JP5074934B2 - 微粒子濃度計測装置及び微粒子濃度計測方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば血球や無機粒子などの微粒子を含有する液体中の微粒子濃度を計測するための微粒子濃度計測チップ、微粒子濃度計測方法及び計測装置に関し、より詳細には、微粒子含有液体が通過する流路にアパーチャ部が設けられており、該アパーチャ部において通過する微粒子数をカウントする構造を備えた微粒子濃度計測チップと、並びに該微粒子濃度計測チップを用いた微粒子濃度計測装置及び計測方法に関する。

従来、液体中の微粒子の数を計測する装置として、コールターカウンターがー広く知られている。コールターカウンターでは、装置内部に設けられた液収容部からポンプにより、微粒子含有液体が流路に供給される。この流路の一部に、例えば、微粒子が１つだけ通過し得る、幅の細いアパーチャ部が設けられている。アパーチャ部を微粒子が通過する際のインピーダンス変化により、微粒子の通過が確認され、それによって通過した微粒子の数がカウントされている。この種のコールターカウンターでは、赤血球などの細胞や、ラテックス粒子あるいは無機粒子などの微粒子の数を測定することができる。

特許文献１には、このようなコールターカウンターの一例としての細胞数計測装置が開示されている。ここでは、マイクロ流路及びアパーチャ部が設けられたカートリッジが、計測部を有する計測装置本体に着脱可能とされている。着脱されるカートリッジに、上記アパーチャ部が設けられたマイクロ流路と、該アパーチャ部におけるインピーダンス変化を測定するための一対の電極とが配置されている。より具体的には、マイクロ流路のアパーチャ部を設けた部分の下流側部分が第１，第２の分岐流路に分岐されている。第１，第２の分岐流路に、それぞれ、上記電極が配置されている。カートリッジを計測装置本体に装着すると、一対の電極が計測部と電気的に接続される。そして、細胞がアパーチャ部を通過した際の一対の電極間のインピーダンス変化により細胞がカウントされる。

特許文献１に記載の細胞数計測装置では、上記インピーダンス変化により細胞を検出し、細胞数をカウントすることができる。しかしながら、細胞が含有されている液体における細胞の濃度、すなわち液状の検体中の微粒子の濃度を知るには、一定量の検体に対する微粒子の数を検出しなければならない。

多量の液体の検体を流すことができる通常の微粒子カウンターでは、供給される液体の量を一定量とすればカウントされた微粒子の数に基づき、微粒子の濃度を知ることができる。しかしながら、例えば、１０ｎＬ〜５００μＬ程度の非常に少量の液状の検体が供給される径、すなわちマイクロ流路と一般的に知られているような小さな流路が形成されているシステムでは、マイクロ流路内における液状の検体の量を一定に制御することは非常に困難であった。加えて、表面張力や圧力損失の影響により、流路の上流端及び下流端における流速が一定になり難かった。そのため、予め計量された一定の微量の液体を微細流路に導入し、アパーチャ部において微粒子の数をカウントしたとしても、供給された液体とカウントされた微粒子の数とを正確に対応させることが困難であった。

そこで、特許文献１では、アパーチャ部の下流の特定の位置に液状の検体が到達したことを検出する液検出部が設けられている。ここでは、アパーチャ部から上記特定の位置までの流路の容量が一定の容量とされている。従って、検出部により検体が特定位置に到達したことを検出した場合に、計測機本体からの制御により液の供給を停止する。それによって、アパーチャ部を通過した液状の検体の量が一定量とされている。
特開２００７−１７３０３号公報

特許文献１に記載の細胞数計測装置では、上記液検出部により液状の検体が特定の位置に到達したことが検出され、計測機本体が液の供給を停止することにより、アパーチャ部を通過した液体の量が一定量に制御されている。

従って、マイクロ流路に微量の液状の検体が供給される、非常に小型の細胞数計測装置において、細胞数の液状の検体中に占める割合、すなわち濃度を検出することが可能とされている。

しかしながら、上記液検出部として、特定位置に液状の検体が到達したことを検出するセンサなどを設けねばならなかった。また、上記センサからの出力により計測機本体が液の供給を停止するように制御しなければならなかった。さらに、液の供給を停止する装置も必要であった。そのため、装置全体が複雑になりがちであった。

加えて、上記のようにして、液状の検体の供給を停止したとしても、マイクロ流路内の圧力勾配が緩和されるまでには、ある程度の時間が必要であった。そのため、計測機本体からの制御により、液状の検体の供給が停止されたとしても、アパーチャ部における実際の液体の流れは直ちに停止せず、時間遅れが生じざるを得なかった。よって、アパーチャ部を通過する液体の量を正確に一定量に制御することも困難であった。

本発明の目的は、上述した従来技術の欠点を解消し、液状の検体を検出する装置や、液体の検体の供給を制御する装置及び制御を必要とせず、さらに確実に一定量の微量の液状の検体をアパーチャ部を通過させることを可能とする、微粒子濃度計測チップ、該微粒子濃度計測チップを用いた微粒子濃度計測装置及び微粒子濃度計測方法を提供することにある。

本発明によれば、微粒子含有液体の微粒子濃度を計測する微粒子濃度計測装置であって、微粒子含有液体が導入されるサンプル導入部を備えたチップ本体を有し、前記チップ本体内に、前記サンプル導入部に連ねられた流路が形成されており、該流路の一部が通過する際の微粒子数を検出するために、該流路の他の部分に比べて狭くされているアパーチャ部が設けられており、前記アパーチャ部の下流側に接続された一定容量の流路部分を介して前記アパーチャ部に接続されており、前記微粒子含有液体を停止させるストップバルブをさらに備える微粒子濃度計測チップと、前記微粒子濃度計測チップの前記アパーチャ部を通過する微粒子数をカウントするための検出手段と、前記検出手段から得られた単位時間あたりの微粒子数から、微粒子の頻度データを算出し、該頻度データから、予め定められた安定指標を満たす所定の安定期間を求め、安定期間中の頻度データを算出し、全頻度変動データが得られる時間に対する安定期間の比と、前記アパーチャ部と前記ストップバルブとの間の流路部分の前記一定容量との積と、前記安定期間中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数とから微粒子濃度を求める制御装置とを備えることを特徴とする微粒子濃度計測装置が提供される。

上記ストップバルブは、様々なバルブにより形成することができる。好ましくは、ストップバルブはラプラス圧を利用した受動型の液体停止バルブからなる、その場合には、細絞り、スリット、細管の部分重ね合わせ、堰構造により構成することができる。

また、ストップバルブは、流路の内壁に一端が接続されて微粒子含有液体の圧力により流路内で変形し、流路を閉塞する可撓性材料からなる弁体であってもよい。この場合には、上記可撓性材料からなる弁体を流路内に設けるだけでよいため、安価に、かつ単純な構成でストップバルブを形成することができる。その場合には、片持ち弁、両持ち弁、スリット、未接着可撓性障害といった構成をとることができる。

さらに、上記ストップバルブは、流路内に配置された多孔質体からなるものであってもよい。この場合には、多孔質体を流路内に配置するだけで、ストップバルブを容易に形成することができる。多孔質体としては、焼結体、連泡体、粒子凝集体といった材料を用いることができる。

本発明に係る微粒子濃度計測装置のある特定の局面では、前記チップ本体が複数のシート状部材を積層してなるプレートからなり、該プレートの片面に前記サンプル導入部が開口されており、前記アパーチャ部及び前記ストップバルブが前記プレート内に設けられている。この場合には、持ち運びが容易であり、取扱いが簡単なプレート状の形状の微粒子濃度計測チップを提供することができる。

また、本発明に係る微粒子濃度計測装置のある特定の局面では、前記安定期間は、前記頻度データの２階差分の変動のＣＶが５％以下である区間の内の最長区間とされる。この場合には、上記制御装置において、頻度データの２階差分をとることにより得られるデータにおけるばらつきが一定のしきい値以下である間の内最長区間を選択するだけで、安定期間を容易に求めることができる。

本発明に係る微粒子濃度計測方法は、本発明に従って構成された微粒子濃度計測装置の前記微粒子濃度計測チップのアパーチャ部を通過する微粒子の数を検出し、単位時間あたりの頻度データを求める工程と、前記頻度変動データが所定の安定指標を満たす安定期間を算出する工程と、全頻度データが得られる時間に対する前記安定期間の時間の比と、前記アパーチャ部と前記ストップバルブとの間の流路部分の前記一定容量との積と、前記安定期間中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数とから、微粒子濃度を求める工程とを備える。

本発明に係る微粒子濃度計測方法では、好ましくは、前記安定期間として、前記頻度データの２階差分の変動のＣＶが５％以下である区間の内の最長区間が用いられる。

本発明の微粒子濃度計測チップでは、アパーチャ部を通過した微粒子含有液体がストップバルブに到達すると停止するため、また上記アパーチャ部とストップバルブとの間の流路部分が一定容量とされる。従って、アパーチャ部を通過した微粒子含有液体の量を確実に一定量とすることができる。しかも、アパーチャ部を通過した液体の量を一定量とするために、検出装置などのセンサを必要とせず、また検出装置からの出力に従って液体の供給を投資する制御装置や、並びに液体の供給を停止する装置等を必要としない。従って、アパーチャ部を通過する液体の量を確実に一定量とすることができる微粒子濃度計測チップであって、簡単な構造を有し、容易に製造でき、しかも安価な微粒子濃度計測チップを提供することが可能となる。

本発明に係る微粒子濃度計測装置及び計測方法では、本発明の微粒子濃度計測チップを用い、アパーチャ部を通過する微粒子の頻度を検出し、単位時間あたりの頻度変動データと、頻度変動データが所定の安定指標を満たす安定期間を求め、全頻度データ出現時間に対する安定期間の比と、アパーチャ部とストップバルブとの間の流路部分の上記一定容量との積と、安定期間中の頻度データによりカウントされた微粒子数とから、微粒子濃度を高精度に測定することが可能となる。

以下、図面を参照しつつ、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。

図１（ａ）は、本発明の一実施形態に係る微粒子濃度計測チップの外観を示す斜視図である。微粒子濃度計測チップ１は、矩形板状のベースプレート２と、ベースプレート２上に積層されたプレート材３とを有する。ベースプレート２とプレート材３とは接着などの適宜の方法で一体化されている。

図１（ｂ）に分解斜視図で示すように、ベースプレート２の上面には、上面側に開いた溝が形成されている。この溝が、平板状のプレート材により閉成され、後述のマイクロ流路４などが形成されている。溝と流路の双方に参照番号を付すると、説明が煩雑になるため、以下、溝を閉成することにより構成された流路に参照番号を付して説明することとする。

プレート材３には、貫通孔３ａ，３ｂが形成されている。貫通孔３ａがサンプル導入部であり、貫通孔３ｂが排気口である。

図１（ｂ）に示すように、ベースプレート２の上面にはマイクロ流路４が形成されている。マイクロ流路４は、幅が５μｍ〜５００μｍ程度、深さが５μｍ〜５００μｍ程度の寸法を有し、本実施形態では、微粒子濃度が測定される液体の量は１０ｎＬ〜５００μＬ程度である。マイクロ流路４は、貫通孔３ａに連なるサンプル導入側端部４ａを有する。

マイクロ流路４は、サンプル導入側端部４ａから矩形のベースプレート２の長さ方向に沿って延ばされている。マイクロ流路４の途中には、アパーチャ部５が設けられている。アパーチャ部５は、マイクロ流路４のアパーチャ部５以外の部分に比べて幅が狭くされている。このアパーチャ部５における流路の隙間は、１個の微粒子が通過し、複数の微粒子が通過し得ない大きさとされている。従って、上記隙間は、測定対象である微粒子によって適宜その大きさが決定される。

なお、本発明が対象とする微粒子の大きさは、特に限定されないが、例えば、直径５００μｍ以下の大きさのものを挙げることができる。いうまでもないが、マイクロ流路の幅と深さは、微粒子の大きさによって、マイクロ流路が詰まることがないように選ばれる。

マイクロ流路４は、アパーチャ部５を経て下流側に至っており、ストップバルブ６に接続されている。アパーチャ部５とストップバルブ６との間の流路部分４ｂは、一定の容量を有するように形成されている。ここでは、流路部分４ｂはミアンダ状とされているが、直線状でもよい。後述するように、微粒子濃度を測定するにあたって、微粒子含有液体の量を一定量に制御し、該一定量の微粒子含有液体中の微粒子数をカウントすることにより微粒子濃度を測定する。そのために、流路部分４ｂが、微粒子濃度を測定するために一定容量とされている。

流路部分４ｂの容積は、特に限定されるわけではないが、例えば、マイクロ流路４の幅が５μｍ〜５００μｍ程度である場合、また微粒子含有液体として懸濁重合ポリマー微粒子などを測定する場合、１０ｎＬ〜５００μＬ程度の大きさとされる。

このように非常に小さな容積の微粒子含有液体中の微粒子数をカウントし、微粒子濃度を測定する場合、前述したように、従来法では、微粒子含有液体の容積を一定に制御することが困難であった。

本実施形態では、流路部分４ｂの容積を一定にすることにより、測定対象である微粒子含有液体の容積を一定にすることが可能とされている。

ストップバルブ６は液体を通過させず、気体のみを通過させるバルブである。このような機能を果たす限り、ストップバルブの構造は特に限定されないが、本実施形態では、流路部分４ｂに比べて非常に小さい断面積の流路を有し、ラプラス圧を利用した受動型の液体停止バルブにより構成されている。このストップバルブ６の具体的な構造及び変形例については、後程詳述する。

ストップバルブ６よりも下流側には、気体が通過する流路部分７が連ねられており、流路部分７の下流側端部が、前述した貫通孔３ｂに連ねられている。

上記ベースプレート２及びプレート材３は、適宜の合成樹脂、ガラス、セラミック等により形成することができ、その材料は特に限定されるものではない。

図２は、上記微粒子濃度計測チップを含む本実施形態の微粒子濃度計測装置の概略ブロック図である。微粒子濃度計測装置１１は、上記微粒子濃度計測チップ１と、検出手段１２と、制御装置１３とを備える。検出手段１２は、微粒子濃度計測チップ１においてアパーチャ部５を通過する微粒子を検出する適宜のセンサからなる。制御装置１３は、微粒子濃度計測チップ１における微粒子濃度含有液体の送液を開始させ、検出手段１２において、アパーチャ部５を通過する微粒子の数を検出する動作を開始させ、検出手段１２から得られた結果に基づき、後述するように、供給された微粒子含有液体中の微粒子濃度を測定する。

本実施形態では、上記検出手段１２は、図１（ｂ）に示すように、発光素子としてのＬＥＤ（発光ダイオード）１２ａと、受光センサ１２ｂと、レンズ１４，１５とを有する。ＬＥＤ１２ａは、微粒子濃度計測チップ１の上方に配置され、アパーチャ部５に光を照射する。受光センサ１２ｂは、アパーチャ部５の下方に配置されており、微粒子濃度計測チップ１を透過してきた光を受光するように配置されている。すなわち、受光センサ１２ｂは、ＬＥＤ１２ａから照射され、レンズ１４で収束され、微粒子濃度計測チップ１を透過してきた光を受光する位置に配置されている。

なお、光を透過させる必要があるため、本実施形態では、ベースプレート２及びプレート材３は、少なくともアパーチャ部５が設けられている部分において透光性とされている。

もっとも、検出手段１２としては、上記光を利用したものに限らず、前述した特許文献１に記載の計測装置のように、アパーチャ部を挟んで対向する一対の電極を設け、電極間のインピーダンス変化を検出することにより、微粒子数をカウントしてもよい。その場合には、ベースプレート２及びプレート材３は透光性を有する材料で形成される必要は必ずしもない。

次に、本実施形態の微粒子濃度計測装置を用いた微粒子濃度計測方法の一例を説明する。図３は、本実施形態の微粒子濃度計測方法の各工程を示すフローチャートである。

まず、ステップＳ１において、微粒子濃度含有液体の送液を開始する。この送液の開始は、微粒子濃度計測チップ１の上面に開いた貫通孔３ａから微粒子濃度含有液体を供給することにより行う。この微粒子濃度含有液体の供給に対しては、シリンジ等からユーザーが微粒子濃度含有液体を貫通孔３ａに供給してもよい。あるいは、送液ポンプを貫通孔３ａに接続し、送液ポンプにより微粒子濃度含有液体を供給してもよい。送液ポンプを用いる場合、制御装置１３からの測定開始信号により、上記送液ポンプを駆動開始してもよい。また、カートリッジにおける微粒子分散液体の導入と送液の機能を分離しても良い。例えば、導入部にチャンバーを設け、微粒子分散液体の導入後に導入部に粘着シール等で蓋をし、異なるガス湧出源等でチャンバー内の微粒子分散液体を押し出してもよい。ガス湧出源は、キャピラリー接続されたガス溜であってもよいし、カートリッジに内蔵されるマイクロポンプであってもよい。

次に、ステップＳ２において、制御装置１３からの信号により、検出手段１２が駆動され、検出が開始される。この検出は、上記ＬＥＤ１２ａから照射された光を受光センサ１２ｂで受光することにより行われる。受光センサ１２ｂは、透過してきた光の強度に応じた電気信号を制御装置１３に与える。微粒子含有液体中に微粒子が存在しない場合に比べて、微粒子が通過する場合、光の強度が著しく低下することとなる。アパーチャ部５では、１つの微粒子のみが通過し得るように隙間が設定されている。従って、アパーチャ部を、微粒子が１個ずつ通過することとなる。微粒子が通過するたびに、受光センサ１２ｂにおける受光強度が低下し、その結果、図４（ａ）に示す電気信号が制御装置１３に与えられる。図４（ａ）において、縦軸は、受光強度の逆数である。微粒子が通過する度に、受光強度が著しく低下するため、微粒子が１個通過するに従って、１個のパルスが立ち上がることになる。

もっとも、受光センサ１２ｂで受光される光の強度は、測定対象である微粒子以外の汚染源によっても低下することがある。従って、制御装置１３には、予め定められた一定のしきい値ＴＨが記憶されており、該しきい値ＴＨよりも高さが高いパルスの場合には、微粒子と判断し、該しきい値ＴＨよりも低いパルスについては微粒子以外の汚染源と判断する。そして、上記微粒子と判断されるパルス数をステップＳ３でカウントする。たとえば、図４（ｂ）では、単位時間Ｔ０内の微粒子の数は５個となる。

すなわち、図４（ｂ）で単位時間Ｔ０あたりの微粒子数をカウントする。しかる後、単位時間あたりの微粒子数をカウントした後、ステップＳ４において、図５（ａ）に示す各単位時間あたりの微粒子数からなる微粒子の頻度データを求める。

次に、ステップＳ５において、図５（ｂ）に示すように、上記頻度データを１階微分し、頻度データ１階差分を求め、さらに、ステップＳ６において、上記頻度データを２階微分して得られた頻度データ２階差分を算出する。上記のように、頻度データを２階微分するのは、以下の理由による。

上記頻度データでは、測定時間が経過すると共に、頻度が下がってくる傾向がある。これは、送液に際しての圧力源から離れた位置まで流動先端が移動したことにより、流体内の圧力勾配が緩やかとなり、流速が低下することによる。従って、このような流速の変動などの変動要因を解消するために、頻度データの２階差分を用いている。なお、マイクロ流路４を通過する微量の流体では、送液開始時及び送液終了時においては特に大きく流速が変化しやすいため、図５（ａ）に示す時刻ｔａ、すなわち微粒子が出現する最初の時刻から、時刻ｔｂ、すなわち微粒子の出現が終了する時刻までの間であっても、頻度データの２階差分が揺らぎやすい区間が存在する。従って、このような頻度データのばらつきの影響を無くすために、本実施形態では、ステップＳ７において図５（ａ）に示す安定期間Ｔｓを基準に微粒子濃度を検出する。

安定期間Ｔｓは、上記単位時間あたりの頻度データを２階微分した結果に対して、一定のしきい値内に収まる最長区間を求めることにより定められる。すなわち、図５（ｂ）に示す頻度変動データの１階差分をさらに微分し、図５（ｃ）に示す２階差分における変動のＣＶが５％以下である期間の内の最長期間を安定期間Ｔｓとしている。もっとも、５％は目安であり、測定される微粒子含有液体の種類、マイクロ流路４の大きさ、アパーチャ部５における隙間の大きさ、送液速度等により適宜の値に設定され得る。

なお、ＣＶが５％以下である区間が複数存在することも考えられるため、ＣＶが５％以下である区間の内の最長区間を安定期間とする。

いずれにしても、２階差分の変動が一定のしきい値以下の期間を図５（ａ）に示す安定期間Ｔｓと定義することにより、該安定期間Ｔｓを制御装置１３により容易に求めることができる。

そして、本実施形態では、求められた安定期間Ｔｓの全頻度データ出現時間Ｔａに対する比、すなわち、Ｔｓ／Ｔａと、アパーチャ部５とストップバルブ６との間の流路部分４ｂの容量Ｖとの積（Ｔｓ／Ｔａ）・Ｖと、安定期間Ｔｓ中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数とから、微粒子濃度が求められる。すなわち、ステップＳ８において、上記安定期間Ｔｓ中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数をＮとした場合、微粒子濃度は、Ｎ×（Ｔｓ／Ｔａ）／Ｖで求められる。

上記のようにして求められた微粒子濃度は、上記安定期間Ｔｓ中にアパーチャ部５を通過した微粒子の数に基づいて求められるため、送液開始時や送液停止時付近の流速が大きく変化する部分におけるばらつきの影響を解消することができる。従って、微量のマイクロ流体中の微粒子濃度を高精度に検出することができる。

加えて、本実施形態の微粒子濃度計測チップ１を用いた場合、送液停止は、前述したストップバルブ６により行われ、微粒子濃度計測チップ外に、送液を停止するための装置を必要としない。また、送液を停止するための制御操作を必要としない。従って、微粒子濃度計測装置の構造か複雑になり難く、また微粒子濃度計測装置全体の構成を略化し、コストを低減することが可能となる。

上記ストップバルブ６の詳細を説明する。

図６（ａ）及び（ｂ）は、細絞り部を設けたラプラス圧を利用した受動型液体停止バルブからなるストップバルブの原理を説明するための模式図である。

図６（ａ）に示すように、マイクロ流路２１の端部２１ａに、マイクロ流路２１よりも相対的に断面積が非常に小さい細絞り部を設け、ストップバルブ２２を形成する。ストップバルブ２２の他端側には、流路２３が接続されている。流路２３は気体を逃がす部分であり、その断面積は、特に限定されるものではないが、ストップバルブ２２の流路断面積よりも大きくされている。

図６（ｂ）に示すように、ストップバルブ２２の流路の断面積が非常に小さいため、マイクロ流路２１内に液体２４が流れてきた場合に、微粒子含有液体２４とマイクロ流路２１及びストップバルブ２２の内壁の表面張力に起因するラプラス圧が流体の背圧と釣り合うことにより、液体はマイクロ流路２１からストップバルブ２２には流れ込まず、気体のみがストップバルブ２２に通過する。従って、微粒子含有液体２４が、ストップバルブ２２の入口に到達した時点で、その送液が停止される。

図６（ａ），（ｂ）では、円筒状のマイクロ流路２１に、円筒状のストップバルブ２２を接続した構造を模式的に示したが、図１に示した微粒子濃度計測チップ１のようなプレート構造を有する場合には、図７に模式的斜視図で示すようにマイクロ流路４にストップバルブ６及びストップバルブ６の下流側に連ねられた流路部分を形成すればよい。

図７では、マイクロ流路４の流路部分４ｂの一部が矩形の平面形状を有するように図示されている。該矩形の平面形状の流路部分４ｂよりも、非常に幅が小さい横断面が矩形の流路部分、すなわち細絞り部を設けることによりストップバルブ６が形成されている。また、ストップバルブ６の下流側に接続されている流路部分についても、平面形状は矩形とされている。そして、ベースプレート２の上面に、上記マイクロ流路４を構成している流路部分４ｂを形成するための溝が形成されている。これに対して、上記ストップバルブ６及び流路部分を形成するために、プレート材３の下面に溝が形成されている。ストップバルブ６と流路部分４ｂとがストップバルブ６に気体のみが通過するようにストップバルブ６と流路部分４ｂとが連通されればよい。

また、図８に模式的平面図で示すように、流路部分４ｂの端部に設けられる細絞り部からなるストップバルブ６を形成するに際し、複数の細絞り部６ａ〜６ｃを設けてもよい。

前述したように、本発明で用いられるストップバルブは、上記のような細絞り部を設けたものに限らず、マイクロ流路の流路部分４ｂの下流側において、内壁を撥水加工し、ラプラス圧を利用した受動的な液体停止バルブであってもよい。

また、上記ストップバルブは、可撓性の弁体により形成されてもよい。このような可撓性の弁体によるストップバルブの一例を図９を参照して説明する。

図９では、三層構造のプレート構造を有する微粒子濃度計測チップ３１におけるストップバルブ構成部分のみが分解斜視図で模式的に示されている。本変形例では、ベースプレート３２と、プレート材３３との間に中間プレート３４が積層されている。ベースプレート３２内に、マイクロ流路４の流路部分４ｂが形成されている。ここでは、流路部分４ｂは、ベースプレート３２内に形成されており、流路部分４ｂの端部が、上方に開いた開口部４ｃに連ねられている。開口部４ｃに臨むように、中間プレート３４には、片持ち梁様の可撓性の弁体３４ａが形成されている。すなわち、中間プレート３４には、先端が自由端とされた片持ち梁様の可撓性の弁体３４ａが形成されている。弁体３４ａは、微粒子含有液体の圧力により、先端が上下方向に移動し得るように変形可能とされている。従って、上記中間プレート３４及び弁体３４ａは、このような変形が可能な材料及び厚みとなるように形成されている。このような材料については、合成樹脂、高分子ゲルなどの適宜の材料を用いることができる。

プレート材３３の下面には、凹部３３ａが形成されている。凹部３３ａは、上記弁体３４ａが入り込み得る大きさとされている。凹部３３ａには、下流側の流路部分３３ｂが連ねられている。流路部分３３ｂは、凹部３３ａに開口している開口部３３ｃを有する。弁体３４ａは、微粒子含有液体の圧力により、上方に先端が移動し、上記開口部３４ｃを閉成する。このようにして、液体の通過が停止される。

片持ち梁様の可撓性弁体の平面形状については、上記矩形の弁体３４ａに限らず、図１０（ａ）〜（ｃ）に示すように、様々な形状とすることができる。すなわち、図１０（ａ）に示すように、固定側端部４１ａに比べて、先端４１ｂに向かって幅が徐々に広くなる片持ち梁の可撓性弁体４１を用いてもよい。また、図１０（ｂ）に示すように、矩形の領域と半円状の領域とが連ねられており、自由端側が半円状の領域である平面形状の弁体４２を用いてもよい。さらに、図１０（ｃ）に示すように、固定端４３ａから、自由端である先端４３ｂに向かって徐々に幅が大きくなり、先端４３ｂにおいて、外周縁が曲線状とされた弁体４３を用いてもよい。

さらに、図１１（ａ），（ｂ）に示すように、両持ちの可撓性弁体によりストップバルブを構成してもよい。図１１（ｂ）に示すように、本実施形態の微粒子計測チップ５１では、ベースプレート５２、中間プレート５３〜５５及びプレート材５６が積層されている。そして、中間プレート５３，５５にストップバルブが構成されている。

中間プレート５５に形成されているストップバルブの詳細を図１１（ａ）に拡大して示す。ストップバルブ５７では、中間プレート５５に、円形の開口部５５ａが形成されている。そして、この開口部５５ａ内において、両持ち様の弁体５８が形成されている。弁体５８は、ブリッジ５９ａ，５９ｂにより中間プレート５５の本体部分に連結されている。弁体５８は、開口部５５ａよりも径の小さい図形の弁本体部５８ａを有する。ここでは、中間プレート５４に設けられた貫通孔から上方に流れてきた液体の圧力により、弁本体部５８ａが上下方向に移動するように変形する。この場合、液体を通過させないが、気体を通過させるように、弁本体部５８ａが、上記貫通孔を常時は封止している。このように、両持ち様の可撓性弁体によりストップバルブを構成してもよい。

また、マイクロ流路４の流路部分４ｂの下流側端部に、図１２に示すように、多孔質体７１を充填し、ストップバルブを構成してもよい。このような多孔質体７１としては、微粒子含有液体を透過させないが、気体を透過させる適宜の多孔性材料を挙げることができる。すなわち、連続気孔を有する発泡体、あるいは無機微粒子凝集体などの適宜の材料を挙げることができる。

さらに、図１３に示すように、流路部分４ｂの下端に未接着可撓性障害によるストップバルブ８１を設けてもよい。このストップバルブ８１では、流路部分４ｂに連なる、流路部分８２を有する。この流路部分８１ａの周囲に、ハッチングを付して示す未接着領域８３が設けられている。そして、流路部分８２と分離して、気体を逃がす流路部分７が設けられている。この流路部分８２と、流路部分７とは、未接着領域８３内に配置されている。未接着領域８３では、液体は流路部分８２から流路部分７に至らないが、気体は流路部分８２から流路部分７に至る。従って、未接着領域８３を通過できた気体のみが通過し、ストップバルブとして機能することとなる。

上記のように、本発明で用いられるストップバルブは様々に変形することができ、各変形例のものに限定されるものでもない。いずれにしても、流路部分４ｂの容積が一定とされており、ストップバルブに到達すると微粒子含有液体の送液は自動的に停止される。従って、微粒子含有液体中の微粒子数をカウントし、かつ一定量に制御された微粒子含有液体中の微粒子カウント数に基づいて、微粒子濃度を高精度に測定することが可能となる。

本発明により測定される微粒子含有液体については、様々な液体が挙げられ、例えば、血液、人や動物の体液、または無機粒子含有液体などを挙げることができる。微粒子についても、血液中の赤血球などの適宜細胞、あるいは無機粒子含有液体中の無機粒子などを挙げることができる。

なお、本発明が対象とする微粒子の大きさは、特に限定されないが、例えば５μｍ〜５００μｍ以下の大きさのものを挙げることができる。

（ａ）は本発明の一実施形態に係る微粒子濃度計測チップの外観を示す斜視図であり、（ｂ）はその分解斜視図であり、（ｃ）は内部に構成されている流路を模式的に示す図である。 本発明の一実施形態に係る微粒子濃度計測装置を示す概略ブロック図である。 本発明の一実施形態の微粒子計測方法の工程を示すフローチャートである。 （ａ）は、本発明の一実施形態の計測方法において、検出手段から得られるパルス波形を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）のパルス波形から求められた単位時間あたりの微粒子出現データを示す図である。 （ａ）は、本発明の一実施形態において求められた微粒子の出願の頻度データであり、（ｂ）は（ａ）の頻度変動データの１階差分を示し、（ｃ）は、（ａ）の頻度データの２階差分を示す。 （ａ）及び（ｂ）は細絞り部を設けた構造を有するストップバルブの原理を説明するための各模式図である。 細絞り部によるストップバルブが設けられた変形例を説明するための略図的斜視図である。 複数の細絞り部が設けられたストップバルブを説明するための模式的平面図である。 片持ち梁様の可撓性弁体からなるストップバルブが設けられている構造を示す模式的部分切欠分解斜視図である。 （ａ）〜（ｃ）は、ストップバルブを構成する可撓性の弁体の変形例を説明するための各模式的平面図である。 （ａ），（ｂ）は、両持ちの可撓性の弁体を用いて構成されたストップバルブを説明するための模式的斜視図及び該ストップバルブが設けられた微粒子計測チップの分解斜視図である。 多孔質体からなるストップバルブを示す模式的平面断面図である。 本発明の微粒子計測チップのストップバルブのさらに他の変形例を説明するための模式的平面図である。

符号の説明

１…微粒子濃度計測チップ
２…ベースプレート
３…プレート材
３ａ，３ｂ…貫通孔
４…マイクロ流路
４ａ……サンプル導入側端部
４ｂ…流路部分
４ｃ…開口部
５…アパーチャ部
６…ストップバルブ
６ａ〜６ｃ…部
７…流路部分
１１…微粒子濃度計測装置
１２…検出手段
１２ａ…ＬＥＤ
１２ｂ…受光センサ
１３…制御装置
１４，１５…レンズ
２１…マイクロ流路
２１ａ…端部
２２…ストップバルブ
２３…流路
２４…微粒子含有液体
３１…微粒子濃度計測チップ
３２…ベースプレート
３３…プレート材
３３ａ…凹部
３３ｂ…流路部分
３３ｃ…開口部
３４…中間プレート
３４ａ…弁体
３４ｃ…開口部
４１…可撓性弁体
４１ａ…固定側端部
４１ｂ…先端
４２…弁体
４３…弁体
４３ａ…固定端
４３ｂ…先端
５１…微粒子計測チップ
５２…ベースプレート
５３〜５５…中間プレート
５５ａ…開口部
５６…プレート材
５７…ストップバルブ
５８…弁体
５８ａ…弁本体部
５９ａ，５９ｂ…ブリッジ
７１…多孔質体
８１…ストップバルブ
８１ａ…流路部分
８２…流路部分
８３…未接着領域

Claims (8)

1. 微粒子含有液体の微粒子濃度を計測する微粒子濃度計測装置であって、
   微粒子含有液体が導入されるサンプル導入部を備えたチップ本体を有し、前記チップ本体内に、前記サンプル導入部に連ねられた流路が形成されており、該流路の一部が通過する際の微粒子数を検出するために、該流路の他の部分に比べて狭くされているアパーチャ部が設けられており、
   前記アパーチャ部の下流側に接続された一定容量の流路部分を介して前記アパーチャ部に接続されており、前記微粒子含有液体を停止させるストップバルブをさらに備える微粒子濃度計測チップと、
   前記微粒子濃度計測チップの前記アパーチャ部を通過する微粒子数をカウントするための検出手段と、
   前記検出手段から得られた単位時間あたりの微粒子数から、微粒子の頻度データを算出し、該頻度データから、予め定められた安定指標を満たす所定の安定期間を求め、安定期間中の頻度データを算出し、全頻度変動データが得られる時間に対する安定期間の比と、前記アパーチャ部と前記ストップバルブとの間の流路部分の前記一定容量との積と、前記安定期間中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数とから微粒子濃度を求める制御装置とを備える、微粒子濃度計測装置。
2. 前記ストップバルブが、ラプラス圧を利用した受動型の液体停止バルブである、請求項１に記載の微粒子濃度計測装置。
3. 前記ストップバルブが、前記流路の内壁に一端が接続されており、前記微粒子含有液体の圧力により流路内で変形し、前記流路を閉塞する可撓性の弁体である、請求項１に記載の微粒子濃度計測装置。
4. 前記ストップバルブが前記流路内に配置された多孔質体である、請求項１に記載の微粒子濃度計測装置。
5. 前記チップ本体が複数のシート状部材を積層してなるプレートからなり、該プレートの片面に前記サンプル導入部が開口されており、前記アパーチャ部及び前記ストップバルブが前記プレート内に設けられている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微粒子濃度計測装置。
6. 前記安定期間が、前記頻度データの２階差分の変動のＣＶが５％以下である区間の内の最長区間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微粒子濃度計測装置。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の微粒子濃度計測装置の前記微粒子濃度計測チップのアパーチャ部を通過する微粒子の数を検出し、単位時間あたりの頻度データを求める工程と、
   前記頻度変動データが所定の安定指標を満たす安定期間を算出する工程と、
   全頻度データが得られる時間に対する前記安定期間の時間の比と、前記アパーチャ部と前記ストップバルブとの間の流路部分の前記一定容量との積と、前記安定期間中の頻度データにおいてカウントされた微粒子数とから、微粒子濃度を求める工程とを備える、微粒子濃度計測方法。
8. 前記安定期間として、前記頻度データの２階差分の変動のＣＶが５％以下である区間の内の最長区間を用いる、請求項７に記載の微粒子濃度計測方法。

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