JP5080103B2 - ヌクレオチド修飾微小管の合成方法および保存方法 - Google Patents
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Description
H. Hess, et al., "Light-controlled Molecular Shuttles Made from Motor Proteins Carrying Cargo on Engineered Surfaces," Nano Letters, vol.1, no.5, pp.235-239, 2001.
(微小管の調製)
ブタ脳などから抽出・精製したα-,β-チューブリン溶液(40〜60μM)に、1mM GTP、1mM MgSO4を加えて混合し、37℃で30分間インキュベートする。その後、80μM タキソールを加えて重合した微小管を安定化させ、室温にて静置する。
(微小管−化学架橋剤の複合体の合成)
上記手順にて調製した微小管溶液に、例えば脱水DMSO(dimethyl sulphoxide)にて濃度調整した2.5mM Sulfo-GMBS(22324、PIERCE社製)を加えて混合し、遮光した状態で室温にて30分間インキュベートする。この間、図1に示すように、微小管のアミノ基とSulfo-GMBSのスクシイミドが化学反応する。
(微小管−化学架橋剤−ヌクレオチドの複合体の合成)
上記手順にて調製した微小管−化学架橋剤の複合体溶液と、同程度の濃度の5'末端をチオール化した ssDNAとを混合し、遮光した状態で室温にて90分間インキュベートする。この間、図2に示すように、微小管にラベルされたSulfo-GMBSのマレイミドとssDNAのチオールが化学反応する。なお、ssDNAの鎖長や塩基配列は任意のものでよく、3'末端がチオール化されたものでもよい。また、チオール化されていない他方の末端には、TAMRAやFITCなどの蛍光色素を付けておくと、ヌクレオチドが微小管にラベルされた結果を、蛍光顕微鏡で視覚的に確認できるので便利である。チオールや蛍光色素で末端修飾したssDNAは、SIGMA社やOPERON社などの受託合成会社から容易に入手できるが、ジスルフィド結合を防ぐための保護基を付けた状態で納入されることが多く、本合成手順を踏む前に、各社が推奨する方法で保護基を外す必要がある。また、納入されたssDNA濃度が薄い場合には、凍結乾燥手順を経て濃縮することが必要となる。
(合成したヌクレオチド修飾微小管の評価)
ヌクレオチドが微小管にラベルされた結果は、ヌクレオチドの一方の末端に、蛍光色素を標識していれば、蛍光顕微鏡観察を行うことによって視覚的に確認することができる。例えば、5'末端をチオール化し、3'末端を蛍光色素TAMRAにて標識した10塩基の一本鎖部分を有するssDNAを微小管にラベルした結果を、TAMRAの蛍光を通すフィルタ(WIG)を通じて蛍光顕微鏡観察すると、図3(a)に示すように、繊維状の微小管が確認できる。一方、TAMRAの蛍光を通さないフィルタ(NIBA)を通じて蛍光顕微鏡観察しても、図3(b)に示すように、何も映らない。これらのことから、ヌクレオチドが微小管にラベルされていることが視覚的に分かる。
(ヌクレオチド修飾微小管の脱重合と保存)
上記手順にて調製した微小管−化学架橋剤−ヌクレオチドの複合体溶液を、超遠心分離機によって遠心分離し(30krpm、25℃、10分)、そのペレット成分を氷冷した緩衝溶液B(80mM PIPES-KOH pH 6.8、1mM MgCl2、1mM EGTA)で懸濁し、4℃で30分間インキュベートする。または、コルセミドなどの脱重合剤を加えることで、ヌクレオチド修飾微小管を脱重合させてもよい。
(ヌクレオチド修飾微小管の再合成)
上記手順で保存したヌクレオチド修飾チューブリン溶液を溶解し、緩衝溶液B、1mM GTP、1mM MgSO4を加えて混合し、37℃で30分間インキュベートする。この際に、必要に応じてグリセロールを追加して重合能を上げてもよい。また、ヌクレオチドを修飾していない野生型チューブリンを適度に配合すると、微小管に対するヌクレオチドのラベル率を自由に変更することができる。そして、ヌクレオチド修飾チューブリンとは異なる塩基配列を有するヌクレオチドを修飾したチューブリンも適度に配合すると、複数種類の塩基配列を有するヌクレオチドを修飾した微小管を合成することができる。
Claims (8)
- 重合後に安定化させた微小管と、スクシイミドおよびマレイミドを有する化学架橋剤のスクシイミドとを反応させて微小管−化学架橋剤の複合体を合成し、
前記微小管−化学架橋剤の複合体のマレイミドと、3'末端又は5'末端をチオール化したヌクレオチドとを反応させて微小管−化学架橋剤−ヌクレオチド複合体を合成する
工程を含み、
前記化学架橋剤は、MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、Sulfo-MBS、SMPB(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)、Sulfo-SMPB、
GMBS(N-[γ-maleimidobutyryloxy]succinimide ester)、Sulfo-GMBS、
EMCS(N-[ε-maleimidocaproyloxy]succinimide ester)、Sulfo-EMCSから選択されることを特徴とする、ヌクレオチド修飾微小管の合成方法。 - 前記化学架橋剤の分子量は280〜460Daであることを特徴とする請求項1に記載のヌクレオチド修飾微小管の合成方法。
- 前記ヌクレオチドは、一本鎖部分を有するデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であることを特徴とする請求項1に記載のヌクレオチド修飾微小管の合成方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のヌクレオチド修飾微小管の合成方法によって微小管−化学架橋剤−ヌクレオチド複合体を合成し、
前記微小管−化学架橋剤−ヌクレオチド複合体の溶液を冷却、または前記複合体の溶液に脱重合剤を加えることによって、ヌクレオチド修飾微小管を脱重合させてヌクレオチド修飾チューブリンとし、
前記ヌクレオチド修飾チューブリンを急速凍結して保存する
ことを特徴とするヌクレオチド修飾微小管の保存方法。 - 前記急速凍結を行う前に、前記ヌクレオチド修飾チューブリンの重合と、前記ヌクレオチド修飾微小管の脱重合とを複数回繰り返す、
工程をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載のヌクレオチド修飾微小管の保存方法。 - 請求項4または5に記載の方法で前記ヌクレオチド修飾チューブリンを急速凍結し、
前記急速凍結されたヌクレオチド修飾チューブリンを溶解してヌクレオチド修飾チューブリンの溶解液とし、
前記ヌクレオチド修飾チューブリンの溶解液に、グアノシン三リン酸(GTP)とマグネシウムイオンを混合して混合溶液とし、
前記混合溶液を加温して、前記ヌクレオチド修飾チューブリンを再重合させて前記ヌクレオチド修飾微小管を再合成する
ことを特徴とするヌクレオチド修飾微小管の再合成方法。 - 前記混合溶液に、ヌクレオチドを修飾していない野生型チューブリンを添加する工程、
をさらに含むことを特徴とする請求項6に記載のヌクレオチド修飾微小管の再合成方法。 - 前記混合溶液に、前記急速凍結したヌクレオチド修飾チューブリンとは異なる塩基配列を有するヌクレオチドを修飾したチューブリンを添加する工程、
をさらに含むことを特徴とする請求項6または7に記載のヌクレオチド修飾微小管の再合成方法。
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