made to the preferred embodiments of the invention without departing from the spirit of the invention. I will understand that. Accordingly, the appended claims are intended to cover all such equivalent modifications as fall within the true spirit and scope of this invention.

Claims

コラーゲン（collagen）、脱灰骨材（a demineralized bone material）、酸および水を含むパテ状材料であって、該パテ状材料のｐＨが3.0〜6.0であり、該酸は、該コラーゲン100mgあたり0.05mmol〜2.3mmol含有され、該コラーゲンが、該パテ状材料の水を含めない重量の１重量％〜１０重量％であることを特徴とするパテ状材料。A putty-like material comprising collagen, a demineralized bone material , acid and water, wherein the pH of the putty-like material is 3.0-6.0, and the acid is 0.05 per 100 mg of the collagen A putty-like material comprising mmol to 2.3 mmol, wherein the collagen is 1 wt% to 10 wt% of the weight of the putty-like material not including water.

コラーゲンと、骨誘導物質と、酸とを含み、さらに水を含有させてｐHが3.0〜6.0のパテ状材料とするための骨形成組成物であって、該酸を該コラーゲン１００mgあたり0.05mmol〜2.3mmol含有することを特徴とする骨形成組成物。 See containing collagen, and bone-inducing substance, an acid, further contain a water an osteogenic composition for the pH to putty materials 3.0 to 6.0, 0.05 mmol per the collagen 100mg of acid An osteogenic composition containing ˜2.3 mmol.

コラーゲンと、酸と、活性成分と、脱灰骨材（demineralized bone material）と、水とを混合してパテ状材料を形成する工程を有し、該酸を、該コラーゲン100mgあたり0.05mmol〜2.3mmol添加し、該パテ状材料のｐＨが3.0〜6.0の間であることを特徴とするパテ状材料の製造方法。Collagen, acid, active ingredient, demineralized bone material and water are mixed to form a putty-like material, and the acid is added in an amount of 0.05 mmol to 2.3 per 100 mg of collagen. mmol was added, the production method of the putty-like material, wherein the pH of the putty-like material is between 3.0 to 6.0.

該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１のパテ状材料。The putty according to claim 1, wherein the collagen is selected from the group consisting of fibrillar collagen, atelopeptide collagen, telopeptide collagen, and tropocollagen. Material.

該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。The bone according to claim 2, wherein the collagen is selected from the group consisting of fibrillar collagen, atelopeptide collagen, telopeptide collagen, and tropocollagen. Forming composition .

該コラーゲンが、原線維コラーゲン（fibrillar collagen）、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）およびトロポコラーゲン（tropocollagen）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。 The putty according to claim 3, wherein the collagen is selected from the group consisting of fibrillar collagen, atelopeptide collagen, telopeptide collagen, and tropocollagen. A method for producing a material .

該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。Putty-like material according to claim 1, characterized in that the collagen is bovine type I collagen (bovine Type I collagen).

該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。Osteogenic composition according to claim 2, characterized in that the collagen is bovine type I collagen (bovine Type I collagen).

該コラーゲンが牛I型コラーゲン（bovine Type I collagen）であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。 Method for producing a putty-like material according to claim 3, characterized in that the collagen is bovine type I collagen (bovine Type I collagen).

該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１のパテ状材料。The acid is ascorbic acid, acetic acid, acetyl salicylic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid, glycolic acid ), Lactic acid, malic acid, salicylic acid, and hydrochloric acid, the putty-like material of claim 1 .

該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。The acid is ascorbic acid, acetic acid, acetyl salicylic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid, glycolic acid ), lactic acid (lactic acid), malic acid (malic acid), salicylic acid (salicylic acid) and hydrochloric acid (hYDROCHLORIC acid) osteogenic composition according to claim 2, characterized in that it is selected from the group consisting of.

該酸が、アスコルビン酸（ascorbic acid）、酢酸（acetic acid）、アセチルサリチル酸（acetyl salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、クエン酸（citric acid）、グルタミン酸（glutamic acid）、グリコール酸（glycolic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）、サリチル酸（salicylic acid）および塩酸（hydrochloric acid）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。The acid is ascorbic acid, acetic acid, acetyl salicylic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid, glycolic acid ), Lactic acid, malic acid, salicylic acid and hydrochloric acid (hydrochloric acid). The method for producing a putty-like material according to claim 3 .

該酸が塩酸であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。2. A putty-like material according to claim 1, wherein the acid is hydrochloric acid.

該酸が塩酸であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。 The osteogenic composition according to claim 2, wherein the acid is hydrochloric acid.

該酸が塩酸であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。The method for producing a putty-like material according to claim 3, wherein the acid is hydrochloric acid.

さらに活性成分を含有することを特徴とする請求項１のパテ状材料。The putty-like material according to claim 1, further comprising an active ingredient.

さらに活性成分を含有することを特徴とする請求項２の骨形成組成物。The osteogenic composition according to claim 2 , further comprising an active ingredient.

活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６のパテ状材料。 The putty-like material according to claim 16, wherein the active ingredient is selected from the group consisting of osteoinductive substances, growth factors, cartilage inducing factors, angiogenic factors, hormones, antibiotics and antiviral compounds.

活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１７の骨形成組成物。 The osteogenic composition according to claim 17, wherein the active ingredient is selected from the group consisting of osteoinductive substances, growth factors, cartilage inducing factors, angiogenic factors, hormones, antibiotics and antiviral compounds.

活性成分が、骨誘導物質、成長因子、軟骨誘導因子、血管新生因子、ホルモン、抗生物質および抗ウィルス性化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。 4. The method for producing a putty-like material according to claim 3, wherein the active ingredient is selected from the group consisting of osteoinductive substances, growth factors, cartilage inducing factors, angiogenic factors, hormones, antibiotics and antiviral compounds.

該活性成分が、骨誘導物質であることを特徴とする請求項１６のパテ状材料。 The putty-like material according to claim 16, wherein the active ingredient is an osteoinductive substance.

該活性成分が、骨誘導物質であることを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。The method for producing a putty-like material according to claim 3, wherein the active ingredient is an osteoinductive substance.

該骨誘導物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８のパテ材料。Putty material of claim 18, osteoinductive factor included in the osteoinductive material, characterized in that it is selected from the group consisting of bone growth proteins, BMP 1-13, OP1 Prefecture.

該骨誘道物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。 Osteoinductive factor included in the bone誘道material, bone growth proteins, BMP 1-13, osteogenic composition according to claim 2, characterized in that it is selected from the group consisting of OP1 Prefecture.

該骨誘導物質に含まれる骨誘導因子が、骨成長蛋白、BMP 1-13、OP1とからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０のパテ状材料の製造方法。 Osteoinductive factors contained in the osteoinductive material, manufacturing method of the putty-like material according to claim 20, characterized in that it is selected from the group consisting of bone growth proteins, BMP 1-13, OP1 Prefecture.

該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１８のパテ状材料。The putty-like material according to claim 18, wherein the growth factor is selected from the group consisting of b-FGF and TGF-beta.

該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１９の骨形成組成物。20. The osteogenic composition according to claim 19, wherein the growth factor is selected from the group consisting of b-FGF and TGF-beta.

該成長因子が、b-FGFおよびTGF-betaとからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２０のパテ状材料の製造方法。21. The method for producing a putty-like material according to claim 20, wherein the growth factor is selected from the group consisting of b-FGF and TGF-beta.

無菌であることを特徴とする請求項１のパテ状材料。The putty-like material according to claim 1 , which is aseptic.

無菌であることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。The osteogenic composition according to claim 2 , which is sterile.

エチレンオキサイドでの殺菌により製造されることを特徴とする請求項２９のパテ状材料。30. The putty-like material of claim 29 , which is produced by sterilization with ethylene oxide.

エチレンオキサイドでの殺菌により製造されることを特徴とする請求項３０の骨形成組成物。31. The bone forming composition of claim 30 , wherein the composition is produced by sterilization with ethylene oxide.

ガンマ放射線に曝露して殺菌することにより製造されることを特徴とする請求項２９のパテ状材料。30. The putty-like material of claim 29 , produced by sterilization by exposure to gamma radiation.

ガンマ放射線に曝露して殺菌することにより製造されることを特徴とする請求項３０の骨形成組成物。31. The osteogenic composition of claim 30 produced by sterilization by exposure to gamma radiation.

乾燥していることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。 3. The bone forming composition of claim 2 , wherein the composition is dry.

ゲルであることを特徴とする請求項２の骨形成組成物。The osteogenic composition according to claim 2 , which is a gel.

さらに水を含有することを特徴とする請求項２の骨形成組成物。Furthermore, water is contained, The bone formation composition of Claim 2 characterized by the above-mentioned.

骨誘導物質が脱灰骨材を含有することを特徴とする請求項２、３０、３５、３６、３７の骨形成組成物。Osteogenic composition of Claim 2,30,35,36,37, wherein the osteoinductive material contains a demineralized bone material.

さらに、該パテ状材料を殺菌する工程を有することを特徴とする請求項３のパテ状材料の製造方法。Furthermore, the manufacturing method of the putty-like material according to claim 3, characterized in that it comprises a step of sterilizing the putty-like material.

該殺菌工程で、該パテ状材料をガンマ放射線に曝露することを特徴とする請求項３９のパテ状材料の製造方法。40. The method for producing a putty-like material according to claim 39 , wherein in the sterilizing step, the putty-like material is exposed to gamma radiation.

さらに、該パテ状材料がゲルを減圧凍結乾燥する工程を有することを特徴とする請求項３、３９のパテ状材料の製造方法。Furthermore, the manufacturing method of the putty-like material according to claim 3,39, characterized in that it comprises a step of the putty-like material under reduced pressure lyophilized gel.