JP5057727B2 - Transformant containing hydroxynitrile lyase gene and nitrilase gene, and method for producing α-hydroxycarboxylic acid using the same - Google Patents
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Description
本発明は、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む発現ベクター、および形質転換体、並びにそれを用いたα−ヒドロキシカルボン酸の製造法に関する。 The present invention relates to a hydroxynitrile lyase gene, an expression vector containing a nitrilase gene, a transformant, and a method for producing α-hydroxycarboxylic acid using the same.
微生物を用いた酵素反応によるα−ヒドロキシカルボン酸の製造に関しては、α−ヒドロキシニトリルに、ニトリラーゼを作用させ、α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法が知られている。 Regarding the production of α-hydroxycarboxylic acid by enzymatic reaction using microorganisms, a method of producing α-hydroxycarboxylic acid by reacting nitrilase with α-hydroxynitrile is known.
例えば、コリネバクテリウム属細菌によるグリコール酸、乳酸およびα−ヒドロキシイソ酪酸等の製造方法（特許文献１）、バチルス属細菌、バクテリジウム属細菌、クロコッカス属細菌またはブレビバクテリウム属細菌による乳酸、グリコール酸等の製造方法（特許文献２）、シュードモナス属細菌、アースロバクター属細菌、アスペルギルス属細菌、ペニシリウム属細菌、コクリオボラス属細菌またはフザリウム属細菌による乳酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、マンデル酸、α−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシ吉草酸、α−ヒドロキシ−α−フェニルプロピオン酸、α−ヒドロキシ−α−（ｐ−イソブチルフェニル）−プロピオン酸等の製造方法（特許文献３）等が挙げられる。 For example, a method for producing glycolic acid, lactic acid, α-hydroxyisobutyric acid and the like by Corynebacterium bacteria (Patent Document 1), lactic acid, glycol by Bacillus bacteria, Bacterium bacteria, Crococcus bacteria, or Brevibacterium bacteria A method for producing acids, etc. (Patent Document 2), Pseudomonas bacteria, Arthrobacter bacteria, Aspergillus bacteria, Penicillium bacteria, Cocryobora bacteria or Fusarium bacteria, lactic acid, α-hydroxyisobutyric acid, mandelic acid, α- Examples include a method for producing hydroxybutyric acid, α-hydroxyvaleric acid, α-hydroxy-α-phenylpropionic acid, α-hydroxy-α- (p-isobutylphenyl) -propionic acid (Patent Document 3), and the like.
また、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法としては、以下の方法がしられている。 In addition, as a method for producing optically active α-hydroxycarboxylic acid, the following method is used.
（１）α−ヒドロキシニトリルに、光学選択性の高いニトリラーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（２）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、化学的加水分解によりα―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（３）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、ニトリラーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
(1) A method for producing optically active α-hydroxycarboxylic acid by allowing nitrilase having high optical selectivity to act on α-hydroxynitrile.
(2) A method of producing an α-hydroxycarboxylic acid by chemical hydrolysis after synthesizing an optically active α-hydroxynitrile by reacting a carbonyl compound and a cyanide donor with a hydroxynitrile lyase having high optical selectivity.
(3) A method for producing an optically active α-hydroxycarboxylic acid by reacting a carbonyl compound and a cyanide donor with a highly optically selective hydroxynitrile lyase to synthesize optically active α-hydroxynitrile and then reacting with nitrilase.
上記（１）の方法としては、例えばラセミ体のマンデロニトリルから（Ｒ）−選択的ニトリラーゼの作用により、高収率で（Ｒ）−マンデル酸を製造する方法が提案されている（特許文献４，特許文献５，特許文献６）。（Ｒ）−選択的ニトリラーゼを与える微生物としてはシュードモナス属細菌、アルカリゲネス属細菌、アシネトバクター属細菌、カセオバクター属細菌、ノカルディア属細菌、バチルス属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、オーロバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌またはゴルドナ属細菌（特許文献４，５，６，７および８）が知られている。一方、立体選択性の高い（Ｓ）−選択的ニトリラーゼは知られていない。よって、上記（１）の方法は、特定の光学活性体にのみ有効な製造方法で汎用性があるとは言えない。
As the method (1), for example, a method for producing (R) -mandelic acid in high yield from racemic mandelonitrile by the action of (R) -selective nitrilase has been proposed (Patent Literature). 4,
上記（２）の方法は、非特許文献１、非特許文献２、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１で提案されている。
The method (2) is proposed in
上記（３）の方法としては、固定化ヒロドキシニトリルリアーゼと固定化ニトリラーゼの混合物を使用し、ベンズアルデヒドとシアニドドナーからワンポットでＲ−マンデル酸を製造する方法が報告されている。（非特許文献３）、Manihot esculenta由来の（Ｓ）−選択的ヒドロキシニトリルリアーゼにより（Ｓ）−マンデロニトリルを製造後、Pseudomonas fluorescens EBC191由来のニトリラーゼを作用させることにより（Ｓ）−マンデル酸を製造する方法（非特許文献４）等がある。 As a method of (3) above, a method of producing R-mandelic acid in one pot from benzaldehyde and cyanide donor using a mixture of immobilized hydroxynitrile lyase and immobilized nitrilase has been reported. (Non-patent Document 3) After (S) -mandelonitrile is produced by (S) -selective hydroxynitrile lyase derived from Manihot esculenta , nitrilase derived from Pseudomonas fluorescens EBC191 is allowed to act on (S) -mandelic acid. There is a manufacturing method (Non-Patent Document 4).
しかしながら、非特許文献３の方法では、光学活性α―ヒドロキシニトリルは、水溶液中でラセミ化が起こり易いため、α−ヒドロキシニトリルを合成する反応は、有機溶剤中で行う必要がある。一般的に有機溶媒中での反応では、酵素を菌体に保持したまま反応に供すると、菌体内の酵素へ基質（反応原料化合物）が十分に接触せず、反応効率が低下することが知られている。よって、菌体から酵素を単離して反応に用いる必要がある。また単離した酵素は、適当な担体に固定する必要があるため、操作が煩雑となり、コスト高となる。さらには、酵素反応後、続く加水分解反応に際し、溶媒の置換、不純物の除去、光学活性の維持等の問題を回避する必要もあり、操作が煩雑となる。
However, in the method of Non-Patent
また、非特許文献４記載のニトリラーゼは、ニトリルヒドラターゼ活性も示すため、マンデル酸アミドを副生する。
したがって、より簡便な反応で更には低コストで光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造する方法が求められていた。
Moreover, since the nitrilase described in Non-Patent
Therefore, there has been a demand for a method for producing optically active α-hydroxycarboxylic acid with a simpler reaction and at a lower cost.
本発明の目的は、上述した従来技術における欠点を解消した光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することにある。 The objective of this invention is providing the manufacturing method of the optically active alpha-hydroxy carboxylic acid which eliminated the fault in the prior art mentioned above.
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを作製し、それを導入したヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを有する形質転換体を得ることに成功した。 As a result of intensive studies, the present inventors have produced an expression vector containing a hydroxynitrile lyase gene and a nitrilase gene, and have succeeded in obtaining a transformant having the hydroxynitrile lyase and nitrilase introduced therewith.
本発明者らは、上記形質転換体を利用して更に研究を進めた結果、酵素を菌体から単離することなく菌体自体を反応に用いることが可能であり、しかも、このような菌体自体を用いる反応によれば、立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼにより生成した光学活性シアンヒドリンは速やかにニトリラーゼにより光学活性α−ヒドロキシカルボン酸に変換され、アルデヒド化合物とシアニドドナーから高光学純度の光学活性α−ヒドロキシカルボン酸が高収率で製造できることを見いだした。 As a result of further research using the transformant, the present inventors can use the microbial cell itself in the reaction without isolating the enzyme from the microbial cell. According to the reaction using the product itself, the optically active cyanohydrin produced by the stereoselective hydroxynitrile lyase is rapidly converted into optically active α-hydroxycarboxylic acid by nitrilase, and the optically active α-hydroxy of high optical purity is obtained from the aldehyde compound and cyanide donor. It has been found that hydroxycarboxylic acids can be produced in high yield.
すなわち本発明は、下記の態様を含む。
〔１〕ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔２〕立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低いまたは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔３〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターとから得られる〔１〕又は〔２〕記載の微生物。
〔４〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターから得られる請求項１又は２記載の微生物。
〔５〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、Manihot esculenta由来の遺伝子である、〔３〕又は〔４〕記載の発現ベクター。
That is, the present invention includes the following aspects.
[1] A transformed microorganism into which a hydroxynitrile lyase gene and a gene encoding nitrilase have been introduced.
[2] A transformed microorganism into which a gene encoding a stereoselective hydroxynitrile lyase and a gene encoding a nitrilase having a low stereoselectivity or the same stereoselectivity as the hydroxynitrile lyase are introduced.
[3] The microorganism according to [1] or [2] obtained from an expression vector containing a gene encoding hydroxynitrile lyase and an expression vector containing a gene encoding nitrilase.
[4] The microorganism according to
[5] The expression vector according to [3] or [4], wherein the gene encoding hydroxynitrile lyase is a gene derived from Manihot esculenta .
〔６〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である、〔３〕又は〔４〕記載のベクター。
（ａ） 配列番号２で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号２で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔７〕ニトリラーゼをコードする遺伝子がBradyrhizobium japonicum由来の遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
〔８〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号３で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号３で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔９〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号４で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号４で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号５で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号５で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
[6] The vector according to [3] or [4], wherein the gene encoding hydroxynitrile lyase is any of the following genes:
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene that hybridizes with the gene shown in SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
[7] The vector according to any one of [3] to [6], wherein the gene encoding nitrilase is a gene derived from Bradyrhizobium japonicum.
[8] The vector according to any one of [3] to [6], wherein the gene encoding nitrilase is any of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 3.
(B) A gene that hybridizes with the gene shown in SEQ ID NO: 3 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
[9] The vector according to any one of [3] to [6], wherein the gene encoding nitrilase is any of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 4.
(B) A gene that hybridizes with the gene shown in SEQ ID NO: 4 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
[10] The vector according to any one of [3] to [6], wherein the gene encoding nitrilase is any of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 5.
(B) a gene that hybridizes with the gene shown in SEQ ID NO: 5 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
〔１１〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号６で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号６で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１２〕ベクターが、プラスミドベクターである〔３〕〜〔１１〕のいずれかに記載のベクター。
〔１３〕プラスミドベクターが、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミド（ｐＯＸＮ１０３、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ）、ニトリラーゼ発現プラスミド（ｐＮＬＡ００１、ｐＮＬＡ０１０、ｐＮＬＢ００１、ｐＮＬＢ００２、ｐＮＬＢ００４、ｐＮＬＢ０１０）、ニトリラーゼ遺伝子及びヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミド（ｐＮＬＡ２０１、ｐＮＬＡ２０３、ｐＮＬＡ２１１、ｐＮＬＡ２１３、ｐＮＬＢ２０１、ｐＮＬＢ２０３、ｐＮＬＢ２１１、ｐＮＬＢ２１３）のいずれかである〔１２〕記載のベクター。
〔１４〕請求項３〜１３のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換体。
〔１５〕形質転換体の宿主が、大腸菌又はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌である〔１４〕に記載の形質転換体。
[11] The vector according to any one of [3] to [6], wherein the gene encoding nitrilase is any of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 6.
(B) a gene that hybridizes with the gene shown in SEQ ID NO: 6 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
[12] The vector according to any one of [3] to [11], wherein the vector is a plasmid vector.
[13] Plasmid vectors include a hydroxynitrile lyase expression plasmid (pOXN103, pOXN103V2I, pOXN103V2R), a nitrilase expression plasmid (pNLA001, pNLA010, pNLB001, pNLB002, pNLB004, pNLB010), a nitrilase gene and a hydroxynitrile lyase gene integrated [12] The vector according to any one of (pNLA201, pNLA203, pNLA211, pNLA213, pNLB201, pNLB203, pNLB211, pNLB213).
[14] A transformant into which the vector according to any one of
[15] The transformant according to [14], wherein the transformant host is Escherichia coli or a Rhodococcus bacterium.
〔１６〕形質転換体が、JM109/pNLA201、JM109/pNLA203、JM109/pNLA211、ATCC12674株/pOXN611、ATCC12674株/pOXN612のいずれかである請求項１５記載の形質転換体。
〔１７〕カルボニル化合物及びシアニドドナーに〔１〕，〔２〕，〔１４〕，〔１５〕，〔１６〕のいずれかの形質転換微生物を作用させることを含む、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
[16] The transformant according to
[17] Production of an optically active α-hydroxycarboxylic acid comprising the action of a transformed microorganism of any one of [1], [2], [14], [15] and [16] on a carbonyl compound and a cyanide donor Method.
本発明によれば、カルボニル化合物とシアニドドナーからヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを用いた、簡便なα−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a simple method for producing an α-hydroxycarboxylic acid using a hydroxynitrile lyase and a nitrilase from a carbonyl compound and a cyanide donor.
すなわち、本発明による形質転換体を用いることにより、酵素を菌体から単離することなくカルボニル化合物とシアニドドナーからα−ヒドロキシカルボン酸の製造が可能になる。 That is, by using the transformant according to the present invention, it is possible to produce α-hydroxycarboxylic acid from a carbonyl compound and a cyanide donor without isolating the enzyme from the microbial cell.
更に、本発明によれば、形質転換体内にヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼが高密度に存在することにより、ヒドロキシニトリルリアーゼにより生成したヒドロキシニトリル中間体が速やかにニトリラーゼによりヒドロキシカルボン酸に変換することが可能となり、α−ヒドロキシカルボン酸を高収率に製造することが可能となる。 Furthermore, according to the present invention, since the hydroxynitrile lyase and nitrilase are present in a high density in the transformant, the hydroxynitrile intermediate produced by the hydroxynitrile lyase can be quickly converted into hydroxycarboxylic acid by the nitrilase. Thus, α-hydroxycarboxylic acid can be produced in high yield.
本発明の形質転換体は、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子が含むものである。好ましくは、立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低い、あるいは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子を含むものである。ここで、同じ立体選択性とは、ヒドロキシニトリルリアーゼが（Ｓ）選択的の場合は、（Ｓ）選択的ニトリラーゼ、（Ｒ）選択的の場合は、（Ｒ）選択的ニトリラーゼの組合せを言う。 The transformant of the present invention includes a gene encoding hydroxynitrile lyase and a gene encoding nitrilase. Preferably, it includes a gene encoding a stereoselective hydroxynitrile lyase and a gene encoding a nitrilase having a low stereoselectivity or the same stereoselectivity as the hydroxynitrile lyase. Here, the same stereoselectivity means a combination of (S) selective nitrilase when hydroxynitrile lyase is (S) selective, and (R) selective nitrilase when (R) selective.
（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子とは、アルデヒド化合物とシアニドドナーから（Ｓ）立体選択的にα−ヒドロキシ化合物を製造する能力を有する酵素蛋白をコードする遺伝子をいう。その遺伝子としては特に制限されないが、好ましくは、キャッサバ（Manihot esculenta）やパラゴム（Hevea brasiliensis）等由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（非特許文献Hughes Ｊ．ら、Arch. Biochem. Biopphys．311, 496-502 (1994)、非特許文献Hasslacher M．ら、J. Biol. Chem．271, 5884-5891 (1996)、GenBank accession number Ｚ２９０９１およびＵ４０４０２）。 The (S) -hydroxynitrile lyase gene refers to a gene encoding an enzyme protein having the ability to produce an (S) stereoselectively from an aldehyde compound and a cyanide donor. The gene is not particularly limited, but preferably, a hydroxynitrile lyase gene derived from cassava ( Manihot esculenta ), para rubber ( Hevea brasiliensis ) and the like can be mentioned. These gene sequences have been published in the literature (Non-Patent Document Hughes J. et al., Arch. Biochem. Biopphys. 311, 496-502 (1994), Non-Patent Document Hasslacher M. et al., J. Biol. Chem. 271, 5884-5891 (1996), GenBank accession number Z29091 and U40402).
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子とは、アルデヒド化合物とシアニドドナーから（Ｒ）立体選択的にα−ヒドロキシ化合物を製造する能力を有する酵素蛋白をコードする遺伝子をいう。その遺伝子としては特に制限されないが、好ましくは、アーモンド（Prunus dulcis）やブラックチェリー（Prunus serotina）等由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（非特許文献Dreveny, I.，ら、Structure，９（９），８０３−８１５（２００１）、非特許文献 Cheng I.P．ら、Plant Cell Physiol，３４，１１３９−１１４３（１９９３）およびGenBank accession number ＡＦ４１２３２９）。 The (R) -hydroxynitrile lyase gene refers to a gene encoding an enzyme protein having the ability to produce an (R) stereoselectively from an aldehyde compound and a cyanide donor. Although it does not restrict | limit especially as the gene, Preferably, the hydroxy nitrile lyase gene derived from almond ( Prunus dulcis ), black cherry ( Prunus serotina ), etc. can be mentioned. These gene sequences have been published in the literature (Non-patent literature Dreveny, I., et al., Structure, 9 (9), 803-815 (2001)), Non-patent literature Cheng IP. Et al., Plant Cell Physiol, 34 1139-1143 (1993) and GenBank accession number AF41329).
上述のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子は、植物から当該酵素遺伝子のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ等を抽出し、定法に従ってｃＤＮＡを合成し、公知のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子配列情報をもとに設計したプライマ−を用いてＰＣＲ法で当該酵素をコ−ドする遺伝子を増幅することで得ることができる（このような方法に関しては、例えば、文献「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))等を参照することができる）。 The above-mentioned hydroxynitrile lyase gene is designed based on known hydroxynitrile lyase gene sequence information by extracting total RNA or mRNA containing mRNA of the enzyme gene from plants, synthesizing cDNA according to a conventional method. Can be obtained by amplifying a gene that encodes the enzyme by PCR using the prepared primer (for example, the literature “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold See Spring Harbor Press (1989)).
また、ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をいくつかの領域（例えば、５０塩基程度）に分割し、隣り合う領域とのオーバーラップ（例えば、２０塩基程度）を両端に有するような複数のオリゴヌクレオチドを設計および合成し、これらオリゴヌクレオチドを互いにアニールさせるＰＣＲによっても合成することができる。得られた増幅産物は、例えば、適切な制限酵素により切断し、同制限酵素切断末端と連結可能な切断末端を生じさせることができる制限酵素で処理したベクターＤＮＡと連結し、適切な微生物宿主の形質転換体または形質導入体を作製し、目的増幅産物がベクターＤＮＡ中に正しく組み込まれたクロ−ンを選択することにより、クロ−ニングすることができる（このような方法に関しては、例えば、文献 Xiong, A-S ら Nucleic Acids Res. 32(12), e98 (2004)等を参照することができる）。 Also, design multiple oligonucleotides that divide the hydroxynitrile lyase gene into several regions (for example, about 50 bases) and have overlapping regions (for example, about 20 bases) at both ends. It can also be synthesized by PCR, which synthesizes and anneals these oligonucleotides to each other. The obtained amplification product is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and ligated with a vector DNA treated with a restriction enzyme capable of generating a cleaved end that can be ligated with the same restriction enzyme cleaved end. Cloning can be performed by preparing a transformant or a transductant and selecting a clone in which the target amplification product is correctly incorporated into the vector DNA (for such methods, see, for example, the literature). Xiong, AS et al. Can refer to Nucleic Acids Res. 32 (12), e98 (2004)).
上述のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、その遺伝子がコードする酵素の立体選択性、酵素活性等が損失されない限り、塩基の欠失、付加、挿入又は置換等の変異が含まれていても構わない。例えば、配列番号１記載のヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列に対して、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加した配列であって、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、配列番号２記載のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子に対して、相補な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ当該活性を有するＤＮＡであっても構わない。 The above-mentioned hydroxynitrile lyase gene may contain mutations such as base deletion, addition, insertion or substitution as long as the stereoselectivity and enzyme activity of the enzyme encoded by the gene are not lost. For example, a gene encoding a protein having a hydroxynitrile lyase activity, wherein the amino acid sequence of hydroxynitrile lyase described in SEQ ID NO: 1 is a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added. It is. Alternatively, it may be DNA that hybridizes to the hydroxynitrile lyase gene described in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions with a complementary sequence and has the activity .
ニトリラーゼ遺伝子としては、ニトリラーゼの立体選択性が低いかまたは当該する生成物の選択性に偏っていれば特に制限はない。例えばBradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株由来のニトリラーゼ遺伝子や自然環境中のＤＮＡからクローニングされた２Ａ４と名付けられたニトリラーゼ遺伝子(図１Ｈ 配列番号６)等を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（それぞれ、非特許文献DNA Res．９ ，１８９−１９７（２００２）、Robertson, D. E．ら、Appl.Environ.Microbiol．７０，２４２９−２４３６（２００４）およびGenBank accession number ＡＰ００５９５８およびＡＹ４８７４７３）。 The nitrilase gene is not particularly limited as long as the stereoselectivity of the nitrilase is low or the selectivity of the product concerned is biased. For example, a nitrilase gene derived from Bradyrhizobium japonicum USDA110 strain, a nitrilase gene named 2A4 cloned from DNA in the natural environment (FIG. 1H, SEQ ID NO: 6) and the like can be mentioned. These gene sequences have been published in literature (Non-patent literature DNA Res. 9, 189-197 (2002), Robertson, D. E. et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2429-2436 (respectively). 2004) and GenBank accession numbers AP005958 and AY487473).
ここで、「立体選択性の低いニトリラーゼ」とは、生成物の光学純度が±２０％ｅ．ｅ．以下のもの、好ましくは±１０％ｅ．ｅ．以下のものをいう。この場合に使用すべき生成物の光学純度を決定する方法に関しては、例えば、文献 日本化学会編“化学総説６，光学異性体の分離”、学会出版センター(1989)等を参照することができる。
Here, “nitrilease with low stereoselectivity” means that the optical purity of the product is ± 20% e.e. e. The following, preferably ± 10% e.e. e. It means the following. Regarding the method for determining the optical purity of the product to be used in this case, for example, the literature “
Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ遺伝子については、ニトリラーゼとしてアノテーションされていたものの、これまでニトリラーゼ活性は確認されておらず、本発明に於いて初めてニトリラーゼ活性を有することおよび基質特異性等が明らかとなった。 Although the nitrilase gene derived from Bradyrhizobium japonicum has been annotated as nitrilase, no nitrilase activity has been confirmed so far, and for the first time in the present invention, it has been revealed that it has nitrilase activity and substrate specificity.
Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ遺伝子は、常法により染色体ＤＮＡを抽出し、遺伝子配列情報をもとに設計したプライマ−を用いてＰＣＲ法で当該酵素をコ−ドする遺伝子を増幅することで得ることができる。また、上記のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の場合と同様に、遺伝子を人工合成することができる。自然環境中のＤＮＡからクローニングされたニトリラーゼ遺伝子についても、その配列情報を元に遺伝子を人工合成すればよい。 The nitrilase gene derived from Bradyrhizobium japonicum can be obtained by extracting the chromosomal DNA by a conventional method and amplifying the gene encoding the enzyme by the PCR method using a primer designed based on the gene sequence information. it can. In addition, the gene can be artificially synthesized as in the case of the above-mentioned hydroxynitrile lyase gene. A nitrilase gene cloned from DNA in the natural environment may be artificially synthesized based on the sequence information.
上述のニトリラーゼ遺伝子は、その遺伝子がコードする酵素の立体選択性、酵素活性等が損失されない限り、塩基の欠失、付加、挿入又は置換等の変異が含まれていても構わない。例えば、配列番号３記載のニトリラーゼのアミノ酸配列に対して、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加した配列であって、且つニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、配列番号４記載のニトリラーゼ遺伝子の配列に対して、相補な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ当該活性を有する遺伝子であっても構わない。次に、上述のヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼを発現させるための宿主―ベクター系の選択を行う。 The nitrilase gene described above may contain mutations such as base deletion, addition, insertion, or substitution as long as the stereoselectivity, enzyme activity, etc. of the enzyme encoded by the gene are not lost. For example, a gene encoding a protein having a nitrilase activity, which is a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added to the amino acid sequence of nitrilase described in SEQ ID NO: 3. Further, it may be a gene that hybridizes to a sequence complementary to the sequence of the nitrilase gene described in SEQ ID NO: 4 under stringent conditions and has the activity . In the following, hydroxynitrile rear above - to select the vector system - host for expressing a peptidase and nitrilase.
宿主に導入するベクターとしては、上記の酵素遺伝子を保持し、且つ複製可能であれば、特段の制約を受けるものではなく、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ等が挙げられる。
The vector to be introduced into the host is not particularly limited as long as it retains the above enzyme gene and can be replicated, and a vector suitable for each host can be used. For example, plasmid DNA, bacteriophage, etc. are mentioned.
Examples of plasmid DNA include Escherichia coli-derived plasmids (ColE plasmids such as pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, and pBluescript), actinomycete-derived plasmids (pIJ486, etc.), and yeast-derived plasmids (YEp13,
宿主としては、上記の酵素遺伝子が発現するものであれば良い。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、植物等を挙げることができる。好ましくは、大腸菌及びロドコッカス属細菌である。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体および遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
Any host that expresses the above-described enzyme gene may be used. For example, mammalian cells, insect cells, E. coli, Bacillus subtilis, yeasts, molds, plants and the like can be mentioned. Preferred are Escherichia coli and Rhodococcus bacteria.
Examples of the E. coli host include E. coli K12 strain and B strain, or JM109 strain, XL1-Blue strain, C600 strain, W3110 strain and the like derived from these wild strains. In addition, mutants of these strains, recombinants, derivatives by genetic engineering techniques, and the like can also be used.
ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株やロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株(FERM BP-1478)等を挙げることができる。 Examples of the genus Rhodococcus include Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674 strain, Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (FERM BP-1478), and the like.
以下、より詳細に形質転換（導入）体（以下、単に「形質転換体」と称す）の作成方法について説明する。
プラスミドＤＮＡは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、プロモ−タ−、リボソーム結合配列、転写タ−ミネ−タ−、更に好ましくは形質転換体の選択マ−カ−となる遺伝子を含む。
Hereinafter, a method for producing a transformed (introduced) body (hereinafter simply referred to as “transformant”) will be described in more detail.
Plasmid DNA comprises DNA sequences, promoters, ribosome binding sequences, transcription terminators, and more preferably transformant selection markers necessary for the plasmid to grow in the host cell. Contains the gene
プロモーター配列としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。また、ｔａｃプロモーター・ｔｒｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。 Examples of promoter sequences include trp promoter of tryptophan operon derived from E. coli, lac promoter of lactose operon, PL promoter and PR promoter derived from lambda phage, gluconate synthase promoter (gnt) derived from Bacillus subtilis, alkaline protease promoter (apr) -Neutral protease promoter (npr), alpha-amylase promoter (amy), etc. can be mentioned. In addition, sequences modified and designed uniquely such as tac promoter and trc promoter can also be used.
リボソーム結合配列としては、ＳＤ配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法等により付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス属細菌または枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。 SD sequences and Kozak sequences are known as ribosome binding sequences, and these sequences can be inserted upstream of the mutated gene. An SD sequence may be added by a PCR method or the like when a prokaryote is used as a host, and a Kozak sequence may be added when a eukaryotic cell is used as a host. Examples of the SD sequence include E. coli-derived, Rhodococcus genus bacteria, Bacillus subtilis-derived sequences, and the like, but are not particularly limited as long as the sequence functions in a desired host. For example, a consensus sequence in which a sequence complementary to the 3 'terminal region of 16S ribosomal RNA is continuous by 4 bases or more may be prepared by DNA synthesis and used.
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。選択マ−カ−としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。 A transcription termination sequence is not always necessary, but a ρ-factor-independent sequence such as a lipoprotein terminator, a trp operon terminator, etc. can be used. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a kanamycin resistance gene.
大腸菌を宿主に用いた場合には、特に有用なベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＦＹ５２９、ｐＥＴ−１２、ｐＥＴ−２６ｂ等が例示される。これらベクターにヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼをコ−ドする遺伝子断片を組み込むには、これらを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカ−を付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子およびニトリラーゼ遺伝子は、何れの順に結合させてもよい。また、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子発現プラスミドおよびニトリラーゼ遺伝子発現プラスミドとを別々に作成した後、これらを同じ宿主に導入して、ヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを発現する組換え体を作成してもよい。この場合、両ベクターは不和合性を持たないように選択しなければならない。 When Escherichia coli is used as a host, particularly useful vectors include pTrc99A, pKK233-2, pFY529, pET-12, pET-26b and the like. In order to incorporate the gene fragments encoding hydroxynitrile lyase and nitrilase into these vectors, the DNA containing them is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and if necessary, an appropriate linker is added, and then an appropriate linker is added. This can be performed by ligating with a vector cleaved with a restriction enzyme. The hydroxynitrile lyase gene and the nitrilase gene may be combined in any order. Alternatively, a hydroxynitrile lyase gene expression plasmid and a nitrilase gene expression plasmid may be prepared separately and then introduced into the same host to produce a recombinant that expresses the hydroxynitrile lyase and nitrilase. In this case, both vectors must be chosen so as not to be incompatible.
かくして得られた発現プラスミドを宿主細胞に導入すれば、ヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼを高度に発現する形質転換体が得られる。当該形質転換体を培養することにより、細胞内にこれらの酵素を発現・蓄積させることができる。 When the expression plasmid thus obtained is introduced into a host cell, a transformant highly expressing hydroxynitrile lyase and nitrilase can be obtained. By culturing the transformant, these enzymes can be expressed and accumulated in the cells.
発現ベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレ−ション法等を挙げることができる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を用いることができる。酵母への発現プラスミドの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレ−ション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。 The method for introducing the expression vector is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA. Examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method. When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Pichia pastoris, etc. can be used. The method for introducing an expression plasmid into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
次に上記のごとく作成した形質転換体を培養する方法を説明する。培養に際し使用する培地には特に制限は無く、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また培養条件に関しても、形質転換体が生育、増殖可能で且つ酵素産生が良好に行える条件を選択し、培養すればよい。 Next, a method for culturing the transformant prepared as described above will be described. There is no particular limitation on the medium used for culturing, and any natural medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host fungus and can efficiently culture the transformant. Either a medium or a synthetic medium may be used. In addition, regarding the culture conditions, it is sufficient to select and culture conditions under which the transformant can grow and proliferate and can produce the enzyme satisfactorily.
使用する培地として、炭素源としては、グルコ−ス、ガラクト−ス、フラクト−ス、スクロ−ス、ラフィノ−ス、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ−ル、プロパノ−ル、グリセリン等のアルコ−ル類を挙げることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物を挙げることができる。その他、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−、酵母エキス、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を挙げることができる。その他、ビタミン等が必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 As a medium to be used, as a carbon source, glucose, galactose, fructose, sucrose, raffinose, starch and other carbohydrates, acetic acid, propionic acid and other organic acids, ethanol, and propanol And alcohols such as glycerin and glycerin. Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds. In addition, peptone, meat extract, cone-prica, yeast extract, various amino acids, and the like may be used. Examples of the inorganic substance include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. In addition, vitamins and the like may be added as necessary. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
プロモ−タ−として誘導性のプロモ−タ−を用いた発現プラスミドで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデュ−サ−を培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモ−タ−を有する発現プラスミドで形質転換した微生物を培養するときには ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インド−ル酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモ−タ−を用いた発現プラスミドで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。 When culturing a microorganism transformed with an expression plasmid using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression plasmid having a promoter inducible with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), IPTG or the like can be added to the medium. Further, when cultivating a microorganism transformed with an expression plasmid using a trp promoter inducible with indolacetic acid (IAA), IAA or the like can be added to the medium.
大腸菌の培養に際し、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養することが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コ−ンスティ−プリカ−、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものを用いることができる。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整することが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施することが好ましい。 When culturing Escherichia coli, it may be cultured by a normal solid culture method, but it is preferable to employ a liquid culture method as much as possible. Examples of the culture medium used for the culture include one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, polypeptone, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, potassium phosphate, phosphate Add one or more inorganic salts such as ferric potassium, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate, or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. be able to. It is appropriate to adjust the initial pH of the medium to 7-9. The culture is performed at 5 ° C to 40 ° C, preferably 10 ° C to 37 ° C for 5 to 100 hours. It is preferable to carry out by aeration stirring deep culture, shaking culture, static culture, fed-batch culture, or the like.
次に、上記のごとく調製した形質転換体をカルボニル化合物およびシアニドドナーに接触させることによる、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を説明する。
本反応で使用するカルボニル化合物とは、下記式（１）で示すアルデヒド又はケトンをいう。
Ｒ1−ＣＯ−Ｒ2 （Ｉ）
で示される化合物をいう。
Next, a method for producing an optically active α-hydroxycarboxylic acid by contacting the transformant prepared as described above with a carbonyl compound and a cyanide donor will be described.
The carbonyl compound used in this reaction refers to an aldehyde or ketone represented by the following formula (1).
R 1 —CO—R 2 (I)
The compound shown by these.
式Iにおいて、Ｒ1及びＲ2は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）の炭化水素基、置換基を有していてもよい炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜20（Ｃ6〜Ｃ20）のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数７〜20（Ｃ7〜Ｃ20）のアルキルアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数２〜20（Ｃ2〜Ｃ20）のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいシリル基又は水酸基である。但し、Ｒ1及びＲ2が同時に水素原子となることはない。また、置換基を有していてもよいアルキルチオ基、置換基を有していてもよいアリールチオ基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基であってもよい。 In Formula I, R 1 and R 2 are different from each other, and are each a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms (C 1 to C 20 ), or an optionally substituted carbon group having 1 to 20 carbon atoms ( C 1 -C 20 ) alkoxy group, optionally having 6 to 20 carbon atoms (C 6 -C 20 ) aryloxy group optionally having substituents, and optionally having 7 to 20 carbon atoms (C 7 -C 20 ) alkylaryloxy group, optionally having 2 to 20 carbon atoms (C 2 -C 20 ) alkoxycarbonyl group, optionally having amino group A silyl group or a hydroxyl group which may have a substituent. However, R 1 and R 2 are not simultaneously hydrogen atoms. Moreover, the alkylthio group which may have a substituent, the arylthio group which may have a substituent, the alkylsulfonyl group which may have a substituent, the arylsulfonyl which may have a substituent It may be a group.
前記炭化水素基中、−ＣＨ2−及び−ＣＨ3のＣＨ2はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ2は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ2−のＣ−Ｈ、−ＣＨ3のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ及び＝ＣＨ2のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ1及びＲ2は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。 During the hydrocarbon group, -CH 2 - replaced by and CH 2 carbonyl groups -CH 3, a sulfonyl group, may be replaced by -O- or -S-, = CH 2 is = O or = S Or —CH 2 —CH, —CH 3 C—H,> CH—C—H, ═CH—C—H, and ═CH 2 C—H are N Alternatively, it may be replaced by C-halogen, and R 1 and R 2 may jointly represent an asymmetric divalent group. Examples of the halogen include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基、Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基、Ｃ6〜Ｃ18アリール基、Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基、Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基、（Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル）Ｃ1〜Ｃ10アルキル基などが含まれる。 The hydrocarbon group may be saturated or unsaturated acyclic or saturated or unsaturated cyclic. When the hydrocarbon group is acyclic, it may be linear or branched. The hydrocarbon group, C 1 -C 20 alkyl group, C 2 -C 20 alkenyl group, C 2 -C 20 alkynyl group, C 4 -C 20 alkadienyl group, C 6 -C 18 aryl group, C 6 -C 20 alkylaryl group, C 6 -C 20 arylalkyl group, C 4 -C 20 cycloalkyl group, C 4 -C 20 cycloalkenyl group, (C 3 ~C 10 cycloalkyl) C 1 -C 10 alkyl group Etc. are included.
Ｃ1〜Ｃ20アルキル基は、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基であることが好ましい。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。 C 1 -C 20 alkyl group is preferably a C 1 -C 10 alkyl group. Examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, and undecyl group. And a dodecyl group.
Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル基であることが好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、2-メチル-1-プロペニル基、2-メチルアリル基、2-ブテニル基等が挙げられる。 C 2 -C 20 alkenyl group is preferably a C 2 -C 10 alkenyl group. Examples of the alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, a propenyl group, an isopropenyl group, a 2-methyl-1-propenyl group, a 2-methylallyl group, and a 2-butenyl group.
Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルキニル基であることが好ましい。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。 C 2 -C 20 alkynyl group is preferably a C 2 -C 10 alkynyl group. Examples of the alkynyl group include ethynyl group, propynyl group, butynyl group and the like.
Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基は、Ｃ4〜Ｃ10アルキルジエニル基であることが好ましい。アルキルジエニル基としては、例えば1,3-ブタジエニル基等が挙げられる。 The C 4 -C 20 alkyl dienyl group is preferably a C 4 -C 10 alkyl dienyl group. Examples of the alkyldienyl group include a 1,3-butadienyl group.
Ｃ6〜Ｃ18アリール基は、Ｃ6〜Ｃ10アリール基であることが好ましい。アリール基としては、例えばフェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。 The C 6 -C 18 aryl group is preferably a C 6 -C 10 aryl group. Examples of the aryl group include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, an indenyl group, a biphenyl group, an anthryl group, and a phenanthryl group.
Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基は、Ｃ6〜Ｃ12アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基としては、例えばo-トリル基、m-トリル基、p-トリル基、2,3-キシリル基、2,4-キシリル基、2,5-キシリル基、o-クメニル基、m-クメニル基、p-クメニル基、メシチル基等が挙げられる。 C 6 -C 20 alkylaryl group, preferably a C 6 -C 12 alkyl aryl group. Examples of alkylaryl groups include o-tolyl, m-tolyl, p-tolyl, 2,3-xylyl, 2,4-xylyl, 2,5-xylyl, o-cumenyl, m- Examples thereof include cumenyl group, p-cumenyl group, mesityl group and the like.
Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基は、Ｃ6〜Ｃ12アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、1-ナフチルメチル基、2-ナフチルメチル基、1-フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。 The C 6 -C 20 arylalkyl group is preferably a C 6 -C 12 arylalkyl group. As the arylalkyl group, for example, benzyl group, phenethyl group, 1-naphthylmethyl group, 2-naphthylmethyl group, 1-phenylethyl group, phenylpropyl group, phenylbutyl group, phenylpentyl group, phenylhexyl group, methylbenzyl group Dimethylbenzyl group, trimethylbenzyl group, ethylbenzyl group, methylphenethyl group, dimethylphenethyl group, diethylbenzyl group and the like.
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。 The C 4 to C 20 cycloalkyl group is preferably a C 4 to C 10 cycloalkyl group. Examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, and the like.
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。 The C 4 to C 20 cycloalkenyl group is preferably a C 4 to C 10 cycloalkenyl group. Examples of the cycloalkenyl group include a cyclopropenyl group, a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclopentadienyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
Ｃ1〜Ｃ20アルコキシ基は、Ｃ1〜Ｃ10アルコキシ基であることが好ましい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。 C 1 -C 20 alkoxy group is preferably a C 1 -C 10 alkoxy group. Examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, a butoxy group, and a pentyloxy group.
Ｃ6〜Ｃ20アリールオキシ基は、Ｃ6〜Ｃ10アリールオキシ基であることが好ましい。アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。 The C 6 -C 20 aryloxy group is preferably a C 6 -C 10 aryloxy group. Examples of the aryloxy group include a phenyloxy group, a naphthyloxy group, and a biphenyloxy group.
Ｃ7〜Ｃ20アルキルアリールオキシ基は、Ｃ7〜Ｃ12アルキルアリールオキシ基であることが好ましい。アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。 The C 7 -C 20 alkylaryloxy group is preferably a C 7 -C 12 alkylaryloxy group. Examples of the alkylaryloxy group include a methylphenyloxy group, an ethylphenyloxy group, a propylphenyloxy group, a butylphenyloxy group, a dimethylphenyloxy group, a diethylphenyloxy group, a dipropylphenyloxy group, a dibutylphenyloxy group, and a methyl group. Examples thereof include an ethylphenyloxy group, a methylpropylphenyloxy group, and an ethylpropylphenyloxy group.
Ｃ2〜Ｃ20アルコキシカルボニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルコキシカルボニル基であることが好ましい。アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、2-メトキシエトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基等が挙げられる。 C 2 -C 20 alkoxycarbonyl group is preferably a C 2 -C 10 alkoxycarbonyl group. Examples of the alkoxycarbonyl group include methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, 2-methoxyethoxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl group and the like.
置換基を有していてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、メチルフェニルアミノ基、フェニルアミノ基等が挙げられる。 Examples of the amino group that may have a substituent include an amino group, a dimethylamino group, a methylamino group, a methylphenylamino group, and a phenylamino group.
置換基を有していてもよいシリル基としては、例えばジメチルシリル基、ジエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリフェニルシリル基、トリフェノキシシリル基、ジメチルメトキシシリル基、ジメチルフェノキシシリル基、メチルメトキシフェニル基等が挙げられる。 Examples of the silyl group which may have a substituent include a dimethylsilyl group, a diethylsilyl group, a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a trimethoxysilyl group, a triethoxysilyl group, a diphenylmethylsilyl group, a triphenylsilyl group, A triphenoxysilyl group, a dimethylmethoxysilyl group, a dimethylphenoxysilyl group, a methylmethoxyphenyl group, etc. are mentioned.
前記式Iで示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。 Examples of the carbonyl compound represented by the formula I include benzaldehyde, m-phenoxybenzaldehyde, p-methylbenzaldehyde, o-chlorobenzaldehyde, m-chlorobenzaldehyde, p-chlorobenzaldehyde, m-nitrobenzaldehyde, 3,4-methylene. Aromatic aldehydes such as dioxybenzaldehyde, 2,3-methylenedioxybenzaldehyde, phenylacetaldehyde, furfural; aliphatic aldehydes such as acetaldehyde, butyraldehyde, isobutyraldehyde, valeraldehyde, cyclohexanealdehyde; ethyl methyl ketone, butyl methyl ketone, Methyl propyl ketone, isopropyl methyl ketone, methyl pentyl ketone, methyl (2-methylpropyl) ketone, methyl (3-methyl Saturated aliphatic ketones such as (tilbutyl) ketone; unsaturated aliphatic ketones such as methyl (2-propenyl) ketone and (3-butenyl) methyl ketone; alkyl (haloalkyl) ketones such as (3-chloropropyl) methyl ketone; And 2- (protected amino) aldehydes such as alkoxycarbonylamino) -3-cyclohexylpropionaldehyde; and alkylthioaliphatic aldehydes such as 3-methylthiopropionaldehyde.
シアニドドナーとは、反応系へ添加することによって、シアニド、すなわちシアン化物イオン（ＣＮ−）を生じる物質を意味し、例えば、ＨＣＮ、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）やシアン化カリウム（ＫＣＮ）等のシアン化水素の塩、又は、アセトンシアノヒドリン等のシアノヒドリン類を挙げることができる。特に、無機塩や副生物が生じないＨＣＮを用いることが好ましい。 The cyanide donor means a cyanide, that is, a substance that generates cyanide ions (CN-) when added to the reaction system. For example, a salt of hydrogen cyanide such as HCN, sodium cyanide (NaCN) or potassium cyanide (KCN), Alternatively, cyanohydrins such as acetone cyanohydrin can be given. In particular, it is preferable to use HCN that does not produce inorganic salts or by-products.
形質転換体は、培養液、培養濃縮菌体、培養濃縮菌体洗浄物、培養濃縮菌体懸濁物、培養菌体を固定化したもの等の形態で使用される。操作の簡便性、容易性、反応効率の点から、培養濃縮菌体を緩衝液で洗浄後、同緩衝液で懸濁させたものを使用することが好ましい。 The transformant is used in the form of a culture solution, a culture-concentrated cell body, a culture-concentrated cell-washed product, a culture-concentrated cell suspension, a culture cell-immobilized product, or the like. From the viewpoint of ease of operation, ease, and reaction efficiency, it is preferable to use a culture-concentrated bacterial cell that has been washed with a buffer and then suspended in the same buffer.
本反応において、ｐＨは、例えば、キャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリアーゼであれば、反応ｐＨ領域は、ｐＨ３．５〜ｐＨ７、至適ｐＨはｐＨ４．５〜ｐＨ６である。また、Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ(配列番号３)および２Ａ４ニトリラーゼ（配列番号５）であれば、反応ｐＨ領域が少なくともｐＨ３．５以上である。よって、ｐＨ３．５〜ｐＨ７、更に好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６で反応を実施する。
In this reaction, for example, if the hydroxynitrile lyase derived from cassava ( Manihot esculenta ) is used, the reaction pH range is pH 3.5 to
反応温度は、使用するヒドロキシニトリルラーゼおよびニトリラーゼの至適反応温度や、製造するα−ヒドロキシカルボン酸、原料のカルボニル化合物、およびシアニドドナーの安定性を考慮して設定する。例えば、マンデル酸を製造する反応では、１０〜４５℃が好ましく、更に好ましくは１５〜４０℃である。 The reaction temperature is set in consideration of the optimum reaction temperature of the hydroxynitrilease and nitrilase to be used and the stability of the α-hydroxycarboxylic acid to be produced, the starting carbonyl compound, and the cyanide donor. For example, in the reaction for producing mandelic acid, the temperature is preferably 10 to 45 ° C, more preferably 15 to 40 ° C.
反応溶媒は、水系、有機溶媒系、水−有機溶媒二相系、いずれの条件でもヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼがともに作用する条件であれば限定されるものではない。形質転換体の培養菌体を固定化せずに用いる場合には、水系であることが好ましい。
カルボニル化合物、シアニドドナーの添加方法は、例えば、反応開始時にカルボニル化合物、シアニドドナー全量を添加する方法、予め反応溶媒にカルボニル化合物を全量添加し、シアニドドナーを連続、又は分割して添加する方法、あるいは、シアニドドナーを予め反応溶媒に添加し、カルボニル化合物を連続、又は分割して添加する方法などが挙げられる。
The reaction solvent is not limited as long as the hydroxynitrile lyase and nitrilase act together under any conditions of aqueous system, organic solvent system, and water-organic solvent two-phase system. In the case where the cultured cells of the transformant are used without being immobilized, an aqueous system is preferable.
The addition method of the carbonyl compound and cyanide donor is, for example, a method of adding the whole amount of the carbonyl compound and cyanide donor at the start of the reaction, a method of adding the whole amount of the carbonyl compound to the reaction solvent in advance and adding the cyanide donor continuously or dividedly, or a cyanide donor. May be added in advance to the reaction solvent, and the carbonyl compound may be added continuously or dividedly.
反応終了液からのα―ヒドロオキシカルボン酸の回収方法については、特に限定されないが、例えば、反応溶液から有機溶媒を用いて抽出し、さらに必要に応じて水洗した後、溶媒を蒸発・乾固することにより、目的とするα−ヒドロキシカルボン酸を単離することができる。また、反応終了液から形質転換体をろ過、遠心などにより除去した後、水系、有機溶媒系あるいは水系―有機溶媒で晶析させる方法などが挙げられる。 The method for recovering α-hydroxycarboxylic acid from the reaction-finished solution is not particularly limited. For example, extraction from the reaction solution using an organic solvent, and washing with water as necessary, the solvent is evaporated and dried. By doing so, the target α-hydroxycarboxylic acid can be isolated. In addition, after removing the transformant from the reaction completion solution by filtration, centrifugation, etc., crystallization is carried out with an aqueous, organic solvent, or aqueous-organic solvent.
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
実施例１Example 1
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の取得）
（１）ＰＣＲによるヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
非特許文献１およびGenBank accession number Z29091記載の塩基配列（配列番号２）を元に、キャッサバ（Manihot esculenta）のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０（配列番号７〜２６）を設計および合成した。
(Acquisition of hydroxynitrile lyase gene)
(1) Preparation of hydroxynitrile lyase gene by PCR Based on the nucleotide sequence described in
オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した（図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃ）。 Twenty kinds of oligonucleotides set to be complementary to the oligonucleotides were designed to overlap each other by about 20 bases (FIGS. 2A, 2B, and 2C).
凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、100 pmol/μlとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をPCR-mix（Ｐｗｏ １０×緩衝液、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ（Boehringer Mannheim）に下記（表１）の用量で加えた。
The lyophilized oligonucleotide was resuspended in distilled water to 100 pmol / μl. 1 μl of each of the 20 oligonucleotide solutions was collected to prepare a mixed oligo. This mixed solution was added to PCR-mix (
（表１）ＰＣＲ反応液の組成
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子を合成した（１ｓｔ ＰＣＲ）。 PCR was performed by setting 55 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds to extend the oligonucleotide and synthesize a gene (1st PCR).
次に、上記のように作製した合成遺伝子の増幅を行った（２ｎｄ ＰＣＲ）。上記のＡ、Ｂ、Ｃの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水および１μｌの外側プライマ−を添加した。外側プライマ−として、Ｆ０１（配列番号７）およびＲ０１（配列番号１７）のプライマ−を用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。１．５％アガロ−スゲル電気泳動により、約１ｋｂの増幅産物を確認した。
Next, the synthetic gene prepared as described above was amplified (2nd PCR). To 1.3 μl of the above A, B, C reaction products, 5 μl of
（２）ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のクロ−ニング
（１）で得られた約１ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡquick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（オリゴヌクレオチドＦ０１中に切断認識部位が含まれる）およびＫｐｎＩ（オリゴヌクレオチドＲ０１中に切断認識部位が含まれる）で消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで予め消化しておいたベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ（株））（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびsolution Ｉ（ＤＮＡ Ligation Kit ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで増幅産物とベクターを結合した。
(2) Cloning of hydroxynitrile lyase gene The band of about 1 kb amplification product obtained by cloning (1) was purified with QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). The purified DNA is digested with the restriction enzymes BamHI (contains a cleavage recognition site in the oligonucleotide F01) and KpnI (contains a cleavage recognition site in the oligonucleotide R01), extracted with phenol, extracted with chloroform, and ethanol. Purified by precipitation. Purified DNA (5 μl), vector pUC19 (Takara Bio Inc.) (1 μl) previously digested with BamHI and KpnI, distilled water (4 μl) and solution I (DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.) ))) (10 μl) was mixed and incubated at 16 ° C. for 12 hours to bind the amplified product to the vector.
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ ＮａＣｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物 ０．４ｍｌをＳＯＢ培地 ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液 ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。 E. coli strain JM109 was inoculated into 1 ml of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 0.5% NaCl) and pre-cultured aerobically at 37 ° C. for 5 hours. Was added to 40 ml of SOB medium (2% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM MgCl2) and cultured at 18 ° C. for 20 hours. After the culture was collected by centrifugation, 13 ml of a cold TF solution (20 mM PIPES-KOH (pH 6.0), 200 mM KCl, 10 mM CaCl 2 , 40 mM MnCl 2 ) was added and left at 0 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again and the supernatant was removed. Then, the precipitated Escherichia coli was suspended in 3.2 ml of a cold TF solution, 0.22 ml of dimethyl sulfoxide was added, and the mixture was allowed to stand at 0 ° C. for 10 minutes.
こうして作製したコンピテントセル ２００μｌ に工程（１）で作製したクローニング産物を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ 培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌ を添加して３７℃にて１時間振盪培養した。 Add 10 μl of the cloning product prepared in step (1) to 200 μl of the competent cell thus prepared, leave it at 0 ° C. for 30 minutes, give a heat shock at 42 ° C. for 30 seconds, cool it at 0 ° C. for 2 minutes, 1 ml of medium (20 mM glucose, 2% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 ) was added and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. did.
培養後、２００μｌずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を１．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後、Flexi Prep（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
After culturing, 200 μl each was applied to an LBAmp agar medium (LB
得られた組換えプラスミドＤＮＡの塩基配列を、プライマ−としてオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０を用い、ＣＥＱ ＤＴＣＳ Quick Start Kitおよび蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Analysis system（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。 Using the oligonucleotides F01 to F10 and R01 to R10 as primers, the CEQ DTCS Quick Start Kit and the fluorescent sequencer CEQ 2000XL DNA Analysis system (both BECKMAN COULTER, USA) Was used for analysis.
解析したプラスミドＤＮＡの内、配列番号２のキャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有するプラスミドＤＮＡのひとつをｐＵＭＥと命名した。 Among the analyzed plasmid DNAs, one of the plasmid DNAs having the same sequence as the base sequence of the hydroxynitrile lyase gene derived from cassava ( Manihot esculenta ) of SEQ ID NO: 2 was named pUME.
実施例２
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現大腸菌組換え体の作製）
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
Example 2
(Production of Hydroxynitrile Lyase Expression Plasmid and Hydroxynitrile Lyase-Expressing Escherichia coli Recombinant Containing the Plasmid)
(1) Preparation of hydroxynitrile lyase expression plasmid
実施例１で得られたヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を、pKK233-2（Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）の誘導体であるpKK233-2(+Sse)のNcoI-Sse8387I部位に挿入し、pKK233-2をベースとしたヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターpOXN103を以下のようにして作製した。
まず、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマーＯＸＹＮ−０６（配列番号４８）は、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を含む。また、アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−０９（配列番号４９）は、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む。
The DNA fragment of the hydroxynitrile lyase gene obtained in Example 1 was converted into pKK233-2 (pKK233-2 (Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Netherlands; http://www.cbs.knaw.nl/)). + Sse) was inserted into the NcoI-Sse8387I site, and a hydroxynitrile lyase expression vector pOXN103 based on pKK233-2 was prepared as follows.
First, a DNA fragment encoding hydroxynitrile lyase was amplified by PCR so as to have a restriction enzyme recognition site at both ends that can be easily introduced into an expression vector. The reaction mixture for PCR is 5 μl Pwo 10 × buffer, 5 μl dNTP mix, 0.5 μl Pwo DNA polymerase, 36.2 μl distilled water, 1 μl sense and antisense primers, and 1 μl plasmid pUME as template What was done was used. PCR was performed at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes. The sense primer OXYN-06 (SEQ ID NO: 48) consists of 29 nucleotides, and includes an NcoI recognition site and the ATG start codon after the hydroxynitrile lyase gene in the sequence. Antisense primer OXYN-09 (SEQ ID NO: 49) consists of 33 nucleotides and includes a Sse8387I recognition site in the sequence.
ＯＸＹＮ−０６：ccaccatggtaactgcacattttgttctg（配列番号４８；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
ＯＸＹＮ−０９：ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
OXYN-06: cca ccatgg taactgcacattttgttctg (SEQ ID NO: 48; underlined indicates restriction enzyme NcoI recognition site)
OXYN-09: gg cctgcagg ttaacttaataggagctaaaagc (SEQ ID NO: 49; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme Sse8387I)
得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。アガロースゲル電気泳動で分離し、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。該ゲル中の増幅産物をQIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 The obtained amplified PCR product was digested with Sse8387I and then partially digested with NcoI. After separation by agarose gel electrophoresis, a gel (about 0.8 kb) containing a full length plant codon wild type hydroxynitrile lyase was cut out. The amplification product in the gel was purified with QIAquick Gel Extraction Kit.
次いで、発現用ベクターpKK233-2(+Sse)を以下のように調製した。pKK233-2 ５μｌをHindIII（１μｌ）で消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。次いで、DNA Blunting Kit（タカラバイオ（株））を用いて末端を平滑処理した。該処理液を再度フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。精製した発現ベクター（５μｌ）をShrimp Alkaline Phosphatase（タカラバイオ（株））を用いて脱リン酸化処理した。該処理液を再度エタノール沈殿により精製した。精製したベクターＤＮＡ（５μｌ）、アニーリング済みSse8387Iリン酸化リンカーpSse8387I（タカラバイオ（株））（５μｌ）およびsolution Ｉ（ＤＮＡ Ligation Kit ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（２）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してSse8387I消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをpKK233-2(+Sse)とした。pKK233-2(+Sse)を制限酵素NcoIとSse8387Iで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。 Next, an expression vector pKK233-2 (+ Sse) was prepared as follows. After digesting 5 μl of pKK233-2 with HindIII (1 μl), it was purified by phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation. Next, the ends were blunted using a DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.). The treatment solution was purified again by phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation. The purified expression vector (5 μl) was dephosphorylated using Shrimp Alkaline Phosphatase (Takara Bio Inc.). The treatment solution was purified again by ethanol precipitation. Purified vector DNA (5 μl), annealed Sse8387I phosphorylated linker pSse8387I (Takara Bio Inc. (5 μl)) and solution I (DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.)) (10 μl) were mixed. A ligation mixture was made. The mixture was incubated for 12 hours at 16 ° C. to bind the linker to the vector. E. coli JM109 strain was transformed by the same operation as in Example 1 (2). The recombinant vector was recovered from the grown colonies. The recovered recombinant vector was subjected to Sse8387I digestion reaction and confirmed to be linearly digested, and designated pKK233-2 (+ Sse). pKK233-2 (+ Sse) was digested with restriction enzymes NcoI and Sse8387I and purified by phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation.
上述のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片（５μｌ）と発現ベクターpKK233-2(+Sse)（５μｌ）を混合した。該混合液にsolution I（ＤＮＡ Ligation Kit ver.2（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（２）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーより組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結された組換えベクターを確認し、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103と命名した。 The above-mentioned hydroxynitrile lyase gene DNA fragment (5 μl) and the expression vector pKK233-2 (+ Sse) (5 μl) were mixed. Solution I (DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.)) (10 μl) was added to the mixture to make a ligation mixture. The mixture was incubated for 12 hours at 16 ° C. to bind the linker and the vector. E. coli JM109 was transformed by the same operation as in Example 1 (2), and the recombinant vector was recovered from the growing colonies. A recombinant vector in which the DNA fragment of the hydroxynitrile lyase gene was correctly ligated to the expression vector was confirmed, and named the hydroxynitrile lyase expression plasmid pOXN103.
（２）２番目のコドンが置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリア−ゼの２番目のアミノ酸であるバリンをイソロイシンに置換したヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲは（１）と同様の条件にて行った。センスプライマ−は、OXYN-10（配列番号５０；３３ヌクレオチドからなり、その配列中にBspHI認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、OXYN-09（配列番号４９、３４ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
(2) Preparation of a hydroxynitrile lyase expression plasmid in which the second codon is substituted A DNA fragment encoding a hydroxynitrile lyase in which the second amino acid of hydroxynitrile lyase is substituted with isoleucine, It was produced by PCR so that a restriction enzyme recognition site that can be easily introduced into an expression vector was added. PCR was performed under the same conditions as in (1). The sense primer consists of OXYN-10 (SEQ ID NO: 50; 33 nucleotides), and has a BspHI recognition site and the ATG start codon of the hydroxynitrile lyase gene in the sequence, and the codon corresponding to the second amino acid is Codes isoleucine with ATC). The antisense primer is OXYN-09 (consisting of SEQ ID NO: 49, 34 nucleotides, which contains the Sse8387I recognition site and the stop codon of the hydroxynitrile lyase gene).
センスプライマ−ＯＸＹＮ−１０：
ATTTCCATCATGATCACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号５０；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
Sense Primer-OXYN-10:
ATTTCCA TCATGA TCACTGCACATTTTGTTCTG (SEQ ID NO: 50; underlined indicates the restriction enzyme BspHI recognition site)
アンチセンスプライマ−ＯＸＹＮ−０９：
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
Antisense Primer-OXYN-09:
GG CCTGCAGG TTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC (SEQ ID NO: 49; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme Sse8387I)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、BspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 The amplified PCR product obtained by PCR was digested with BspHI and Sse8387I, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
本ＤＮＡ断片を（１）と同様の方法により、pKK233-2(+Sse)のNcoIおよびSse8387I認識部位に挿入して、プラスミドpOXN103V2Iを得た。 This DNA fragment was inserted into the NcoI and Sse8387I recognition sites of pKK233-2 (+ Sse) by the same method as in (1) to obtain plasmid pOXN103V2I.
（３）第２番目のアミノ酸バリンがアルギニンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸であるバリンがアルギニンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2Rを、（１）で作製したプラスミドpOXN103を鋳型とし、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）による部位特異的変異導入法により作製した。変異導入用プライマーには以下を用いた。
(3) Preparation of a hydroxynitrile lyase expression plasmid in which the second amino acid valine is substituted with arginine A hydroxynitrile lyase expression plasmid pOXN103V2R in which the second amino acid of hydroxynitrile lyase is substituted with arginine is represented by (1 ) Was prepared by site-directed mutagenesis using the QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). The following were used as primers for mutagenesis.
センスプライマーＯＸＹＮ−４５：
aaacagacca tgcgtactgc acattttg（配列番号５１：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４６と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコードする）
Sense primer OXYN-45:
aaacagacca tgcgtactgc acattttg (SEQ ID NO: 51: 28 nucleotides, having a sequence complementary to OXYN-46, the codon corresponding to the second amino acid encodes arginine with CGT)
アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−４６：
caaaatgtgc agtacgcatg gtctgttt（配列番号５２：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４５と相補的な配列を有する）
Antisense primer OXYN-46:
caaaatgtgc agtacgcatg gtctgttt (SEQ ID NO: 52: 28 nucleotides, having a sequence complementary to OXYN-45)
実施例３
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換体の活性評価）
（１）細胞抽出液の調製
実施例２で作製したヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体JM109/pOXN103、JM109/pOXN103V2IおよびJM109/pOXN103V2Rを得た。これらを、以下に示すＬＢ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）で３０℃で２４時間培養した。
Example 3
(Evaluation of activity of transformants expressing hydroxynitrile lyase)
(1) Preparation of cell extract Escherichia coli JM109 strain was transformed with the hydroxynitrile lyase expression plasmid prepared in Example 2 to obtain hydroxynitrile lyase expression transformants JM109 / pOXN103, JM109 / pOXN103V2I and JM109 / pOXN103V2R. It was. These were cultured for 24 hours at 30 ° C. in the following LB medium (100 ml in a 500 ml Erlenmeyer flask).
培地組成
トリプトン １０ｇ／Ｌ
酵母エキス ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ
アンピシリン ５０ｍｇ／Ｌ
ＩＰＴＧ １ｍＭ（終濃度）
Medium composition Tryptone 10g / L
Yeast extract 5g / L
NaCl 10g / L
Ampicillin 50mg / L
得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、DUTY CYCLE ４０％、PULS、TIMER＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷紙ながら３分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を細胞抽出液全画分として採取した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液可溶性画分として採取した。得られた細胞抽出液可溶性画分を用い、特許文献１記載の方法によりヒドロキシニトリルリア−ゼ活性を測定した。すなわち、２５℃およびｐＨ５．０の条件下、ラセミ体マンデロニトリルからベンズアルデヒドの生成を経て追跡した。酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９００μｌと混合し、基質溶液１００μｌ（毎回新たに調製される１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中で３７．５ｍＭラセミ体マンデロニトリル）を添加して活性測定を開始した。２８０ｎｍでの吸光の増加（対照として酵素非含有基質溶液で測定）を５分間追跡した。１Ｕは上記条件下でラセミマンデロニトリルから１分間あたりベンズアルデヒド１μｍｏｌの変換を触媒する酵素量に相当する。
Bacteria were collected from the obtained culture by centrifugation (3,700 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed with 10 mM phosphate-sodium buffer (pH 7.0), and then suspended in the same buffer. It became cloudy. The obtained cell suspension was iced using an ultrasonic crusher VP-15S (Tytec, Japan) under the conditions of
その結果、JM109/pOXN103、JM109/pOXN103V2IおよびJM109/pOXN103V2Rの細胞抽出液化可溶性画分のタンパク質ｍｇあたり比活性（ユニット（Ｕ）／ｍｇタンパク質）はそれぞれ ２．７２、３．９９、１６．６であった。 As a result, specific activities (unit (U) / mg protein) per mg of protein of the cell extract liquefied soluble fractions of JM109 / pOXN103, JM109 / pOXN103V2I and JM109 / pOXN103V2R were 2.72, 3.99, and 16.6, respectively. there were.
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現量の解析
（１）で得られた細胞抽出液全画分を、それぞれ菌濃度換算でＯＤ６３０＝１２．５となるよう、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した各株由来の細胞抽出液全画分を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファ−（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノ−ル、２０％ｖ／ｖグリセロ−ル、微量ブロモフェノ−ルブル−）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レ−ンあたり５μｌずつアプライし、電気泳動分析を行い、ヒドロキシニトリルリア−ゼは約３０ｋＤａのバンドとして観察された。
(2) Analysis of expression level by polyacrylamide gel electrophoresis The cell extract total fraction obtained in (1) is 10 mM phosphate-sodium buffer (so that OD630 = 12.5 in terms of bacterial concentration). diluted with pH 7.0). Equal amount of sample buffer for polyacrylamide gel electrophoresis (0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 4% w / v SDS, 12% v / vβ) Mercaptoethanol, 20% v / v glycerol, trace amount of bromophenol blue) and boiled for 5 minutes for modification. A 10% polyacrylamide gel was prepared, and 5 μl of the denatured sample was applied to each lane and electrophoretic analysis was performed. Hydroxynitrile lyase was observed as a band of about 30 kDa.
実施例４
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現形質転換体の作製
（その１）：Bradyrhizobium由来のニトリラーゼ様遺伝子の取得
Bradyrhizobium japonicum USDA110株はゲノム配列情報が公開されており、２種のニトリラーゼ様配列を持つ遺伝子がアノテーションされている。しかしながら、これらのニトリラーゼ様遺伝子が真にニトリラーゼ活性を有するかどうかは明らかではなかった。これらの遺伝子はRhodococcus rhodochrous Ｊ−１株（FERM BP-1478）、Rhodococcus erythropolis ＳＫ−９２株（FERM BP-3324）、Alcaligenes faecalis ＪＭ３株（FERM P-13277）等由来の入手容易なニトリラーゼ遺伝子とはホモロジーが低く、これらとは性質等が大きく異なる可能性がある。本発明の目的に叶うものであるかどうかを確かめるため、Bradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株（（独）製品評価技術基盤機構 NBRC14792）由来の遺伝子をクローニングし、その活性を調べた。
Example 4
Acquisition of low-stereoselective nitrilase gene and preparation of nitrilase-expressing transformant (Part 1): Acquisition of Bradyrhizobium-derived nitrilase-like gene
The genome sequence information of Bradyrhizobium japonicum USDA110 strain is publicly disclosed, and genes having two kinds of nitrilase-like sequences are annotated. However, it was not clear whether these nitrilase-like genes truly have nitrilase activity. These genes are easily available nitrilase genes derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (FERM BP-1478), Rhodococcus erythropolis SK-92 strain (FERM BP-3324), Alcaligenes faecalis JM3 strain (FERM P-13277), etc. Homology is low, and there is a possibility that properties and the like are greatly different from these. In order to confirm whether or not the object of the present invention is met, a gene derived from Bradyrhizobium japonicum USDA110 strain ((Germany) Product Evaluation Technology Infrastructure NBRC14792) was cloned and its activity was examined.
（１）Bradyrhizobium japonicumからの染色体ＤＮＡの調製
寒天培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５％ 寒天）上で生育させたBradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株を１０ｍｌの液体培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に植菌し、３０℃にて５日間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。
(1) Preparation of chromosomal DNA from Bradyrhizobium japonicum Agar medium (0.5% mannitol, 0.1% bactoeast extract, 0.07% K 2 HPO 4 , 0.01% KH 2 PO 4 , 0.1% Bradyrhizobium japonicum USDA110 strain grown on MgSO 4 .7H 2 O, 1.5% agar) in 10 ml liquid medium (0.5% mannitol, 0.1% bactoist extract, 0.07% K 2 HPO 4 , 0.01% KH 2 PO 4 , 0.1% MgSO 4 .7H 2 O), and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days. After completion of the culture, cells were collected from 2 ml of the culture solution by centrifugation, and 100 μl of genomic DNA was obtained using Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation).
（２）ニトリラーゼ遺伝子の取得と発現プラスミドの作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型として上記ゲノムＤＮＡを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１３（配列番号５３、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＡＧでアスパラギン酸をコ−ドする）およびＮＬＲ−２２（配列番号５４、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＧでリジンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−１４（配列番号５５、４１ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
(2) Acquisition of nitrilase gene and preparation of expression plasmid A DNA fragment encoding nitrilase was prepared by PCR so that a restriction enzyme recognition site that can be easily introduced into an expression vector was added. The reaction mixture for PCR was 5 μl of 10 × Pfu buffer—4 μl of dNTP mix (2.5 mM each), 2.5 μl of DMSO, 1 μl of Pfu DNA polymerase, 30.5 μl of distilled water, 1 μl of sense. In addition, an antisense primer and 1 μl of the genomic DNA added as a template were used. PCR was performed by denaturing at 95 ° C. for 1 minute, and then performing 30 cycles of 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 10 minutes. The sense primer consists of NLR-13 (SEQ ID NO: 53, 40 nucleotides, which has an NcoI recognition site and a nitrilase gene after the ATG start codon, and the codon corresponding to the second amino acid is GAG and aspartic acid. And NLR-22 (SEQ ID NO: 54, 40 nucleotides), and the sequence has a BspHI recognition site and a nitrilase gene after the ATG start codon, and the codon corresponding to the second amino acid is AAG Code lysine). The antisense primer is NLR-14 (consisting of SEQ ID NOs: 55 and 41 nucleotides, including an Sse8387I recognition site and a nitrilase gene stop codon in the sequence).
センスプライマ−ＮＬＲ−１３：
GGCCATGGAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
Sense Primer-NLR-13:
GG CCATGG AGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG (SEQ ID NO: 53; underlined indicates restriction enzyme NcoI recognition site)
センスプライマ−ＮＬＲ−２２：
GGTCATGAAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５４；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
Sense Primer-NLR-22:
GGTCATGAAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG (SEQ ID NO: 54; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme BspHI)
アンチセンスプライマ−ＮＬＲ−１４：
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGTGAAAG（配列番号５５；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
Antisense Primer-NLR-14:
GG CCTGCAGG ATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGTGAAAG (SEQ ID NO: 55; underlined indicates restriction enzyme Sse8387I recognition site)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、NcoIおよびSse8387I又はBspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 Amplified PCR products obtained by PCR were digested with NcoI and Sse8387I or BspHI and Sse8387I, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
実施例２と同様にして、これらの断片をベクターpTrc99AおよびpKK233-2に組込み、発現プラスミドpNLB001(pTrc99A NcoI-Sse8387I断片)、pNLB002(pKK233-2 NcoI-Sse8387I断片)pNLB004(pTrc99A BspHI-Sse8387I断片)およびpNLB010(pKK233-2 BspHI-Sse8387I断片)を作製した。 In the same manner as in Example 2, these fragments were incorporated into vectors pTrc99A and pKK233-2, and expression plasmids pNLB001 (pTrc99A NcoI-Sse8387I fragment), pNLB002 (pKK233-2 NcoI-Sse8387I fragment) pNLB004 (pTrc99A BspHI-Sse8387I fragment) And pNLB010 (pKK233-2 BspHI-Sse8387I fragment) was prepared.
（３）形質転換体の作製および該形質転換体のニトリラーゼ活性評価
実施例２と同様にして、これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、すなわち、ＪM109/pNLB001、JM109/pNLB002、JM109/pNLB004、JM109/pNLB010およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例3と同様にして培養した。
(3) Preparation of transformants and evaluation of nitrilase activity of the transformants In the same manner as in Example 2, E. coli strain JM109 was transformed with these plasmids, and nitrilase expression transformants, ie, JM109 / pNLB001, JM109 / PNLB002, JM109 / pNLB004, JM109 / pNLB010 and JM109 / pTrc99A as a control were cultured in the same manner as in Example 3.
これらの培養菌体を用いてマンデロニトリルを基質としてニトリラーゼ活性を測定した。 Using these cultured cells, nitrilase activity was measured using mandelonitrile as a substrate.
マンデロニトリルを基質とした場合、１．５ｍｌのマイクロチューブ０．５ｍｌの４０ｍＭ マンデロニトリル水溶液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２））を３０℃、５分間プレインキュベートし、これに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に懸濁された菌体懸濁液を０．５ｍｌを加え混合し、３０℃にて３０分間反応させる。０．２ｍｌの１Ｍリン酸を添加することにより反応を停止させ、遠心（１５０００ｒｐｍ／５ｍｉｎ）により菌体を除去し上清を取得した。０．２ｍｌの上清に１．８ｍｌの２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加えて希釈し、１０μｌを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム 東ソーＯＤＳ−１２０Ａ（４．６ｘ２５０ｍｍ）３５℃、キャリヤー ０．１％リン酸：アセトニトリル＝８：２、ＵＶ検出波長＝２５４ｎｍ）にて分析した。１分間に１μｍｏｌのマンデル酸が生成する活性を１ユニットとした。生成したマンデル酸の光学純度の測定は下記のように行った。上清０．５ｍｌに酢酸エチル０．５ｍｌを加え攪拌後、遠心し、酢酸エチル相を回収した。酢酸エチル相に０．５ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加えて攪拌し、遠心後、酢酸エチル相を得た。遠心エバポレーターにて溶媒を完全に除去し、残渣を１００μｌの水に溶かし、更に水にて３０倍希釈後、５μｌを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム 三菱化学ＭＣＩ−ＧＥＬ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６ｘ２５０ｍｍ）３５℃、キャリヤー ２ｍＭ ＣｕＳＯ４：アセトニトリル＝８５：１５、ＵＶ検出波長＝２５４ｎｍ）にて分析した。結果は表２に示す。
When mandelonitrile was used as the substrate, 0.5 ml of 40 mM mandelonitrile aqueous solution (50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.2)) in 1.5 ml microtube was preincubated for 5 minutes at 30 ° C., and 10 mM was added thereto. 0.5 ml of the cell suspension suspended in sodium phosphate buffer (pH 7) is added and mixed, and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.2 ml of 1M phosphoric acid, and the cells were removed by centrifugation (15000 rpm / 5 min) to obtain a supernatant. To 0.2 ml of the supernatant, 1.8 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 8.2) was added for dilution, and 10 μl was subjected to high performance liquid chromatography (analytical column Tosoh ODS-120A (4.6 × 250 mm) 35 ° C., carrier 0. 1% phosphoric acid: acetonitrile = 8: 2, UV detection wavelength = 254 nm). The activity produced by 1 μmol of mandelic acid per minute was defined as 1 unit. The optical purity of the produced mandelic acid was measured as follows. 0.5 ml of ethyl acetate was added to 0.5 ml of the supernatant and stirred, followed by centrifugation to recover the ethyl acetate phase. To the ethyl acetate phase, 0.5 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 8.2) was added and stirred. After centrifugation, an ethyl acetate phase was obtained. The solvent was completely removed with a centrifugal evaporator, the residue was dissolved in 100 μl of water, further diluted 30-fold with water, and 5 μl was subjected to high performance liquid chromatography (analysis column Mitsubishi Chemical MCI-GEL CRS10W (4.6 × 250 mm) 35 ° C. And
（４）Bradyrhizobiumニトリラーゼ活性に及ぼすｐＨの影響
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。JM109/pNLB004菌体懸濁液を用いた。結果は表３に示す。
(4) Influence of pH on Bradyrhizobium nitrilase activity Sodium phosphate buffer (
実施例５
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現組換え体の作製
（その２）：環境中より得られたニトリラーゼ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲによるニトリラーゼ遺伝子の作製
Robertson, D. E．ら、Appl. Environ. Microbiol．７０，２４２９−２４３６（２００４）記載およびGenBank accession number ＡＹ４８７４７３の塩基配列を元に、２Ａ４ニトリラーゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＳＮＹ５０９Ｆ０１〜ＳＮＹ５０９Ｆ１０およびＳＮＹ５０９Ｒ０１〜ＳＮＹ５０９Ｒ１１（配列番号２７〜４７）を設計および合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した（図３）。これらのオリゴヌクレオチドを用い実施例１と同様にして遺伝子を合成した。こうして得られた目的の配列を有するプラスミドＤＮＡのひとつをｐＳＹＮ５９０と命名した。
Example 5
Acquisition of low stereoselective nitrilase gene and preparation of nitrilase-expressing recombinant (Part 2): Acquisition of nitrilase gene obtained from the environment
(1) Production of nitrilase gene by PCR
Robertson, D.E. Et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2429-2436 (2004) and the base sequence of GenBank accession number AY487473, 2A4 nitrilase gene was synthesized by PCR. Specifically, 20 types of oligonucleotides SNY509F01 to SNY509F10 and SNY509R01 to SNY509R11 (SEQ ID NOs: 27 to 47) were designed and synthesized. Twenty kinds of oligonucleotides set to be complementary to the oligonucleotides were designed to overlap each other by about 20 bases (FIG. 3). Using these oligonucleotides, genes were synthesized in the same manner as in Example 1. One of the plasmid DNAs having the target sequence thus obtained was named pSYN590.
（２）ニトリラーゼ発現プラスミドpNLA001およびpNLA010の作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようpSYN590を鋳型としてＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型としてプラスミドｐＳＹＮ１５９を１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１９（配列番号５６、３０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＣＴでアラニンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
(2) Preparation of nitrilase expression plasmids pNLA001 and pNLA010 A DNA fragment encoding nitrilase was prepared by PCR using pSYN590 as a template so that a restriction enzyme recognition site that can be easily introduced into an expression vector was added. . The reaction mixture for PCR is the same as the reaction mixture for PCR: 5 μl 10 × Pfu Turbo buffer—4 μl dNTP mix (2.5 mM each), 2.5 μl DMSO, 1 μl Pfu Turbo DNA polymerase, 30 0.5 μl of distilled water, 1 μl of sense and antisense primers, and 1 μl of plasmid pSYN159 as a template were used. PCR was performed by denaturing at 95 ° C. for 1 minute, and then performing 30 cycles of 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 10 minutes. The sense primer consists of NLR-19 (SEQ ID NO: 56, 30 nucleotides, the NcoI recognition site and the ATG start codon after the nitrilase gene in the sequence, and the codon corresponding to the second amino acid is GCT with alanine. Code). The antisense primer is NLR-21 (consisting of SEQ ID NO: 57, 26 nucleotides, including the Sse8387I recognition site and the nitrilase gene stop codon in the sequence).
センスプライマ−ＮＬＲ−１９：
AGACCATGGCTGAAACAGCCTTCAAGATCG（配列番号５６；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
Sense Primer-NLR-19:
AGA CCATGG CTGAAACAGCCTTCAAGATCG (SEQ ID NO: 56; underlined indicates the restriction enzyme NcoI recognition site)
アンチセンスプライマ−ＮＬＲ−２１：
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
Antisense primer-NLR-21:
ATG CCTGCAGG TCACTCCGCTTTTGC (SEQ ID NO: 57; underlined indicates the restriction enzyme Sse8387I recognition site)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、NcoIおよびSse8387I又はBspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 Amplified PCR products obtained by PCR were digested with NcoI and Sse8387I or BspHI and Sse8387I, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
実施例２と同様にして、本断片をベクターpTrc99AおよびpKK233-2に組込み、発現プラスミドpNLA001(pTrc99A NcoI-Sse8387I断片）およびpNLA010(pKK233-2 BspHI-Sse8387I断片)を作製した。 In the same manner as in Example 2, this fragment was incorporated into vectors pTrc99A and pKK233-2 to prepare expression plasmids pNLA001 (pTrc99A NcoI-Sse8387I fragment) and pNLA010 (pKK233-2 BspHI-Sse8387I fragment).
（３）形質転換体の作製および該形質転換体のニトリラーゼ活性評価
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、JM109/pNLA001およびJM109/pNLA010を得た。これらの形質転換体およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例３と同様にして培養し、実施例４と同様にしてマンデロニトリルを基質としてニトリラーゼ活性および生成物であるマンデル酸の光学純度を測定した。結果は表４に示す。
(3) Preparation of transformants and evaluation of nitrilase activity of the transformants Escherichia coli JM109 strain was transformed with these plasmids to obtain nitrilase-expressing transformants, JM109 / pNLA001 and JM109 / pNLA010. These transformants and JM109 / pTrc99A as a control were cultured in the same manner as in Example 3, and in the same manner as in Example 4, nitrilase activity and the optical purity of mandelic acid as a product were measured using mandelonitrile as a substrate. did. The results are shown in Table 4.
（４）２Ａ４ニトリラーゼ活性に及ぼすｐＨの影響
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。結果は表５に示す。JM109/pNLAO10菌体懸濁液を用いた。
(4) Effect of pH on 2A4 nitrilase activity As a buffer, sodium phosphate buffer (
実施例６
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体の作製
（１）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流にBradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
Example 6
(S) Preparation of E. coli transformant having selective hydroxynitrile lyase and low stereoselective nitrilase
(1) (S) Preparation of plasmid in which Bradyrhizobium-derived nitrilase gene is introduced downstream of selective hydroxynitrile lyase gene
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpNLB001を鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＮＬＲ−３１（配列番号５８、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）およびＮＬＲ−３３（配列番号５９、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＧでリジンをコ−ドする）ある。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−１２（配列番号６０、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。 A DNA fragment encoding nitrilase was used as a template in Example 5 with pNLB001 as a template so that a restriction enzyme Sse8387I recognition site that can be introduced downstream of the hydroxynitrile lyase gene of the hydroxynitrile lyase expression plasmids pOXN103V2I and pOXN103V2R was added. Similarly, it was prepared by the PCR method. The sense primer consists of NLR-31 (consisting of SEQ ID NO: 58, 38 nucleotides, having a PstI recognition site and the ATG start codon of the nitrilase gene in the sequence) and NLR-33 (SEQ ID NO: 59, 38 nucleotides; The sequence has a PstI recognition site and the ATG start codon after the nitrilase gene, and the codon corresponding to the second amino acid codes lysine with AAG). The antisense primer is NLR-12 (consisting of SEQ ID NO: 60, 26 nucleotides, including the Sse8387I recognition site and the nitrilase gene stop codon in the sequence).
センスプライマーＮＬＲ−３１：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGCAGGACACGAAATTC（配列番号５８；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
Sense primer NLR-31:
GG CTGCAG AGGAAACAGACCATGCAGGACACGAAATTC (SEQ ID NO: 58; underlined indicates the restriction enzyme PstI recognition site)
センスプライマーＮＬＲ−３３：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGAAGGACACGAAATTC（配列番号５９；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
Sense primer NLR-33:
GG CTGCAG AGGAAACAGACCATGAAGGACACGAAATTC (SEQ ID NO: 59; underlined indicates the restriction enzyme PstI recognition site)
アンチセンスプライマーＮＬＲ−１２：
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGT（配列番号６０；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
Antisense primer NLR-12:
GG CCTGCAGG ATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGT (SEQ ID NO: 60; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme Sse8387II)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 Amplified PCR products obtained by PCR were digested with PstI, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
制限酵素Sse8387Iにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rに、上記２種の断片をそれぞれライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpOXN701（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）、pOXN703（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）、pOXN711（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ、BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）およびpOXN713（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）を作製した。 The above two fragments were ligated to the hydroxynitrile lyase expression plasmids pOXN103V2I and pOXN103V2R cleaved with the restriction enzyme Sse8387I, respectively, and the expression plasmid pOXN701 (hydroxynitrile lyase V2I, wild type, in which the hydroxynitrile lyase gene and the nitrilase gene were incorporated. Bradyrhizobium nitrilase), pOXN703 (hydroxynitrile lyase V2I, wild-type Bradyrhizobium nitrilase), pOXN711 (hydroxynitrile lyase V2R, Bradyrhizobium nitrilase Q2K) and pOXN713 (hydroxynitrile lyase V2R Bradyrhizobium nitrilase Q2K).
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、JM109/pOXN701、JM109/pOXN703、JM109/pOXN711およびJM109/pOXN713を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、それぞれヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。 E. coli strain JM109 was transformed with these plasmids to produce recombinant nitrile lyase and nitrilase co-expressing recombinants, JM109 / pOXN701, JM109 / pOXN703, JM109 / pOXN711 and JM109 / pOXN713, as in Example 3. Cultured. After the culture, analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and bands of about 30 kDa and about 37 kDa corresponding to hydroxynitrile lyase and Bradyrhizobium nitrilase were confirmed.
（２）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に環境ＤＮＡ由来２Ａ４ニトリラーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpNLA001を鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＮＬＲ−３４（配列番号６１、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
(2) (S) Preparation of a plasmid in which the environmental DNA-derived 2A4 nitrilase gene is introduced downstream of the selective hydroxynitrile lyase gene. In the same manner as in Example 5, it was prepared by PCR using pNLA001 as a template so that a restriction enzyme Sse8387I recognition site that can be introduced downstream was added. The sense primer is NLR-34 (consisting of SEQ ID NO: 61, 38 nucleotides, having a PstI recognition site and a nitrilase gene after the ATG start codon). The antisense primer is NLR-21 (consisting of SEQ ID NO: 57, 26 nucleotides, including the Sse8387I recognition site and the nitrilase gene stop codon in the sequence).
センスプライマーＮＬＲ−３４：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGGCTGAAACAGCCTTC（配列番号６１；下線部は制限酵素PstI認識部位を示す）
Sense primer NLR-34:
GG CTGCAG AGGAAACAGACCATGGCTGAAACAGCCTTC (SEQ ID NO: 61; underlined indicates the restriction enzyme PstI recognition site)
アンチセンスプライマーＮＬＲ−２１：
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Sse8387II認識部位を示す）
Antisense primer NLR-21:
ATG CCTGCAGG TCACTCCGCTTTTGC (SEQ ID NO: 57; underlined indicates the restriction enzyme Sse8387II recognition site)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 Amplified PCR products obtained by PCR were digested with PstI, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
制限酵素Sse8387Iにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドに、上記断片をライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpOXN721（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ）およびpOXN723（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ）を作製した。 The above fragments were ligated to a hydroxynitrile lyase expression plasmid cleaved with the restriction enzyme Sse8387I, and the expression plasmids pOXN721 (hydroxynitrile lyase V2I, 2A4 nitrilase S2A) in which the hydroxynitrile lyase gene and the nitrilase gene were incorporated and pOXN723 (hydroxynitrile) A lyase V2R, 2A4 nitrilase S2A) was produced.
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、JM109/pOXN721およびJM109/pOXN723を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよび２Ａ４ニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３５ｋＤａのバンドを確認した。 Escherichia coli JM109 was transformed with these plasmids to produce recombinant nitrile lyase and nitrilase co-expression recombinants, JM109 / pOXN721 and JM109 / pOXN723, and cultured in the same manner as in Example 3. After culturing, analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and bands of about 30 kDa and about 35 kDa corresponding to hydroxynitrile lyase and 2A4 nitrilase were confirmed.
（３）Bradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子の下流に（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリアーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ニトリラーゼ発現プラスミドpNLB004およびpNLB010のニトリラーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rを鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＯＸＹＮ−６２（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉを用いた場合）（配列番号６２、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする、）およびＯＸＹＮ−６３（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒを用いた場合）（配列番号６３、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコ−ドする）ある。また、アンチセンスプライマ−は、ＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
(3) Preparation of plasmid in which (S) selective hydroxynitrile lyase gene was introduced downstream of Bradyrhizobium-derived nitrilase gene DNA fragments encoding hydroxynitrile lyase were introduced downstream of the nitrilase gene of nitrilase expression plasmids pNLB004 and pNLB010 In the same manner as in Example 5, it was prepared by PCR using pOXN103V2I and pOXN103V2R as templates so that a possible restriction enzyme Sse8387I recognition site was added. The sense primer is OXYN-62 (when pOXN103V2I is used as a template) (SEQ ID NO: 62, consisting of 31 nucleotides, the PstI recognition site and the nitrilase gene after the ATG start codon) The codons corresponding to are coding for isoleucine with ATC, and OXYN-63 (when pOXN103V2R is used as a template) (SEQ ID NO: 63, consisting of 31 nucleotides, including the PstI recognition site and the ATG of the nitrilase gene) The codon corresponding to the second amino acid after the start codon is CGT and codes for arginine). The antisense primer is OXYN-09 (consisting of SEQ ID NO: 49, 33 nucleotides, which contains the Sse8387I recognition site and the nitrilase gene stop codon).
センスプライマ−ＯＸＹＮ−６２：
GGCTGCAGGAAACAGACCATGATCACTGCAC（配列番号６２；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
Sense Primer-OXYN-62:
GG CTGCAG GAAACAGACCATGATCACTGCAC (SEQ ID NO: 62; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme PstI)
センスプライマ−ＯＸＹＮ−６３：
GGCTGCAGGAAACAGACCATGCGTACTGCAC（配列番号６３；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
Sense Primer-OXYN-63:
G GCTGCAG GAAACAGACCATGCGTACTGCAC (SEQ ID NO: 63; the underlined portion indicates the restriction enzyme PstI recognition site)
アンチセンスプライマ−ＯＸＹＮ−０９：
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
Antisense Primer-OXYN-09:
GG CCTGCAGG TTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC (SEQ ID NO: 49; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme Sse8387II)
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。 Amplified PCR products obtained by PCR were digested with PstI, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit.
制限酵素Sse8387Iにより切断したニトリラーゼ発現プラスミドｐＮＬＢ００４およびｐＮＬＢ０１０に、上記断片をライゲーションにより結合させ、ニトリラーゼ遺伝子とヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpNLB201（ベクターpTrc99A、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2I）、pNLB203（ベクターpTrc99A、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2R）、pNLB211（ベクターpKK233-2、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2I）、pNLB213（ベクターpKK233-2、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2R）を作製した。 The above-mentioned fragment was ligated to the nitrilase expression plasmids pNLB004 and pNLB010 cleaved by the restriction enzyme Sse8387I, and an expression plasmid pNLB201 in which the nitrilase gene and the hydroxynitrile lyase gene were incorporated (vector pTrc99A, Bradyrhizobium nitrilase Q2K, hydroxynitrile lyase V2I), pNLB203 (vector pTrc99A, Bradyrhizobium nitrilase Q2K, hydroxynitrile lyase V2R), pNLB211 (vector pKK233-2, Bradyrhizobium nitrilase Q2K, hydroxynitrile lyase V2I), pNLB213 (vector pKK233-2, Bradyrhizobium nitrilease Q2K, R2 did.
これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼとヒドロキシニトリルリアーゼの共発現組換え体、JM109/pNLB201、JM109/pNLB203、JM109/pNLB211、およびJM109/pNLB213を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。 Escherichia coli JM109 strain was transformed with these plasmids to produce nitrilase and hydroxynitrile lyase co-expression recombinants, JM109 / pNLB201, JM109 / pNLB203, JM109 / pNLB211 and JM109 / pNLB213. And cultured. After culturing, analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and bands of about 30 kDa and about 37 kDa corresponding to hydroxynitrile lyase and Bradyrhizobium nitrilase were confirmed.
（４）２Ａ４由来ニトリラーゼ遺伝子に（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
制限酵素Sse8387Iにより切断したニトリラーゼ発現プラスミドｐＮＬＡ００１およびｐＮＬＡ０１０に、（３）で作製したＤＮＡ断片をライゲーションにより結合させ、ニトリラーゼ遺伝子とヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）ｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＡＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）を作製した。
(4) Preparation of plasmid in which (S) selective hydroxynitrile lyase gene is introduced into 2A4-derived nitrilase gene The DNA fragment prepared in (3) is ligated to nitrilase expression plasmids pNLA001 and pNLA010 cleaved by restriction enzyme Sse8387I by ligation. Expression plasmids pNLA201 (vector pTrc99, 2A4 nitrilase S2A, hydroxynitrile lyase V2I) and pNLA203 (vector pTrc99, 2A4 nitrilase S2A, hydroxynitrile lyase V2R) pNLA201 (vector pKK233-2), in which the nitrilase gene and the hydroxynitrile lyase gene are integrated 2A4 nitrilase AS2A, hydroxynitrile lyase V2I) and pNLA203 (vector) Tar pKK233-2,2A4 nitrilase S2A, the hydroxynitrile lyase V2R) was prepared.
これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼとヒドロキシニトリルリアーゼの共発現組換え体、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０１、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０３、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２１１およびＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２１３を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよび２Ａ４ニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３５ｋＤａのバンドを確認した。 Escherichia coli JM109 strain was transformed with these plasmids to produce nitrilase and hydroxynitrile lyase co-expression recombinants, JM109 / pNLA201, JM109 / pNLA203, JM109 / pNLA211 and JM109 / pNLA213, as in Example 3. Cultured. After culturing, analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and bands of about 30 kDa and about 35 kDa corresponding to hydroxynitrile lyase and 2A4 nitrilase were confirmed.
実施例７
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌組換え体による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
（１）JM109/pOXN701およびJM109/pOXN703
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０３を用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１９５μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、５μｌのベンズアルデヒド（終濃度４７ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１ＭのＫＣＮを加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
Example 7
(S) Synthesis of S-mandelic acid from benzaldehyde and KCN by E. coli recombinants with selective hydroxynitrile lyase and low stereoselective nitrilase
(1) JM109 / pOXN701 and JM109 / pOXN703
Synthesis of (S) -mandelic acid from benzaldehyde and KCN using E. coli transformants JM109 / pOXN701 and JM109 / pOXN703 with (S) -selective hydroxynitrile lyase and low stereoselective nitrilase prepared in Example 6 Tried. To a microtube, 300 μl of 1M citrate buffer (pH 5) and 195 μl of distilled water were added and mixed, incubated at 20 ° C. for 5 minutes to dissolve 5 μl of benzaldehyde (
JM109/pOXN701およびJM109/pOXN703は、それぞれ０．３９ｍＭおよび２．７５ｍＭ（比活性6.2および18.8mU/mg dry cell）のマンデル酸を生成していた。 JM109 / pOXN701 and JM109 / pOXN703 produced mandelic acid of 0.39 mM and 2.75 mM (specific activities 6.2 and 18.8 mU / mg dry cell), respectively.
（２）C600/pOXN701およびC600/pOXN703
大腸菌Ｃ６００株を実施例１に従ってｐＯＸＮ７０１およびｐＯＸＮ７０３を用いて形質転換を行い、形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ７０１およびＣ６００／ｐＯＸＮ７０３を得た。これらをＩＰＴＧ無添加であることを除けば実施例２と同様にして培養を行い、菌体懸濁液を得た。
(2) C600 / pOXN701 and C600 / pOXN703
E. coli strain C600 was transformed with pOXN701 and pOXN703 according to Example 1 to obtain transformants C600 / pOXN701 and C600 / pOXN703. The cells were cultured in the same manner as in Example 2 except that IPTG was not added to obtain a cell suspension.
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
To a microtube, 300 μl of 1M citrate buffer (pH 5) and 100 μl of distilled water were added and mixed, incubated at 20 ° C. for 5 minutes, 100 μl of 20 mM benzaldehyde (
Ｃ６００／ｐＯＸＮ７０１およびＣ６００／ｐＯＸＮ７０３は、ベンズアルデヒドを全量消費し、それぞれ１．８０ｍＭおよび１．８１ｍＭ（比活性４．４５ｍＵ以上、および４．８３ｍＵ以上／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ）の、いずれも光学純度１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸を生成していた。 C600 / pOXN701 and C600 / pOXN703 consume the entire amount of benzaldehyde, each of 1.80 mM and 1.81 mM (specific activity of 4.45 mU or more and 4.83 mU or more / mg dry cell), both with an optical purity of 100% e . e. Of S-mandelic acid.
（３）JM109/pOXN711、JM109/pOXN713、JM109/pOXN721およびJM109/pOXN723
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼとBradyrhizobiumニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３、および（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと２Ａ４ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２３を実施例６に記載の条件で培養を行ない、菌体懸濁液を得た。これらを用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ４）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの５０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度５ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を（実施例４）と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
(3) JM109 / pOXN711, JM109 / pOXN713, JM109 / pOXN721 and JM109 / pOXN723
E. coli transformants JM109 / pOXN711 and JM109 / pOXN713 with (S) selective hydroxynitrile lyase and Bradyrhizobium nitrilase prepared in Example 6 and (S) E. coli transformant JM109 with selective hydroxynitrile lyase and 2A4 nitrilase / POXN721 and JM109 / pOXN723 were cultured under the conditions described in Example 6 to obtain a cell suspension. Using these, the synthesis of (S) -mandelic acid from benzaldehyde and KCN was attempted. In a microtube, 1 μM citrate buffer (pH 4) 300 μl and distilled
ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３は、ベンズアルデヒドを全量消費し、それぞれ４．１５ｍＭおよび４．４７ｍＭ（比活性２３０ｍＵおよび２４７ｍＵ／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ以上）の、いずれも光学純度１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸が生成していた。 JM109 / pOXN711 and JM109 / pOXN713 consume the entire amount of benzaldehyde, both of 4.15 mM and 4.47 mM (specific activity of 230 mU and 247 mU / mg dry cell or more), respectively, with an optical purity of 100% e.e. e. Of S-mandelic acid was produced.
ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２３は、それぞれ１．５９ｍＭおよび１．３５ｍＭ（比活性８８．４ｍＵおよび７４．９ｍＵ／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ以上）の、光学純度はそれぞれ９８．９および１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸が生成していた。 JM109 / pOXN721 and JM109 / pOXN723 are 1.59 mM and 1.35 mM (specific activities of 88.4 mU and 74.9 mU / mg dry cell or more), respectively, with optical purity of 98.9 and 100% e. e. Of S-mandelic acid was produced.
（４）基質ベンズアルデヒド濃度の影響（ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３）
（３）で得られたＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３菌体懸濁液を用いて、ベンズアルデヒド濃度以外は（３）と同様にしてＳ−マンデル酸の合成を行った。ベンズアルデヒドの終濃度は０．５、１、２および５ｍＭとした。
(4) Influence of substrate benzaldehyde concentration (JM109 / pOXN711 and JM109 / pOXN713)
Using the JM109 / pOXN711 and JM109 / pOXN713 cell suspensions obtained in (3), S-mandelic acid was synthesized in the same manner as in (3) except for the benzaldehyde concentration. The final concentration of benzaldehyde was 0.5, 1, 2, and 5 mM.
ベンズアルデヒド濃度が２ｍＭ以上の場合に、比活性が低下していることから、本濃度領域では酵素の失活が起こっていると考えられる。Ｓ−マンデル酸を高濃度蓄積させるためには、ベンズアルデヒドを５ｍＭ以下、できれば２ｍＭ以下に維持しながら、分割添加して反応すべきことが明らかとなった。 Since the specific activity is reduced when the benzaldehyde concentration is 2 mM or more, it is considered that the enzyme is deactivated in this concentration range. In order to accumulate S-mandelic acid at a high concentration, it has been clarified that benzaldehyde should be added in portions while maintaining benzaldehyde at 5 mM or less, preferably 2 mM or less.
（５）ｐＨの効果
反応時のｐＨの影響を調べるために、実施例６で得られたＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０１を用いて反応を行った。
(5) Effect of pH In order to examine the influence of pH during the reaction, the reaction was carried out using JM109 / pNLA201 obtained in Example 6.
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４、４．５、５）３００μｌと蒸留水１９５μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、５μｌのベンズアルデヒド（終濃度４７ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１ＭのＫＣＮ（終濃度１００ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
In a microtube, add 300 μl of 1M citrate buffer (
その結果、緩衝液のｐＨ４および５においては反応は進行せず、ｐＨ５においてのみ３．１ｍＭのマンデル酸が生成し、その光学純度は４２％ｅ．ｅ．（Ｓ体）であった。
As a result, the reaction did not proceed at
次に、ベンズアルデヒド濃度を２ｍＭおよびＫＣＮ濃度を１０ｍＭに下げて、同様の実験を行った。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５、４、４．５、５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。その結果、いずれの場合もほぼ全量のベンズアルデヒドが消費され、高い光学純度のＳ−マンデル酸を生成した。
Next, the same experiment was performed by reducing the benzaldehyde concentration to 2 mM and the KCN concentration to 10 mM. Add 300 μl of 1M citrate buffer (pH 3.5, 4, 4.5, 5) and 100 μl of distilled water to a microtube, mix, incubate at 20 ° C. for 5 minutes, and 100 μl of 20 mM benzaldehyde (
条件１：４７ｍＭベンズアルデヒド−１００ｍＭ ＫＣＮ
条件２：２ｍＭベンズアルデヒド−１０ｍＭ ＫＣＮ
Condition 1: 47 mM benzaldehyde-100 mM KCN
Condition 2: 2 mM benzaldehyde-10 mM KCN
実施例８
ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現ロドコッカス組換え体の作製
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
実施例１で得られたキャッサバ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの合成遺伝子を鋳型として、実施例４の条件でＰＣＲ反応を行い、ロドコッカス発現ベクターｐＳＪ０３４に挿入するためのＤＮＡ断片を得た。センスプライマーとしてＯＸＹＮ−０１（配列番号６４、３２ヌクレオチドからなり、その配列中にＸｂａＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）、アンチセンスプライマーとしてＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む）を用いた。
Example 8
Hydroxynitrile lyase expression plasmid and production of hydroxynitrile lyase-expressing Rhodococcus recombinant containing the plasmid
(1) Preparation of hydroxynitrile lyase expression plasmid Using the cassava-derived hydroxynitrile lyase synthetic gene obtained in Example 1 as a template, a PCR reaction was carried out under the conditions of Example 4 and inserted into the Rhodococcus expression vector pSJ034. A DNA fragment was obtained. OXYN-01 (consisting of SEQ ID NO: 64, 32 nucleotides, having an XbaI recognition site and the ATG start codon of the hydroxynitrile lyase gene in the sequence) as a sense primer, and OXYN-09 (SEQ ID NO: 49, 33 as an antisense primer) It consists of nucleotides and includes a Sse8387I recognition site in its sequence).
センスプライマーＯＸＹＮ−０１：
TTTCTAGAATGGTAACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号６４；下線部は制限酵素ＸｂａＩ認識部位を示す）
Sense primer OXYN-01:
TT TCTAGA ATGGTAACTGCACATTTTGTTCTG (SEQ ID NO: 64; the underlined portion indicates a restriction enzyme XbaI recognition site)
アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−０９：
ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
Antisense primer OXYN-09:
gg cctgcagg ttaacttaataggagctaaaagc (SEQ ID NO: 49; underlined indicates the recognition site for restriction enzyme Sse8387I)
以下、実施例１と同様の手法によりヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドを作製した。ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉにより切断したｐＳＪ０３４に、上記断片をライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＯＸＮ０３１を得た。 Thereafter, a hydroxynitrile lyase expression plasmid was prepared in the same manner as in Example 1. The amplified PCR product obtained by PCR was digested with XbaI and Sse8387I, separated by agarose gel electrophoresis, and then purified by QIAquick Gel Extraction Kit. The above fragment was ligated to pSJ034 cleaved with restriction enzymes XbaI and Sse8387I to obtain an expression plasmid pOXN031 in which the hydroxynitrile lyase gene was incorporated.
なお、ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法により作製したものである。ｐＳＪ０２３は形質転換体 R.rhodochrous ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として産業総合技術研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。 PSJ034 was prepared from plasmid pSJ023 by the method described in JP-A-10-337185. pSJ023 is deposited as a transformant R.rhodochrous ATCC12274 / pSJ023 (FERM BP-6232) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary.
（２）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とBradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＯＸＮ６１１およびｐＯＸＮ６１２の作製
実施例６（１）で得られた増幅ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し精製されたＤＮＡ断片を、Ｓｓｅ８３８７Ｉにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドｐＯＸＮ０３１に、ライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＯＸＮ６１１（野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）およびｐＯＸＮ６１２（BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）を作製した。
(2) Preparation of plasmids pOXN611 and pOXN612 having (S) selective hydroxynitrile lyase gene and Bradyrhizobium-derived nitrilase gene A DNA fragment purified by digesting the amplified PCR product obtained in Example 6 (1) with PstI, Ligation was combined with the hydroxynitrile lyase expression plasmid pOXN031 cleaved with Sse8387I to prepare expression plasmids pOXN611 (wild-type Bradyrhizobium nitrilase) and pOXN612 (Bradyrhizobium nitrilase Q2K) in which the hydroxynitrile lyase gene and the nitrilase gene were incorporated.
これらのプラスミドによりロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、ＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＯＸＮ６１１およびＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＯＸＮ６１２を作製した。 Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 was transformed with these plasmids to produce recombinant recombinant expression of hydroxynitrile lyase and nitrilase, ATCC12674 / pOXN611 and ATCC12674 / pOXN612.
ＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換は次のようにして行った。ＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド溶液１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。これを遺伝子導入装置Gene Pulser（ＢＩＯ ＲＡＤ）用キュベットに移し、同装置を用いて２．０ＫＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置後、３７℃で１０分間インキュベートし、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ ＰＯ４）５００μｌ を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。得られたコロニーを培養し、プラスミドが導入されていることを確認した。 Transformation of the ATCC12674 strain was performed as follows. Cells in the logarithmic growth phase of ATCC12674 strain were collected by a centrifuge, washed three times with ice-cooled sterilized water, and suspended in sterilized water. 1 μl of the above plasmid solution and 10 μl of the cell suspension were mixed and ice-cooled. This was transferred to a gene introduction device Gene Pulser (BIO RAD) cuvette, and electric pulse treatment was performed at 2.0 KV and 200 OHMS using the same device. The electric pulse treatment solution was allowed to stand for 10 minutes under ice-cooling, and then incubated at 37 ° C. for 10 minutes. MYK medium (0.5% polypeptone, 0.3% bactoeast extract, 0.3% bactomalt extract, 0.2 % K2 HPO4, 0.2% KH2 PO4) 500 μl was added, and the mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 5 hours, and then applied to a MYK agar medium containing 50 μg / ml kanamycin and cultured at 30 ° C. for 3 days. The obtained colony was cultured, and it was confirmed that the plasmid was introduced.
培養は、次のように行った。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＹＫ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃にて２４時間前培養を行った。培養液を１ｍｌ取り１００ｍｌの同培地に加え、３０℃にて４８時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。 The culture was performed as follows. Inoculated into 10 ml of MYK medium containing kanamycin (50 mg / L) and pre-cultured at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the culture solution was taken and added to 100 ml of the same medium, followed by shaking culture at 30 ° C. for 48 hours. Bacteria were collected from the obtained culture by centrifugation (3,700 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed with 10 mM phosphate-sodium buffer (pH 7.0), and then suspended in the same buffer. It became cloudy.
培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、それぞれヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。 After the culture, analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and bands of about 30 kDa and about 37 kDa corresponding to hydroxynitrile lyase and Bradyrhizobium nitrilase were confirmed.
比較例１
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼを有する組換え体と低立体選択的ニトリラーゼを有する組換え体を含む反応系による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
実施例３で得られたヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒの菌体懸濁液、および実施例４で得られたニトリラーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＮＬＢ０１０の菌体懸濁液を用いて、実施例７と同様にしてベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成を行った。
Comparative Example 1
(S) Synthesis of S-mandelic acid from benzaldehyde and KCN by a reaction system comprising a recombinant having a selective hydroxynitrile lyase and a recombinant having a low stereoselective nitrilase. Hydroxynitrile obtained in Example 3 Using a microbial suspension of JM109 / pOXN103V2R having lyase activity and a microbial suspension of JM109 / pNLB010 having nitrilase activity obtained in Example 4, benzaldehyde and KCN were used in the same manner as in Example 7. The S-mandelic acid was synthesized.
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液各々２００μｌずつを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、生成したマンデル酸の分析を行った。その結果、ベンズアルデヒドは全量消費され、１．８０ｍＭの光学純度８５．０％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸を生成していた。
To a microtube, 300 μl of 1M citrate buffer (pH 5) and 100 μl of distilled water were added and mixed, incubated at 20 ° C. for 5 minutes, 100 μl of 20 mM benzaldehyde (
Claims (10)
（ａ） 配列番号３で示すアミノ酸配列を示すタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ） 配列番号３で示すアミノ酸配列を示すタンパク質をコードする遺伝子の相補鎖と
ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号３で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 An expression vector comprising a gene encoding a stereoselective hydroxynitrile lyase, and a gene encoding a nitrilase having a stereoselectivity of 20% ee or less of the product, wherein the gene encoding the nitrilase An expression vector that is one of the following genes.
(A) a gene encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(B) A gene that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of a gene encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encodes a protein having nitrilase activity.
(C) A gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having nitrilase activity.
（ａ） 配列番号４で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号４で示す遺伝子の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 An expression vector comprising a gene encoding a stereoselective hydroxynitrile lyase, and a gene encoding a nitrilase having a stereoselectivity of 20% ee or less of the product, wherein the gene encoding the nitrilase An expression vector that is one of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 4.
(B) a gene that hybridizes with a complementary strand of the gene represented by SEQ ID NO: 4 under a stringent condition and encodes a protein having nitrilase activity.
である、請求項１又は２に記載の発現ベクター。 The expression vector according to claim 1 or 2 , wherein the gene encoding hydroxynitrile lyase is a gene derived from Manihot esculenta.
（ａ） 配列番号２で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号２で示す遺伝子の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 The vector according to any one of claims 1 to 3 , wherein the gene encoding hydroxynitrile lyase is any of the following genes.
(A) The gene shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene that hybridizes with a complementary strand of the gene represented by SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having hydroxynitrile lyase activity.
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