JP5100541B2 - Immunochromatographic conjugate pad containing fluorescent particles and colored particles as labeled particles, immunochromatographic test strip using the same, and inspection method - Google Patents
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Description
本発明は、標識粒子として、蛍光粒子と着色粒子とを含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップおよび検査方法に関する。 The present invention relates to an immunochromatographic conjugate pad containing fluorescent particles and colored particles as labeled particles, an immunochromatographic test strip using the same, and an inspection method.
イムノクロマト法とは、被検物質が標識粒子に捕捉され、毛細管現象により多孔質支持体内を移動し、更に多孔質支持体にライン状に固定化された捕捉物質と効率的に接触することによって被検物質が結合した標識粒子が濃縮され、捕捉物質が固定化されたラインが発色化することによって被検物質の有無を判定する免疫測定法である。
イムノクロマト法の特徴として以下の３点が挙げられる。
〈１〉判定までに要する時間が２０分以下であり迅速な検査が可能である。
〈２〉検体を滴下するだけで測定でき、操作が簡便であるため、複数の検体処理が可能である。
〈３〉特別な検出装置を必要とせず、判定が容易なため一般消費者が自身で検査できる。
これらの特徴を利用して、イムノクロマト法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として注目を集めている（例えば、特許文献１参照）。
In the immunochromatography method, the test substance is captured by the labeled particles, moves through the porous support by capillary action, and further contacts with the capture substance immobilized in a line on the porous support. This is an immunoassay method for determining the presence or absence of a test substance by concentrating labeled particles to which a test substance is bound and coloring a line on which a capture substance is immobilized.
The following three points can be mentioned as features of the immunochromatography method.
<1> Time required for determination is 20 minutes or less, and rapid inspection is possible.
<2> Measurement can be performed simply by dropping a specimen, and the operation is simple, so that a plurality of specimens can be processed.
<3> Since a determination is easy without requiring a special detection device, a general consumer can inspect himself / herself.
Utilizing these characteristics, immunochromatography is used for pregnancy test drugs and influenza test drugs, and has attracted attention as a new POCT (Point Of Care Testing) technique (see, for example, Patent Document 1).
現在イムノクロマト法では標識粒子として金ナノ粒子や着色ラテックス粒子が使用されており、ラインの発色を目視で確認する方法が一般的である。しかし、ラインの発色を目視で判定する方法は、簡便であるものの、感度が高くないことが問題である。
本発明者らは標識粒子として蛍光粒子を用い、ラインの蛍光発色を蛍光検出装置で確認する方法について特許出願している。蛍光検出装置を用いる蛍光型イムノクロマト検査薬は従来の目視で確認するタイプに比べて感度が向上するものの、以下のような問題点がある。
Currently, gold nanoparticles and colored latex particles are used as labeling particles in the immunochromatography method, and a method of visually confirming the color development of the line is common. However, although the method of visually determining the color development of the line is simple, there is a problem that the sensitivity is not high.
The present inventors have applied for a patent on a method of using a fluorescent particle as a labeling particle and confirming the color development of a line with a fluorescence detection device. Although the fluorescence type immunochromatography test using a fluorescence detection device has improved sensitivity as compared with the conventional type visually confirmed, it has the following problems.
〈１〉イムノクロマト法試薬の製造工程において、抗体を感作させた標識粒子をパッドに含有させ、乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製する。標識粒子が、発色を目視で判定する金粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子は、粒子の吸光度が高いのでパッドに粒子が含有されているかどうか、あるいは均一に含有されているかどうかを容易に判断できる。しかし標識粒子が蛍光粒子の場合は、粒子の吸光度が低いため、蛍光粒子をパッドに含有させた際に蛍光粒子が含有されているかどうかが容易に判断できず、一定量に含有させることが難しい。一定量に含有できているかどうかは蛍光検出装置で判定する必要があり、生産コストが高くなることが問題である。
〈２〉蛍光検出型イムノクロマト法試薬は、蛍光検出器が故障した場合や蛍光検出装置を持ち合わせていない場合など、蛍光検出器が使用できない環境においては使用できないことが問題である。
〈３〉蛍光粒子は保存期間が長くなると退色によって蛍光強度が低下するため、長期間保管した蛍光型イムノクロマト法試薬を用いると、正しい判定ができない場合があることが問題である。
〈４〉検査後のイムノクロマト法試薬を検査結果として保管する際、蛍光型イムノクロマト法試薬では蛍光粒子の退色によってラインが消えてしまい、イムノクロマト法試薬の検査後の判定結果を長期保管ができないことが問題である。
<2> The fluorescence detection type immunochromatography reagent is problematic in that it cannot be used in an environment where the fluorescence detector cannot be used, such as when the fluorescence detector fails or when the fluorescence detection device is not present.
<3> Since the fluorescence intensity of fluorescent particles decreases due to fading when the storage period is long, there is a problem that correct determination may not be possible when a fluorescent immunochromatographic reagent stored for a long period of time is used.
<4> When storing the immunochromatography reagent after the test as a test result, the fluorescence type immunochromatography reagent loses the line due to fading of the fluorescent particles, and the determination result after the test of the immunochromatography reagent cannot be stored for a long time. It is a problem.
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、製造工程において標識粒子をコンジュゲートパッドに含有させた際に、目視で含有状態が確認可能な標識粒子コロイドを含有させてなるコンジュゲートパッドを提供することにある。
また、本発明の目的は、蛍光検出装置が無い状況でも目視の判定が可能なイムノクロマト法用テストストリップを提供することにある。
また、本発明の目的は、作製から長期間経った後でも、目視による判定ができるイムノクロマト法用テストストリップを提供することにある。
更に、本発明の目的は、検査後のイムノクロマト法用テストストリップを検査結果として長期保存が可能なイムノクロマト法用テストストリップを提供することにある。
In view of the above problems, an object of the present invention is to provide a conjugate pad containing a labeled particle colloid that can be visually confirmed when the labeled particle is contained in the conjugate pad in the production process. It is to provide.
Another object of the present invention is to provide an immunochromatographic test strip capable of visual determination even in the absence of a fluorescence detection apparatus.
Another object of the present invention is to provide an immunochromatographic test strip that can be visually judged even after a long period of time has elapsed since its preparation.
It is another object of the present invention to provide an immunochromatographic test strip that can be stored for a long period of time as a result of the test strip for immunochromatography after the test.
本発明は下記手段により達成された。
すなわち本発明は、
（１）着色粒子の表面を抗体で修飾した標識粒子（Ａ）と、蛍光粒子の表面を前記抗体で修飾した標識粒子（Ｂ）とを含有するコンジュゲートパッドを具備するテストストリップを用いて、液体試料中の検体をイムノクロマト法により検出する方法であって、
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、
前記標識粒子（Ａ）による着色を指標にした目視判定を実施し、該目視判定により検体を検出できない場合に、前記標識粒子（Ｂ）の蛍光を指標にした判定を実施することを特徴とする方法、
（２）前記着色粒子がシリカ粒子、ラテックス粒子、半導体ナノ粒子、金粒子、金属ナノ粒子又は無機結晶であり、前記蛍光粒子がシリカ粒子、ラテックス粒子又は半導体ナノ粒子である、前記（１）に記載の方法、
（３）前記コンジュゲートパッドが、前記標識粒子（Ａ）の分散液と前記標識粒子（Ｂ）の分散液とをそれぞれ別々に含有させて調製されたものであるか、又は、前記コンジュゲートパッドが、前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の混合分散液を含有させて調製されたものである、前記（１）又は（２）に記載の方法、
（４）前記コンジュゲートパッド中の標識粒子の含有量が２０〜２００μｇ／ｃｍ２であり、前記コンジュゲートパッドに含有された着色粒子の表面積の和が、前記コンジュゲートパッドに含有された蛍光粒子の表面積の和の１〜５０％であることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法、
（５）前記標識粒子（Ａ）と前記標識粒子（Ｂ）が同一の粒子であり、前記標識粒子（Ａ）と前記標識粒子（Ｂ）は、いずれも着色性と蛍光性とを兼ね備えた標識物質を含有するシリカ粒子の表面を抗体で修飾した標識粒子であることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法、
（６）前記の着色性と蛍光性とを兼ね備えた標識物質を含有するシリカ粒子のモル吸光係数が５×１０ ６ Ｍ −１ ｃｍ −１ 以上であることを特徴とする、前記（５）に記載の方法、
（７）前記標識物質がローダミンである、前記（６）に記載の方法、
（８）着色粒子の表面を抗体で修飾した標識粒子（Ａ）と、蛍光粒子の表面を前記抗体で修飾した標識粒子（Ｂ）とを含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッドであって、
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、
前記コンジュゲートパッド中の標識粒子の含有量が２０〜２００μｇ／ｃｍ ２ であり、前記コンジュゲートパッドに含有された着色粒子の表面積の和が、前記コンジュゲートパッドに含有された蛍光粒子の表面積の和の１〜５０％であることを特徴とする、イムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（９）着色性と蛍光性とを兼ね備えた標識物質を含有するシリカ粒子の表面を抗体で修飾した標識粒子を含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッドであって、
前記標識粒子の平均粒径が２０〜１０００ｎｍであり、
前記コンジュゲートパッド中の前記標識粒子の含有量が２０〜２００μｇ／ｃｍ ２ であることを特徴とする、イムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（１０）前記の着色性と蛍光性とを兼ね備えた標識物質を含有するシリカ粒子のモル吸光係数が５×１０ ６ Ｍ −１ ｃｍ −１ 以上であることを特徴とする、前記（９）に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（１１）着色粒子の表面を抗体で修飾した標識粒子（Ａ）と、蛍光粒子の表面を前記抗体で修飾した標識粒子（Ｂ）とが分散したコロイド溶液であって、
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、
イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造に用いるコロイド溶液
を提供するものである。
The present invention has been achieved by the following means.
That is, the present invention
(1) Using a test strip including a conjugate pad containing a labeled particle (A) in which the surface of a colored particle is modified with an antibody and a labeled particle (B) in which the surface of a fluorescent particle is modified with the antibody, A method for detecting a specimen in a liquid sample by immunochromatography,
The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
Visual determination is performed using the coloring by the labeled particles (A) as an index, and when the specimen cannot be detected by the visual determination, determination using the fluorescence of the labeled particles (B) is performed. Way ,
(2) the colored particles of silica particles, latex particles, semiconductor nanoparticles, gold particles are metal nanoparticles or inorganic crystal, the fluorescent particles are silica particles, latex particles or semiconductor nanoparticle element, wherein (1 the method according to),
(3) The conjugate pad is prepared by separately containing a dispersion of the labeled particles (A) and a dispersion of the labeled particles (B), or the conjugate pad Is prepared by containing a mixed dispersion of the labeled particles (A) and the labeled particles (B), (1) or the method according to (2),
(4) Fluorescent content 20~200μg / cm 2 der is, the sum of the area of the colored particles contained in the conjugate pad, which is contained in the conjugate pad of label particles in the conjugate pad The method according to any one of the above (1) to (3) , characterized in that it is 1 to 50% of the sum of the surface areas of the particles ,
(5) The labeling particle (A) and the labeling particle (B) are the same particle, and the labeling particle (A) and the labeling particle (B) both have coloring and fluorescence. The method according to any one of (1) to ( 3 ) , wherein the surface of silica particles containing a substance is a labeled particle modified with an antibody .
(6) In the above (5), the molar extinction coefficient of the silica particles containing the labeling substance having both the coloring property and the fluorescence property is 5 × 10 6 M −1 cm −1 or more. Described method ,
(7) The method according to (6), wherein the labeling substance is rhodamine ,
(8) A conjugate pad for immunochromatography containing a labeled particle (A) in which the surface of a colored particle is modified with an antibody and a labeled particle (B) in which the surface of a fluorescent particle is modified with the antibody,
The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
The content of the labeled particles in the conjugate pad is 20 to 200 μg / cm 2 , and the sum of the surface areas of the colored particles contained in the conjugate pad is the surface area of the fluorescent particles contained in the conjugate pad. 1 to 50% of the sum, a conjugate pad for immunochromatography,
(9) A conjugate pad for immunochromatography containing labeled particles obtained by modifying the surface of silica particles containing a labeling substance having both colorability and fluorescence with an antibody,
The labeling particles have an average particle size of 20 to 1000 nm,
A conjugate pad for immunochromatography , wherein the content of the labeled particles in the conjugate pad is 20 to 200 μg / cm 2 ;
(10) The above (9) is characterized in that the molar extinction coefficient of the silica particles containing the labeling substance having both the coloring property and the fluorescence property is 5 × 10 6 M −1 cm −1 or more. The conjugate pad for immunochromatography as described,
(11) A colloidal solution in which labeled particles (A) in which the surface of colored particles is modified with an antibody and labeled particles (B) in which the surface of fluorescent particles is modified with the antibody are dispersed,
The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
A colloidal solution for use in the production of a conjugate pad for immunochromatography is provided.
本発明のイムノクロマト法用コンジュゲートパッドは、着色粒子と蛍光粒子を両方含有しているため、製造工程においてどの程度含有しているか、また均一に含有しているかを蛍光検出装置によらないで目視で確認することができる。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、前記イムノクロマト法用コンジュゲートパッドを用いて作製してなるので、蛍光検出装置が使えない状況であっても、目視による検出が可能である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、前記イムノクロマト法用コンジュゲートパッドを用いて作製してなるので、長期間保存し、蛍光が退色してしまった後であっても、目視による検出が可能である。
さらに、本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、前記イムノクロマト法用コンジュゲートパッドを用いて作製してなるので、検査後の前記テストストリップを保存し、蛍光が退色してしまった場合でも、目視による判定結果の再確認が可能であるため、判定結果の長期間の保存が可能である。
本発明の検査方法は、前記イムノクロマト法用テストストリップを用いてなるので、目視によって判定できない場合であっても高侵襲な処置により検体を再採取することを要することなく、蛍光による判定ないし定量が可能であることから低侵襲な検査ができる。
Since the conjugate pad for immunochromatography of the present invention contains both colored particles and fluorescent particles, it can be visually checked without using a fluorescence detection device how much it is contained in the production process and whether it is contained uniformly. Can be confirmed.
Since the immunochromatographic test strip of the present invention is prepared using the immunochromatographic conjugate pad, visual detection is possible even in a situation where a fluorescence detection apparatus cannot be used.
Since the immunochromatographic test strip of the present invention is prepared using the immunochromatographic conjugate pad, it can be visually detected even after it has been stored for a long time and the fluorescence has faded. is there.
Furthermore, since the immunochromatographic test strip of the present invention is prepared using the immunochromatographic conjugate pad, the test strip after inspection is stored, and even when the fluorescence has faded, it is visually observed. Since the determination result can be reconfirmed, the determination result can be stored for a long time.
Since the test method of the present invention uses the immunochromatographic test strip, determination or quantification by fluorescence can be performed without requiring re-collection of a sample by a highly invasive procedure even when it cannot be determined visually. Since it is possible, a minimally invasive test can be performed.
まず、本発明のコンジュゲートパッドについて説明する。
本発明のコンジュゲートパッド（標識粒子含有部材）は、イムノクロマト法用テストストリップに用いられ、標識粒子として、着色粒子と蛍光粒子とをいずれをも含有することを特徴とする。
本発明のコンジュゲートパッドにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識粒子の含有量は特に制限ないが２０μｇ／ｃｍ２〜２ｍｇ／ｃｍ２が好ましく、２０〜２００μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。含有量が多すぎると、１粒子当りの検体結合数が低下し、検出感度が低下する。
含有させる方法としては、前記標識粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。このとき着色粒子または蛍光粒子を含有させ、一旦乾燥させた後、蛍光粒子または着色粒子を含有させても良く、予め着色粒子と蛍光粒子を混合し、この混合コロイドを含有させても良い。
吸光粒子と蛍光粒子の割合は、特に制限は無いが、目視でも蛍光でも十分な検出感度を得るために、コンジュゲートパッドに含有された吸光粒子の表面積の和が、コンジュゲートパッドに含有された蛍光粒子の表面積の和の５０％以下であることが好ましく、含有された前記蛍光粒子の表面積の和の０．１〜５０％であることがより好ましく、含有された前記蛍光粒子の表面積の和の１％〜３０％であることがさらに好ましい。
本発明において、前記標識粒子の表面積の和は、一定体積のコロイドに含まれる標識粒子の表面積の総和を意味する。例えば粒子Ａと粒子Ｂの混合コロイドを考える。本混合コロイド中の粒子Ａの重量濃度をｃ［ｍｇ／ｍｌ］、粒子Ａの平均粒径をｄ［ｎｍ］、粒子Ａの密度をρ［ｇ／ｃｍ３］とすると、本混合コロイド１ｍｌの粒子Ａの表面積の和Ｓ［ｍ２］は下記の式１で表される。
First, the conjugate pad of the present invention will be described.
The conjugate pad (labeled particle-containing member) of the present invention is used for a test strip for immunochromatography and is characterized by containing both colored particles and fluorescent particles as labeled particles.
The content of the labeled particles per unit area (cm 2 ) in the conjugate pad of the present invention is not particularly limited, but is preferably 20 μg / cm 2 to 2 mg / cm 2, more preferably 20 to 200 μg / cm 2. . If the content is too large, the number of analyte bindings per particle decreases, and the detection sensitivity decreases.
Examples of the method of inclusion include a method in which the dispersion of the labeled particles is applied, dropped or sprayed, and then dried. At this time, colored particles or fluorescent particles may be contained, and after drying once, fluorescent particles or colored particles may be contained, or colored particles and fluorescent particles may be mixed in advance and the mixed colloid may be contained.
The ratio between the light-absorbing particles and the fluorescent particles is not particularly limited, but the sum of the surface area of the light-absorbing particles contained in the conjugate pad was contained in the conjugate pad in order to obtain sufficient detection sensitivity for both visual observation and fluorescence. The total surface area of the fluorescent particles is preferably 50% or less, more preferably 0.1 to 50% of the total surface area of the contained fluorescent particles, and the total surface area of the contained fluorescent particles. More preferably, it is 1% to 30%.
In the present invention, the sum of the surface areas of the label particles means the sum of the surface areas of the label particles contained in a fixed volume of colloid. For example, consider a mixed colloid of particles A and B. When the weight concentration of the particles A in the mixed colloid is c [mg / ml], the average particle diameter of the particles A is d [nm], and the density of the particles A is ρ [g / cm 3 ], The sum S [m 2 ] of the surface area of the particles A is represented by the following formula 1.
本発明に用いる標識粒子について説明する。
本発明に用いられる標識粒子は、検体を認識する物質（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子）で表面修飾された着色粒子および蛍光粒子である。
本発明において、前記標識粒子の平均粒径は２０〜１０００ｎｍであることが好ましく、２０〜６００ｎｍであることがより好ましく、６０〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、イムノクロマト法に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の標識粒子の合計の投影面積から標識粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
The labeled particles used in the present invention will be described.
The labeled particles used in the present invention are colored particles and fluorescent particles that are surface-modified with a substance that recognizes a specimen (for example, biomolecules such as antibodies, antigens, DNA, and RNA).
In the present invention, the labeling particles preferably have an average particle size of 20 to 1000 nm, more preferably 20 to 600 nm, and still more preferably 60 to 300 nm. If the particle size is too small, the detection sensitivity decreases, and if the particle size is too large, the porous support (membrane) used in the immunochromatography method becomes clogged.
In the present invention, the average particle size is determined from the total projected area of 50 labeled particles randomly selected from an image of a transmission electron microscope (TEM), a scanning electron microscope (SEM), or the like, Is obtained by an image processing apparatus, and an average value (average circle equivalent diameter) of the diameters of the circles corresponding to a value obtained by dividing the total occupied area by the number (50) of the selected labeled particles is obtained.
The variation coefficient of the particle size distribution, the so-called CV value, is not particularly limited, but is preferably 10% or less, more preferably 8% or less.
In the present specification and claims, monodisperse means a particle group having a CV value of 15% or less.
本発明のコンジュゲートパッドは、上述のように、標識粒子として、着色粒子と蛍光粒子とをいずれをも含有してなり、蛍光特性を有し、かつモル吸光係数εが５×１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である標識粒子（着色粒子及び蛍光粒子の混合物を含む。）を含有していることが好ましく、蛍光特性を有し、かつモル吸光係数εが５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１〜１×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１である標識粒子（着色粒子及び蛍光粒子の混合物を含む。）を含有していることがより好ましい。
ここで、モル吸光係数εは下記ランベルト−ベールの式から算出することができる。
Ａ＝Ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ）＝εｂｐ＝ａｓｂｐ’
［Ａ：吸光度、Ｉ：透過光の強度、Ｉ０：入射光の強度、ε：モル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）、ｂ：光路長（ｃｍ）、ｐ：標識粒子（着色粒子及び蛍光粒子の混合分散液を含む。）の濃度（Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））、ａｓ：比吸光度、ｐ’：標識粒子（着色粒子及び蛍光粒子の混合分散液を含む。）の濃度（ｇ／ｌ）］
As described above, the conjugate pad of the present invention contains both colored particles and fluorescent particles as labeled particles, has fluorescence characteristics, and has a molar extinction coefficient ε of 5 × 10 6 M −. It preferably contains labeled particles (including a mixture of colored particles and fluorescent particles) that are 1 cm −1 or more, has fluorescent properties, and has a molar extinction coefficient ε of 5 × 10 7 M −1 cm. It is more preferable that it contains label particles (including a mixture of colored particles and fluorescent particles) that are −1 to 1 × 10 10 M −1 cm −1 .
Here, the molar extinction coefficient ε can be calculated from the following Lambert-Bale equation.
A = Log 10 (I 0 / I) = εbp = a s bp ′
[A: absorbance, I: intensity of transmitted light, I 0 : intensity of incident light, ε: molar extinction coefficient (M −1 cm −1 ), b: optical path length (cm), p: labeled particles (colored particles and Concentration (M (mol / l)) of a fluorescent particle mixed dispersion), a s : Specific absorbance, p ′: Concentration of labeled particles (including a mixed dispersion of colored particles and fluorescent particles) (g / L)]
上記濃度ｐ’（ｇ／ｌ）は、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた質量を決定して得られた値である。一方、上記濃度ｐ（ｍｏｌ／ｌ）は、標識粒子の大きさをＴＥＭ写真から求め、一粒子の体積を決定し、粒子の密度（例えばシリカ粒子の場合は２．３ｇ／ｃｍ３）から一粒子の質量を決定し、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた標識粒子の質量からモル数を決定して得られた値である。
本発明において、「標識粒子のモル吸光係数ε」とは、標識粒子分散液（着色粒子及び蛍光粒子の混合分散液を含む。）について吸光度を測定し、前記ランベルト−ベールの式に適用することにより得られた、前記分散液中における標識粒子（着色粒子及び蛍光粒子の混合物を含む。）のモル吸光係数εをいう。
標識粒子の吸光度、吸光スペクトル及びεは、任意の吸光光度計ないしはプレートリーダーを用いて、水分散液、エタノール分散液、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド分散液等の分散液として測定できる。
The concentration p ′ (g / l) is a value obtained by determining the mass obtained by collecting only the labeled particles from a fixed amount (for example, 1 ml) of the labeled particle dispersion and drying it. On the other hand, for the concentration p (mol / l), the size of the labeled particle is obtained from a TEM photograph, the volume of one particle is determined, and the particle density (for example, 2.3 g / cm 3 in the case of silica particles) is It is a value obtained by determining the mass of particles, determining the number of moles from the mass of labeled particles obtained by collecting only the labeled particles from a fixed amount (for example, 1 ml) of the labeled particle dispersion and drying them.
In the present invention, the “molar extinction coefficient ε of the labeled particles” refers to measuring the absorbance of a labeled particle dispersion (including a mixed dispersion of colored particles and fluorescent particles) and applying it to the Lambert-Beer equation. The molar extinction coefficient ε of the labeled particles (including a mixture of colored particles and fluorescent particles) in the dispersion obtained by the above.
The absorbance, absorbance spectrum, and ε of the labeled particles can be measured as a dispersion such as an aqueous dispersion, an ethanol dispersion, or an N, N-dimethylformamide dispersion using an arbitrary absorptiometer or plate reader.
前記着色粒子の材質に特に制限はないが、例えば、シリカ粒子、ラテックス粒子、半導体ナノ粒子、金粒子、金属ナノ粒子、無機結晶等を用いることができる。
また蛍光粒子の材質に特に制限は無いが、例えば、シリカ粒子、ラテックス粒子、半導体ナノ粒子等を用いることができる。
前記標識粒子は、上述のように検体を認識する物質（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子）で表面修飾されている。
The material of the colored particles is not particularly limited, and for example, silica particles, latex particles, semiconductor nanoparticles, gold particles, metal nanoparticles, inorganic crystals, and the like can be used.
Moreover, there is no restriction | limiting in particular in the material of fluorescent particle, For example, a silica particle, a latex particle, a semiconductor nanoparticle etc. can be used.
As described above, the labeled particles are surface-modified with a substance that recognizes a specimen (for example, a biomolecule such as an antibody, an antigen, DNA, or RNA).
本発明において、前記シリカ粒子としては特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５９， １５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子等が挙げられる。
国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、標識物質を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。
具体的には、前記標識物質を含有するシリカ粒子は、前記標識物質とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記標識物質を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記標識物質と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
In the present invention, the silica particles are not particularly limited, and may be silica particles obtained by any arbitrary preparation method. Examples thereof include silica particles prepared by the sol-gel method described in Journal of Colloid and Interface Science, 159, 150-157 (1993).
It is particularly preferable to use silica particles containing a labeling substance obtained according to the method for preparing fluorescent dye compound-containing colloidal silica particles described in International Publication No. 2007 / 074722A1.
Specifically, the silica particles containing the labeling substance are 1 or 2 in a product obtained by reacting the labeling substance and a silane compound and covalently bonding, ionic bonding, or other chemical bonding or adsorption. It can be prepared by polymerizing two or more silane compounds.
Preferred embodiments of the silica particles containing the labeling substance include N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group, maleimide group, isocyanate group, isothiocyanate group, aldehyde group, paranitrophenyl group, diethoxymethyl. The labeling substance having an active group such as a group, an epoxy group or a cyano group is reacted with a silane coupling agent having a substituent (for example, an amino group, a hydroxyl group or a thiol group) that reacts with the active group. The product obtained by covalent bonding can be prepared by polymerizing one or more silane compounds.
前記標識物質は蛍光物質または吸光物質である。蛍光物質または吸光物質に関して特に制限はなく、有機化合物、無機化合物、半導体粒子等である。
前記活性基を有する前記標識物質の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する標識物質を挙げることができる。
The labeling substance is a fluorescent substance or a light absorbing substance. There is no restriction | limiting in particular regarding a fluorescent substance or a light absorbing substance, It is an organic compound, an inorganic compound, a semiconductor particle, etc.
Specific examples of the labeling substance having the active group include labeling substances having an NHS ester group such as 5- (and -6) -carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (trade name, manufactured by emp Biotech GmbH). Can be mentioned.
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。 Specific examples of the silane coupling agent having a substituent include γ-aminopropyltriethoxysilane (APS), 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyl-triethoxysilane, N-2 ( Examples thereof include silane coupling agents having an amino group such as (aminoethyl) 3-aminopropylmethyldimethoxysilane and 3-aminopropyltrimethoxysilane. Of these, APS is preferable.
前記重合させる前記シラン化合物としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、ＴＥＯＳ、ＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
本発明において、前記標識物質は、前記シリカ粒子中において固定化された状態にある。
The silane compound to be polymerized is not particularly limited, but includes tetraethoxysilane (TEOS), γ-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPS), γ-mercaptopropyltriethoxysilane, γ-aminopropyltriethoxysilane (APS). ), 3-thiocyanatopropyltriethoxysilane, 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane, 3-isocyanatopropyltriethoxysilane, and 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyl-triethoxy Mention may be made of silane. Among these, TEOS, MPS, or APS is preferable.
In the present invention, the labeling substance is in a state of being immobilized in the silica particles.
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
When prepared as described above, spherical or nearly spherical silica particles can be produced. The nearly spherical silica particles specifically have a shape in which the ratio of the major axis to the minor axis is 2 or less.
In order to obtain silica particles having a desired average particle size, ultrafiltration is performed using an ultrafiltration membrane such as YM-10, YM-100 (both trade names, manufactured by Millipore), and the particle size is large. It is possible to remove particles that are too small or too small, or to centrifuge at an appropriate gravitational acceleration and collect only the supernatant or precipitate.
本発明において、前記ラテックス粒子としては、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合成高分子粒子を挙げることができる。
また、ラテックス粒子の着色方法としては、特開２０００−１７８３０９、特開平１０−４８２１５号、特開平８−２６９２０７号、特開平６−３０６１０８号などに記載の方法で行うことができる。
In the present invention, the latex particles include polystyrene, styrene-sulfonic acid (salt) copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile-butadiene-sulfonic acid copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer. Examples thereof include synthetic polymer particles composed of a polymer, a vinyl acetate-acrylic acid ester copolymer, and the like.
The latex particles can be colored by the methods described in JP-A 2000-178309, JP-A 10-48215, JP-A 8-269207, JP-A 6-306108, and the like.
前記半導体ナノ粒子の材質として蛍光特性又は吸光特性を有する限り特に制限されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅが好ましく例示される。例えば、特許第３８９７２８５号公報等に記載の半導体ナノ粒子を用いることができる。
前記半導体ナノ粒子は、チオール化合物の−ＳＨ基が半導体ナノ粒子の表面のＳ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐ、Ａｓ、Ｎ等の原子と置換することにより表面修飾することができる。
前記金粒子、前記金属ナノ粒子としては、特開２００３−２６６３８明細書等に記載の金コロイド粒子及び金属コロイド粒子を用いることができる。
前記金属コロイド粒子の具体例としては、白金、銅、酸化鉄等の金属コロイド粒子が挙げられる。
前記無機結晶としては、酸化鉄（III）（Ｆｅ２Ｏ３）、酸化銀（Ｉ）（Ａｇ２Ｏ）、 酸化スズ（IV）（ＳｎＯ２）、酸化チタン（IV）（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等が挙げられる。例えば、特開２００５−７６０６４公報に記載の無機結晶を用いることができる。
The material of the semiconductor nanoparticles is not particularly limited as long as it has fluorescence characteristics or light absorption characteristics, but ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, InP, InAs, GaN, GaP, Preferred examples include GaAs, TiO 2 , WO 3 , PbS, or PbSe. For example, semiconductor nanoparticles described in Japanese Patent No. 3897285 can be used.
The semiconductor nanoparticles can be surface-modified by replacing the —SH group of the thiol compound with atoms such as S, O, Se, Te, P, As, and N on the surface of the semiconductor nanoparticles.
As the gold particles and the metal nanoparticles, colloidal gold particles and metal colloidal particles described in JP-A-2003-26638 can be used.
Specific examples of the metal colloid particles include metal colloid particles such as platinum, copper, and iron oxide.
Examples of the inorganic crystal include iron (III) oxide (Fe 2 O 3 ), silver (I) oxide (Ag 2 O), tin oxide (IV) (SnO 2 ), titanium oxide (IV) (TiO 2 ), and indium. Examples thereof include tin oxide (ITO). For example, inorganic crystals described in JP-A-2005-76064 can be used.
前記標識粒子を前記検体を認識する物質で表面修飾させる方法としては特に制限は無く、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって前記検体を認識する物質を前記標識粒子に吸着させても良いし、架橋剤や縮合剤によって化学結合で結合させても良い。また、前記標識粒子表面にチオール基を有する場合には、前記検体を認識する物質のチオール基とＳ−Ｓ結合によって結合させても良い。
また、前記標識粒子表面の生体分子（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの前記検体を認識する物質を結合したときに粒子が凝集する場合は、予め、前記標識粒子表面に交互吸着法によって表面処理を施しておいても良い。交互吸着法とは、電荷を有する基板や粒子の表面に電荷を持った高分子を静電的引力で吸着させることで、基板や粒子の表面に高分子の薄膜を形成する手法である。前記標識粒子の表面に交互吸着処理を行うことにより粒子表面に電荷を付与できるため、粒子間に静電的反発力が生じ、分散性が向上する。また、粒子に結合した高分子は排除体積を持つことから、立体反発力の効果によっても分散性が向上する。
There is no particular limitation on the method of surface-modifying the labeled particle with a substance that recognizes the specimen, and the substance that recognizes the specimen is adsorbed to the labeled particle by electrostatic attraction, van der Waals force, hydrophobic interaction, or the like. You may make it combine, and you may make it couple | bond with a chemical bond with a crosslinking agent or a condensing agent. Further, when the labeled particle surface has a thiol group, it may be bonded to the thiol group of a substance that recognizes the specimen by an SS bond.
In the case where particles aggregate when binding a substance that recognizes the specimen, such as biomolecules (for example, antibodies, antigens, DNA, RNA) on the surface of the labeled particles, an alternate adsorption method is used on the surface of the labeled particles in advance. May be subjected to surface treatment. The alternating adsorption method is a method of forming a polymer thin film on the surface of a substrate or particle by adsorbing a charged polymer to the surface of the substrate or particle having a charge by electrostatic attraction. By carrying out the alternate adsorption treatment on the surface of the labeled particle, a charge can be imparted to the particle surface, so that an electrostatic repulsive force is generated between the particles and the dispersibility is improved. Further, since the polymer bonded to the particles has an excluded volume, the dispersibility is improved also by the effect of the steric repulsive force.
本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、
（１）試料添加用部材（サンプルパッド）と前記標識粒子を含有させてなる部材（本発明のコンジュゲートパッド）とが、
（２）前記コンジュゲートパッドと抗体固定化部を有するメンブレン（抗体固定化メンブレン）とが、並びに
（３）前記抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることがより好ましい。
The test strip for immunochromatography of the present invention is
(1) A sample addition member (sample pad) and a member (conjugate pad of the present invention) containing the labeled particles,
(2) The conjugate pad and a membrane having an antibody immobilization part (antibody immobilization membrane), and (3) the antibody immobilization membrane and the absorption pad are connected in series so that a capillary phenomenon occurs between them. More preferably.
図１ａ及びｂを参照して、本発明のイムノクロマト法用テストストリップの好ましい１つの実施態様について説明する。
図１ａは本発明のイムノクロマト法用テストストリップの平面図を示し、図１ｂは、ａで示されたイムノクロマト法用テストストリップの平面図の縦断面図を示す図である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップ１は、試料添加用部材（サンプルパッド）２、標識粒子含有部材（本発明のコンジュゲートパッド）３、抗体固定化メンブレン４、吸収パッド５からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート６により裏打ちされていることがより好ましい。
前記メンブレン４における抗体固定化部としては、検体の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するための捕捉用抗体が固定化されたテストライン４１、および標識粒子により標識された全ての検体を捕捉する抗体が固定化されたコントロールライン４２を含むことが好ましい。
本発明において、検出、定量、検査、診断、判定の対象としての検体は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。
本発明において、検体を含有する試料液体としては特に制限ないが、尿、血液などが挙げられる。
A preferred embodiment of the immunochromatographic test strip of the present invention will be described with reference to FIGS. 1a and b.
FIG. 1a is a plan view of the immunochromatographic test strip of the present invention, and FIG. 1b is a longitudinal sectional view of the plan view of the immunochromatographic test strip indicated by a.
The immunochromatographic test strip 1 of the present invention preferably comprises a sample addition member (sample pad) 2, a labeled particle-containing member (conjugate pad of the present invention) 3, an antibody-immobilized membrane 4 and an absorption pad 5. The constituent members are more preferably backed by a backing sheet 6 with an adhesive.
The antibody immobilization section in the membrane 4 captures all the samples labeled with the test line 41 on which the capture antibody for determining the presence or absence of the sample, that is, positive / negative is fixed, and the labeled particles. It is preferable to include a control line 42 on which the antibody is immobilized.
In the present invention, examples of specimens to be detected, quantified, tested, diagnosed, and judged include antigens, antibodies, DNA, RNA, sugars, sugar chains, ligands, receptors, peptides, chemical substances, and the like.
In the present invention, the sample liquid containing the specimen is not particularly limited, and examples thereof include urine and blood.
次に、上記各部材について説明する。
１）試料添加用部材（サンプルパッド）２
サンプルパッド２は検体を含むサンプルを滴下する構成部材である。
２）標識粒子含有部材（本発明のコンジュゲートパッド）３
コンジュゲートパッド３は標識粒子が含有された構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた試料液体に含まれる検体が抗原抗体反応等の分子認識反応で、前記標識粒子によって捕捉され、標識される部分である。
Next, each member will be described.
1) Sample addition member (sample pad) 2
The sample pad 2 is a constituent member that drops a sample containing a specimen.
2) Labeled particle-containing member (conjugate pad of the present invention) 3
The conjugate pad 3 is a constituent member containing labeled particles, and the specimen contained in the sample liquid that has moved from the sample pad 2 by capillary action is captured by the labeled particles in a molecular recognition reaction such as an antigen-antibody reaction, The part to be labeled.
３）抗体固定化メンブレン４
メンブレン４は前記標識粒子により標識された検体が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体―検体―標識粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる抗体固定化部（判定部）を有する。
前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
固定化抗体―検体―標識粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応により抗体固定化部（判定部）に、前記標識粒子により標識された検体が捕捉され、形成された前記複合体中の前記標識粒子に由来する発色又は蛍光の程度により検体の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定することができる。すなわち、前記抗体固定化部（判定部）に標識粒子が濃縮され、着色シグナルとして目視的に、又は検出機器を用いて検出、判定できる。
前記サンドイッチ型免疫複合体形成反応を充分に完了させるため、あるいは液体試料中の着色物質による測定への影響や検体と結合していない標識粒子による測定への影響を回避するため、メンブレンにおける判定部は、前記コンジュゲートパッドとの連結端及び前記吸収パッドとの連結端からある程度離れた位置（例えば、前記メンブレンの中程など）に設けておくことが好ましい。
3) Antibody-immobilized membrane 4
The membrane 4 is a structural member in which the specimen labeled with the labeled particles moves by capillary action, and an antibody immobilization section (determination section) in which a sandwich type immune complex forming reaction consisting of immobilized antibody-specimen-labeled particles is performed. Have
The shape of the antibody immobilization part (determination part) in the membrane is not particularly limited as long as the capture antibody is locally immobilized, and includes a line shape, a circular shape, a belt shape, etc. It is preferable that there is a line shape having a width of 0.5 to 1.5 mm.
The label in the complex formed by capturing the specimen labeled with the labeled particles in the antibody immobilization section (determination section) by the sandwich-type immune complex forming reaction consisting of immobilized antibody-sample-labeled particles. The presence or absence of the specimen can be determined by the degree of color development or fluorescence derived from the particles, that is, positive / negative can be determined. That is, the labeled particles are concentrated in the antibody immobilization section (determination section), and can be detected and determined visually as a colored signal or using a detection device.
In order to sufficiently complete the sandwich-type immune complex formation reaction, or to avoid the influence on the measurement by the colored substance in the liquid sample or the measurement by the labeled particles not bound to the specimen, the determination unit in the membrane Is preferably provided at a position (for example, in the middle of the membrane) that is separated to some extent from the connection end with the conjugate pad and the connection end with the absorption pad.
前記抗体固定化部（判定部）における抗体固定化量は特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの０．１μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。
前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
The amount of antibody immobilization in the antibody immobilization part (determination part) is not particularly limited, but when the shape is a line, it is preferably 0.1 μg to 5 μg per unit length (cm). Examples of the immobilization method include a method in which an antibody solution is applied, dropped or sprayed and then dried and immobilized by physical adsorption.
After the above-described antibody immobilization, the whole membrane is preferably subjected to a so-called blocking treatment in order to prevent the influence of nonspecific adsorption on the measurement. For example, a method of immersing in a buffer solution containing a blocking agent such as albumin, casein, polyvinyl alcohol or the like for an appropriate period of time and then drying may be mentioned. Examples of the commercially available blocking agent include skim milk (manufactured by DIFCO), 4% block ace (manufactured by Meiji Dairies), and the like.
４）吸収パッド５
吸収パッド５は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた試料液体および標識粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマト法用テストストリップに用いられる部材が使用できるが、サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
前記テストストリップの作製法としては、試料添加用部材（サンプルパッド）、標識粒子含有部材（コンジュゲートパッド）、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
4) Absorption pad 5
The absorption pad 5 is a constituent member that absorbs the sample liquid and the labeled particles that have moved through the membrane by capillary action and always generates a constant flow.
There are no particular restrictions on the material of each of these constituent members, and members used for immunochromatographic test strips can be used. As sample pads and conjugate pads, glass such as Glass Fiber Conjugate Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE) is used. A fiber pad is preferable, a nitrocellulose membrane such as Hi-Flow Plus 120 membrane (trade name, manufactured by MILLIPORE) is preferable as the membrane, and a cellulose membrane such as Cellulose Fiber Sample Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE) is preferable as the absorbent pad. Is preferred.
Examples of the backing sheet with an adhesive include AR9020 (trade name, manufactured by Adhesives Research).
As a method for preparing the test strip, a capillary phenomenon is easily generated between the members in the order of the sample addition member (sample pad), the labeled particle-containing member (conjugate pad), the antibody-immobilized membrane, and the absorption pad. Therefore, it can produce by superimposing both ends of each of these members on adjacent members about 1 to 5 mm (preferably on a backing sheet).
次に本発明のイムノクロマト法用テストストリップを用いてなる検査方法について説明する。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップを用いてなる検査方法は、まず、検体を含む試料液体（サンプル）をサンプルパッドに滴下して行うことができる。サンプルに含まれる検体が一定量（目視検出可能量）以上であれば、テストラインの発色は目視で確認が可能であり、陽性あるいは陰性の判定ができる。
一方、検体が一定量以下のサンプルではテストラインの発色は目視では確認されないが、前記ストリップを、イムノクロマト法用蛍光検出装置を用いて観察することで陽性あるいは陰性の判定を高感度に行うことが可能である。このように、本発明のイムノクロマト法用テストストリップを用いてなる検査方法は、検体が一定量以上の場合は目視によって簡便かつ迅速に陽性の判定が可能であり、検体の量が一定以下の場合にはイムノクロマト法用蛍光検出装置を用いて高感度に判定することが可能である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップを用いてなる検査方法は、目視による判定を行った後、蛍光検出装置による高感度判定および／または定量測定を行うことが好ましい。
Next, an inspection method using the immunochromatographic test strip of the present invention will be described.
The test method using the immunochromatographic test strip of the present invention can be performed by first dropping a sample liquid (sample) containing a specimen onto a sample pad. If the sample contained in the sample is equal to or greater than a certain amount (amount that can be detected visually), the color of the test line can be visually confirmed, and a positive or negative determination can be made.
On the other hand, the color of the test line is not visually confirmed in samples with a certain amount or less, but the strip can be positively or negatively determined with high sensitivity by observing the strip using an immunochromatographic fluorescence detector. Is possible. As described above, the test method using the immunochromatographic test strip of the present invention can easily and quickly make a positive determination visually when the sample is a certain amount or more, and the sample amount is less than a certain amount. It is possible to determine with high sensitivity using a fluorescence detection apparatus for immunochromatography.
In the inspection method using the immunochromatographic test strip of the present invention, it is preferable to perform high-sensitivity determination and / or quantitative measurement using a fluorescence detection apparatus after visual determination.
次に、本発明に用いるイムノクロマト法用蛍光検出装置について説明する。
本発明に用いるイムノクロマト法用検出装置は、励起抗原およびフィルタからなる。
前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタと、さらに、蛍光のみを検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。
前記蛍光検出装置は、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから検体の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
Next, the fluorescence detection apparatus for immunochromatography used in the present invention will be described.
The detection apparatus for immunochromatography used in the present invention comprises an excitation antigen and a filter.
Examples of the excitation light source include a mercury lamp, a halogen lamp, a xenon lamp, a laser diode, and a light emitting diode. The filter is a filter for transmitting only light of a specific wavelength from an excitation light source, and further a filter that removes the excitation light and transmits only fluorescence from the viewpoint of detecting only fluorescence. It selects suitably from a fluorescence wavelength and a fluorescence wavelength.
The fluorescence detection apparatus may include a photomultiplier tube or a CCD detector that receives the fluorescence. As a result, fluorescence having an intensity or wavelength that cannot be visually confirmed can be detected. Further, since the fluorescence intensity can be measured, the specimen can be quantified, and highly sensitive detection and quantification are possible.
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１（本発明に用いる着色蛍光シリカナノ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）５．８ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに２．６μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液４００μｌにエタノール１２８ｍｌ、ＴＥＯＳ４００μｌ、蒸留水２８．８ｍｌ、２８質量％アンモニア水４００μｌを加え、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径１７２ｎｍのシリカナノ粒子９４．２ｍｇを得た。収率約８８％。
図２は、得られた標識シリカナノ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。図中、白く見える球形状物質が、得られた標識シリカナノ粒子である。
前記標識シリカナノ粒子１ｇ／ｌのコロイドの吸光度を測定し、シリカ粒子の密度を２．３ｍｇ／ｃｍ３として、粒子のモル吸光係数を求めたところ、７．４×１０７Ｍ−１ｃｍ−１であった。また、前記標識シリカナノ粒子１ｇ／ｌの蛍光強度を測定し、シリカ粒子の密度を２．３ｍｇ／ｃｍ３として、１粒子あたりの蛍光強度を求めたところ、１粒子あたりの蛍光強度は５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミンの８７０００個分に相当した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
Reference Example 1 (Preparation of colored fluorescent silica nanoparticles used in the present invention)
5.8 mg of 5- (and -6) -carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (trade name, manufactured by emp Biotech GmbH) was dissolved in 1 ml of dimethylformamide (DMF). 2.6 μl of APS was added thereto and reacted at room temperature (23 ° C.) for 1 hour.
Ethanol (128 ml), TEOS (400 μl), distilled water (28.8 ml) and 28% by mass ammonia water (400 μl) were added to the obtained reaction solution (400 μl), and the reaction was performed at room temperature for 24 hours.
The reaction solution was centrifuged for 30 minutes at a gravitational acceleration of 18000 × g, and the supernatant was removed. 4 ml of distilled water was added to the precipitated silica particles to disperse the particles, and the mixture was again centrifuged for 30 minutes at a gravitational acceleration of 18000 × g. This washing operation was further repeated twice to remove unreacted TEOS, ammonia and the like contained in the labeled silica nanoparticle dispersion, thereby obtaining 94.2 mg of silica nanoparticles having an average particle diameter of 172 nm. Yield about 88%.
FIG. 2 is a view showing an SEM photograph image of the obtained labeled silica nanoparticles. In the figure, spherical-shaped substances that appear white are the obtained labeled silica nanoparticles.
The absorbance of the colloid of the labeled silica nanoparticles 1 g / l was measured, and the molar extinction coefficient of the particles was determined by setting the density of the silica particles to 2.3 mg / cm 3 and found 7.4 × 10 7 M −1 cm −1. Met. Further, the fluorescence intensity of the labeled silica nanoparticles 1 g / l was measured, the silica particle density was 2.3 mg / cm 3 , and the fluorescence intensity per particle was determined. The fluorescence intensity per particle was 5- ( And -6) equivalent to 87000 of carboxytetramethylrhodamine.
参考例２（シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子の作製）
参考例１と同様な方法により得られた、濃度４０ｍｇ／ｍｌのローダミン含有シリカ粒子（平均粒径１８３ｎｍ）のコロイド５００μｌ（分散媒蒸留水）に、蒸留水２．９ｍｌと、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液（重量平均分子量７００００）４００μｌを加え、撹拌子でよく撹拌した。続いて、２８質量％のアンモニア水を２００μｌ加え、コロイドを室温（２３℃）で１時間撹拌した。得られたコロイドを１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去した。沈殿させた粒子に蒸留水を３．４ｍｌ加え、粒子を再分散させた。続いて、１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液を４００μｌ加え撹拌子でよく撹拌したあと、２８質量％のアンモニア水を２００μｌ加え、１時間撹拌した。このコロイドを１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水１ｍｌに分散させ、ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイドを得た（収量２０ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
Reference Example 2 (Production of Silica Particle / Alginic Acid Composite Particle)
In a 500 μl colloid (dispersion medium distilled water) of 40 mg / ml rhodamine-containing silica particles (average particle size 183 nm) obtained by the same method as in Reference Example 1, 2.9 ml distilled water and 10 mg / ml concentration. 400 μl of an aqueous sodium alginate solution (weight average molecular weight 70000) was added, and the mixture was well stirred with a stir bar. Subsequently, 200 μl of 28 mass% ammonia water was added, and the colloid was stirred at room temperature (23 ° C.) for 1 hour. The resulting colloid was centrifuged for 30 minutes at a gravitational acceleration of 15,000 × G, and the supernatant was removed. 3.4 ml of distilled water was added to the precipitated particles to redisperse the particles. Subsequently, 400 μl of 10 mg / ml sodium alginate aqueous solution was added and stirred well with a stir bar, and then 200 μl of 28% by mass of ammonia water was added and stirred for 1 hour. The colloid was centrifuged for 30 minutes at a gravitational acceleration of 15,000 × G. After removing the supernatant, 1 ml of distilled water was added to disperse the particles. Similarly, centrifugal separation twice and dispersion in distilled water were repeated to wash the particles, and the particles were dispersed in 1 ml of distilled water to obtain a colloid of rhodamine-containing silica particles / alginic acid composite particles (yield 20 mg / ml × 1 ml). ).
参考例３（粒子の抗ｈＣＧ抗体修飾）
参考例２で作製した濃度２０ｍｇ／ｍｌローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイド５００μｌに、０．５ＭのＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）を１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳを４６１μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを１５０μｌ、蒸留水を１．０８９ｍｌ加え、３０分間混合した。
反応液を１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、最後に５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに分散させた。ここに５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１ｍｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ マウスＩｇＧ１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１ｍｌ加え、２時間混合した。続いて１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を１００μｌ加え、さらに１時間混合した。
反応液を１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回、遠心分離と５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）への分散を繰り返して粒子を洗浄し、最後に５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに分散させ、抗ｈＣＧ抗体で修飾されたローダミン含有シリカ粒子のコロイドを得た（収量１０ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
Reference Example 3 (Particle anti-hCG antibody modification)
To 500 μl of a colloid of silica particles / alginate composite particles containing 20 mg / ml rhodamine-containing silica particles / concentration prepared in Reference Example 2, 100 μl of a 0.5 M MES (2-Morpholine ethersic acid) buffer (pH 6.0), 50 mg / ml NHS 461 μl, 19.2 mg / ml EDC 150 μl and distilled water 1.089 ml were added and mixed for 30 minutes.
The reaction solution was centrifuged at a gravitational acceleration of 15,000 × G for 30 minutes, and after removing the supernatant, 1 ml of distilled water was added to disperse the particles. In the same manner, centrifugation was repeated twice and dispersion in distilled water was repeated to wash the particles. Finally, the particles were dispersed in 1 ml of 50 mM KH 2 PO 4 buffer (pH 8.0). To this, 1 ml of 1 mg / ml anti-hCG antibody (Anti-hCG mouse IgG 1 manufactured by Medix Biochemical) dissolved in 50 mM KH 2 PO 4 buffer (pH 8.0) was added and mixed for 2 hours. Subsequently, 100 μl of a 100 mg / ml BSA solution was added and further mixed for 1 hour.
The reaction solution was centrifuged at a gravitational acceleration of 15,000 × G for 30 minutes, and after removing the supernatant, 1 ml of 50 mM KH 2 PO 4 buffer (pH 8.0) was added to disperse the particles. Similarly twice more, by repeating the dispersion into KH 2 PO 4 buffer centrifugation and 50 mM (pH 8.0) to wash the particles, finally KH 2 PO 4 buffer 50 mM (pH 8.0) 1 ml To obtain a colloid of rhodamine-containing silica particles modified with an anti-hCG antibody (yield 10 mg / ml × 1 ml).
実施例１（着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有したコンジュゲートパッドの作製）
粒径０．１６μｍ、濃度１０ｍｇ／ｍｌの着色ラテックス粒子（ＤＣ０２Ｂ／５６４１，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１ｍｌについて、参考例３と同様の方法で抗ｈＣＧ抗体を修飾し、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）に分散した抗ｈＣＧ抗体で修飾された着色ラテックス粒子コロイド１ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。
続いて、粒径０．１９μｍ、濃度１０ｍｇ／ｍｌの蛍光ラテックス粒子（ＦＳ０２Ｆ／８２３４、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１ｍｌについて、参考例３と同様の方法で抗ｈＣＧ抗体を修飾し、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）に分散した抗ｈＣＧ抗体で修飾された蛍光ラテックス粒子コロイド１ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。
前記抗ｈＣＧ抗体で修飾された着色ラテックス粒子コロイド（１０ｍｇ／ｍｌ）０．０５ｍｌと、前記抗ｈＣＧ抗体で修飾された蛍光ラテックス粒子コロイド（１０ｍｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌと、５０ｍｇ／ｍｌのスクロース３ｍｌと、蒸留水１．７ｍｌを混合した。
得られた混合コロイドの着色ラテックス粒子の重量濃度は０．１［ｍｇ／ｍｌ］、蛍光ラテックス粒子の重量濃度は０．５［ｍｇ／ｍｌ］である。また着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子の密度はどちらも１．０５［ｍｇ／ｍｌ］である。着色ラテックス粒子の平均粒径を１６０ｎｍ、蛍光ラテックス粒子の平均粒径を１９０ｎｍとして、前記式１より混合コロイド１ｍｌ中の着色ラテックス粒子の表面積の和および蛍光ラテックス粒子の表面積の和を求めると、着色ラテックス粒子の表面積の和は３．６×１０−３［ｍ２］であり、混合コロイド１ｍｌ中の蛍光ラテックス粒子の表面積は１．５×１０−２［ｍ２］である。よって本混合コロイドにおいて、着色ラテックス粒子の表面積の和は、蛍光ラテックス粒子の表面積の和の２４％である。
続いて前記混合粒子コロイドをＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、８×１５０ｍｍ）１枚に対し０．８ｍｌ含有させた。前記混合コロイド０．８ｍｌに含まれる標識粒子の重量は４８０μｇ、前記Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄの面積は１２ｃｍ２であるから、本コンジュゲートパッドの標識粒子の含有量は４０μｇ／ｃｍ２である。
Example 1 (Preparation of a conjugate pad containing both colored latex particles and fluorescent latex particles)
About 1 ml of colored latex particles (DC02B / 5641, manufactured by Bangs Laboratories) having a particle size of 0.16 μm and a concentration of 10 mg / ml, an anti-hCG antibody was modified in the same manner as in Reference Example 3, and 50 mM KH 2 PO 4 buffer solution was used. 1 ml (10 mg / ml) of colored latex particle colloid modified with anti-hCG antibody dispersed in (pH 8.0) was obtained.
Subsequently, with respect to 1 ml of fluorescent latex particles (FS02F / 8234, manufactured by Bangs Laboratories) having a particle size of 0.19 μm and a concentration of 10 mg / ml, the anti-hCG antibody was modified in the same manner as in Reference Example 3, and 50 mM KH 2 PO 1 ml (10 mg / ml) of fluorescent latex particle colloid modified with anti-hCG antibody dispersed in 4 buffers (pH 8.0) was obtained.
0.05 ml of colored latex particle colloid (10 mg / ml) modified with the anti-hCG antibody, 0.25 ml of fluorescent latex particle colloid (10 mg / ml) modified with the anti-hCG antibody, and 3 ml of 50 mg / ml sucrose And 1.7 ml of distilled water were mixed.
The weight concentration of the colored latex particles of the obtained mixed colloid is 0.1 [mg / ml], and the weight concentration of the fluorescent latex particles is 0.5 [mg / ml]. The densities of the colored latex particles and fluorescent latex particles are both 1.05 [mg / ml]. When the average particle diameter of the colored latex particles is 160 nm and the average particle diameter of the fluorescent latex particles is 190 nm, the sum of the surface area of the colored latex particles and the sum of the surface areas of the fluorescent latex particles in 1 ml of the mixed colloid is obtained by the above formula 1. The sum of the surface areas of the latex particles is 3.6 × 10 −3 [m 2 ], and the surface area of the fluorescent latex particles in 1 ml of the mixed colloid is 1.5 × 10 −2 [m 2 ]. Therefore, in this mixed colloid, the sum of the surface areas of the colored latex particles is 24% of the sum of the surface areas of the fluorescent latex particles.
Subsequently, 0.8 ml of the mixed particle colloid was added to one Glass Fiber Conjugate Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE, 8 × 150 mm). Since the weight of labeled particles contained in 0.8 ml of the mixed colloid is 480 μg and the area of the Glass Fiber Conjugate Pad is 12 cm 2 , the content of the labeled particles in this conjugate pad is 40 μg / cm 2 .
着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の混合粒子を含有させたＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄは薄い青色であり、パッドに粒子が含有されていることが目視で確認できた。
比較として、前記抗ｈＣＧ抗体を修飾した蛍光ラテックス粒子コロイド（１０ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌと、５０ｍｇ／ｍｌのスクロース３ｍｌと、蒸留水１．７ｍｌを混合して得られた蛍光ラテックス粒子コロイドをＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、８×１５０ｍｍ）１枚に対し０．８ｍｌ含有させた。蛍光ラテックス粒子を含有したＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄは無色であり、パッドに粒子が含有されていることが目視で確認できなかった。
The Glass Fiber Conjugate Pad containing mixed particles of colored latex particles and fluorescent latex particles is a light blue color, and it can be visually confirmed that the pads contain particles.
For comparison, the fluorescent latex particle colloid obtained by mixing 0.3 ml of the fluorescent latex particle colloid (10 mg / ml) modified with the anti-hCG antibody, 3 ml of 50 mg / ml sucrose, and 1.7 ml of distilled water was added to Glass. 0.8 ml of Fiber Conjugate Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE, 8 × 150 mm) was contained. The Glass Fiber Conjugate Pad containing the fluorescent latex particles was colorless, and it was not possible to visually confirm that the particles were contained in the pad.
実施例２（着色蛍光シリカ粒子を含有したコンジュゲートパッドの作製）
参考例３で作製した、抗ｈＣＧ抗体で修飾された着色蛍光シリカ粒子（１０ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌと、５０ｍｇ／ｍｌスクロース３ｍｌと、蒸留水１．７ｍｌを混合した。得られた着色蛍光シリカ粒子コロイドをＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、８×１５０ｍｍ）１枚に対し０．８ｍｌ含有させた。粒子を含有させたＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄは薄い赤色であり、パッドに粒子が含有されていることが目視で確認できた。
Example 2 (Preparation of conjugate pad containing colored fluorescent silica particles)
0.3 ml of colored fluorescent silica particles (10 mg / ml) modified with an anti-hCG antibody prepared in Reference Example 3, 3 ml of 50 mg / ml sucrose, and 1.7 ml of distilled water were mixed. 0.8 ml of the colored fluorescent silica particle colloid obtained was added to one Glass Fiber Conjugate Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE, 8 × 150 mm). The Glass Fiber Conjugate Pad containing the particles was light red, and it was confirmed visually that the pads contained particles.
実施例３（着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の混合粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したイムノクロマト法用テストストリップを用いたリコンビナントｈＣＧの検出）
（１）抗体固定化メンブレンの作製
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の中央付近（端から約１２ｍｍ）に幅約１ｍｍのテストラインとして抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ）， ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー中に室温で３０分浸した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分静置した。メンブレンを引上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、抗体固定化メンブレンを作製した。
前記得られたメンブレン、実施例１で得られた着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の混合粒子を含有したコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図１ａ及びｂに示した構成のテストストリップを得た。図１ａ及びｂについては前述の通りである。
なお、各構成部材は、図１ａ及びｂに示しているように各々その両端を隣接する部材と２ｍｍ程度重ね合わせて貼付した（以下、同様である。）。
Example 3 (Detection of recombinant hCG using immunochromatographic test strip prepared using a conjugate pad containing a mixture of colored latex particles and fluorescent latex particles)
(1) Preparation of antibody-immobilized membrane Anti-hCG antibody (alpha subunit of of the test) with a width of about 1 mm around the center (about 12 mm from the end) of the membrane (length 25 mm, trade name Hi-Flow Plus120 membrane, manufactured by MILLIPORE) A solution ((50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0) + 5% sucrose) containing 1 mg / mL of FSH (LH), clone code / 6601, manufactured by Medix Biochemica was applied at a coating amount of 0.75 μL / cm.
Subsequently, as a control line having a width of about 1 mm, a solution ((50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0) sugar free) containing 1 mg / mL of anti-IgG antibody (Anti Mouse IgG, manufactured by Dako) was added at 0.75 μL / cm. The coating amount was applied and dried at 50 ° C. for 30 minutes.
Next, the entire membrane was immersed in a blocking buffer for 30 minutes at room temperature as a blocking treatment.
The membrane was transferred to a membrane washing / stabilization buffer and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The membrane was pulled up, placed on a paper towel and dried overnight at room temperature to prepare an antibody-immobilized membrane.
The obtained membrane, a conjugate pad containing mixed particles of colored latex particles and fluorescent latex particles obtained in Example 1, a sample pad (Glass Fiber Conjugate Pad (GFCP), manufactured by MILLIPORE), an absorption pad (Cellulose) A fiber sample pad (CFSP) (manufactured by MILLIPORE) is assembled on a backing sheet (trade name AR9020, manufactured by Adhesives Research) and cut into a strip of 5 mm width and 60 mm length, and the structure shown in FIGS. A test strip was obtained, as described above with reference to FIGS.
In addition, as shown to FIG. 1 a and b, each component was affixed and bonded about 2 mm with the member which adjoined each other (it is the same hereafter).
（２）リコンビナントｈＣＧの検出
１００，５０，２０，１０，５，２，０．２ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）１００μＬを前記ストリップのサンプルパッド部分に１００μＬ滴下し、五分間放置し、目視で抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ）， ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を塗布したライン（テストライン）および、抗ＩｇＧ抗体を塗布したライン（コントロールライン）の発色を確認したところ、リコンビナントｈＣＧが１００，５０，２０ＩＵ／Ｌの場合は目視でテストラインおよびコントロールラインの発色が確認できた。リコンビナントｈＣＧが１０，５，２，０．２ＩＵ／Ｌのときは目視ではテストラインの発色は確認されなかった。
続いて、励起光源側のフィルタとしてＦＦ０１−４８２（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）、検出器側のフィルタとしてＦＦ０１−５３６（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）を用い、前記リコンビナントｈＣＧが１０，５，０．２ＩＵ／Ｌのサンプルを滴下したテストストリップを水銀ランプ（１０３Ｗ）で照射し、検出器としてＣＣＤ検出器（Ｃ２７４１−３５Ａ（商品名、浜松ホトニクス社製））を用いて蛍光の画像化を行った。その結果リコンビナントｈＣＧが１０，５，２，０．２ＩＵ／Ｌの何れのサンプルについても、テストラインおよびコントロールラインの蛍光発色を確認した。
以上の結果から、前記着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の混合粒子を用いた前記テストストリップはリコンビナントｈＣＧが２０ＩＵ／Ｌ以上の場合は目視で簡単に確認でき、リコンビナントｈＣＧが２０〜０．２ＩＵ／Ｌのときであっても蛍光検出装置で判定が可能である。
(2) Detection of recombinant hCG 100 μL of 100, 50, 20, 10, 5, 2, 0.2 IU / L of recombinant hCG (manufactured by Rohto Pharmaceutical Co., Ltd.) was dropped on the sample pad portion of the strip and left for 5 minutes. Visually confirm the color development of the line (test line) coated with anti-hCG antibody (alpha subunit of FSH (LH), clone code / 6601, manufactured by Medix Biochemica) and the line coated with anti-IgG antibody (control line) As a result, when the recombinant hCG was 100, 50, and 20 IU / L, the color development of the test line and the control line was confirmed visually. When the recombinant hCG was 10, 5, 2, 0.2 IU / L, no color development on the test line was visually confirmed.
Subsequently, FF01-482 (trade name, manufactured by Semrock) is used as the filter on the excitation light source side, and FF01-536 (trade name, manufactured by Semrock) is used as the filter on the detector side, and the recombinant hCG is 10, 5, 0. .2 IU / L sample-dropped test strip is irradiated with a mercury lamp (103W), and fluorescence is imaged using a CCD detector (C2741-35A (trade name, manufactured by Hamamatsu Photonics)) as a detector. It was. As a result, the fluorescent color development of the test line and the control line was confirmed for any sample having the recombinant hCG of 10, 5, 2, and 0.2 IU / L.
From the above results, the test strip using the mixed particles of colored latex particles and fluorescent latex particles can be easily confirmed visually when the recombinant hCG is 20 IU / L or more, and the recombinant hCG is 20 to 0.2 IU / L. Even in this case, the determination can be made by the fluorescence detection device.
実施例４（着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したイムノクロマト法用テストストリップを用いたリコンビナントｈＣＧの検出）
コンジュゲートパッドとして、実施例２で得られた着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いた以外は実施例３（１）と同じ方法で作製したテストストリップを用いて、実施例３（２）と同じ方法でリコンビナントｈＣＧの検出を行った。その結果、リコンビナントｈＣＧが１００，５０ＩＵ／Ｌの場合は目視でテストラインおよびコントロールラインの発色が確認できた。リコンビナントｈＣＧが２０，１０，５，２，０．２ＩＵ／Ｌのときは目視ではテストラインの発色は確認されなかった。蛍光検出装置を用いた評価においては、リコンビナントｈＣＧが２０，１０，５，２，０．２ＩＵ／Ｌの何れのサンプルについても、テストラインおよびコントロールラインの蛍光発色を確認した。
以上の結果から、前記着色蛍光シリカ粒子を用いた前記テストストリップはリコンビナントｈＣＧが５０ＩＵ／Ｌ以上の場合は目視で簡単に確認でき、リコンビナントｈＣＧが５０〜０．２ＩＵ／Ｌのときであっても蛍光検出装置で判定が可能である。
Example 4 (Detection of recombinant hCG using immunochromatographic test strip prepared using a conjugate pad containing colored fluorescent silica particles)
A test strip produced in the same manner as in Example 3 (1) except that the conjugate pad containing the colored fluorescent silica particles obtained in Example 2 was used as the conjugate pad. Recombinant hCG was detected by the same method as 2). As a result, when the recombinant hCG was 100, 50 IU / L, the color development of the test line and the control line could be confirmed visually. When the recombinant hCG was 20, 10, 5, 2, 0.2 IU / L, the color development of the test line was not visually confirmed. In the evaluation using the fluorescence detection apparatus, the fluorescence development of the test line and the control line was confirmed for any sample having the recombinant hCG of 20, 10, 5, 2, 0.2 IU / L.
From the above results, the test strip using the colored fluorescent silica particles can be easily confirmed visually when the recombinant hCG is 50 IU / L or more, even when the recombinant hCG is 50 to 0.2 IU / L. Determination can be made with a fluorescence detection device.
実施例５（長期放置後のテストストリップを用いたリコンビナントｈＣＧの検出評価）
実施例１に記載の着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップと、実施例１に記載の蛍光ラテックス粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップと、実施例２に記載の着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップそれぞれを、室温で９ヶ月間放置した。
９ヶ月間放置後のテストストリップに、１００，５０，２０，１０，５，３ＩＵ／ｌのリコンビナントｈＣＧを滴下し、ラインの検出を行ったところ、着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の混合粒子を含有させたテストストリップは、リコンビナントｈＣＧが２０ＩＵ／Ｌ以上であれば目視でテストラインおよびコントロールラインの発色が確認でき、着色蛍光シリカ粒子を含有させたテストストリップは、リコンビナントｈＣＧが５０ＩＵ／Ｌ以上であれば目視でテストラインおよびコントロールラインの発色が確認できた。一方、蛍光ラテックス粒子を含有させたテストストリップでは何れの濃度のリコンビナントｈＣＧを滴下した場合でも、目視によるテストラインおよびコントロールラインの発色の確認、および蛍光検出器によるテストラインおよびコントロールラインの蛍光発色の確認が共にできなかった。
以上の結果から、着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップおよび着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップは長期保存に適していることが分かる。
Example 5 (Detection evaluation of recombinant hCG using a test strip after being left for a long time)
Using a test strip prepared using a conjugate pad containing both colored latex particles and fluorescent latex particles described in Example 1, and using a conjugate pad containing fluorescent latex particles described in Example 1 Each of the prepared test strip and the test strip prepared using the conjugate pad containing the colored fluorescent silica particles described in Example 2 was allowed to stand at room temperature for 9 months.
100, 50, 20, 10, 5, 3 IU / l of recombinant hCG was dropped on the test strip after standing for 9 months, and when the line was detected, it contained mixed particles of colored latex particles and fluorescent latex particles As long as the recombinant hCG has a recombinant hCG of 20 IU / L or higher, the color of the test line and the control line can be visually confirmed. The test strip containing the colored fluorescent silica particles should have a recombinant hCG of 50 IU / L or higher. As a result, color development of the test line and the control line could be confirmed visually. On the other hand, in the test strip containing fluorescent latex particles, the color development of the test line and the control line by visual observation is confirmed, and the color development of the test line and the control line by the fluorescence detector is observed regardless of the concentration of the recombinant hCG. We could not confirm both.
Based on the above results, test strips prepared using conjugate pads containing both colored latex particles and fluorescent latex particles and test strips prepared using conjugate pads containing colored fluorescent silica particles are stored for a long time. It turns out that it is suitable for.
実施例６（リコンビナントｈＣＧの検出にもちいたテストストリップの長期放置後のライン発色確認の可否の評価）
実施例１に記載の着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップと、実施例１に記載の蛍光ラテックス粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップと、実施例２に記載の着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップそれぞれについて、５０ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧを１００μＬ滴下し、テストラインとコントロールラインを発色させた。このテストストリップを室温で１０ヶ月間放置した。
その結果、蛍光ラテックス粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップは目視によっても、蛍光検出器を用いてもコントロールライン及びテストラインの発色または蛍光発色が確認できなかった。着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップおよび着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップは目視でコントロールライン及びテストラインの発色が確認できた。
以上の結果から、着色ラテックス粒子と蛍光ラテックス粒子の両方を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップおよび着色蛍光シリカ粒子を含有させたコンジュゲートパッドを用いて作製したテストストリップは、検査後のテストストリップを検査結果として長期間保存するのに適していることが分かる。
Example 6 (Evaluation of whether or not line coloring can be confirmed after leaving a test strip for a long period of time for detection of recombinant hCG)
Using a test strip prepared using a conjugate pad containing both colored latex particles and fluorescent latex particles described in Example 1, and using a conjugate pad containing fluorescent latex particles described in Example 1 100 μL of 50 IU / L of recombinant hCG was dropped on each of the prepared test strip and the test strip prepared using the conjugate pad containing the colored fluorescent silica particles described in Example 2, and the test line and the control line were separated. Color was developed. The test strip was left at room temperature for 10 months.
As a result, the test strip produced using the conjugate pad containing the fluorescent latex particles could not confirm the color development or the color development of the control line and the test line by visual observation or by using a fluorescence detector. Test strips made using conjugate pads containing both colored latex particles and fluorescent latex particles and test strips made using conjugate pads containing colored fluorescent silica particles are visually control lines and test lines. The color development was confirmed.
Based on the above results, test strips made using conjugate pads containing both colored latex particles and fluorescent latex particles and test strips made using conjugate pads containing colored fluorescent silica particles were tested. It can be seen that the later test strip is suitable for long-term storage as a test result.
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ 抗体固定化メンブレン
５ 吸収パッド
６ バッキングシート
1 Test strip 2 Sample pad 3 Conjugate pad 4 Antibody-immobilized membrane 5 Absorbent pad 6 Backing sheet
Claims (11)
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、
前記標識粒子（Ａ）による着色を指標にした目視判定を実施し、該目視判定により検体を検出できない場合に、前記標識粒子（Ｂ）の蛍光を指標にした判定を実施することを特徴とする方法。 In a liquid sample, a test strip comprising a conjugate pad containing a labeled particle (A) whose surface is colored with an antibody and a labeled particle (B) whose surface is modified with an antibody is used. A method for detecting a sample of the sample by immunochromatography,
The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
Visual determination is performed using the coloring by the labeled particles (A) as an index, and when the specimen cannot be detected by the visual determination, determination using the fluorescence of the labeled particles (B) is performed. Way .
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
前記コンジュゲートパッド中の標識粒子の含有量が２０〜２００μｇ／ｃｍThe content of the labeled particles in the conjugate pad is 20 to 200 μg / cm ２2 であり、前記コンジュゲートパッドに含有された着色粒子の表面積の和が、前記コンジュゲートパッドに含有された蛍光粒子の表面積の和の１〜５０％であることを特徴とする、イムノクロマト法用コンジュゲートパッド。And the sum of the surface areas of the colored particles contained in the conjugate pad is 1 to 50% of the sum of the surface areas of the fluorescent particles contained in the conjugate pad. Gate pad.
前記標識粒子の平均粒径が２０〜１０００ｎｍであり、The labeling particles have an average particle size of 20 to 1000 nm,
前記コンジュゲートパッド中の前記標識粒子の含有量が２０〜２００μｇ／ｃｍThe content of the labeled particles in the conjugate pad is 20 to 200 μg / cm ２2 であることを特徴とする、イムノクロマト法用コンジュゲートパッド。A conjugate pad for immunochromatography, characterized in that
前記標識粒子（Ａ）及び前記標識粒子（Ｂ）の平均粒径がいずれも２０〜１０００ｎｍであり、The average particle diameter of the labeled particles (A) and the labeled particles (B) is 20 to 1000 nm,
イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造に用いるコロイド溶液。A colloidal solution used for the production of a conjugate pad for immunochromatography.
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