JP5057377B2 - Method and apparatus for measuring biological components or their functions - Google Patents
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
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Description
本発明は、生体成分又はその機能の測定方法及び装置に関するものであり、より詳細には、複数の試料保持部内に保持された分子プローブと検体とを含む試料混合物からの光を撮像により同時に検出することで該試料混合物における生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定するための測定方法及び装置に関するものである。 The present invention relates to a method and apparatus for measuring a biological component or its function. More specifically, the present invention detects light from a sample mixture containing a molecular probe and a specimen held in a plurality of sample holders simultaneously by imaging. Thus, the present invention relates to a measurement method and apparatus for measuring the presence or absence of biological components or their functions in the sample mixture.
近年、様々な分子プローブが開発され、分子プローブを利用して生体成分又はその機能を解析する技術が発展してきた。その一例として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Fluorescent Resonance Energy Transfer）を利用した分子プローブがある。ＦＲＥＴは、同一分子又は別の分子に存在する２種類の蛍光物質のうちエネルギーを与える側の蛍光物質であるドナーとエネルギーを与えられる側の蛍光物質であるアクセプターとの間で起こるエネルギー移動である。 In recent years, various molecular probes have been developed, and techniques for analyzing biological components or their functions using molecular probes have been developed. As an example, there is a molecular probe using fluorescence resonance energy transfer (FRET). FRET is an energy transfer that occurs between a donor that is a fluorescent material that gives energy and an acceptor that is a fluorescent material that gives energy among two types of fluorescent materials existing in the same molecule or different molecules. .
図２２は、ＦＲＥＴを利用してプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）の活性を測定する方法を模式的に示す。この場合、分子プローブは、アクセプターである蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ）とドナーである蛍光色素とを、プロテアーゼと反応する基質のペプチドで結合した構造を有している。この分子プローブでは、プロテアーゼが作用していない状態ではドナーからアクセプターにエネルギーが移動してＦＲＥＴが起きるが、プロテアーゼの作用により基質が分解（切断）されることでアクセプターが外れると、ドナーとアクセプターとの間の距離が広がり、ＦＲＥＴが解消する。この原理を応用して、プロテアーゼ活性を測定することが可能になる。 FIG. 22 schematically shows a method for measuring the activity of a protease (proteolytic enzyme) using FRET. In this case, the molecular probe has a structure in which a fluorescent protein (for example, YFP) as an acceptor and a fluorescent dye as a donor are bound with a peptide of a substrate that reacts with a protease. In this molecular probe, when the protease is not acting, energy is transferred from the donor to the acceptor and FRET occurs. However, when the acceptor is released by the decomposition (cleavage) of the substrate by the action of the protease, the donor and the acceptor The distance between is increased and FRET is eliminated. By applying this principle, protease activity can be measured.
図２３は、波長５３０ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光タンパク質ＹＦＰと波長６２５ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光色素とを有するプロテアーゼ活性測定用の分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。図２３の例では、ドナーである蛍光タンパク質ＹＦＰの蛍光ピーク（波長５３０ｎｍ付近）とアクセプターである蛍光色素の蛍光ピーク（波長６２５ｎｍ付近）との２個の蛍光ピークを持つ蛍光スペクトルが観測されている。この分子プローブを用いた場合、プロテアーゼが作用する前は、ＦＲＥＴが起きることによって波長５３０ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に弱く、波長６２５ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に強いが、プロテアーゼが作用した後には、ＦＲＥＴが消滅することによって波長５３０ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に強くなり、波長６２５ｎｍ付近の蛍光強度が相対的に弱くなる。 FIG. 23 shows an example of a fluorescence spectrum in the case of using a molecular probe for measuring protease activity having a fluorescent protein YFP having a fluorescence peak near a wavelength of 530 nm and a fluorescent dye having a fluorescence peak near a wavelength of 625 nm. In the example of FIG. 23, a fluorescence spectrum having two fluorescence peaks, a fluorescence peak of the fluorescent protein YFP as a donor (wavelength near 530 nm) and a fluorescence peak of a fluorescent dye as an acceptor (wavelength near 625 nm) is observed. . When this molecular probe is used, before the protease acts, the fluorescence intensity around the wavelength of 530 nm is relatively weak and the fluorescence intensity around the wavelength of 625 nm is relatively strong due to the occurrence of FRET. As FRET disappears, the fluorescence intensity near the wavelength of 530 nm becomes relatively strong, and the fluorescence intensity near the wavelength of 625 nm becomes relatively weak.
このような分子プローブを用いた測定では、典型的には、ドナーとアクセプターとの蛍光強度の比率を測定することで、生体成分又はその機能を測定することができる。例えば、上記のプロテアーゼ活性測定用の分子プローブの場合には、ドナーとアクセプターとの蛍光強度の比率は、プロテアーゼ活性と相関するため、この蛍光強度の比率を測定することで、測定対象となる生体成分のプロテアーゼの機能（活性）を測定することができる。 In the measurement using such a molecular probe, typically, a biological component or its function can be measured by measuring the ratio of the fluorescence intensity between the donor and the acceptor. For example, in the case of the above molecular probe for measuring protease activity, the ratio of the fluorescence intensity of the donor and the acceptor correlates with the protease activity. Therefore, by measuring the ratio of the fluorescence intensity, the biological target to be measured is measured. The function (activity) of the component protease can be measured.
又、２種類以上の分子プローブ用いて、複数の生体成分又はその機能を同時に測定する技術も開発されている（特許文献１）。例えば、ＦＲＥＴを利用した２種類の分子プローブを用いる場合には、通常、４個の蛍光ピークの蛍光強度を測定する必要があり、ＦＲＥＴを利用した３種類分子プローブを用いる場合には、通常、６個の蛍光ピークの蛍光強度を測定する必要がある。
ところで、上述のような蛍光スペクトルの測定は、１個の試料を測定する場合は、回折格子やプリズムを利用した蛍光分光光度計を用いて支障なく行うことが可能である。しかしながら、複数の試料を測定する場合には、試料保持部を切り換えて測定する必要がある。プレートリーダ等では、試料保持部をスキャンしながら測定できるものもあるが、測定時間の短縮には限界があり、短時間のうちに同時に複数の試料を測定することは困難である。 By the way, the measurement of the fluorescence spectrum as described above can be performed without any trouble using a fluorescence spectrophotometer using a diffraction grating or a prism when measuring one sample. However, when measuring a plurality of samples, it is necessary to switch and measure the sample holder. Some plate readers can measure while scanning the sample holder, but there is a limit to shortening the measurement time, and it is difficult to measure a plurality of samples simultaneously in a short time.
又、蛍光イメージング手法を用いて複数の試料からの蛍光を同時に測定する方法もある。従来の蛍光イメージング手法では、複数の分光フィルタを切り換えて、蛍光ピーク波長付近のみの蛍光強度を測定する方法が一般的である。しかしながら、斯かる従来の蛍光イメージング手法では、測定する分子プローブの種類に応じて多種類の分光フィルタを用意し、それらを切り換えて測定する必要があり、煩雑な操作を要した。又、このような複数の分光フィルタを切り替えて使用する方法では、蛍光スペクトルを測定することは困難である。そのため、分子プローブの蛍光が正常に発生しているかの確認や、蛍光ピークの変化を測定できないなどの問題点があった。このような問題は、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いるような場合にはより顕著となる。 There is also a method of simultaneously measuring fluorescence from a plurality of samples using a fluorescence imaging technique. In a conventional fluorescence imaging method, a method of measuring a fluorescence intensity only in the vicinity of a fluorescence peak wavelength by switching a plurality of spectral filters is common. However, in such a conventional fluorescence imaging method, it is necessary to prepare various types of spectral filters according to the types of molecular probes to be measured, and to perform measurement by switching them, which requires a complicated operation. In addition, it is difficult to measure a fluorescence spectrum by using such a method of switching a plurality of spectral filters. For this reason, there are problems such as confirmation of whether the fluorescence of the molecular probe is normally generated and measurement of changes in the fluorescence peak. Such a problem becomes more prominent when a plurality of types of molecular probes are used simultaneously in one or a plurality of sample holders.
従って、本発明の目的は、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことを可能とする生体成分又はその機能の測定方法及び装置を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method and an apparatus for measuring a biological component or a function thereof capable of simultaneously measuring a biological component or its function in multiple specimens in a short time.
又、本発明の他の目的は、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いる場合でも、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことを可能とする生体成分又はその機能の測定方法及び装置を提供することである。 Another object of the present invention is to enable simultaneous measurement of biological components or their functions in multiple specimens in a short time even when a plurality of types of molecular probes are used simultaneously in one or a plurality of sample holders. It is providing the measuring method and apparatus of the biological component which performs, or its function.
上記目的は本発明に係る生体成分又はその機能の測定方法及び装置にて達成される。要約すれば、本発明の第１の態様は、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む試料混合物を複数の試料保持部に保持させ；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に検出器により撮像することで同時に検出することを、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更して繰り返して、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する；ことを特徴とする測定方法である。 The above object is achieved by the method and apparatus for measuring a biological component or its function according to the present invention. In summary, according to the first aspect of the present invention, the first fluorescent substance and the second fluorescent substance are included in the same molecule, and the biological component to be measured acts on the first fluorescent substance and the second fluorescent substance. a molecular probe for fluorescence resonance energy transfer is affected between the second fluorescent material, it is held specimen and, a plurality of sample holding portion of the sample mixture comprising: said held by the plurality of sample holder the fluorescence was emitted from the sample mixture, to detect simultaneously be imaged by detector after the wavelength range of transmitted light passed through the variable wavelength liquid crystal spectral filter is variable, the wavelength tunable liquid crystal spectral filter The transmission peak wavelength of the first fluorescent material is changed and repeated, and at least the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material and the detected value of the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material are Acquired for each sample holder A plurality of times at regular intervals; based on the detected value of the fluorescence intensity, the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent substance and the specific intensity corresponding to the second fluorescent substance The amount of change of the ratio of the fluorescence wavelength to the fluorescence intensity during the predetermined interval is determined for each sample holding unit; the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material, which is obtained in advance, and the a change amount between the fixed interval of the ratio of the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent substance, the presence or amount of a biological component or function of the measurement object based on the relationship, the Measuring the presence / absence or degree of function of the biological component to be measured in the sample in the sample mixture held in each sample holding part or the function thereof from the amount of change obtained based on the detected value of fluorescence intensity ; Special It is to that measurement method with.
本発明の一実施態様によると、前記検出器による蛍光の検出の際には、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を、少なくとも前記第１の蛍光物質の蛍光ピーク波長と前記第２の蛍光物質の蛍光ピーク波長とを含む透過ピーク波長範囲にわたり所定の透過ピーク波長毎に変更して、前記検出器により撮像することを繰り返す。 According to an embodiment of the present invention, when the fluorescence is detected by the detector, the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter is set to at least the fluorescence peak wavelength of the first fluorescent material and the second fluorescence. It changes for every predetermined | prescribed transmission peak wavelength over the transmission peak wavelength range containing the fluorescence peak wavelength of a substance, and it repeats imaging with the said detector .
本発明の一実施態様によると、前記複数の試料保持部のうち１個以上に保持された前記試料混合物には、複数種類の前記分子プローブが含まれており、該１個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記複数種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する。 According to one embodiment of the present invention, wherein the plurality of said sample mixture held in one or more of the sample holder, includes a plurality of types of the molecular probe, the one or more sample holder The analyte in the sample mixture held in the column corresponds to the fluorescence intensity of a specific fluorescence wavelength corresponding to each of the first fluorescent materials and the second fluorescent material of each of the plurality of types of the molecular probes. based on the detected value of the fluorescence intensity of a specific fluorescence wavelength, measuring the presence or amount of said plurality of types of each measurement subject to the biological components or features of the molecular probe.
本発明の他の実施態様によると、前記複数の試料保持部のうち２個以上に保持された前記試料混合物に含まれる前記分子プローブ間の種類が異なっており、該２個以上の試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体については、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値に基づいて、前記異なる種類の前記分子プローブのそれぞれの測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する。 According to another embodiment of the present invention, the kind between the molecular probe that among contained in the sample mixture held in two or more of the plurality of sample holding portion is different, the two or more sample holder for the sample of the sample mixture that is retained, corresponding to the different types of the molecular particular fluorescent intensity of fluorescent light and the second fluorescent substance of the wavelength corresponding to each of the first fluorescent material of the probe to based on the detected value of the fluorescence intensity of a specific fluorescence wavelength, measuring the presence or amount of the different types of the respective measurement subject to biological components or features of the molecular probe.
本発明の一実施態様によれば、前記生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択される。又、本発明の一実施態様によれば、前記検体は、生体成分、細胞、細胞抽出液又はそれらの混合物である。又、本発明の一実施態様によれば、前記検出器による蛍光の検出の際には、前記複数の試料保持部に透過光、落射光、エバネッセント光又はそれらを組み合わせて励起光を照射する。更に、本発明の一実施態様によれば、前記検出器として、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又はイメージインテンシファイアを用いる。 According to one embodiment of the present invention, the biological component includes proteins, enzymes, peptides, amino acids, coenzymes, sugars, sugar chains, lipids, nucleic acids, derivatives thereof, complexes thereof, hydrogen ions, and metal ions. Selected from the group consisting of According to one embodiment of the present invention, the specimen is a biological component, a cell, a cell extract, or a mixture thereof. Further, according to an embodiment of the present invention, upon detection of fluorescence by the detector, the transmitted light to the plurality of sample holding portions, incident light, irradiation shine that the excitation light evanescent light or a combination thereof . Furthermore, according to an embodiment of the present invention, a CCD camera, a CMOS camera, or an image intensifier is used as the detector.
そして、本発明の第２の態様によれば、複数の試料保持部に保持された試料混合物から発された蛍光が通過する、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタと、前記波長可変液晶分光フィルタを通過した後の前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、撮像することで同時に検出する検出器と、前記検出器により各前記試料保持部に対応して検出された蛍光の強度に基づいて、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する処理装置と、を有し、前記処理装置は；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物が、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む場合に；前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更させて前記検出器による蛍光の検出を繰り返させて、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、ことを特徴とする測定装置が提供される。 Then, according to the second aspect of the present invention, a wavelength tunable liquid crystal spectral filter firefly light emitted from the specimen mixture maintained in a plurality of sample holder passes, the wavelength range of the transmitted light is variable , the wavelength tunable liquid crystal spectral filter firefly light emitted from the sample mixture, wherein held in the plurality of sample holder after passing a detector for detecting simultaneously by imaging, each said by the detector based on the intensity of the fluorescent light detected in correspondence with the sample holder, measuring the presence or amount of a biological component or function of the measurement target in the sample of the sample mixture which is retained in each of said sample holder a processing unit, have a, wherein the processing unit; wherein the sample mixture held by the plurality of sample holding portion, to be measured and a first fluorescent substance and the second fluorescent material in the same molecule By the action of biological components When a molecular probe that affects fluorescence resonance energy transfer between the first fluorescent substance and the second fluorescent substance is included, and a specimen; the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter is changed The detection of the fluorescence by the detector is repeated, and at least the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material are detected. Acquiring the value for each sample holding unit a plurality of times at regular intervals; based on the detected value of the fluorescence intensity, the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescence substance and the The amount of change in the ratio between the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material during the predetermined interval is obtained for each sample holding unit; corresponding to the first fluorescent material obtained in advance. Specific fluorescence to The amount of change in the ratio between the long fluorescence intensity and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material during the certain interval, and the presence or absence of the biological component to be measured or its function Based on the relationship, from the amount of change obtained based on the detected value of the fluorescence intensity, the presence or absence of the biological component to be measured in the sample in the sample mixture held in each sample holding unit or the function thereof, or amount to measure, there is provided measurement apparatus you wherein a.
本発明によれば、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。又、本発明によれば、複数種類の分子プローブを一の又は複数の試料保持部において同時に用いる場合でも、多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。 According to the present invention, it is possible to simultaneously measure biological components or their functions in multiple specimens in a short time. In addition, according to the present invention, even when a plurality of types of molecular probes are used simultaneously in one or a plurality of sample holders, it is possible to simultaneously measure biological components or their functions in multiple samples in a short time.
以下、本発明に係る生体成分又はその機能の測定方法及び装置を図面に則して更に詳しく説明する。 Hereinafter, the method and apparatus for measuring a biological component or its function according to the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.
本発明によれば、上述の問題を解決するための手段として、蛍光分光フィルタに、透過ピーク波長が固定された従来の分光フィルタではなく、波長可変液晶分光フィルタを使用する。 According to the present invention, as a means for solving the above-described problem, a wavelength tunable liquid crystal spectral filter is used as a fluorescent spectral filter instead of a conventional spectral filter having a fixed transmission peak wavelength.
即ち、本発明の一実施態様によれば、複数の試料保持部に保持された、蛍光物質又は発光物質を利用した分子プローブと検体とを含む試料混合物から発された光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に、検出器により撮像することで同時に検出する。そして、検出器により各試料保持部に対応して検出された光の強度に基づいて、各試料保持部に保持された試料混合物中の検体における分子プローブが対象とする生体成分又はその機能を測定する。 That is, according to one embodiment of the present invention, light emitted from a sample mixture that is held in a plurality of sample holders and includes a molecular probe using a fluorescent substance or a luminescent substance and a specimen is converted into a wavelength of transmitted light. After passing through a wavelength tunable liquid crystal spectral filter whose range is variable, detection is performed simultaneously by imaging with a detector. Based on the intensity of light detected by the detector corresponding to each sample holder, the biological component targeted by the molecular probe in the sample in the sample mixture held in each sample holder or the function thereof is measured. To do.
波長可変液晶分光フィルタは、１９３３年にリオ（Ｂ．Ｌｙｏｔ）により考案された、結晶板による干渉を利用して比較的狭い波長域の光だけを透過するリオ・フィルタの原理を応用したものである。リオ・フィルタは、透過する直線偏光の振動方向を平行にした複数個の偏光子の列の間に、光学軸が端面に平行で厚さが２ｎｄ（ｎ＝０、１、２‐‐‐）の複屈折板である結晶板（一軸結晶：例えば水晶板）を、光学軸が偏光子の振動方向に４５゜をなすように配置した構成を有する。リオ・フィルタは、透過光の波長域が固定されている。これに対して、波長可変液晶分光フィルタは、複屈折板としてリオ・フィルタにおける一軸結晶の代わりに液晶セル（液晶板）を使用することで、液晶セルに対する印加電圧を変化させることにより、透過光の波長域を可変にすることができるように設計したものである。 The wavelength tunable liquid crystal spectral filter is an application of the principle of the Rio filter, which was devised by B. Lyot in 1933 and transmits only light in a relatively narrow wavelength region using interference by a crystal plate. is there. The Rio filter has an optical axis parallel to the end face and a thickness of 2nd (n = 0, 1, 2, −−−) between a plurality of polarizers paralleling the vibration direction of the linearly polarized light that is transmitted. The crystal plate (uniaxial crystal: for example, a quartz plate), which is a birefringent plate, is arranged so that the optical axis forms 45 ° in the vibration direction of the polarizer. The Rio filter has a fixed wavelength range of transmitted light. On the other hand, a wavelength tunable liquid crystal spectral filter uses a liquid crystal cell (liquid crystal plate) instead of a uniaxial crystal in a Rio filter as a birefringent plate, thereby changing transmitted voltage by changing the applied voltage to the liquid crystal cell. The wavelength range is designed to be variable.
図３は、波長可変液晶分光フィルタの概略構成を示す。この波長可変液晶分光フィルタは、偏光子１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄと、該偏光子間に挟まれる液晶セル１４ａ、１４ｂ、１４ｃと、該液晶セルに電圧を印加する電圧源１５ａ、１５ｂ、１５ｃと、を有する。液晶セルに印加する電圧を変化させることで、リオ・フィルタにおけるｎを変化させることができる。これにより、波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変化させることができる。 FIG. 3 shows a schematic configuration of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter. The tunable liquid crystal spectral filter includes polarizers 13a, 13b, 13c, and 13d, liquid crystal cells 14a, 14b, and 14c sandwiched between the polarizers, and voltage sources 15a, 15b, and 15c that apply voltages to the liquid crystal cells. And having. By changing the voltage applied to the liquid crystal cell, n in the Rio filter can be changed. Thereby, the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter can be changed.
図３の例では３枚の液晶セルが４枚の直線偏光子で挟まれた構造となっている。透過波長の半値幅は、液晶セルと直線偏光子の枚数を増やすことにより狭くすることができるが、枚数が増えると透過率も低下する。又、透過波長の可変範囲も液晶セルと直線偏光子の枚数により変化するため、透過波長の可変範囲により適切な枚数を選択することが望まれる。 In the example shown in FIG. 3, three liquid crystal cells are sandwiched between four linear polarizers. The full width at half maximum of the transmission wavelength can be narrowed by increasing the number of liquid crystal cells and linear polarizers, but the transmittance decreases as the number increases. Further, since the variable range of the transmission wavelength also varies depending on the number of liquid crystal cells and linear polarizers, it is desirable to select an appropriate number depending on the variable range of the transmission wavelength.
現在では、各透過波長域において非常に狭い波長域の光を透過する波長可変液晶分光フィルタが得られるようになっている（特開平３−２８２４１７号公報、特開２００５−１１５２０８号公報参照）。 At present, a tunable liquid crystal spectral filter that transmits light in a very narrow wavelength region in each transmission wavelength region can be obtained (see JP-A-3-282417 and JP-A-2005-115208).
図４は、６枚の液晶セルを使用した波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を４４０ｎｍから７００ｎｍまで２０ｎｍステップで変化させたときの、透過ピーク波長と透過率との関係を示す。 FIG. 4 shows the relationship between the transmission peak wavelength and the transmittance when the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter using six liquid crystal cells is changed from 440 nm to 700 nm in 20 nm steps.
波長可変液晶分光フィルタは所望の設定透過波長をピークとして、左右対称の波長透過特性を有しており、その半値幅は短波長ほど小さくなっている。又、短波長では透過率が小さくなる傾向がある。又、波長毎に透過特性が異なるため、透過率の補正を行うことが望ましい。 The tunable liquid crystal spectral filter has a symmetrical wavelength transmission characteristic with a desired set transmission wavelength as a peak, and its half-value width is smaller as the wavelength is shorter. Also, the transmittance tends to be small at short wavelengths. Further, since the transmission characteristics are different for each wavelength, it is desirable to correct the transmittance.
この補正方法は、一実施態様では、次のようにすることができる。即ち、例えば波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を４４０ｎｍから７００ｎｍに１ｎｍ毎に変更し、透過ピーク波長毎の透過波長スペクトルを予め測定する。そして、それらのスペクトルの面積比を計算し、ピーク波長毎に面積比を乗算することで、透過波長特性を補正することができる。 In one embodiment, this correction method can be performed as follows. That is, for example, the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter is changed from 440 nm to 700 nm every 1 nm, and the transmission wavelength spectrum for each transmission peak wavelength is measured in advance. Then, the transmission wavelength characteristics can be corrected by calculating the area ratio of the spectra and multiplying the area ratio for each peak wavelength.
図１は、本発明の一実施態様に係る測定装置１００である波長可変液晶分光フィルタを用いた蛍光イメージング装置の一例の概略構成を示す。図１の測定装置１００は、概略、光源１と、波長可変液晶分光フィルタ２と、本例では高感度冷却ＣＣＤカメラとされる検出器（撮像装置）３と、波長可変液晶分光フィルタ２の駆動装置８と、駆動装置８を制御し且つ検出器３から入力された信号を処理する処理装置（コンピュータ）１１と、を有する。又、光源１から検出器３に至る光学経路において、励起光を平行光とするための光源レンズ４、所定の波長域の励起光を透過する励起フィルタ５、励起光が検出器３に入射しないように所定の波長域以外の光をカットするカットフィルタ（広帯域フィルタ）６、試料混合物から発された蛍光を検出器３の受光面に結像するためのレンズ（本例ではテレセントリックレンズ）７などが光学的に整列されて配置される。本例では、光源１から検出器３に至る光学経路は、下から上へと略垂直方向に向いている。 FIG. 1 shows a schematic configuration of an example of a fluorescence imaging apparatus using a wavelength tunable liquid crystal spectral filter which is a measuring apparatus 100 according to an embodiment of the present invention. 1 schematically includes a light source 1, a wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, a detector (imaging device) 3 that is a high-sensitivity cooled CCD camera in this example, and driving of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2. The apparatus 8 includes a processing device (computer) 11 that controls the driving device 8 and processes a signal input from the detector 3. Further, in the optical path from the light source 1 to the detector 3, the light source lens 4 for making the excitation light parallel light, the excitation filter 5 that transmits the excitation light in a predetermined wavelength region, and the excitation light do not enter the detector 3. In this way, a cut filter (broadband filter) 6 that cuts light outside the predetermined wavelength range, a lens (telecentric lens in this example) 7 for imaging the fluorescence emitted from the sample mixture on the light receiving surface of the detector 3, etc. Are arranged optically aligned. In this example, the optical path from the light source 1 to the detector 3 is oriented in a substantially vertical direction from bottom to top.
そして、光源１と波長可変液晶分光フィルタ２との間、図示の例では、励起フィルタ５と波長可変液晶分光フィルタ２との間に、複数の試料保持部としてのウェル１２ａを有する試料容器としての測定プレート１２が光学的に整列されて配置される。測定プレート１２は、測定装置１００の本体内に設けられたガイド、位置決め手段などの所定の装着手段を介して測定装置１００の本体に対して着脱可能に装着される。測定プレート１２は、光源１から検出器３に至る光学経路の光軸に略直交する平面に沿って複数のウェル１２ａが配列されるように配置される。 As a sample container having a plurality of wells 12 a as sample holders between the light source 1 and the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, in the illustrated example, between the excitation filter 5 and the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2. A measuring plate 12 is arranged optically aligned. The measurement plate 12 is detachably attached to the main body of the measurement apparatus 100 via predetermined attachment means such as a guide and positioning means provided in the main body of the measurement apparatus 100. The measurement plate 12 is arranged such that a plurality of wells 12a are arranged along a plane substantially orthogonal to the optical axis of the optical path from the light source 1 to the detector 3.
図２（ａ）〜２（ｃ）に示すように、本例では測定プレート１２は２層の構造になっており、第１層１２ｂとしての透明のアクリル板上に、第２層１２ｃとして直径２ｍｍの穴が３行３列で９個開けられた黒色のプラスチック板を、防水接着剤で張り合わせた構造となっている。又、本例では、各ウェル１２ａの深さは３ｍｍで、容量は約１０μＬである。励起光が照射される側の図中下方に配置される第１層１２ｂを透明としたのは、励起光を良く透過して、ウェル１２ａ内の試料混合物に入射するようにするためである。より好ましくは、第２層１２ｂの表面１２ｂ１には、励起光を拡散してウェル１２ａ内の試料混合液に均一に入射させるための手段として、フロスト処理などが施される。一方、ウェル１２ａが形成される第２層１２ｃを黒色としたのは、複数のウェル１２ａ間を遮光して、各ウェル１２ａ内の試料混合物間の干渉を抑制し、又各ウェル１２からの光を良好に区別して検出できるようにするためである。測定プレート１２は、本例では樹脂製であるが、これに限定されるものではなく、ガラスなどその他の材料で作製されてもよい。 As shown in FIGS. 2 (a) to 2 (c), in this example, the measurement plate 12 has a two-layer structure, and a diameter as a second layer 12c is formed on a transparent acrylic plate as the first layer 12b. It has a structure in which nine black plastic plates with 2 mm holes in 3 rows and 3 columns are pasted together with a waterproof adhesive. In this example, each well 12a has a depth of 3 mm and a capacity of about 10 μL. The reason why the first layer 12b disposed below in the drawing on the side irradiated with the excitation light is transparent is to allow the excitation light to pass well and enter the sample mixture in the well 12a. More preferably, the surface 12b1 of the second layer 12b is subjected to a frost treatment or the like as a means for diffusing the excitation light so as to uniformly enter the sample mixed solution in the well 12a. On the other hand, the second layer 12c in which the wells 12a are formed is black because the plurality of wells 12a are shielded from light to suppress interference between the sample mixtures in the wells 12a, and light from the wells 12a. This is because it is possible to detect and distinguish them well. The measurement plate 12 is made of resin in this example, but is not limited thereto, and may be made of other materials such as glass.
光源１から検出器３に至る光学経路の全体は、遮光手段としての遮光箱１０内に配置されており、測定プレート１２の装着又は取り外しのための開口部（図示せず）が閉じられた状態で、遮光箱１０内は周辺光から実質的に完全に遮断される。 The entire optical path from the light source 1 to the detector 3 is disposed in a light shielding box 10 as a light shielding means, and an opening (not shown) for mounting or removing the measurement plate 12 is closed. Thus, the inside of the light shielding box 10 is substantially completely shielded from ambient light.
斯かる構成の測定装置１００において、光源１からの励起光は、光源レンズ４と励起フィルタ５とを通して複数のウェル１２ａに透過光として照射される。測定プレート１２の複数のウェル１２ａのそれぞれには、分子プローブと検体とを含む試料混合物（サンプル溶液）が収容される。励起光が照射されることによって、各ウェル１２ａ内の試料混合物から発生された蛍光は、波長可変液晶分光フィルタ２とカットフィルタ６とで分光され、レンズ７を通して検出器３で蛍光イメージング画像として検出される。即ち、波長可変液晶分光フィルタ２を通して検出器３によって測定プレート１２の複数のウェル１２ａを同時に撮像する。 In the measuring apparatus 100 having such a configuration, the excitation light from the light source 1 is irradiated as transmitted light to the plurality of wells 12 a through the light source lens 4 and the excitation filter 5. In each of the plurality of wells 12a of the measurement plate 12, a sample mixture (sample solution) containing a molecular probe and a specimen is accommodated. The fluorescence generated from the sample mixture in each well 12a by being irradiated with the excitation light is dispersed by the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 and the cut filter 6, and detected as a fluorescence imaging image by the detector 3 through the lens 7. Is done. That is, a plurality of wells 12 a of the measurement plate 12 are simultaneously imaged by the detector 3 through the tunable liquid crystal spectral filter 2.
この時、波長可変液晶分光フィルタ２を、処理装置１１からの指示によって駆動装置８で制御することで、透過ピーク波長を必要な範囲で変化させる。これにより、検出器３は、測定プレート１２からの蛍光を、波長可変液晶分光フィルタ２を透過した波長毎の画像として検出する。検出器３は、検出結果に係る画像情報信号を、ケーブル９を介して処理装置１１に入力する。 At this time, the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 is controlled by the driving device 8 in accordance with an instruction from the processing device 11 to change the transmission peak wavelength within a necessary range. Thereby, the detector 3 detects the fluorescence from the measurement plate 12 as an image for each wavelength transmitted through the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2. The detector 3 inputs an image information signal related to the detection result to the processing device 11 via the cable 9.
処理装置１１は、波長毎に検出された画像から、ウェル１２ａ毎に波長毎の蛍光強度を計算する。これにより、波長毎の蛍光強度の集合から、ウェル１２ａ毎の蛍光スペクトルデータ得ることが可能になる。 The processing device 11 calculates the fluorescence intensity for each wavelength for each well 12a from the image detected for each wavelength. This makes it possible to obtain fluorescence spectrum data for each well 12a from a set of fluorescence intensities for each wavelength.
この方法によれば、従来困難であった複数の試料保持部からの蛍光の蛍光スペクトルを短時間のうちに一度に取得することが可能である。又、一の又は複数の試料保持部内で複数の分子プローブを用いることにより検体における複数の生体成分又はその機能を同時に短時間に測定することが可能となり、従来の方法と比較し格段にハイスループットな測定を実現することができる。 According to this method, it is possible to acquire fluorescence spectra of fluorescence from a plurality of sample holders, which has been difficult in the past, at once in a short time. In addition, by using multiple molecular probes in one or multiple sample holders, it is possible to simultaneously measure multiple biological components or their functions in a specimen in a short time, which is significantly higher throughput than conventional methods. Measurement can be realized.
ここで、量子ドット蛍光試薬を測定した場合を例にして、測定装置１００による蛍光イメージング手法について更に説明する。量子ドット蛍光試薬は、染色用の蛍光物質として使用することができるものであり、一種類の励起波長で複数の蛍光波長の量子ドット蛍光試薬を励起できる点や、蛍光が安定して持続するなどの利点を有する。ここでは、量子ドット蛍光試薬として、インビトロジェン製のＱｄｏｔ（登録商標）ストレプトアビジン標識シリーズを用いた。又、励起フィルタ５としては、４１０ｎｍ〜４２０ｎｍの光を透過する特性を有する光学フィルタを用いた。又、カットフィルタ６としては、励起光をカットするために、４９０ｎｍより短波長の光を透過しない特性を有する光学フィルタを用いた。又、波長可変液晶分光フィルタ２は、処理装置１１から駆動装置８を通して制御し、１ｎｍステップで透過ピーク波長を４４０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で任意にコントロールできるようにした。 Here, the fluorescence imaging method by the measuring apparatus 100 will be further described by taking as an example the case of measuring the quantum dot fluorescent reagent. Quantum dot fluorescent reagents can be used as fluorescent materials for staining, and can excite quantum dot fluorescent reagents with multiple fluorescent wavelengths with one type of excitation wavelength, and fluorescence can be sustained stably. Has the advantage of Here, Qdot (registered trademark) streptavidin labeled series manufactured by Invitrogen was used as the quantum dot fluorescent reagent. As the excitation filter 5, an optical filter having a characteristic of transmitting light of 410 nm to 420 nm was used. Further, as the cut filter 6, an optical filter having a characteristic that does not transmit light having a wavelength shorter than 490 nm is used in order to cut the excitation light. The tunable liquid crystal spectral filter 2 is controlled from the processing device 11 through the driving device 8 so that the transmission peak wavelength can be arbitrarily controlled in the range of 440 nm to 700 nm in 1 nm steps.
図５は、測定装置１００で撮像された測定プレート１２の画像の一例を示しているが、図示の通りに９個のウェルのそれぞれをウェル（１）〜ウェル（９）としたとき、ウェル（１）〜ウェル（６）には、５２５ｎｍ〜７０３ｎｍの６種類の量子ドット蛍光試薬を単独で入れた。又、ウェル（７）、ウェル（８）、ウェル（９）にはそれぞれ、２種類、３種類、４種類の量子ドット蛍光試薬を入れた。各ウェル（１）〜（９）に入れた量子ドット蛍光試薬の種類（蛍光ピーク波長）は次の通りである。ウェル（１）：５２５ｎｍ、ウェル（２）：５６５ｎｍ、ウェル（３）：５８５ｎｍ、ウェル（４）：６０５ｎｍ、ウェル（５）：６５５ｎｍ、ウェル（６）：７０３ｎｍ、ウェル（７）：５６５ｎｍ，６５５ｎｍ、ウェル（８）：５２５ｎｍ，５８５ｎｍ，６５５ｎｍ、ウェル（９）：５２５ｎｍ，５６５ｎｍ，６０５ｎｍ，６５５ｎｍ。 FIG. 5 shows an example of an image of the measurement plate 12 imaged by the measurement apparatus 100. As shown in the drawing, when each of the nine wells is defined as well (1) to well (9), the well ( In 1) to well (6), six types of quantum dot fluorescent reagents of 525 nm to 703 nm were put alone. In addition, two types, three types, and four types of quantum dot fluorescent reagents were placed in the well (7), the well (8), and the well (9), respectively. The types (fluorescence peak wavelengths) of the quantum dot fluorescent reagents placed in the wells (1) to (9) are as follows. Well (1): 525 nm, Well (2): 565 nm, Well (3): 585 nm, Well (4): 605 nm, Well (5): 655 nm, Well (6): 703 nm, Well (7): 565 nm, 655 nm Well (8): 525 nm, 585 nm, 655 nm, Well (9): 525 nm, 565 nm, 605 nm, 655 nm.
一例として、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍ〜７００ｎｍに１０ｎｍステップで変化させて、各ウェル（１）〜（９）からの蛍光を撮像する。又、撮像は、２秒の露光時間で行い、５ｎｍステップで画像データを処理装置１１に記憶し、各ウェル（１）〜（９）に対応する平均輝度（平均蛍光強度）を求めた。 As an example, the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter 2 is changed from 500 nm to 700 nm in 10 nm steps, and fluorescence from each well (1) to (9) is imaged. Imaging was performed with an exposure time of 2 seconds, and image data was stored in the processing device 11 in 5 nm steps, and the average luminance (average fluorescence intensity) corresponding to each well (1) to (9) was obtained.
即ち、処理装置１１は、各ウェル１２ａに対応した蛍光画像の平均輝度を計算するために、各ウェル１２ａの領域を同じ面積の円で領域指定し、円内の平均輝度を計算する。更に説明すると、図６は、処理装置１１の制御態様を説明するための概略制御ブロック図である。又、図７は、処理装置１１による各ウェルからの蛍光の平均輝度の計算方法の概略を示すフローチャートである。先ず、処理装置１１の制御部１１ａは、駆動装置８に制御信号を送り、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を設定し、検出器３から複数のウェル１２ａを同時に撮像した画像データを受信して、処理装置１１に設けられた記憶手段としてのＲＡＭ１１ｂに記憶する（Ｓ１０１）。次いで、制御部１１ａは、各ウェル１２ａの領域と同じ面積の円である平均輝度を計算する領域を、本例では９ヶ所指定する（Ｓ１０２）。次いで、制御部１１ａは、例えば先ずウェル（１）について、指定領域内の検出器３により撮像された画像データの各ドット（画素）の輝度値を積算し（Ｓ１０３）、ドット数で除算することで平均輝度を求める（Ｓ１０４）。Ｓ１０３及びＳ１０４の処理を全ての指定領域について行い、全ての指定領域について平均輝度を求める（Ｓ１０５）。そして、制御部１１ａは、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を所定のステップ幅で変更して、Ｓ１０１〜Ｓ１０５の操作を所定の透過波長範囲にわたり繰り返す（Ｓ１０６）。 That is, in order to calculate the average luminance of the fluorescence image corresponding to each well 12a, the processing device 11 designates the region of each well 12a with a circle having the same area, and calculates the average luminance in the circle. More specifically, FIG. 6 is a schematic control block diagram for explaining a control mode of the processing apparatus 11. FIG. 7 is a flowchart showing an outline of a method for calculating the average luminance of fluorescence from each well by the processing apparatus 11. First, the control unit 11a of the processing device 11 sends a control signal to the driving device 8, sets the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, and receives image data obtained by simultaneously imaging the plurality of wells 12a from the detector 3. And it memorize | stores in RAM11b as a memory | storage means provided in the processing apparatus 11 (S101). Next, the control unit 11a designates nine areas for calculating the average luminance, which is a circle having the same area as the area of each well 12a, in this example (S102). Next, for example, for the well (1), the control unit 11a first integrates the luminance values of the dots (pixels) of the image data captured by the detector 3 in the designated area (S103), and divides by the number of dots. In step S104, the average luminance is obtained. The processes of S103 and S104 are performed for all the designated areas, and the average luminance is obtained for all the designated areas (S105). Then, the control unit 11a changes the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 with a predetermined step width, and repeats the operations of S101 to S105 over a predetermined transmission wavelength range (S106).
処理装置１１の制御部１１ａは、処理装置１１に設けられた記憶手段としてのＲＯＭ１１ｃ内に予め格納されているプログラム、データに従って各種の処理を行う。 The control unit 11a of the processing device 11 performs various processes according to programs and data stored in advance in a ROM 11c serving as storage means provided in the processing device 11.
尚、図７のフローチャートでは、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を変更して蛍光画像を撮像するたびにウェル１２ａ毎の平均輝度を計算するものとして示しているが、全ての画像を取得後、まとめて計算することも可能である。 In the flowchart of FIG. 7, the average luminance for each well 12a is calculated every time the fluorescence image is captured by changing the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, but all images are acquired. Later, it is also possible to calculate all together.
上述のようにして、ウェル１２ａ毎に波長毎の平均輝度（平均蛍光強度）のデータを取得することが可能である。尚、本明細書では、測定装置１００において、上述のようにして求められた波長毎の平均輝度（平均蛍光強度）を「蛍光強度」とも呼ぶ。そして、このようにして取得された各ウェル１２ａの位置の波長毎の蛍光強度のデータから、各ウェル１２ａの位置の蛍光スペクトルを求めることができる。 As described above, it is possible to acquire data of average luminance (average fluorescence intensity) for each wavelength for each well 12a. In the present specification, the average luminance (average fluorescence intensity) for each wavelength obtained as described above in the measuring apparatus 100 is also referred to as “fluorescence intensity”. And the fluorescence spectrum of the position of each well 12a can be calculated | required from the fluorescence intensity data for every wavelength of the position of each well 12a acquired in this way.
図８は、ウェル（１）〜ウェル（６）の蛍光スペクトルを示す。蛍光強度は、各ウェルの蛍光ピーク波長における蛍光強度を１００とした相対強度で示した。ウェル（１）〜ウェル（６）にはそれぞれ、５２５ｎｍ、５６５ｎｍ、５８５ｎｍ、６０５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０３ｎｍの蛍光ピーク波長を有する量子ドット蛍光試薬が入っており、各ウェルの波長毎の蛍光強度は、各量子ドット蛍光試薬の蛍光ピーク波長とほぼ一致した結果が得られた。 FIG. 8 shows the fluorescence spectra of well (1) to well (6). The fluorescence intensity was shown as a relative intensity with the fluorescence intensity at the fluorescence peak wavelength of each well as 100. Well (1) to well (6) contain quantum dot fluorescent reagents having fluorescence peak wavelengths of 525 nm, 565 nm, 585 nm, 605 nm, 655 nm, and 703 nm, respectively. A result almost identical to the fluorescence peak wavelength of the quantum dot fluorescent reagent was obtained.
図９は、ウェル（７）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（７）には、５６５ｎｍと６５５ｎｍの蛍光ピーク波長を有する量子ドット蛍光試薬が入っており、５６５ｎｍと６５５ｎｍ付近に２個の蛍光ピークを有するスペクトルが得られた。この結果は、測定した量子ドット蛍光試薬の蛍光パターンと一致した結果であった。 FIG. 9 shows the fluorescence spectrum of the well (7). Well (7) contains quantum dot fluorescent reagents having fluorescence peak wavelengths of 565 nm and 655 nm, and spectra having two fluorescence peaks near 565 nm and 655 nm were obtained. This result was consistent with the measured fluorescence pattern of the quantum dot fluorescent reagent.
同様に、図１０は、ウェル（８）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（８）には５２５ｎｍ、５８５ｎｍ及び６５５ｎｍの蛍光ピークを有する３種類の量子ドット蛍光試薬が入っており、それぞれに対応した波長に蛍光ピークが観測された。又、図１１は、ウェル（９）の蛍光スペクトルを示す。ウェル（９）には５２５ｎｍ、５６５ｎｍ、６０５ｎｍ及び６５５ｎｍの蛍光ピークを有する４種類の量子ドット蛍光試薬が入っており、それぞれに対応した蛍光ピークが観測された。 Similarly, FIG. 10 shows the fluorescence spectrum of well (8). Well (8) contained three types of quantum dot fluorescent reagents having fluorescence peaks of 525 nm, 585 nm, and 655 nm, and fluorescence peaks were observed at wavelengths corresponding to the respective quantum dots. FIG. 11 shows the fluorescence spectrum of the well (9). Well (9) contained four types of quantum dot fluorescent reagents having fluorescence peaks of 525 nm, 565 nm, 605 nm, and 655 nm, and fluorescence peaks corresponding to each were observed.
このように波長可変液晶分光フィルタ２を用いた測定装置１００により、複数の試料保持部からの蛍光の蛍光スペクトルを、波長毎に取得される２次元の画像として測定することが可能である。そして、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を変更して、該透過ピーク波長毎の検出器３により検出された光の強度を試料保持部毎に求め、試料保持部毎に、分子プローブに対応する特定の透過ピーク波長における光の強度に基づいて、その試料保持部に保持された試料混合物中の検体における分子プローブが対象とする生体成分又はその機能を測定することができる。 Thus, the measurement apparatus 100 using the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 can measure the fluorescence spectra of the fluorescence from the plurality of sample holders as a two-dimensional image acquired for each wavelength. Then, the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 is changed, and the intensity of the light detected by the detector 3 for each transmission peak wavelength is obtained for each sample holding unit. Based on the intensity of light at the corresponding specific transmission peak wavelength, the biological component targeted by the molecular probe in the sample in the sample mixture held in the sample holding unit or the function thereof can be measured.
この方法によれば、同じ試料保持部に複数種類の蛍光試薬が混在する場合でも、蛍光スペクトルを測定することで、蛍光試薬の分布を調べることができる。従って、複数の試料保持部のうち１個以上に保持された試料混合物に複数種類の分子プローブが含まれている場合に、該１個以上の試料保持部に保持された試料混合物中の検体について、複数種類の分子プローブのそれぞれが対象とする複数種類の生体成分又はその機能を測定することができる。又、複数の試料保持部においてそれぞれ異なる種類の蛍光試薬が用いられる場合でも、一度にそれぞれの試料保持部における蛍光試薬の分布を調べることができる。従って、複数の試料保持部のうち２個以上に保持された試料混合物に含まれる分子プローブ間の種類が異なっている場合に、該２個以上の試料保持部に保持された試料混合物中の検体間で、複数種類の分子プローブのそれぞれが対象とする異なる種類の生体成分又はその機能を測定することができる。 According to this method, even when a plurality of types of fluorescent reagents coexist in the same sample holder, the distribution of the fluorescent reagents can be examined by measuring the fluorescence spectrum. Therefore, when a plurality of types of molecular probes are included in the sample mixture held in one or more of the plurality of sample holders, the specimen in the sample mixture held in the one or more sample holders A plurality of types of biological components targeted by each of a plurality of types of molecular probes or their functions can be measured. Even when different types of fluorescent reagents are used in the plurality of sample holders, the distribution of the fluorescent reagent in each sample holder can be examined at a time. Therefore, when the types of the molecular probes contained in the sample mixture held in two or more of the plurality of sample holders are different, the specimen in the sample mixture held in the two or more sample holders In the meantime, it is possible to measure different types of biological components or functions of each of the plurality of types of molecular probes.
尚、測定装置１００において、光源１としてはＬＥＤ、ハロゲン、クリプトン、メタルハライド、水銀、キセノン、レーザーなどを使用できる。 In the measuring apparatus 100, the light source 1 can be an LED, halogen, krypton, metal halide, mercury, xenon, laser, or the like.
又、本例では、検出器３としてＣＣＤカメラを使用しているが、検出器３としては、ＣＭＯＳカメラ、イメージインテンシファイアなどの、その他の光検出器（光電変換素子）を使用することも可能である。 In this example, a CCD camera is used as the detector 3. However, as the detector 3, other photodetectors (photoelectric conversion elements) such as a CMOS camera and an image intensifier may be used. Is possible.
又、光源１から検出器３に至る光学経路において、例えば、カットフィルタ６は、図１に示すように波長可変液晶分光フィルタ２よりも検出器３側（本例では波長可変液晶分光フィルタ２とレンズ７との間）に配置してもよいし、図２０に示すように波長可変液晶分光フィルタ２よりも測定プレート１２側に配置してもよい。即ち、光源１から検出器３に至る光学経路における各光学部品は、本例と実質的に同じ機能を達成できるのであれば、その配列順序等は適宜に変更可能である。 In the optical path from the light source 1 to the detector 3, for example, the cut filter 6 is located on the detector 3 side (in this example, the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 and the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2) as shown in FIG. (Between the lens 7), or may be arranged closer to the measurement plate 12 than the tunable liquid crystal spectral filter 2 as shown in FIG. That is, as long as each optical component in the optical path from the light source 1 to the detector 3 can achieve substantially the same function as this example, the arrangement order thereof can be changed as appropriate.
又、励起光は、上述のように透過光として照射する方法、落射光として上部又は斜めから照射する方法、エバネッセント光として照射（エバネッセント照明）する方法、又はこれらを組み合わせた方法によって照射することができる。 In addition, the excitation light may be irradiated by a method of irradiating as transmitted light as described above, a method of irradiating from above or obliquely as incident light, a method of irradiating as evanescent light (evanescent illumination), or a combination of these. it can.
例えば、図２１は、測定プレート１２に、光源１からの励起光を斜めからの落射光として照射し、生じた蛍光をテレセントリックレンズ７を通し、波長可変液晶分光フィルタ２で分光して、高感度冷却ＣＣＤカメラとされる検出器３で撮像する装置の例を示す。この場合には、ウェル１２ａ内の試料混合物に励起光を透過光として照射する必要がないため、測定プレート１２の底面（例えば、図２に示すような層構成の場合は第１層１２ｂの表面１２ｂ１）は透明である必要はない。又、光源１は斜めから光を照射しているので、分子プローブに均一に励起光を照射するため、測定プレート１２から検出器３に至る直線に対して左右の両側に光源を設けた構造になっている。又、図２１の例では、試料混合物から発された蛍光を平行光として波長可変液晶分光フィルタ２を透過させるために、測定プレート１２から検出器３に至る光学経路において、波長可変液晶分光フィルタ２よりも前（即ち、測定プレート１２側）に、テレセントリックレンズ７を設置している。 For example, FIG. 21 shows that the measurement plate 12 is irradiated with excitation light from the light source 1 as incident light from an oblique direction, and the generated fluorescence is passed through the telecentric lens 7 and dispersed by the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 to obtain high sensitivity. An example of an apparatus that takes an image with a detector 3 that is a cooled CCD camera will be described. In this case, since it is not necessary to irradiate the sample mixture in the well 12a with transmitted light as transmitted light, the bottom surface of the measurement plate 12 (for example, the surface of the first layer 12b in the case of the layer configuration shown in FIG. 2) 12b1) need not be transparent. Further, since the light source 1 irradiates light obliquely, the light source 1 is provided on both the left and right sides with respect to the straight line from the measurement plate 12 to the detector 3 in order to uniformly irradiate the molecular probe with excitation light. It has become. In the example of FIG. 21, in order to transmit the fluorescence emitted from the sample mixture as parallel light and transmit the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 in the optical path from the measurement plate 12 to the detector 3. The telecentric lens 7 is installed in front of (ie, on the measurement plate 12 side).
又、エバネッセント照明を利用する場合は、例えば、次のような構成とする。即ち、図２に示すような層構成の測定プレート１２の第１層１２ｂをＢＫ−７のようなガラス材料で作製する。そして、その測定プレート１２の底面１２ｂ１側から斜めに、全ウェル１２ａに光が当たるように、又第１層１２ｂの上面（第２層１２ｃ側の面）で光が全反射するような角度で、励起光を照射する。 When evanescent illumination is used, for example, the following configuration is used. That is, the first layer 12b of the measurement plate 12 having a layer structure as shown in FIG. 2 is made of a glass material such as BK-7. The angle is such that light strikes all the wells 12a obliquely from the bottom surface 12b1 side of the measurement plate 12 and the light is totally reflected by the upper surface of the first layer 12b (surface on the second layer 12c side). Irradiate excitation light.
又、測定プレート１２は本例の構成に限定されるものではなく、任意にウェル１２ａの径などの大きさを変更したり、ウェル１２ａの数を変更したりすることで、より多くの検体又はより少ない検体を測定できるようにしてもよい。 In addition, the measurement plate 12 is not limited to the configuration of this example, and by arbitrarily changing the size of the well 12a or the like, or changing the number of the wells 12a, more samples or A smaller number of specimens may be measured.
更に、本例では、複数の試料保持部を有する試料容器は、測定装置の本体に対して着脱可能に装着されるものであるが、試料容器は測定装置に固定されていてもよい。 Furthermore, in this example, the sample container having a plurality of sample holders is detachably attached to the main body of the measurement apparatus, but the sample container may be fixed to the measurement apparatus.
次に、本発明に従って測定し得る生体成分又はその機能について説明する。 Next, biological components that can be measured according to the present invention or their functions will be described.
「生体成分」とは、生体内に存在する全ての成分のことであり、より詳細には、生体内おいて機能的又は構造的な役割を担って存在する全ての成分である、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、又はそれらの誘導体及び複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）、各種酵素（例えば、核酸分解酵素、核酸修飾酵素、核酸合成酵素、タンパク質分解酵素、タンパク質修飾酵素、糖鎖分解酵素、糖ヌクレオチド合成酵素又は糖転移酵素）、酵素反応の基質（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖など）、水素イオン、金属イオン、その他の生体内物質が含まれる。 “Biological component” refers to all components present in the living body, and more specifically, all components present in a functional or structural role in the living body, for example, nucleic acids. , Proteins, peptides, amino acids, coenzymes, sugars, sugar chains, or derivatives and complexes thereof (eg, glycoproteins, glycolipids, etc.), various enzymes (eg, nucleolytic enzymes, nucleic acid modifying enzymes, nucleic acid synthases, Proteolytic enzyme, protein modifying enzyme, sugar chain degrading enzyme, sugar nucleotide synthase or glycosyltransferase), enzyme reaction substrate (eg, protein, nucleic acid, lipid, sugar, etc.), hydrogen ion, metal ion, other in vivo Contains substances.
「生体成分の機能」とは、生体成分に関わる全ての機能のことであり、より詳細には、生体成分同士の化学反応、その他の生体成分同士の相互作用を含む全ての生体反応が含まれる。生体成分の機能には、生体反応以外にも、ある生体成分の作用により関連する他のある生体成分の量が変わる（例えば、カルシウムイオン濃度変化、プロトンの濃度変化であるｐＨ変化など）などの生体内状態変化を引き起こす全ての機能が含まれる。生体成分の機能の典型例としては、タンパク質、核酸、脂質、糖質などに対する分解、転移、付加、合成を行う酵素反応や、生体内物質の濃度変化、細胞内局在変化などが挙げられる。 “Functions of biological components” are all functions related to biological components, and more specifically, include all biological reactions including chemical reactions between biological components and interactions between other biological components. . In addition to the biological reaction, the function of the biological component changes the amount of other related biological component due to the action of a certain biological component (for example, calcium ion concentration change, proton concentration change pH change, etc.) All functions that cause in vivo state changes are included. Typical examples of the functions of biological components include enzyme reactions for degrading, transferring, adding, and synthesizing proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates, etc., changes in the concentration of biological substances, and changes in intracellular localization.
「分子プローブ」は、測定対象となる生体成分又はその機能の存否若しくは多寡（より詳細には、生体成分の有無若しくは濃度又は生体成分の機能（活性）の有無若しくは大小：これを以下単に「生体成分の活性又は濃度」ともいう）の状態の相違に応じて、蛍光・発光の有無又は強度の状態が相違し、斯かる蛍光・発光の有無又は強度の相違から上記測定対象の状態の相違を測定することを可能とする分子である。分子プローブは、１種類の分子で当該分子プローブとしての機能を発揮するものであってもよいし、複数種類の分子が協働して当該分子プローブとしての機能を発揮するものであってもよい。 “Molecular probe” refers to the presence or absence of the biological component to be measured or its function (more specifically, the presence or absence or concentration of the biological component or the presence or absence or magnitude of the function (activity) of the biological component: Depending on the difference in the state of activity or concentration of the component), the presence / absence or intensity of fluorescence / luminescence is different, and the difference in the state of the measurement object is determined from the presence / absence or intensity of fluorescence / luminescence. A molecule that can be measured. The molecular probe may be one that exhibits the function as the molecular probe with one type of molecule, or may be one in which a plurality of types of molecules cooperate to exhibit the function as the molecular probe. .
分子プローブとしては、代表的には、蛍光分子間（蛍光タンパク質間、有機蛍光分子間、蛍光タンパク質と有機蛍光分子間など）、又は蛍光分子（蛍光タンパク質、有機蛍光分子など）と量子ドット間のＦＲＥＴを利用した分子プローブが挙げられる。この場合、上記蛍光分子（蛍光タンパク質、有機蛍光分子など）や量子ドットなどの蛍光物質は、測定対象となる生体成分又はその相互作用パートナー（測定対象となる生体成分の機能により存否若しくは多寡の状態が変化する関連生体成分と相互作用をするものを含む）に結合される。又、この場合、ＦＲＥＴを生起する一対の蛍光物質（蛍光分子、量子ドットなど）は、当初、１種類の分子上に全てが結合されていても、複数種類の分子上に分けて結合されていてもよい。 As molecular probes, typically, between fluorescent molecules (between fluorescent proteins, between organic fluorescent molecules, between fluorescent proteins and organic fluorescent molecules, etc.), or between fluorescent molecules (fluorescent proteins, organic fluorescent molecules, etc.) and quantum dots Examples include molecular probes using FRET. In this case, fluorescent substances such as fluorescent molecules (fluorescent proteins, organic fluorescent molecules, etc.) and quantum dots are present in the presence or absence of a biological component to be measured or its interaction partner (depending on the function of the biological component to be measured). Including those that interact with related biological components that change. Also, in this case, a pair of fluorescent substances (fluorescent molecules, quantum dots, etc.) that cause FRET are initially bonded separately on a plurality of types of molecules even if they are all combined on one type of molecule. May be.
又、分子プローブは、液体中などの流動状態においても、又は基盤などの支持体に固定した状態においても、使用することができる。例えば、分子プローブを測定プレートのウェルに固定する方法は、利用可能な任意の方法を用いることができる。 Further, the molecular probe can be used even in a fluid state such as in a liquid or in a state where it is fixed to a support such as a base. For example, any available method can be used as the method for fixing the molecular probe to the well of the measurement plate.
「蛍光物質」としては、適宜に任意のもの利用可能であるが、例えば、ＦＲＥＴを利用した分子プローブに使用する第１の蛍光物質としては、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰを代表とする蛍光タンパク質とその変異体、量子ドット蛍光試薬などが好適に利用可能である。又、特に、ＦＲＥＴを利用する場合に、上記の如き第１の蛍光物質と対をなす第２の蛍光物質としては、ＦＲＥＴが起こるような蛍光物質であれば如何なるものでも利用可能であるが、Ａｌｅｘａ ｄｙｅ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ、ｄｙｅ、ｑｕｅｎｃｈｅｒなどが好適に利用可能である。 Any “fluorescent substance” can be used as appropriate. For example, BFP, CFP, GFP, YFP, and RFP are representative examples of the first fluorescent substance used in a molecular probe using FRET. Fluorescent proteins and mutants thereof, quantum dot fluorescent reagents and the like can be suitably used. In particular, when FRET is used, any second fluorescent material that forms a pair with the first fluorescent material as described above can be used as long as it is a fluorescent material that causes FRET. Alexa dye, BODIPY, Cy, dye, quencher, etc. can be suitably used.
ＦＲＥＴを利用した分子プローブによって、典型的には、生体成分の機能としての生体反応、例えば、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖などの結合や解離反応、或いは、酵素反応を測定することができる。 Molecular probes using FRET typically perform biological reactions as a function of biological components, for example, protein-to-protein, protein-to-nucleic acid, nucleic acid-to-nucleic acid, protein-to-sugar chain binding or dissociation reaction, or enzyme reaction. Can be measured.
例えば、第１、第２の蛍光物質（ドナー及びアクセプター）を有する分子プローブにタンパク質、核酸、糖鎖などの生体成分が含まれる場合に、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素、糖鎖分解酵素で処理することでその生体成分が切断され、ＦＲＥＴが解消されることを検出することによって、酵素活性を測定することができる。 For example, when the molecular probe having the first and second fluorescent substances (donor and acceptor) contains biological components such as protein, nucleic acid, sugar chain, etc., it is treated with proteolytic enzyme, nucleolytic enzyme, sugar chain decomposing enzyme Thus, the enzyme activity can be measured by detecting that the biological component is cleaved and FRET is eliminated.
又、酵素が転移酵素である場合には、分子プローブとして、第１の蛍光物質に第２の蛍光物質で標識されていない基質が結合された第１の分子プローブと、第２の蛍光物質で標識された基質である第２の分子プローブとから成るものを用い、第２の分子プローブの基質が転移酵素によって転移された結果生じるＦＲＥＴを検出することによって、酵素活性を測定することができる。 Further, when the enzyme is a transferase, the first fluorescent probe in which the substrate not labeled with the second fluorescent substance is bound to the first fluorescent substance and the second fluorescent substance are used as the molecular probe. The enzyme activity can be measured by detecting FRET resulting from the transfer of the substrate of the second molecular probe by the transferase using a second molecular probe that is a labeled substrate.
このような分子プローブに含まれる生体成分としてのペプチドは、生体内においてそれ自体機能しているものでも、タンパク質の機能領域等に相当するペプチド部分でもよい。又、このペプチドは、特定のタンパク質の機能ドメイン又は機能領域に相当する配列など、タンパク質の一部であってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、タンパク質分解酵素の認識配列、タンパク質リン酸化酵素の認識配列、糖転移酵素の認識配列、核酸結合配列など、ある生体成分によって認識され、該生体成分との相互作用が期待されるものであって、その結果としてＦＲＥＴに影響を及ぼすものであれば任意のものが利用可能である。 The peptide as a biological component contained in such a molecular probe may be a functional part in vivo or a peptide part corresponding to a functional region of a protein. The peptide may also be part of a protein, such as a sequence corresponding to a functional domain or functional region of a specific protein. Examples of such a peptide include a recognition sequence for a proteolytic enzyme, a recognition sequence for a protein kinase, a recognition sequence for a glycosyltransferase, a nucleic acid binding sequence, and the like, and interaction with the biological component. Any one can be used as long as it is expected to affect FRET as a result.
又、タンパク質同士、タンパク質と核酸、核酸同士、タンパク質と糖鎖などの結合反応に関しては、一方の生体成分を第２の蛍光物質で標識せずに第１の蛍光物質に結合させた分子プローブを調製し、この分子プローブと結合パートナーとなる第２の蛍光物質で標識した生体成分を接触させ、ＦＲＥＴの低い状態から高い状態への変化を測定することにより、両生体分子の結合又は相互作用の存在を判断することができる。 In addition, for the binding reaction between proteins, between protein and nucleic acid, between nucleic acids, and between protein and sugar chain, a molecular probe in which one biological component is bound to the first fluorescent substance without being labeled with the second fluorescent substance. The molecular probe and a biological component labeled with a second fluorescent substance serving as a binding partner are brought into contact with each other, and the change in the FRET state from a low state to a high state is measured to thereby determine the binding or interaction between both biomolecules. Existence can be determined.
又、例えば、生体成分との結合（金属イオンをキレートするなども含め）によりその蛍光特性が変化する環境依存型蛍光色素を適切なスペーサー分子等を用いて量子ドットなどの蛍光物質に結合させた分子プローブを用いて、該生体成分の濃度変化をＦＲＥＴ変化検出法に適応することも可能である。更に、例えば、量子ドットなどの第１の蛍光物質と、第２の蛍光物質としてのｐＨ感受性の蛍光色素とを結合した分子プローブを用いて、ｐＨに応じた蛍光スペクトルの変化により、生体成分又はその機能としてｐＨを測定することができる。 In addition, for example, an environment-dependent fluorescent dye whose fluorescence characteristics change by binding to a biological component (including chelating metal ions) is bonded to a fluorescent substance such as a quantum dot using an appropriate spacer molecule. It is also possible to adapt the concentration change of the biological component to the FRET change detection method using a molecular probe. Furthermore, for example, by using a molecular probe in which a first fluorescent substance such as a quantum dot and a pH-sensitive fluorescent dye as a second fluorescent substance are combined, a biological component or The pH can be measured as the function.
尚、分子プローブは、ＦＲＥＴを利用せずに、単独の蛍光物質（蛍光分子、量子ドットなど）を利用したものであってもよく、この場合も、該蛍光物質は、測定対象となる生体成分又はその相互作用パートナーに結合される。例えば、抗体に蛍光物質を標識したものなどが利用可能である。 In addition, the molecular probe may use a single fluorescent substance (fluorescent molecule, quantum dot, etc.) without using FRET. In this case, the fluorescent substance is a biological component to be measured. Or bound to its interaction partner. For example, an antibody labeled with a fluorescent substance can be used.
一方、分子プローブは、蛍光物質を利用せずに、発光物質を利用したものであってもよい。一例として、蛍ルシフェラーゼ標識プローブを分子プローブとした、ＤＮＡの測定が挙げられる。この場合、測定装置１００において、励起光を照射するための光源１は設けなくてよい。 On the other hand, the molecular probe may use a luminescent substance instead of using a fluorescent substance. An example is DNA measurement using a firefly luciferase-labeled probe as a molecular probe. In this case, the measurement apparatus 100 does not have to provide the light source 1 for irradiating the excitation light.
ここで、測定装置１００を用いて試料混合物から発された光を検出した結果に基づいて生体成分又はその機能を測定する方法は、大別して２種類のパターンに分類できる。 Here, the method of measuring the biological component or its function based on the result of detecting the light emitted from the sample mixture using the measuring apparatus 100 can be broadly classified into two types of patterns.
第１のパターンは、検出された複数（典型的には２個）の特定波長における光強度の比率が、生体成分の活性又は濃度に相関するパターンである。図１２は、第１のパターンの一例として、ＦＲＥＴを利用する分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。この例では、ドナー（第１の蛍光物質）のピーク１と、アクセプター（第２の蛍光物質）のピーク２との２個の蛍光ピークが観測される。そして、測定対象となる生体成分の活性又は濃度に応じて、観測されるピーク１とピーク２の平均輝度（蛍光強度）が変化する。図１２中に実線、破線、２点鎖線で示す３個の蛍光スペクトルは、生体成分の活性又は濃度を３段階に変化させた場合のものである。 The first pattern is a pattern in which the ratio of the detected light intensity at a plurality of (typically two) specific wavelengths correlates with the activity or concentration of the biological component. FIG. 12 shows an example of a fluorescence spectrum when a molecular probe using FRET is used as an example of the first pattern. In this example, two fluorescence peaks are observed, peak 1 of the donor (first fluorescent material) and peak 2 of the acceptor (second fluorescent material). And the average brightness | luminance (fluorescence intensity) of the observed peak 1 and the peak 2 changes according to the activity or the density | concentration of the biological component used as a measuring object. The three fluorescence spectra indicated by the solid line, the broken line, and the two-dot chain line in FIG. 12 are obtained when the activity or concentration of the biological component is changed in three stages.
この場合、次のようにして、生体成分又はその機能を測定することができる。 In this case, the biological component or its function can be measured as follows.
先ず、図１３のフローチャートに示すように、特定の分子プローブに関し、複数の特定波長の光強度比と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求める。より具体的には、先ず、特定の分子プローブを含む所望の測定系において、測定対象となる生体成分の活性又は濃度を所望の範囲内の適切な値に設定し、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したのと同様にして求める（Ｓ２０１）。次いで、得られた波長と平均輝度との関係から、ピーク１とピーク２の平均輝度をそれぞれ求める（Ｓ２０２）。次いで、ピーク２の平均輝度をピーク１の平均輝度で除算してピーク比率を求める（Ｓ２０３）。生体成分の活性又は濃度を所望の範囲で変化させて、Ｓ２０１〜Ｓ２０３の処理を繰り返し、所望の数のピーク比率データを得る（Ｓ２０４）。そして、得られた所望の数のピーク比率データから、相関式やテーブルデータとして、生体成分の活性又は濃度とピーク比率との関係を求める（Ｓ２０５）。この関係は、測定装置１００において、処理装置１１の制御部１１ａが演算制御することによって求めることができ、ＲＯＭ１１ｃに記憶させておくことができる。 First, as shown in the flowchart of FIG. 13, regarding the specific molecular probe, the relationship between the light intensity ratio of a plurality of specific wavelengths and the activity or concentration of the biological component is obtained in advance. More specifically, first, in a desired measurement system including a specific molecular probe, the activity or concentration of the biological component to be measured is set to an appropriate value within the desired range, and the wavelength in the desired wavelength range is set. The relationship (fluorescence spectrum) with the average luminance is obtained in the same manner as described with reference to FIG. 7 (S201). Next, the average luminance of peak 1 and peak 2 is obtained from the relationship between the obtained wavelength and average luminance (S202). Next, a peak ratio is obtained by dividing the average luminance of peak 2 by the average luminance of peak 1 (S203). The biological component activity or concentration is changed within a desired range, and the processing of S201 to S203 is repeated to obtain a desired number of peak ratio data (S204). Then, from the desired number of peak ratio data obtained, the relationship between the activity or concentration of the biological component and the peak ratio is obtained as a correlation equation or table data (S205). This relationship can be obtained by the arithmetic control of the control unit 11a of the processing device 11 in the measuring device 100, and can be stored in the ROM 11c.
次に、検体の測定においては、図１４のフローチャートに示すように、予め求められた関係と、検体に関して測定された複数の特定波長の光強度比との比較結果に基づいて、検体における生体成分又はその機能を測定する。より具体的には、先ず、特定の分子プローブと検体とを含む試料混合物について、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したようにして求める（Ｓ３０１）。次いで、処理装置１１の制御部１１ａは、得られた波長と平均輝度との関係から、ピーク１とピーク２の平均輝度をそれぞれ求める（Ｓ３０２）。次いで、制御部１１ａは、ピーク２の平均輝度をピーク１の平均輝度で除算してピーク比率を求める（Ｓ３０３）。そして、制御部１１ａは、予め求められてＲＯＭ１１ｂに記憶されている関係と、検体について測定されたピーク比率とを比較することによって、当該検体における測定対象となる生体成分の活性又は濃度を求める（Ｓ３０４）。 Next, in the measurement of the specimen, as shown in the flowchart of FIG. 14, the biological component in the specimen is based on the comparison result between the relationship obtained in advance and the light intensity ratios of a plurality of specific wavelengths measured for the specimen. Or measure its function. More specifically, first, for a sample mixture including a specific molecular probe and a specimen, the relationship between the wavelength and the average luminance (fluorescence spectrum) in a desired wavelength range is as described with reference to FIG. Obtain (S301). Next, the control unit 11a of the processing device 11 obtains the average luminance of peak 1 and peak 2 from the relationship between the obtained wavelength and the average luminance (S302). Next, the control unit 11a calculates the peak ratio by dividing the average luminance of peak 2 by the average luminance of peak 1 (S303). Then, the control unit 11a determines the activity or concentration of the biological component to be measured in the sample by comparing the relationship obtained in advance and stored in the ROM 11b with the peak ratio measured for the sample ( S304).
尚、図１３及び図１４の例では、ピーク比率自体と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めているが、ピーク比率の変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めてもよい。この場合、所定の期間でのピーク比率の変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求めておき、検体についても同じ所定期間でのピーク比率の変化量を測定し、予め求められた関係と比較することによって、検体における生体成分の活性又は濃度を求めることができる。このように変化量から生体成分の活性又は濃度を測定する場合は、一定間隔をあけて複数回（例えば２回）の測定を行い、その複数回の測定値間における変化量と、予め求められた関係とを比較すればよい。該一定間隔の間は、測定プレート１２は、測定装置１００の内部又は外部のいずれにあってもよい。又、複数回の測定における各回の測定値は、処理装置１１のＲＡＭ１１ｂに記憶しておき、所望の数の測定値が得られたときに、制御部１１ａによって生体成分の活性又は濃度を計算するようにすることができる。 In the examples of FIGS. 13 and 14, the activity or concentration of the biological component is obtained from the relationship between the peak ratio itself and the activity or concentration of the biological component, but the amount of change in the peak ratio and the activity of the biological component are determined. Alternatively, the activity or concentration of the biological component may be obtained from the relationship with the concentration. In this case, the relationship between the amount of change in the peak ratio in a predetermined period and the activity or concentration of the biological component is obtained in advance, and the amount of change in the peak ratio in the same predetermined period is also measured for the specimen. By comparing with the relationship, the activity or concentration of the biological component in the specimen can be determined. In this way, when measuring the activity or concentration of a biological component from the amount of change, the measurement is performed a plurality of times (for example, twice) with a predetermined interval, and the amount of change between the measured values is obtained in advance. Compare these relationships. During the fixed interval, the measurement plate 12 may be either inside or outside the measurement apparatus 100. Further, each time the measurement values at the plurality of times of measurement may be stored in a RAM 11 b of the processing apparatus 11, when the measured value of the desired number has been obtained, calculate the activity or concentration of the biological component by the control unit 11a To be able to.
又、図１３及び図１４の例では、ピーク１とピーク２とのピーク比率から生体成分の活性又は濃度を計算しているが、得られる蛍光スペクトルが複数の蛍光ピークを有する場合であっても、後述する第２のパターンの場合と同様にして、複数の蛍光ピークのそれぞれ又はいずれか（本例ではピーク１及び／又はピーク２）のピーク高さ又はその変化から、生体成分の活性又は濃度を計算してもよい。 In the examples of FIGS. 13 and 14, the activity or concentration of the biological component is calculated from the peak ratio between peak 1 and peak 2, but even when the obtained fluorescence spectrum has a plurality of fluorescence peaks. In the same manner as in the case of the second pattern described later, the activity or concentration of the biological component is determined from the peak height of each or one of the plurality of fluorescence peaks (peak 1 and / or peak 2 in this example) or its change. May be calculated.
次に、第２のパターンは、検出されたある特定波長における光強度が、生体成分の活性又は濃度に相関するパターンである。図１５は、第２のパターンの一例として、蛍光ピークが１個の分子プローブを用いた場合の蛍光スペクトルの一例を示す。この例では、蛍光ピークは１個だけ観測される。そして、測定対象となる生体成分の活性又は濃度に応じて、観測されるピークの平均輝度（蛍光強度）が変化する。図１５中に実線、破線、２点鎖線で示す３個の蛍光スペクトルは、生体成分の活性又は濃度を３段階に変化させた場合のものである。 Next, the second pattern is a pattern in which the detected light intensity at a specific wavelength correlates with the activity or concentration of the biological component. FIG. 15 shows an example of a fluorescence spectrum when a molecular probe having one fluorescence peak is used as an example of the second pattern. In this example, only one fluorescence peak is observed. Then, the average luminance (fluorescence intensity) of the observed peak changes according to the activity or concentration of the biological component to be measured. In FIG. 15, three fluorescence spectra indicated by a solid line, a broken line, and a two-dot chain line are obtained when the activity or concentration of the biological component is changed in three stages.
この場合、次のようにして、生体成分又はその機能を測定することができる。 In this case, the biological component or its function can be measured as follows.
先ず、図１６のフローチャートに示すように、特定の分子プローブに関し、特定波長の光強度比と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求める。より具体的には、先ず、特定の分子プローブを含む所望の測定系において、測定対象となる生体成分の活性又は濃度を所望の範囲内の適切な値に設定し、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したのと同様にして求める（Ｓ４０１）。次いで、得られた波長と平均輝度との関係から、ピークの平均輝度を求める（Ｓ４０２）。生体成分の活性又は濃度を所望の範囲で変化させて、Ｓ４０１〜Ｓ４０２の処理を繰り返し、所望の数のピークの平均輝度（即ち、ピーク高さ）のデータを得る（Ｓ４０３）。そして、得られた所望の数のピークの平均輝度データから、相関式やテーブルデータとして、生体成分の活性又は濃度とピークの平均輝度との関係を求める（Ｓ４０４）。この関係は、測定装置１００において、処理装置１１の制御部１１ａが演算制御することによって求めることができ、ＲＯＭ１１ｃに記憶させておくことができる。 First, as shown in the flowchart of FIG. 16, regarding a specific molecular probe, the relationship between the light intensity ratio of a specific wavelength and the activity or concentration of a biological component is obtained in advance. More specifically, first, in a desired measurement system including a specific molecular probe, the activity or concentration of the biological component to be measured is set to an appropriate value within the desired range, and the wavelength in the desired wavelength range is set. The relationship (fluorescence spectrum) with the average luminance is obtained in the same manner as described with reference to FIG. 7 (S401). Next, the average luminance of the peak is obtained from the relationship between the obtained wavelength and the average luminance (S402). The process of S401 to S402 is repeated by changing the activity or concentration of the biological component within a desired range, and data on the average luminance (that is, peak height) of a desired number of peaks is obtained (S403). Then, from the obtained average luminance data of the desired number of peaks, the relationship between the activity or concentration of the biological component and the average luminance of the peak is obtained as a correlation equation or table data (S404). This relationship can be obtained by the arithmetic control of the control unit 11a of the processing device 11 in the measuring device 100, and can be stored in the ROM 11c.
次に、検体の測定においては、図１７のフローチャートに示すように、予め求められた関係と、検体に関して測定された特定波長の光強度比との比較結果に基づいて、検体における生体成分又はその機能を測定する。より具体的には、先ず、特定の分子プローブと検体とを含む試料混合物について、所望の波長範囲における波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を、図７を参照して説明したようにして求める（Ｓ５０１）。次いで、処理装置１１の制御部１１ａは、得られた波長と平均輝度との関係から、ピークの平均輝度を求める（Ｓ５０２）。そして、制御部１１ａは、予め求められてＲＯＭ１１ｂに記憶されている関係と、検体について測定されたピークの平均輝度（即ち、ピーク高さ）とを比較することによって、当該検体における測定対象となる生体成分の活性又は濃度を求める（Ｓ５０３）。 Next, in the measurement of the specimen, as shown in the flowchart of FIG. 17, based on the comparison result between the relationship obtained in advance and the light intensity ratio of the specific wavelength measured for the specimen, Measure function. More specifically, first, for a sample mixture including a specific molecular probe and a specimen, the relationship between the wavelength and the average luminance (fluorescence spectrum) in a desired wavelength range is as described with reference to FIG. Obtain (S501). Next, the control unit 11a of the processing device 11 obtains the average luminance of the peak from the relationship between the obtained wavelength and the average luminance (S502). Then, the control unit 11a compares the relationship obtained in advance and stored in the ROM 11b with the average luminance (that is, peak height) of the peak measured for the sample, thereby becoming a measurement target for the sample. The activity or concentration of the biological component is determined (S503).
尚、図１６及び図１７の例では、ピーク高さ自体と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めているが、ピーク高さの変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係から、生体成分の活性又は濃度を求めてもよい。この場合、所定の期間でのピーク高さの変化量と、生体成分の活性又は濃度との関係を予め求めておき、検体についても同じ所定期間でのピーク高さの変化量を測定し、予め求められた関係と比較することによって、検体における生体成分の活性又は濃度を求めることができる。 In the examples of FIGS. 16 and 17, the activity or concentration of the biological component is obtained from the relationship between the peak height itself and the activity or concentration of the biological component. The activity or concentration of the biological component may be determined from the relationship with the activity or concentration of In this case, the relationship between the amount of change in peak height in a predetermined period and the activity or concentration of biological components is determined in advance, and the amount of change in peak height in the same predetermined period is also measured for the specimen. By comparing with the obtained relationship, the activity or concentration of the biological component in the specimen can be obtained.
いずれの場合も、図６に示すように、制御部１１ａは、測定結果に係る情報を処理装置のＲＡＭ１１ｂなどの記憶手段に記憶させたり、処理装置１１の表示部１１ｄにおいて表示させたり、通信制御部１１ｅを介して通信可能に処理装置１１に接続された表示装置、プリンタ、ホスト機器に送信してそれぞれ表示、プリント、記憶などさせたりすることができる。各種設定の入力、測定の開始又は停止などの処理装置１１の制御部１１ａに対する指示は、処理装置１１の入力部１１ｆによって行うことができる。 In either case, as shown in FIG. 6, the control section 11a or stored in the storage means such as a RAM 11 b of the processing apparatus information relating to the measurement results, or is displayed on the display unit 11d of the processing unit 11, a communication The data can be transmitted to a display device, a printer, and a host device that are communicably connected to the processing device 11 via the control unit 11e to be displayed, printed, stored, and the like. An instruction to the control unit 11a of the processing device 11 such as input of various settings and start or stop of measurement can be performed by the input unit 11f of the processing device 11.
又、分子プローブが蛍光物質を利用する場合において、分子プローブと検体とを含む試料混合物に励起波長を照射するタイミングは、該試料混合物をインキュベートしている間、又はインキュベートの後のいずれであってもよい。リアルタイムで何らかの活性、反応を見たい場合は、インキュベート中に励起波長を照射するのが好ましく、最終的な活性の確認を行うのであれば、インキュベート後に励起波長を照射すればよい。 In addition, when the molecular probe uses a fluorescent substance, the timing of irradiating the sample mixture containing the molecular probe and the specimen with the excitation wavelength is either during the incubation of the sample mixture or after the incubation. Also good. When it is desired to observe some activity or reaction in real time, it is preferable to irradiate the excitation wavelength during the incubation. If final activity confirmation is performed, the excitation wavelength may be irradiated after the incubation.
又、いずれの場合も、複数の分子プローブを使用する場合には、それぞれの分子プローブ毎に上述のような計算を実施する必要がある。 In any case, when a plurality of molecular probes are used, it is necessary to perform the calculation as described above for each molecular probe.
この点、本発明によれば、試料保持部毎に種類の異なる分子プローブを用いるような場合でも、測定装置１００を用いて試料保持部毎の蛍光スペクトルを別々に同時に測定することができるため、分子プローブから発される光のパターンがどのように変化しても対応できるという利点がある。 In this regard, according to the present invention, even when different types of molecular probes are used for each sample holding unit, the fluorescence spectrum for each sample holding unit can be separately and simultaneously measured using the measuring apparatus 100. There is an advantage that it is possible to cope with any change in the pattern of light emitted from the molecular probe.
尚、分子プローブからの光のピークがどの波長に出現するかが予め分かっている場合には、必ずしも上述した各パターンの例のようにスペクトルを測定する必要はなく、ピークが発現する波長のみの平均輝度を測定するだけで、検体における測定対象の生体成分の活性又は濃度を計算することが可能である。このような場合でも波長可変液晶分光フィルタを使用することで、分子プローブの種類が変わっても分光フィルタを交換する必要がないという利点がある。 In addition, when it is known in advance at which wavelength the peak of light from the molecular probe appears, it is not always necessary to measure the spectrum as in the example of each pattern described above, only the wavelength at which the peak appears. It is possible to calculate the activity or concentration of the biological component to be measured in the specimen simply by measuring the average luminance. Even in such a case, the use of the tunable liquid crystal spectral filter has the advantage that the spectral filter does not need to be replaced even if the type of molecular probe changes.
上述のように、典型的には、それ自体又はその機能が測定対象となる生体成分は、タンパク質、酵素、ペプチド、アミノ酸、補酵素、糖、糖鎖、脂質、核酸、それらの誘導体並びにそれらの複合体、水素イオン、及び金属イオンからなるグループより選択される。より詳しくは、それ自体又はその機能が測定対象となる生体成分としては、カスパーゼ３、カスパーゼ９、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、トリプシン、セパラーゼ、ＤＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素が挙げられる。 As described above, typically, biological components whose functions are to be measured are proteins, enzymes, peptides, amino acids, coenzymes, sugars, sugar chains, lipids, nucleic acids, derivatives thereof, and their derivatives. It is selected from the group consisting of a complex, a hydrogen ion, and a metal ion. More specifically, examples of the biological component whose measurement target is itself or its function include enzymes such as caspase 3, caspase 9, cathepsin B, cathepsin D, cathepsin E, trypsin, separase, DNase, and DNA polymerase.
又、検体としては、単離された又は混合された状態の生体成分、細胞、細胞抽出物又はそれらの混合物が挙げられる。 Examples of the specimen include an isolated or mixed biological component, cell, cell extract or a mixture thereof.
以下、本発明に従う更に具体的な実施例を参照して、本発明の効果について更に説明する。 Hereinafter, the effects of the present invention will be further described with reference to more specific examples according to the present invention.
実施例１
本実施例では、図１に示す全体構成を有する波長可変液晶分光フィルタ２を用いた測定装置１００において、光源１として中心波長４８０ｎｍの光を発する超高輝度ＬＥＤ光源を用いた。光源１からの光は、測定プレート１２のウェル１２ａ内の試料混合物に平行光を照射するための光源レンズ４を通した後、励起フィルタ５で４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの波長の光を透過させるようにした。励起フィルタ５を通過した光は、９個のウェル１２ａを有する測定プレート１２に入射する。
Example 1
In this example, in the measuring apparatus 100 using the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 having the overall configuration shown in FIG. 1, an ultra-bright LED light source that emits light having a central wavelength of 480 nm was used as the light source 1. The light from the light source 1 passes through the light source lens 4 for irradiating the sample mixture in the well 12a of the measurement plate 12 with parallel light, and then the light having a wavelength of 470 nm to 480 nm is transmitted through the excitation filter 5. . The light that has passed through the excitation filter 5 enters a measurement plate 12 having nine wells 12a.
測定プレート１２のウェル１２ａ内に分子プローブと検体とを含む試料混合物を収容し反応させて、該試料混合物から発される蛍光を測定する。測定プレート１２のウェル１２ａから発生した蛍光は、波長可変液晶分光フィルタ２を通過し、５００ｎｍ以下の波長の光をカットする広帯域フィルタ７を通過し、更に平行光を検出器（本実施例では高感度冷却ＣＣＤカメラ）３の受光面に投影するためのテレセントリックレンズ７を通過して、検出器３により蛍光イメージングとして検出される。検出器３によって撮像した画像の情報は、接続手段としてのＵＳＢケーブル９により処理装置（コンピュータ）１１に送られ、画像データとして保存及び処理される。波長可変液晶分光フィルタ２は、処理装置１１に接続された駆動装置８により、その透過ピーク波長がコントロールされる。 A sample mixture containing a molecular probe and a specimen is accommodated in the well 12a of the measurement plate 12 and reacted, and fluorescence emitted from the sample mixture is measured. Fluorescence generated from the well 12a of the measurement plate 12 passes through the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2, passes through the broadband filter 7 that cuts light with a wavelength of 500 nm or less, and further detects parallel light as a detector (in this embodiment, high It passes through a telecentric lens 7 for projection onto the light receiving surface of a sensitivity-cooled CCD camera) 3 and is detected as fluorescence imaging by the detector 3. Information on an image captured by the detector 3 is sent to a processing device (computer) 11 through a USB cable 9 as a connection means, and stored and processed as image data. The wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 has its transmission peak wavelength controlled by the drive device 8 connected to the processing device 11.
そして、本実施例では、この測定装置１００を用いて、複数の生体成分又はその機能を同時に測定する。本実施例では、分子プローブとしては、ＦＲＥＴを応用したプロテアーゼ活性分析用の分子プローブを用いた。又、本実施例では、そのプロテアーゼ活性分析用の分子プローブとしては、図１８に示すように、次の２種類の分子プローブ１及び２の混合物を使用した。即ち、分子プローブ１は、ドナーとしての蛍光タンパク質ＧＦＰと、アクセプターとしての波長５７０ｎｍに蛍光ピークを持つ蛍光物質１とを有して構成された分子プローブである。又、分子プローブ２は、ドナーとしての蛍光タンパク質であるＲＦＰと、アクセプターとしての波長６７０ｎｍ付近に蛍光ピークを持つ蛍光物質２とを有して構成された分子プローブである。分子プローブ１は、カスパーゼ３が作用すると蛍光物質１が蛍光タンパク質ＧＦＰから外れ、ＦＲＥＴが解消する特性を有する。又、分子プローブ２は、トリプシンが作用すると蛍光物質２が蛍光タンパク質ＲＦＰから外れ、ＦＲＥＴが解消する特性を有する。 In this embodiment, the measurement apparatus 100 is used to simultaneously measure a plurality of biological components or their functions. In this example, a molecular probe for protease activity analysis using FRET was used as the molecular probe. In this example, as a molecular probe for analyzing protease activity, a mixture of the following two types of molecular probes 1 and 2 was used as shown in FIG. That is, the molecular probe 1 is a molecular probe configured to have a fluorescent protein GFP as a donor and a fluorescent substance 1 having a fluorescent peak at a wavelength of 570 nm as an acceptor. Further, the molecular probe 2 is a molecular probe configured to have an RFP that is a fluorescent protein as a donor and a fluorescent substance 2 that has a fluorescent peak near a wavelength of 670 nm as an acceptor. The molecular probe 1 has such a characteristic that when the caspase 3 acts, the fluorescent substance 1 is detached from the fluorescent protein GFP and FRET is eliminated. Further, the molecular probe 2 has a characteristic that when the trypsin acts, the fluorescent substance 2 is detached from the fluorescent protein RFP, and the FRET is eliminated.
従って、本実施例では、各分子プローブのドナー側の蛍光ピーク波長における蛍光強度と、アクセプター側の蛍光ピーク波長における蛍光強度との比率を測定することで、各分子プローブに対応した酵素活性を測定することが可能になる。 Therefore, in this example, the enzyme activity corresponding to each molecular probe is measured by measuring the ratio between the fluorescence intensity at the fluorescence peak wavelength on the donor side of each molecular probe and the fluorescence intensity at the fluorescence peak wavelength on the acceptor side. It becomes possible to do.
本実施例における分子プローブ１と分子プローブ２を用いたカスパーゼ３とトリプシンの活性測定方法は次の通りである。本実施例の測定装置１００でイメージングにより蛍光スペクトルを測定する場合、先ず、２種類の分子プローブ１及び２（溶液）を測定プレート１２の９個のウェル１２ａのそれぞれに入れ、次いでカスパーゼ３とトリプシンの活性を測定する検体（溶液）をそれぞれのウェル１２ａに添加して試料混合物（混合液）を調製した後、この測定プレート１２を３７℃で１時間程度インキュベートする。次いで、測定プレート１２を測定装置１００にセットし、励起光として波長が４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの光を照射する。これにより、測定プレート１２のウェル１２ａ内の試料混合物に励起光が照射されて、分子プローブ１及び２から蛍光が発される。続いて、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍから５ｎｍステップで７００ｎｍまで変化させ、複数のウェル１２ａから発される蛍光を、波長毎の２次元の画像として測定する。 The method for measuring the activity of caspase 3 and trypsin using the molecular probe 1 and the molecular probe 2 in this example is as follows. When the fluorescence spectrum is measured by imaging with the measurement apparatus 100 of the present embodiment, first, two kinds of molecular probes 1 and 2 (solution) are put in each of the nine wells 12a of the measurement plate 12, and then caspase 3 and trypsin. After preparing a sample mixture (mixed solution) by adding a sample (solution) for measuring the activity of each sample to each well 12a, the measuring plate 12 is incubated at 37 ° C. for about 1 hour. Next, the measurement plate 12 is set in the measurement apparatus 100 and irradiated with light having a wavelength of 470 nm to 480 nm as excitation light. As a result, the sample mixture in the well 12 a of the measurement plate 12 is irradiated with excitation light, and fluorescence is emitted from the molecular probes 1 and 2. Subsequently, the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter 2 is changed from 500 nm to 700 nm in 5 nm steps, and the fluorescence emitted from the plurality of wells 12a is measured as a two-dimensional image for each wavelength.
図５に示すような波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長毎に得られる画像から、図７を参照して説明したようにして、各ウェル１２ａに対応した蛍光画像の平均輝度を計算する。本実施例では、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を最初は５００ｎｍに設定し、蛍光画像を測定して保存する。続いて、波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５０５ｎｍに設定し、蛍光画像を測定して保存する。この操作を波長可変液晶分光フィルタ２の透過ピーク波長を５００ｎｍから７００ｎｍまで５ｎｍステップで変更するたびに繰り返して行い、取得された波長毎の画像から各ウェル１２ａの位置に対応する波長毎の平均輝度（蛍光スペクトル）を得る。 From the image obtained for each transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 as shown in FIG. 5, the average luminance of the fluorescent image corresponding to each well 12a is calculated as described with reference to FIG. In this embodiment, the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2 is initially set to 500 nm, and the fluorescence image is measured and stored. Subsequently, the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter 2 is set to 505 nm, and the fluorescence image is measured and stored. This operation is repeated every time the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter 2 is changed from 500 nm to 700 nm in 5 nm steps, and the average luminance for each wavelength corresponding to the position of each well 12a from the acquired image for each wavelength. (Fluorescence spectrum) is obtained.
図１９は、本実施例に従って得られた蛍光スペクトルの一例を示す。図１９の例では、分子プローブ１については、蛍光タンパク質ＧＦＰの蛍光ピーク（１）と蛍光物質１の５７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（２）が測定され、又分子プローブ２については、蛍光タンパク質ＲＦＰの蛍光ピーク（３）と蛍光物質２の６７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（４）が測定される。 FIG. 19 shows an example of a fluorescence spectrum obtained according to this example. In the example of FIG. 19, for the molecular probe 1, the fluorescent peak (1) of the fluorescent protein GFP and the fluorescent peak (2) near 570 nm of the fluorescent substance 1 are measured, and for the molecular probe 2, the fluorescence of the fluorescent protein RFP is measured. The peak (3) and the fluorescent peak (4) around 670 nm of the fluorescent substance 2 are measured.
分子プローブ１はカスパーゼ３の活性が高いとＦＲＥＴが解消するため、アクセプターである蛍光物質１の５７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（２）が小さくなり、ドナーであるＧＦＰの蛍光ピーク（１）が相対的に大きくなる。従って、カスパーゼ３の活性を求める場合、（２）のピーク高さを（１）のピーク高さで除算した値が、カスパーゼ３の活性に比例することになる。 When the molecular probe 1 has high caspase 3 activity, FRET is eliminated. Therefore, the fluorescent peak (2) near 570 nm of the fluorescent substance 1 as an acceptor is small, and the fluorescent peak (1) of the GFP as a donor is relatively growing. Therefore, when determining the activity of caspase 3, the value obtained by dividing the peak height in (2) by the peak height in (1) is proportional to the activity of caspase 3.
同様に、分子プローブ２はトリプシンの活性が高いとＦＲＥＴが解消するため、アクセプターである蛍光物質２の６７０ｎｍ付近の蛍光ピーク（４）が小さくなり、ドナーであるＲＦＰの蛍光ピーク（３）が相対的に大きくなる。従って、トリプシンの活性を求める場合、（４）のピーク高さを（３）のピーク高さで除算した値が、トリプシンの活性に比例することになる。この計算を９個のウェル１２ａについて得られた各蛍光スペクトルに基づいて同時に行うことで、９個の検体における２種類のプロテアーゼの酵素活性の測定を同時に行うことが可能となる。 Similarly, since the molecular probe 2 has a high trypsin activity, FRET is eliminated, so that the fluorescent peak (4) near 670 nm of the fluorescent substance 2 as an acceptor is small and the fluorescent peak (3) of the RFP as a donor is relative. Become bigger. Therefore, when the activity of trypsin is determined, the value obtained by dividing the peak height in (4) by the peak height in (3) is proportional to the trypsin activity. By performing this calculation simultaneously based on the fluorescence spectra obtained for the nine wells 12a, it becomes possible to simultaneously measure the enzyme activities of the two types of proteases in the nine specimens.
以上のように、本実施例によれば、複数のウェル１２ａに複数の分子プローブと検体を入れ、波長可変液晶分光フィルタ２を用いて、蛍光イメージングにより波長毎の画像を全てのウェル１２ａについて取得する。又、取得された画像から各ウェル１２ａについての波長と平均輝度との関係（蛍光スペクトル）を求め、各分子プローブに特異的なドナーとアクセプターとのそれぞれに対応する蛍光ピーク波長における平均輝度（即ち、ピーク高さ）を求める。そして、各分子プローブに特異的なアクセプターに対応する蛍光ピーク波長におけるピーク高さを、ドナーに対応する蛍光ピーク波長におけるピーク高さで除算することで、複数種類の酵素活性の同時測定が可能となる。 As described above, according to the present embodiment, a plurality of molecular probes and specimens are placed in a plurality of wells 12a, and images for each wavelength are acquired for all wells 12a by fluorescence imaging using the wavelength tunable liquid crystal spectral filter 2. To do. Further, the relationship between the wavelength and the average luminance (fluorescence spectrum) for each well 12a is obtained from the acquired image, and the average luminance at the fluorescence peak wavelength corresponding to each of the donor and acceptor specific to each molecular probe (that is, , Peak height). By dividing the peak height at the fluorescence peak wavelength corresponding to the acceptor specific to each molecular probe by the peak height at the fluorescence peak wavelength corresponding to the donor, multiple types of enzyme activities can be measured simultaneously. Become.
この方法の利点は、波長毎の蛍光強度を測定することで、分子プローブの種類が変わっても、その都度その分子プローブの種類に対応した蛍光分光フィルタを用意する必要がなく、例えば試料保持部毎に蛍光特性の異なる分子プローブを使用するような場合であっても極めて簡便、短時間に測定を行うことが可能になる。又、分子プローブによっては、測定条件により蛍光特性が変化する場合もあり、そのような場合でも異なる蛍光分光フィルタを別途容易する必要がなく、最適な波長の蛍光強度を使用して生体成分の活性又は濃度を計算することが可能になる。 The advantage of this method is that by measuring the fluorescence intensity for each wavelength, it is not necessary to prepare a fluorescence spectral filter corresponding to the type of molecular probe each time, even if the type of molecular probe changes. Even when molecular probes having different fluorescence characteristics are used every time, measurement can be performed very easily and in a short time. Depending on the molecular probe, the fluorescence characteristics may change depending on the measurement conditions. Even in such a case, it is not necessary to separately prepare a different fluorescence spectroscopic filter. Or the concentration can be calculated.
本実施例では、２種類の分子プローブを使用し、２種類のプロテアーゼ活性を測定しているが、分子プローブの種類の数は、測定対象となる生体成分又はその機能に対応して任意に設定することができ、測定精度等に鑑みれば、好ましくは、分子プローブは１種類から３種類程度である。 In this example, two kinds of molecular probes are used and two kinds of protease activities are measured, but the number of kinds of molecular probes is arbitrarily set according to the biological component to be measured or its function. In view of measurement accuracy and the like, preferably, there are about 1 to 3 types of molecular probes.
１種類の分子プローブを使用する場合には、励起波長は分子プローブに最適な領域を選択して使用すれば良いし、蛍光を測定する範囲も使用する分子プローブに最適な波長を使用すれば良い。 When one kind of molecular probe is used, the excitation wavelength may be selected and used in an optimum region for the molecular probe, and the optimum wavelength may be used for the molecular probe that also uses the fluorescence measurement range. .
複数の分子プローブを使用する場合の励起波長と蛍光波長の選択は重要である。ＦＲＥＴを利用した分子プローブは、通常ドナーとアクセプターの２個の蛍光波長のピークが生じる。そのため、ＦＲＥＴを利用した２種類の分子プローブを使用する場合には、４個の蛍光ピークが生じることになる。本実施例では、ＧＦＰの蛍光ピークが約５１５ｎｍに、蛍光物質１の蛍光ピークが約５６５ｎｍに、ＲＦＰの蛍光ピークが約６００ｎｍに、蛍光物質２の蛍光ピークが約６７５ｎｍにあり、各蛍光ピークは重ならない。従って、全ての蛍光ピークを的確に測定することが可能である。このように、使用するドナーとアクセプターの蛍光ピーク波長はできるだけ重ならないように分子プローブを設計することが重要である。又、本実施例では、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの狭帯域フィルタを使用して１帯域の励起光を照射しているが、これはＧＦＰとＲＦＰの両方の蛍光タンパク質が、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの光で励起可能であるためである。 The selection of excitation and fluorescence wavelengths is important when using multiple molecular probes. A molecular probe using FRET usually has two fluorescence wavelength peaks, a donor and an acceptor. Therefore, when two types of molecular probes using FRET are used, four fluorescent peaks are generated. In this example, the fluorescence peak of GFP is about 515 nm, the fluorescence peak of fluorescent substance 1 is about 565 nm, the fluorescence peak of RFP is about 600 nm, the fluorescence peak of fluorescent substance 2 is about 675 nm, and each fluorescence peak is Do not overlap. Therefore, it is possible to accurately measure all the fluorescence peaks. Thus, it is important to design the molecular probe so that the fluorescence peak wavelengths of the donor and acceptor used do not overlap as much as possible. In this embodiment, a narrow band filter of 470 nm to 480 nm is used to irradiate one band of excitation light. This is because both GFP and RFP fluorescent proteins can be excited with light of 470 nm to 480 nm. This is because.
３種類の生体成分又はその機能を測定するＦＲＥＴを利用した３種類の分子プローブのドナー及びアクセプターとしては、例えば、次のような組み合わせが使用可能である。ＧＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５１０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６１７ｎｍ）、ＹＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５３０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６４７ｎｍ）、ＲＦＰ（ドナー：蛍光ピーク波長５６０ｎｍ）−蛍光物質（アクセプター：蛍光ピーク波長６８０ｎｍ）などの組み合わせである。この場合にも、４７０ｎｍ〜４８０ｎｍの狭帯域フィルタを使用して１帯域の励起光で照射することで測定を行うことが可能である。 For example, the following combinations can be used as donors and acceptors of three types of molecular probes using FRET that measures three types of biological components or their functions. GFP (donor: fluorescence peak wavelength 510 nm) -fluorescent substance (acceptor: fluorescence peak wavelength 617 nm), YFP (donor: fluorescence peak wavelength 530 nm) -fluorescent substance (acceptor: fluorescence peak wavelength 647 nm), RFP (donor: fluorescence peak wavelength 560 nm) ) -A combination of a fluorescent substance (acceptor: fluorescence peak wavelength 680 nm) and the like. In this case as well, measurement can be performed by irradiating with one band of excitation light using a narrow band filter of 470 nm to 480 nm.
又、使用する蛍光物質によっては１個の帯域の励起波長だけでは適正な励起ができない場合もある。その場合には、励起光を切り換えて測定することもできる。例えば、ドナーとして蛍光タンパクのＢＦＰを使用する場合には、励起波長は３８４ｎｍなどを使用することができる。励起光の切り替えは、当業者には明らかな利用可能な任意の方法を用いて光学フィルタを切り替えて光源から試料容器への光学経路中に配置することで行うことができる。 In addition, depending on the fluorescent material used, proper excitation may not be possible with only one band of excitation wavelengths. In that case, the excitation light can be switched for measurement. For example, when fluorescent protein BFP is used as a donor, an excitation wavelength of 384 nm or the like can be used. The excitation light can be switched by switching the optical filter using any available method apparent to those skilled in the art and placing it in the optical path from the light source to the sample container.
又、前述したように、分子プローブは本実施例のようなＦＲＥＴを利用して測定するもの以外に、単独の蛍光物質を使用した分子プローブ、発光物質を利用した分子プローブなども利用できる。発光物質を利用した分子プローブの場合には、励起光を照射する必要はない。 As described above, in addition to the molecular probe that uses FRET as in this embodiment, a molecular probe that uses a single fluorescent substance, a molecular probe that uses a luminescent substance, and the like can also be used. In the case of a molecular probe using a luminescent substance, it is not necessary to irradiate excitation light.
以上説明したように、本発明によれば、従来困難であった多検体における生体成分又はその機能の測定を同時に短時間に行うことが可能となる。更に言えば、本発明によれば、複数の分子プローブを一の又は複数の検体に対して同時に用いて、一の又は複数の検体における複数の生体成分又はその機能を同時に測定する場合でも、多検体を同時に短時間に測定することが可能となり、よりハイスループットな成分と機能の測定を実現できる。 As described above, according to the present invention, it is possible to simultaneously measure biological components or their functions in multiple specimens, which has been difficult in the past, in a short time. Further, according to the present invention, even when a plurality of molecular probes are simultaneously used for one or a plurality of specimens, a plurality of biological components or their functions in one or a plurality of specimens are measured simultaneously. Samples can be measured simultaneously in a short time, and higher-throughput components and functions can be measured.
１ 光源
２ 波長可変液晶分光フィルタ
３ 検出器
４ 光源レンズ
５ 励起フィルタ
６ カットフィルタ
７ レンズ
８ 駆動装置
９ ケーブル
１０ 遮光箱
１１ 処理装置
１００ 測定装置
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Light source 2 Wavelength variable liquid crystal spectral filter 3 Detector 4 Light source lens 5 Excitation filter 6 Cut filter 7 Lens 8 Drive apparatus 9 Cable 10 Shading box 11 Processing apparatus 100 Measuring apparatus
Claims (16)
前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、透過光の波長域が可変である波長可変液晶分光フィルタを通過させた後に検出器により撮像することで同時に検出することを、前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更して繰り返して、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い、
前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め、
予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、
ことを特徴とする測定方法。 Fluorescence resonance energy between the first fluorescent material and the second fluorescent material by having a first fluorescent material and a second fluorescent material in the same molecule, and a biological component to be measured acts. a molecular probe movement is affected, analyte and, to hold the sample mixture to a plurality of sample holder comprising,
The fluorescence was emitted from the sample mixture held by the plurality of sample holder, at the same time by capturing the detector after the wavelength range of transmitted light passed through the variable wavelength liquid crystal spectral filter is variable detecting, repeatedly to change the transmission peak wavelength of the wavelength tunable liquid crystal spectral filter corresponds to at least the specific fluorescence intensity and the second fluorescent substance of the fluorescent wavelength corresponding to the first fluorescent substance identification Obtaining the detection value of the fluorescence intensity of the fluorescence wavelength for each of the sample holders is performed a plurality of times at regular intervals,
Based on the detection value of the fluorescence intensity, the constant interval of the ratio between the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material For each sample holder,
A change amount of the ratio between the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material, obtained in advance, during the certain interval. And the sample held in each of the sample holders from the amount of change determined based on the detected value of the fluorescence intensity based on the relationship between the biological component to be measured or the presence or absence of the function or the number thereof. Measuring the presence or absence of biological components or their functions in the specimen in the mixture ,
Measurement how to characterized in that.
前記波長可変液晶分光フィルタを通過した後の前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物から発された蛍光を、撮像することで同時に検出する検出器と、
前記検出器により各前記試料保持部に対応して検出された蛍光の強度に基づいて、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する処理装置と、
を有し、
前記処理装置は；前記複数の試料保持部に保持された前記試料混合物が、同一分子内に第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とを有し測定対象の生体成分が作用することで前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間での蛍光共鳴エネルギー移動が影響される分子プローブと、検体と、を含む場合に；前記波長可変液晶分光フィルタの透過ピーク波長を変更させて前記検出器による蛍光の検出を繰り返させて、少なくとも前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度の検出値を前記試料保持部毎に取得することを、一定間隔をあけて複数回行い；前記蛍光強度の検出値に基づいて、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量を、前記試料保持部毎に求め；予め求められた、前記第１の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度と前記第２の蛍光物質に対応する特定の蛍光波長の蛍光強度との比率の前記一定間隔の間における変化量と、測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡と、の関係に基づいて、前記蛍光強度の検出値に基づいて求められた前記変化量から、各前記試料保持部に保持された前記試料混合物中の前記検体における測定対象の生体成分又はその機能の存否若しくは多寡を測定する、
ことを特徴とする測定装置。 Fluorescence passes that emitted from specimen mixture maintained in a plurality of sample holding portion, and the wavelength tunable liquid crystal spectral filter is a wavelength range of transmitted light variable,
The wavelength tunable liquid crystal spectral filter firefly light emitted from the sample mixture, wherein held in the plurality of sample holder after passing a detector for detecting simultaneously by imaging,
Based on the intensity of the detector by fluorescent light detected in correspondence with each of the sample holder, the measurement target biological component or its function in the sample of the sample mixture which is retained in each of said sample holder A processing device for measuring presence / absence or polymorphism ;
I have a,
In the processing apparatus, the sample mixture held in the plurality of sample holding units includes a first fluorescent substance and a second fluorescent substance in the same molecule, and a biological component to be measured acts on the sample mixture. Including a molecular probe affected by fluorescence resonance energy transfer between the first fluorescent material and the second fluorescent material, and an analyte; changing the transmission peak wavelength of the tunable liquid crystal spectral filter The detection of the fluorescence by the detector is repeated, and the detected value of the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to at least the first fluorescent material and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material is detected. For each sample holder is performed a plurality of times at regular intervals; based on the detection value of the fluorescence intensity, the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescence substance and the first Compatible with 2 fluorescent substances The amount of change of the ratio of the specific fluorescence wavelength to the fluorescence intensity during the certain interval is obtained for each sample holding unit; the fluorescence of the specific fluorescence wavelength corresponding to the first fluorescent material obtained in advance Based on the relationship between the amount of change in the ratio between the intensity and the fluorescence intensity of the specific fluorescence wavelength corresponding to the second fluorescent material during the predetermined interval, and the presence or absence of the biological component to be measured or its function Then, from the amount of change obtained based on the detected value of the fluorescence intensity, the biological component to be measured in the sample in the sample mixture held in each sample holding unit or the presence or absence of the function thereof is measured. to,
It shall be the said measurement device.
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