JP5063852B2

JP5063852B2 - 生ワクチン及び製造方法

Info

Publication number: JP5063852B2
Application number: JP2002529471A
Authority: JP
Inventors: ケイティンゲール、ハーマン; エゴロヴ、アンドレ; フェルコ、ボリス; ロマノヴァ、ジュリア; ケイティンゲール、ディートマー
Original assignee: ポリマンサイエンティフィックイミューンバイオロジッシュフォーシュングゲゼルシャフトミットベシュレンクテルファフツング
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2021-09-25
Also published as: CA2423038A1; KR20080043891A; CN1582333B; AU2002223560B2; JP2004509903A; DK1358319T3; KR100927517B1; CA2423038C; CN1582333A; US7494659B2; ES2327103T3; AU2356002A; WO2002024876A2; US20040137013A1; ATE434035T1; KR20030061810A; DE60139026D1; EP1358319A2; WO2002024876A3; EP1358319B1

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、ウイルス学及びワクチン開発の分野に属し、ウイルスワクチンの製造、特に全ウイルスワクチン、好ましくは弱毒化生ワクチンの製造の改善された方法及びかかる方法によって入手しうるワクチンに関する。
【０００２】
背景技術
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原はウイルスに対する宿主の防護免疫応答にとっての主要な標的である。
【０００３】
新しいウイルス分離株を回収する一般的な実施方法は、鼻又は咽喉のスワブから又は同様のソースからの回収と、それに続くふ化鶏卵における分離株の培養を含む。ウイルスはその卵宿主に適応し、卵においてウイルスの大規模生産を実施することができる。インフルエンザワクチンを生産するためのふ化鶏卵を含むそのような従来の方法は、しかしながら、極めて面倒であり、１週間につき何千もの卵の取扱いならびに卵タンパク質を含まないことを保証するための尿膜腔液から誘導したウイルス懸濁液の広汎な精製を含む。
【０００４】
ウイルス生産にニワトリ胚を使用することのもう１つの難点は、この基質が野生型ウイルスとは抗原特異性が異なるウイルス変異株の選択を強く促進し、例えば免疫原性の大きな低下を含めて、それらの変化した表現型のゆえにワクチンには適さないと考えられるウイルスを生じることが少なくないという事実にある。
【０００５】
それ故、ウイルス生産、特にインフルエンザウイルス生産のために、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎）又はベロ（アフリカミドリザル腎）細胞のような樹立哺乳類細胞系に関して標準組織培養テクノロジーを利用する多くの試みが当該技術において為されてきた。
【０００６】
組織培養でインフルエンザ菌株を増殖させる際の難しさの１つは、宿主細胞におけるインフルエンザ赤血球凝集素のタンパク質分解性開裂の必要性から生じる。ウイルスＨＡ前駆体のＨＡ１及びＨＡ２サブフラグメントへの開裂は、完全なビリオンを形成するためのウイルスエレメントの構築には必要ないが、ビリオンを感染性にする、すなわち新しい細胞に感染することを可能にするために必要である。
【０００７】
標準細胞培養でのいくつかのインフルエンザＡ型菌株の限られた複製は、組織培養培地にトリプシンのようなプロテアーゼを加えることによって克服できることが報告された（例えばＬａｚａｒｏｗｉｔｚら、「赤血球凝集素ポリペプチドのタンパク質分解性開裂によるインフルエンザＢ型ウイルスの感染性の増強（ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＩｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａａｎｄＢＶｉｒｕｓｅｓｂｙＰｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃＣｌｅａｖａｇｅｏｆｔｈｅＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６８：４４０−４５４、１９７５）。しかし、一部の場合、例えばベロ細胞を使用するときには依然として難しさが残った。
【０００８】
ＫａｖｅｒｉａｎとＷｅｂｓｔｅｒ（ＪＶｉｒｏｌ６９／４：２７００−２７０３、１９９５）は、ベロ細胞培養では、そしてそれほど顕著ではないがＭＤＣＫ、ブタ腎、又はアカゲザル腎細胞培養においては、培地中のトリプシンの活性がインキュベーションの開始から急速に低下し、十分な数の感染性ビリオンの産生を欠くために培地中のウイルス蓄積の失敗をもたらすと報告している。彼らは、トリプシン阻害因子がベロ細胞から放出されると結論した。彼らはさらに、トリプシンを繰り返し添加することによってウイルスの生殖が再び始まり、多くの生殖サイクルの間維持されて、はるかに良好なウイルス収率を生じることを示した。
【０００９】
効率的なワクチン生産のためのもう１つの方法が米国特許第５，７５３，４８９号に報告されており、その方法においては、ＭＤＣＫ及びベロ細胞を含めた多くの異なる哺乳類細胞でのウイルス増殖のために無血清培地を使用した。開示されている方法は、無血清培地で脊椎動物細胞を増殖させ、細胞培養をウイルスに感染させて、ウイルスに感染した細胞培養をインキュベートし、ウイルスを含む培地の一部を取り出してこの部分をプロテアーゼに接触させ、その後その部分にプロテアーゼ阻害因子を加えて、その部分を細胞培養に戻すことを含む。第一容器で増殖、感染及びインキュベーションの段階を実施し、段階が閉鎖サイクルにおいて実施できるようにループ内で第一容器に接続された第二容器でトリプシン接触と阻害因子添加の段階を実施する。このシステムは、通常培養中で細胞によって耐容されるよりもはるかに高い濃度でトリプシン又は他のタンパク質分解酵素を使用することを可能にする。
【００１０】
ＥＰ０８７０５０８号は、動物細胞系、任意にベロ細胞系をウイルスに感染させ、細胞培養中でウイルスを増殖させて、溶解宿主細胞から培地中に放出された核酸物質を消化するためにウイルス増殖が終了する直前にヌクレアーゼ酵素を細胞培養に加え、ウイルスを採集して、ウイルス抗原ワクチンを作製するために抽出によってそのウイルス抗原を得ることを含む、ウイルス抗原ワクチンを製造する方法を報告している。かかる特許は、ウイルス増殖のために使用する栄養培地の種類に関しては言及しておらず、また感染性ウイルスを得るためのインフルエンザウイルス赤血球凝集素の最終的プロセシングに通常必要な、プロテアーゼの添加に関しても記載がない。かかる方法はさらに、直ちに使用できるワクチン製剤を提供するために様々な精製段階を必要とする。
【００１１】
しかし、宿主基質の性質ならびにウイルス増殖のために使用する栄養培地の組成物は、それによって得られるウイルス後代の免疫原性及び抗原性に有意の影響を及ぼしうる。特に、血清含有培地はウイルス後代の抗原性を低下させうるだけでなく、付加的に培地中のプロテアーゼ活性を低下させると考えられ、従ってウイルスの成熟を阻害し、その後広汎な精製段階が必要となる。
【００１２】
発明の開示
本発明は先行技術の欠点を克服するものである。本発明は、適応選択によるウイルスの表面抗原の変化を最小限に抑える又は全く変化が起こらないようにする条件下で、様々なソースからウイルスを単離するため、及びワクチン、特に生弱毒化インフルエンザワクチンとして使用するためのウイルス後代を生産するための簡単で効率的な工程に関する。
【００１３】
また、ヒト赤血球を選択的に凝集させるが、ニワトリ赤血球は凝集させず、好ましくは最初に接種したウイルス株、例えば一次臨床野生型分離株と同じ抗原特性を持つウイルス後代を生じるウイルス、特にインフルエンザウイルスの生産のための方法を提供することも本発明の目的である。
【００１４】
好ましい実施形態では、増殖したウイルスのＨＡ遺伝子、そして任意にＮＡ遺伝子の核酸配列は、最初に接種したウイルス株（例えば流行性菌株、感染患者の一次臨床分離株）のものと同一である。
【００１５】
遠心分離によって細胞培養上清から採集したウイルス懸濁液のクロマトグラフィーによる精製又は他の精製段階、特に無タンパク質分離又は精製段階を必要としない一段階手順において、全ウイルスワクチン、特に生弱毒化ワクチンの効率的な生産のための方法を提供することは本発明のもう１つの目的である。
【００１６】
弱毒化、低温適応及び温度感受性インフルエンザＡ型及びＢ型菌株及びそれらから作製されるワクチンを提供することは本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１７】
発明を実施するための最良の形態
ふ化鶏卵、ＭＤＣＫ及びベロ細胞を使用した比較実験は、最初に接種したウイルスがこれらの基質のいずれかでの増殖の間に抗原性の変化を受ける可能性が高いことを明らかに証明した。
【００１８】
我々の実験は、無血清培地においてベロ細胞で増殖させたインフルエンザウイルス株に関して変化が最も少ない、あるいはさらに全く変化が起こらないことを確認した。さらに、インフルエンザＡ型ウイルス、少なくともＨ３Ｎ２サブタイプの菌株は、無血清及び無タンパク質培地においてベロ細胞で増殖させたとき、ヒト赤血球の凝集に対する選択性を示すが、ニワトリ赤血球の凝集に対しては選択性を示さないことが明らかになった。また、それらは卵では増殖しなかった。これは、これらのベロ増殖ウイルスが、ＭＤＣＫ細胞又は卵で増殖させたものよりも対応する臨床分離株の野生型ウイルスとより同一であると考えられることの最初の示唆であった。
【００１９】
実際に、鼻スワブから得られた野生型分離株のＨＡ及びＮＡ遺伝子配列と、それぞれベロ及びＭＤＣＫ細胞で増殖した後の同じウイルスの遺伝子配列との比較は、スワブ分離株又はベロ増殖ウイルス又はスワブ分離株とベロ増殖ウイルスの両方のＨＡ又はＮＡに比べてＭＤＣＫ増殖ウイルスのＨＡ又はＮＡの変化を明らかにした。
【００２０】
さらに、ベロ及びＭＤＣＫ増殖野生型ウイルスでフェレット（シロイタチ）を免疫して得られた実験データは、ＭＤＣＫ増殖ウイルスに比べてベロ増殖ウイルスのはるかに強いビルレンスを示唆する。また、マカク（短尾サル）に関する動物実験で試験したベロ増殖ウイルスの免疫原性は、ＭＤＣＫ細胞又は卵で増殖したウイルスのものを有意に上回ることが明らかになった。
【００２１】
これらの所見を合わせると、以下で詳細に述べるような本発明に従ったウイルスの操作と増殖のための工程は最初に接種した（例えば野生型）ウイルスに比べて変化していない又はごくわずかな度合だけ改変されたウイルスを生じるという仮定についての強力な証拠を提供する。
【００２２】
本発明のウイルス操作工程を非常にユニークにしているのは、抗原性変化の回避だけではなく、この工程を大規模な工業的ワクチン生産に極めて適したものにするその顕著な簡便性である。
【００２３】
さらなる実験は、トリプシン（又はトリプシノーゲン）のソースが感染性ビリオンの全体的収率に影響を及ぼす１つの付加的な因子であると考えられることを示した。実際に、当該技術において既知の方法（例えばＫａｖｅｒｉｎとＷｅｂｓｔｅｒ、ＪＶｉｒｏｌ６９／４：２７００−２７０３、１９９５；又は米国特許第５，７５３，４８９号）はトリプシンの反復添加（ＫａｖｅｒｉｎとＷｅｂｓｔｅｒ）又は高いトリプシン濃度（米国特許第５，７５３，４８９号）のいずれかを使用するが、本発明に従った工程は先行技術で報告されているトリプシン濃度の半分又はそれ以下しか適用しない。さらに、感染宿主細胞のインキュベーションの前又はインキュベーションの開始時にわずかに０．５μｇから１０μｇ、好ましくは２μｇから５μｇトリプシン／ｍｌを細胞培養培地に１回添加すれば、至適感染性ウイルス力価に達するのに十分である。不活性化実験は、ブタ又はヒト組換えトリプシンがウシトリプシンよりもベロ又はＭＤＣＫ細胞による不活性化をはるかに受けにくいことを明らかにした。ウシトリプシンは当該技術において最も一般的に使用されているので、先行技術文献は、別のトリプシンソースが明白に記載されていない限り、暗にウシトリプシンだけを指す可能性が高い。このことも、例えばＫａｖｅｒｉｎら及び米国特許第５，７５３，４８９号において言及されているトリプシン適用の様式及び濃度を説明するのに役立つであろう。
【００２４】
本発明に従ってベロ細胞培養のために最初に無血清培地を補足するのにブタ又はヒト組換えトリプシン又はトリプシノーゲンを使用することは、それ故、極めて低いトリプシン又はトリプシノーゲン濃度を使用することを可能にし、その結果ウイルス含有上清の採集後の労力とコストのかかる精製段階の必要を回避する。
【００２５】
本発明の工程を簡単にし、それ故ワクチン製造者にとって魅力的なものにするのに寄与するもう１つの段階は、ウイルス増殖のための感染ベロ細胞のインキュベーションの前又はインキュベーションの開始時に細胞培養培地に１回量の高度活性エンドヌクレアーゼを添加することである。このエンドヌクレアーゼ、好ましくはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を２単位／ｍｌから３０単位／ｍｌ、好ましくは５単位／ｍｌから１５単位／ｍｌ培地という非常に低い初期濃度で培地に１回添加すると、主として溶解しつつある又は溶解した宿主細胞から生じる遊離ＤＮＡ及びＲＮＡから細胞培養培地を効率的に浄化する。遠心分離した上清から得た即時使用ワクチン製剤中の残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ酵素の濃度は１回量当り５ｎｇ又はそれ以下のままである。
【００２６】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）はＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａＡ／ＳＤｅｎｍａｒｋの商標であり、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から得られる細胞外非特異的エンドヌクレアーゼに関する。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅは、多くの形態のＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の両方を小さなオリゴヌクレオチドに分解する遺伝学的に構築されたエンドヌクレアーゼである。超遠心分離を容易にする、細胞溶解産物の粘度の速やかな低下を促進する。タンパク質分解を低下させ、標的タンパク質の収率を高めて、例えば組換えタンパク質から核酸の完全な排除を提供する。４００，０００Ｕ／ｍｇという例外的に高い活性を持つ。
【００２７】
本発明の工程の第三の重要な利点は、時間の因子、従って工程のコストである。動物由来のタンパク質を含まず、好ましくは抗生物質を含まない無血清培地の使用により、費用と時間のかかる精製手順を最小限に抑える、さらには全面的に回避することができる。また、プロテアーゼ（例えばトリプシン又はトリプシノーゲン）及びヌクレアーゼ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）のような外因性酵素の添加はウイルス増殖期の最初に１回行うだけなので、これは、技術水準の方法がウイルス含有培養上清のインキュベーション後処理（例えばＨＡ活性化，ＲＮＡ／ＤＮＡ消化、タンパク質精製、等々）のために必要する時間を大幅に節約する。
【００２８】
意外にも、プロテアーゼ（例えばトリプシン又はトリプシノーゲン）及びヌクレアーゼ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）のいずれか又は両方を最初にウイルス感染ベロ細胞培養に添加することはウイルス収量にマイナスの影響を及ぼさないことが明らかになった。これはおそらく、本発明の工程において適用される酵素の濃度が非常に低いことによるものであろう。
【００２９】
ウイルス増殖の本発明の工程は、様々な種類のウイルス、特にＨ３Ｎ２サブタイプのインフルエンザＡ型ウイルスの操作のために有用であるが、ウイルス接種原（例えば血清試料、鼻洗浄、鼻スワブ、咽喉スワブ、唾液、等々）の種類に関わりなく、流行性又は実験用インフルエンザウイルス株の単離と生殖にも適する。この工程の原理を利用して、本発明の一部であり、下記の実施例においてより詳細に特性付ける多くのインフルエンザＡ型及びＢ型ワクチンを生産した。
【００３０】
また、実施例に示すように、本発明の従って作製したワクチンに関して防護効果ならびにワクチンの安全性を確認した。
【００３１】
本発明に従ったウイルス操作又は増殖の方法に関連してここで使用するとき「無タンパク質」又は「非血清タンパク質不含」の語は、機能的に活性ないかなるタンパク質も含まないことを意味する。しかし、酵母抽出物又はダイズ抽出物のようなタンパク質加水分解産物から生じうるような非機能的ペプチドは排除しない。特に異なる言及がない限り、「無タンパク質」の語は、ここで開示され、特許請求される濃度のプロテアーゼ及びヌクレアーゼ酵素の存在も排除しないものとする。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明は、全ウイルスワクチン、好ましくは弱毒化生ワクチンの製造のための簡単で信頼しうる極めて経済的な方法であって、
ａ）非血清タンパク質を含まない無血清培地で増殖して分離したアフリカミドリザル腎（ベロ）細胞を所望するウイルスに感染させ、
ｂ）プロテアーゼ及びヌクレアーゼを除く非血清タンパク質を含まない適当な無血清細胞培養培地と感染細胞を組み合わせて、
ｃ）感染性ウイルスの産生と、同時に、細胞培養培地に放出された核酸物質の消化を可能にするために、該プロテアーゼと該ヌクレアーゼの存在下で細胞をインキュベートして、
ｄ）細胞培養の遠心分離から得たウイルス含有上清を収集することによって感染性ウイルスを採取し、
ｅ）ウイルス含有上清を、ろ過、濃縮、凍結、凍結乾燥、及び安定剤の添加による安定化から成る群より選択される少なくとも１つのプロセシング段階に供することを含めてそのワクチンを調製する、
段階を含む方法に関する。
【００３３】
増殖のために使用するウイルスはベロ細胞系以外の宿主基質に一度も接触したことがないことが好ましい。これは、初期ウイルス（例えば鼻スワブ分離株）及び増殖後に得られるウイルス後代の免疫原性及び抗原性の同一性に関して最良の結果を保証する。
【００３４】
また、増殖のため、特に全ウイルスワクチン、好ましくはインフルエンザ弱毒化生ワクチンの製造のために使用するウイルスは、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳ８７、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳＰＲ８、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ＮＳ１２４ＰＲ８、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａ、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／９９／ｃａ３７株、及びこれらの株のいずれかから誘導される弱毒化変異株及び再集合体から成る群より選択されるインフルエンザウイルスであることが好ましい。好ましいウイルス株、例えばマスター株の遺伝的特性は下記の実施例において詳細に開示する。
【００３５】
もう１つの実施形態では、本発明は、その即時使用形態において、該ウイルスの生産のために使用される無血清及び無タンパク質ベロ細胞培養の基本的に修飾されていない、任意にろ過及び／又は濃縮された、ウイルス含有上清を含む、全ウイルスワクチンそのもの、好ましくは弱毒化生ワクチンを含む全ウイルスワクチンそのもの、好ましくは弱毒化生ワクチンを対象とする。ワクチンが、ここで開示し、特許請求するような本発明の方法に従って生産されることが特に好ましい。
【００３６】
さらなるプロセシング、例えば遠心分離及び／又は常套的なろ過（すなわちゲルろ過でないもの）以外の精製段階を必要としないこの「一段階」ワクチンは、ＦＤＡ認可のための必要条件に合致する。
【００３７】
本発明に従ったワクチン製剤におけるウイルス含有上清に関してここで使用するとき「基本的に修飾されていない」の語は、増殖したウイルスを採集した時点のままであるような上清の組成物、すなわち上清の液相中に存在する可溶性成分及び要素の組成物を指すものとする。例えばウイルス含有上清のろ過、無菌ろ過、遠心分離、濃縮、乾燥、又は凍結乾燥の段階によって起こりうるような成分の組成物の重要でない変化は「基本的に修飾されていない」の範囲内に含まれるとみなす。また、かかる語は、当該技術においてワクチン製剤に通常適用される防腐剤及び／又は安定剤の存在を排除しないものとする。
【００３８】
本発明の全ウイルスワクチンは、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染の予防的又は治療的処置のために使用しうる。それらは、当該技術において既知であるように、例えば静脈内、皮下、筋肉内又は、最も好ましくは鼻内経路で投与しうる。ここで開示するウイルス株及びそれらから作製されるワクチンは、しかしながら、異種抗原、例えばＨＩＶ−１又は肝炎抗原のようなウイルスエンベロープタンパク質の抗原を免疫系に提示するためのベクター又はシャトルとしても使用しうる。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態は付属の特許請求の範囲において定義する。
【００４０】
ここで述べる本発明がよりよく理解されるように、下記の実施例を提示する。それらは例示だけを目的とし、いかなる意味においても本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４１】
実施例１：ウイルスの生産
ベロ／ＳＦ（＝無血清）細胞の培養
ＳＦ培地：ＤＭＥＭ（ＢｉｏｃｈｒｏｍＦ０４３５）、Ｈａｍ’ｓＦ１２（ＢｉｏｃｈｒｏｍＦ０８１５）、５ｍＭＬ−Ｇｉｎ、０．１％ＳＦ補足（ａ）又は（ｂ）；抗生物質（ウイルス単離の第一継代に関してのみ）。
ＳＦ補足：インスリン、トランスフェリン又は成長因子のような機能的タンパク質を含まない、非動物由来のタンパク質分解産物。
ａ）ｈｙ−ｓｏｙ／ＵＦ６２．５ｇ、Ｑｕｅｓｔ５Ｘ５９１００、ＨＱ−水５００ｇに加えて、ＰＥＳ０．２μｍフィルターでろ過する；
ｂ）ｈｙ−ｐｅｐ１５１０１２．５ｇ、Ｑｕｅｓｔ、ＨＱ−水１００ｇに加えて、ＰＥＳ０．２μｍフィルターでろ過する。
【００４２】
ＷＣＢベロ細胞の低温凍結（液体窒素）消毒した（７０％エタノール）アンプルの内容物を解凍し、１０ｍｌ試験管中の低温無血清（ＳＦ）培地９ｍｌに加えて、１０００ｒｐｍ（１７０ｇ）で１０分間遠心分離した。ペレットをＳＦ培地に再懸濁して総容量３０ｍｌとし、８０ｃｍ²ルーフラスコに移して、３７℃、７％ＣＯ₂で少なくとも１５分間インキュベートした。その後、培地を取り出し、細胞を約０．１ｍｌ／ｃｍ² ＰＢＳｄｅｆ．（＝Ｃａ²⁺及びＭｇ^2;を含まないＰＢＳ）で洗った。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（８１０μｌ／ｃｍ²から１０μｌ／ｃｍ²；０．１％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液）を加え、室温で約３分間インキュベートした。手のひらでルーフラスコを静かに押して分離し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液の約１／５容量の量でＳＦ培地とトリプシン阻害因子（Ｓｉｇｍａ，Ｔ６５２２）を加えた。細胞懸濁液をルーフラスコ又は回転ビンに再分配し、３７℃、９％ＣＯ₂でインキュベートした。
【００４３】
ＭＤＣＫ細胞はＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２＋２％ＦＣＳ（熱不活性化）で増殖させた；ふ化鶏卵は１１日齢から１２日齢であり、ＳＰＦ（特定病原体感染防止条件）由来であった。
【００４４】
ウイルス株の増殖：
ベロ細胞を含む回転ビンからの古い培地を取り出し、各々の回転ビンにＳＦ培地中のウイルス懸濁液５ｍｌを加えて細胞をウイルスに感染させ、約０．０１のＭＯＩ（感染多重度）とした。３３℃で４５分間インキュベートした後、ウイルス接種原をピペットで除去した。０．５から１０、好ましくは２から５、最も好ましくは２μｇ／ｍｌブタトリプシン（供給者：ＡｖＰ）又はヒト組換えトリプシン又はトリプシノーゲン（我々自身の生産）及び０．５ｇ／ｌ重炭酸ナトリウムを補足したＳＦ培地９０ｍｌを各々の回転ビンに加え、ビンを３３℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。動物試験及びヒト臨床試験において使用するための弱毒化生ワクチン試料を生産するために、ＳＦ培地にトリプシンを補足し、さらに２から３０、好ましくは５から１５、最も好ましくは１０単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）／ｍｌ培地の濃度でＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を補足した。感染から６４時間後に、細胞上清を５０ｍｌ試験管中１０℃、４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で５分間遠心分離してウイルスを採集した。各々のウイルス株について上清をプールし、＋４℃で保存した。そのアリコートをワクチン試験に使用した。
【００４５】
保存のために、ウイルス試料を凍結乾燥することができ、また例えばトレハロース及びＨＥＰＥＳ緩衝液中ラクトアルブミン酵素的加水分解産物のような安定剤を加えてもよい。無菌水で還元を行うことができる。
【００４６】
実施例２：細胞培養におけるトリプシン不活性化の比較
【００４７】
【表１】

【００４８】
非感染ベロ細胞培養（実施例１で述べたようなＳＦ培地で増殖させた）及びＭＤＣＫ細胞培養（実施例１で述べたようなＦＳＣ補足培地で増殖させた）から得た上清を、それぞれ等しい濃度で０時の時点で上清に加えた異なる由来のトリプシンを不活性化する能力に関して試験した。ブタトリプシンは２つの異なる品質（異なる製造者から入手した）、すなわち高活性又は低活性で適用した。結果を表１及び図１と２に示す。
【００４９】
データは、ウシトリプシンはベロ細胞培養上清において速やかに不活性化され、ＭＤＣＫ細胞培養上清ではよりゆっくりと不活性化されることを明らかに示している。ブタ及びヒト組換えトリプシン（我々の研究室で製造した）はＭＤＣＫ上清中では完全に活性なままであるが、ベロ上清ではウシトリプシン不活性化のほぼ１／２又はそれ以下の速度で徐々に不活性化される。試験したブタトリプシンの相違は２４７ｎｍの開始時ＯＤレベルだけであるが、不活性化特性は両方のロットのブタトリプシンについて基本的に同じである。
【００５０】
実施例３：種々の宿主細胞基質での増殖後の様々なウイルス特性の比較
種々の宿主細胞基質について実施例１で述べたようにウイルス増殖を実施した。ベロ細胞で回収した７つの分離株の各々はヒト赤血球と反応性であったが、ニワトリ赤血球とは反応せず、それらのいずれもがふ化鶏卵において蓄積しなかった。他方で、ＭＤＣＫ細胞で回収したすべての分離株がニワトリとヒトの両方の赤血球と反応性であり、卵で成長することができた。これらの相違はＨ１Ｎ１サブタイプのインフルエンザＡ型ウイルスあるいはインフルエンザＢ型分離株では見られなかったが（下記の表３及び４参照）、それでもやはり、ベロ細胞でのインフルエンザウイルスの培養は他の基質での培養よりも適切に抗原特性を維持すると推定しうる。
【００５１】
【表２】

【００５２】
表３のデータから、ベロ及びＭＤＣＫ増殖分離株はそれらの赤血球凝集特性あるいはＨＡ配列において有意の差を示さないので、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスは適応選択を受けにくいと思われる。表４に列挙したＢ分離株についても同様の結論を引き出すことができる。
【００５３】
ウイルスの単離と複製のための臨床出発物質（例えば血清試料、スワブ）は主として下記から入手した：
１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ（Ｐｒｏｆ．Ｆ．Ｈｅｉｎｚ）１９９５／９６，１９９６／９７
２．ＵｎｉｔｅｄｅＧｅｎｅｔｉｑｕｅＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｄｅｓＶｉｒｕｓＲｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰａｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ（Ｐｒｏｆ．Ｓ．ｖａｎｄｅｒＷｅｒｆ）１９９６／９７
３．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｅｒｖｉｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（Ｄｒ．Ｍ．Ｚａｍｂｏｎ）１９９６／９７
４．ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓＣｅｎｔｒａｌｄｅＶｉｒｏｌｏｇｉｅ，ＨｏｐｉｔａｕｘＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅｓｄｅＧｅｎｅｖｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（Ｄｒ．Ｗ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉ）１９９６／９７，１９９７／９８
５．ＶｉｒｕｓＵｎｉｔ，ＱｕｅｅｎＭａｒｙＨｏｓｐｉｔａｌ，ＨｏｎｇＫｏｎｇ（Ｄｒ．Ｗ．Ｌ．Ｌｉｍ）１９９７／９８
【００５４】
【表３】

【００５５】
【表４】

【００５６】
【表５】

【００５７】
結果は、一部の分離株に関しては、ＰＣＲ増幅によってスワブ材料から直接得られたＨＡ配列に比べてベロ又はＭＤＣＫ増殖ウイルスのＨＡ配列の変化が存在しないことを示している。ＭＤＣＫ細胞で増殖した別の一部の分離株では、ＨＡ及び／又はＮＡ配列はベロ細胞で得られた対応する配列から逸脱していた。ベロ由来ウイルスは、しかし、測定したときスワブ分離株のＨＡ配列に比べてＨＡ配列の逸脱を示さなかった。
【００５８】
【表６】

【００５９】
【表７】

【００６０】
表６において最も意外な、しかし重要な結果は、ＭＤＣＫ由来のＡ／Ｖｉｅｎｎａ／４７／９６の免疫原性が対応するベロ由来ウイルスに比べて非常に低いことである。卵由来のウイルスが低い免疫原性しか示さないのは特に驚くべきことではない。
【００６１】
同様に表７に列記する結果は、ベロ由来ウイルスがＭＤＣＫ由来ウイルスに比べて、それらの宿主基質での適応選択によって全くではないにせよ、よりわずかしか変化しないことを示している。これは、ＭＤＣＫ由来ウイルスに比べてベロ由来ウイルスがもとのウイルスの免疫学的関連特性、特に抗原特性をより多く、さらにはその全部を維持していることを意味する。
【００６２】
実施例４：好ましい菌株によるワクチン生産
実施例１で述べた工程を動物試験及びヒト臨床試験のためのワクチン試料の生産にも使用した。実施例１で述べたウイルスの工程が、発明の導入なしに当業者によって示唆又は適用されうる変法を、かかる変法がここで及び特許請求の範囲で述べるような本発明の意味を変えない限りにおいて、包含することは明白である。
【００６３】
好ましいインフルエンザＡ型又はＢ型野性型菌株、マスター菌株又は再集合体菌株（下記で詳細に述べる）の１又はそれ以上を含むワクチン試料を、実施例１で述べるような栄養成分と酵素を付加的に補足した無血清培地において連続ベロ細胞系を宿主細胞系として用いて（他の宿主基質から得た試料との比較のためでない限り）独占的に生産した。
【００６４】
弱毒化（例えば温度感受性）、低温適応及び再集合の方法を含めて野生型ウイルスを修飾するのに適したいくつかの方法が当該技術において既知であり、例えばＷＯ９９／６４０６８号において広汎に検討されている。
【００６５】
例えばＷＨＯによって勧められている実際の流行性インフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子との６／２再集合による弱毒化生ワクチン生産のために有用な、２つの最も好ましいインフルエンザＡ型及びＢ型マスター菌株候補物のさらなる特性を下記の表８から表１３に示す。
【００６６】
【表８】

【００６７】
【表９】

【００６８】
しかし、ゲノムセグメントＮｏ．４と６、すなわちＨＡとＮＡ遺伝子は実際の流行性インフルエンザウイルスの対応する遺伝子と交換されるので（上述したように）、インフルエンザＡ型マスター菌株候補物を特性付けるために必要ではないことに留意しなければならない。ワクチンの安全性にとって重要な特徴、例えば温度感受性、又はワクチンの鼻内投与を可能にする特徴、すなわち低温適応（鼻腔内の平均温度は通常の体温よりも低いため）は、主として残りの６ゲノムセグメント内の突然変異によって生じる。
【００６９】
下記の表１０は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７／ｃａのゲノムセグメント内の突然変異を対応する野生型菌株Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７／ｗｔと比較して列記している。
Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７／ｃａの好ましい変異株は下記の表１１に列挙されているものを含み、表中、「Δ」は「デル」又は「デルタ」を意味し、そのＮＳ遺伝子セグメント内に少なくとも１つの「欠失」を含む突然変異体を表わす。
【００７０】
【表１０】

【００７１】
【表１１】

【００７２】
下記の表１２、１３及び１５は、それぞれ、好ましいインフルエンザＢ型マスター菌株候補物及びその変異株と再集合体を示す。
【００７３】
【表１２】

【００７４】
オーストリアのウィーンで１９９９年２月に急性インフルエンザを発症した１２歳の女児から、無血清培地で増殖したベロ細胞培養上で原株Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９を単離した。この株はｔｈｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ），Ａｔｌａｎｔａ，ＵＳＡによりＢ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３様と評価された。３３℃でさらに１継代した後、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｗｔと称する野生型菌株を、同じ細胞培養系を使用して２５℃で２２連続継代することによって弱毒化した。最初は２５℃で、その後の４回は３３℃でプラーク純化を実施した。誘導したプラーク純化クローンを増幅し、−７０℃で保存して、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ又は簡略にＢＶ２２と称した。ＮＩＢＳＣからの標準抗血清に関するＨＩ−アッセイによりＢ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３様ウイルスとしての同一性を確認した。
【００７５】
【表１３】

【００７６】
【表１４】

【００７７】
加えて、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ菌株のさらなる１５継代（すなわち無血清ベロ細胞培養での合計３７継代）により、ＢＶ２２よりもさらに優れた特性を備える突然変異株Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ３７（ＢＶ３７と略称する）を生じた。この突然変異株はＢＶ２２に比べて高い数の突然変異を含み、非組換えインフルエンザウイルス突然変異株に基づく全ウイルスワクチン、特に弱毒化インフルエンザ生ワクチンの生産のための現在最も有望な候補株であると思われる。付加的な突然変異を下記の表１５に列記する。
【００７８】
【表１５】

【００７９】
本発明に従ったインフルエンザＡ型及びＢ型マスター菌株は本文中の表に明白に列記されている特徴及び遺伝的特性に限定されず、変異が本発明の意味に含まれ、ウイルスの機能的特徴のいずれも実質的に変化させない限り、その重要でない変異も包含することは明白であろう。そのような変異は、例えばウイルスの増殖又は伝播（例えば配列分析のための材料を得るため）の付加的な段階のゆえに起こりうる。
【００８０】
さらに、ここで列挙する遺伝子配列は本発明と共に使用してプライマー配列（各ゲノムセグメントの冒頭又は末端部分に位置する）を含み、かかるプライマー配列は野生型及び弱毒化ウイルス株のいずれか又は両方のウイルスゲノムセグメントの対応する真正配列とは異なりうる。
【００８１】
実施例５：ワクチンの安全性と効果
その後のデータは、例えば実施例１で述べたような本発明に従って製造したインフルエンザワクチンに関する温度感受性とワクチンの安全性を確認している。
【００８２】
【表１６】

【００８３】
【表１７】

【００８４】
【表１８】

【００８５】
【表１９】

【００８６】
【表２０】

【００８７】
【表２１】

【００８８】
表１８から表２１に示す結果は、弱毒化温度感受性マスター菌株を含むワクチン、又は再集合体の場合には、弱毒化温度感受性マスター菌株の「骨格」（６遺伝子）と病原性野生型菌株Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０３５／９８ｗｔからのＨＡ及びＮＡ遺伝子から成る再集合ウイルスに基づくワクチンの安全性を明らかにしている。
【００８９】
【表２２】

【００９０】
【表２３】

【００９１】
菌株ＢＶ２２をベロ細胞上で高いＭＯＩにより５回継代した。その後再びｔｓ表現型を抑制した。表２３に示すように菌株は温度感受性を保持した。
【００９２】
【表２４】

【００９３】
データは、ｃａマスター菌株候補物ＢＶ２２は鼻粘膜では中等度の生殖が可能であったが、ウイルスのｔｓ特性は肺における生殖を妨げたことを示している。
【００９４】
【表２５】

【００９５】
野生型インフルエンザ菌株Ｂ／ＵＳＳＲ／６９ｗｔのＨＡとＮＡ及びＢ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ（ＢＶ２２）からのその他の６ゲノムセグメントを含む６／２際集合体菌株を樹立した。赤血球凝集素の由来をＨＩ−アッセイによって試験し、他のすべてのゲノムセグメントを当該技術で既知の方法を用いたＲＴ−ＰＣＲ及び制限分析によって試験した。
【００９６】
【表２６】

【００９７】
実施例６：臨床試験
鼻内送達用に本発明に従って（例えば実施例１で述べたように）下記のワクチン（鼻スプレーの形態）を生産した。
ｍｌ当りの組成物（凍結乾燥物質の還元後）：
（１）プラセボ：２×ＳＦ培地、４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、８％ラクトアルブミン酵素的加水分解産物、４％トレハロース；
（２）ベロ−ＶａｃＨ１：４．３×１０⁷ＴＣＩＤ₅₀のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７／ｃａとＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０３５／９８の６／２再集合体を含むＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）様製剤；２×培養上清、４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、８％ラクトアルブミン酵素的加水分解産物、４％トレハロース；
（３）ベロ−ＶａｃＨ３：２．１×１０⁷ＴＣＩＤ₅₀のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７／ｃａとＡ／ＳＷ／７７２９／９８の６／２再集合体を含むＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２）様製剤；２×培養上清、４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、８％ラクトアルブミン酵素的加水分解産物、４％トレハロース；
（４）ロシア三価ワクチン（成人用生インフルエンザワクチン）：
Ａ／１７／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９５／２５（Ｈ１Ｎ１）１．１×１０⁸
ＥＩＤ₅₀
Ａ／１７／Ｓｙｄｎｅｙ／９７／７６（Ｈ３Ｎ２）２．３×１０⁷
ＥＩＤ₅₀
Ｂ／６０／Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ／９５／２０１．１×１０⁷
ＥＩＤ₅₀
（５）一価ベロワクチンＢＶ２２：２×１０⁶ＴＣＩＤ₅₀のマスター菌株候補物Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ（＝ＢＶ２２）を含むＢ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１８４／９３様製剤；
２×培養上清、４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、８％ラクトアルブミン酵素的加水分解産物、４％トレハロース。
【００９８】
ワクチンを各ワクチン接種群につき１３名の志願者に投与した。還元したワクチン（又はプラセボ、それぞれ）５５０μｌを０日目及び２回目として２２±１日目に各々の患者に鼻内投与した。結果を下記の表２７に要約する。
【００９９】
安全性結果：
第１回及び第２回ワクチン接種後５日間の有害事象（ＡＥ）の総数は、軽度９例と中等度４例を含めた１４例であった。１名の志願者だけが最初のワクチン接種後３時間以内に３８．８℃までの体温上昇を含む重症ＡＥを示したが、局所又は全身症状は伴わなかった。その後４時間でこの志願者の体温は再び正常に戻った。最初のワクチン接種後に７例のＡＥが認められた。それらのうち１例が局所、６例が全身性であった。２回目のワクチン接種後には２例の局所と５例の全身性ＡＥが認められた。
【０１００】
プラセボの１群を含めて試験群の間で安全性に関する有意差は明らかにされなかった。ワクチン接種に関連する重篤なＡＥは、上述した１例を除いて認められなかった。中等度ＡＥのうち２例がＨ３Ｎ２群（１名の志願者では３７．６°までの体温上昇と３日目の急性咽頭炎；もう１名の志願者では鼻閉塞、２２−２４日目にのどの不快及び３７．５℃までの体温上昇）において、１例がＨ１Ｎ１群（のどの痛み、２２−２６日目に鼻炎、２２日目から２４日目の間に３７−３７．８℃までの体温上昇）で起こった。
【０１０１】
【表２７】

【０１０２】
従って臨床試験から得られた結果は、本発明のインフルエンザＡ型及びＢ型マスター菌株候補物を使用して本発明に従って生産したワクチンの非常に良好な安全性を確認している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベロ細胞培養の上清におけるトリプシン不活性化の時間的経過をグラフで示したものである。
【図２】ＭＤＣＫ細胞培養の上清におけるトリプシン不活性化の時間的経過をグラフで示したものである。
【配列表】

Claims

弱毒化インフルエンザ生ワクチン形態の全ウイルスワクチンの製造のための方法であって、
ａ）非血清タンパク質を含まない無血清培地で増殖して分離したアフリカミドリザル腎（以下、「ベロ」という。）細胞を所定のウイルスで感染させるステップと、
ｂ）前記感染された細胞と非血清タンパク質を含まない適当な無血清細胞培養培地を組み合わせるステップと、
ｃ）感染性ウイルスの産生と、同時に、前記細胞培養培地に放出された核酸物質の消化を可能にするために、前記細胞培養培地においてプロテアーゼおよびヌクレアーゼの両方の存在下で前記細胞をインキュベートするステップと、
ｄ）細胞培養の遠心分離および／又はろ過から得たウイルス含有上清を収集することによって感染性ウイルスを採取するステップと、
ｅ）前記ウイルス含有上清を、濃縮、凍結、凍結乾燥、及び、安定剤の添加による安定化から成る群より選択される少なくとも１つのプロセシング段階に供して、直ちに使用できる前記全ウイルスワクチンを得るステップと、を含み、
前記ステップｂ）に記載の前記無血清及び無タンパク質培地に、前記プロテアーゼおよび前記ヌクレアーゼを加え、そして、
前記ステップｅ）に記載の前記プロセシング段階は、たんぱく質分離又は精製を含まない、方法。
前記方法が、クロマトグラフィーによる分離又は精製の段階を含まない、請求項１に記載の方法。
前記クロマトグラフィによる分離が、ゲルクロマトグラフィによる分離である、請求項２に記載の方法。
前記方法が、遠心分離及び／又はろ過以外のいかなる精製段階も含まない、請求項１又は２に記載の方法。
前記方法が、前記ウイルス含有上清の無菌ろ過の少なくとも１つの段階を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記ヌクレアーゼがＤＮＡｓｅ及び／又はＲＮＡｓｅ活性を持つ、請求項１から５のうちいずれか１項に記載の方法。
前記プロテアーゼおよび前記ヌクレアーゼを、前記感染された細胞のインキュベーションの前又は前記インキュベーションの開始時に、前記細胞培養培地に加える、請求項１から６のうちいずれか１項に記載の方法。
前記プロテアーゼが、０．５〜１０μｇ／ｍｌ培地の初期濃度で細胞培養培地中に存在するヒト組換え又はブタ由来のトリプシン及び／又はトリプシノーゲンを含む、請求項１から７のうちいずれか１項に記載の方法。
プロテアーゼが、２〜５μｇ／ｍｌ培地の初期濃度で細胞培養培地中に存在するヒト組換え又はブタ由来のトリプシン及び／又はトリプシノーゲンを含む、請求項８に記載の方法。
前記細胞培養培地が、２Ｕ／ｍｌから３０Ｕ／ｍｌ培地の初期濃度で前記ヌクレアーゼを含む、請求項１から９のうちいずれか１項に記載の方法。
前記細胞培養培地が、５Ｕ／ｍｌから１５Ｕ／ｍｌ培地の初期濃度で前記ヌクレアーゼを含む、請求項１０に記載の方法。
前記ウイルスが、野生型ウイルス、感染個体から直接得られる一次分離株、組換えウイルス、弱毒化ウイルス、ベロ適応ウイルス、低温適応ウイルス、温度感受性ウイルス、及び再集合体ウイルスから成る群より選択される、請求項１から１１のうちいずれか１項に記載の方法。
前記ウイルスがインフルエンザＡ型ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスである、請求項１から１２のうちいずれか１項に記載の方法。
前記インフルエンザＡ型ウイルスが、Ｈ３Ｎ２又はＨ１Ｎ１サブタイプのインフルエンザＡ型ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
前記ウイルスがインターフェロン誘導性及び／又はインターフェロン感受性表現型を有する、請求項１から１４のうちいずれか１項に記載の方法。
前記ウイルスが、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳ８７、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳＰＲ８、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ＮＳ１２４ＰＲ８、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａ、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ３７、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＢ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａの再集合体、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体、及び、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする５個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体から成る群より選択される、請求項１から１５のうちいずれか１項に記載の方法。
アフリカミドリザル腎（ベロ）細胞適応ウイルス含有細胞培養上清を含む弱毒化インフルエンザ生ワクチン形態のベロ細胞適応全ウイルスワクチンであって、
前記ベロ細胞適応全ウイルスワクチンは、直ちに使用できる形態であり、
前記ベロ細胞適応ウイルス含有細胞培養上清は、ベロ細胞をウイルス菌株で感染させ、有効量のプロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む無血清及び無タンパク質細胞培養培地において前記感染されたベロ細胞をインキュベートし、遠心分離および／又はろ過によって前記細胞培養からウイルス含有上清を採取することによって得られ、
前記ウイルスワクチンは、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳ８７、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳＰＲ８、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ＮＳ１２４ＰＲ８、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａ、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ３７、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＢ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａの再集合体、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体、及び、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする５個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体から成る群より選択された１以上のインフルエンザウイルスを含み、
前記上清に含有された前記ベロ細胞適応ウイルスは、感染に使用された前記ウイルスと同じであるか、又は、抗原性、および／又はHA遺伝子の核酸配列、および／又は、NA遺伝子の核酸配列においてわずかに異なるものであり、そして、
前記全ウイルスワクチンは、採取の際の前記上清の組成物、任意に、濃縮、および／又は、凍結乾燥によって処理された前記上清の組成物、および／又は、防腐剤、凍結乾燥用の安定剤、および、滅菌水からなる群より選択された１以上の添加剤を加えた前記上清の組成物である、全ウイルスワクチン。
前記ウイルス菌株が、流行性菌株、又は、一次臨床分離株である、請求項１７に記載のワクチン。
鼻内送達に適した液体製剤の形態である、請求項１７に記載のワクチン。
請求項１から１６のいずれかで定義される製造方法によって得られる、請求項１７に記載のワクチン。
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のワクチンの製造のためのＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳ８７、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ΔＮＳＰＲ８、Ａ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａ／ＮＳ１２４ＰＲ８、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａ、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９／ｃａ３７、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＢ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９ｃａの再集合体、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする６個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体、及び、HAおよびNA以外のたんぱく質をコードする５個の遺伝子の骨格で構成されたＡ／Ｓｉｎｇ／１／５７ｃａの再集合体から成る群より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスの使用。