JP5051454B2 - アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、癌の予防・治療剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなるアポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、又は癌の予防・治療剤等に関する。更に、本発明は、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法等に関する。

前立腺癌は、欧米において男性癌罹患率、死亡率の上位を占める悪性腫瘍である。日本でも近年、食生活の欧米化と高齢化に伴い前立腺癌の罹患率、死亡率が急速に上昇している。
本願発明者らは、前立腺癌の治療標的分子を検索する目的で、前立腺癌患者から摘出された前立腺組織を、病理組織学的に腫瘍部分と非腫瘍部分とに分離し、非腫瘍部分と腫瘍部分との間で発現量に差のある遺伝子を解析した。その結果、非腫瘍部分と比較して腫瘍部分に特異的に高発現している遺伝子として、ＰＣＡ−１（ヒトＡｌｋＢホモローグ３（ｈｕｍａｎ ＡｌｋＢ ｈｏｍｏｌｏｇ ３：ｈＡＢＨ３）とも呼ばれる）と呼ばれる遺伝子のクローニングに成功した（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ．１５、２００３年）。近年、ＰＣＡ−１はＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復酵素であることが確認され、癌の予防との関連が示唆されている（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４２１巻、ｐ８５９−８６３、２００３年／Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９９，Ｎｏ．２６，ｐｐ．１６６６０−１６６６５，２００２）。また、本発明者らは、アルキル化剤であるｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ処理した前立腺癌細胞株の生存率が、ＰＣＡ−１発現ベクターの導入により上昇したことを見出している（第２６回日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集、ｐ．５２５、２００３年）。
しかし、ＰＣＡ−１の前立腺癌細胞内における生物学的機能は必ずしも明らかではない。そのため、ＰＣＡ−１の前立腺癌細胞内における生物学的機能を解明し、それらに基づく前立腺癌の予防・治療薬の開発が求められている。
本発明の目的は、ＰＣＡ−１の前立腺癌細胞内におけるＰＣＡ−１の生物学的機能を解明し、それらに基づく癌の予防・治療薬や、そのスクリーニング方法等を提供することである。

上記目的を達成すべく、前立腺癌細胞の増殖や抗癌剤感受性に及ぼすＰＣＡ−１の機能を鋭意解析した。その結果、前立腺癌細胞株にＰＣＡ−１を強発現させると、ＦＬＩＣＥ−ｌｉｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＬＩＰ）発現の上昇とＦＬＩＰに依存したＲａｆ−１／ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）シグナルの促進が確認され、ＥＧＦ等の成長因子を介した癌細胞の増殖能が有意に増強された。また、ＰＣＡ−１はＦＬＩＰを介して、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）を阻害し、Ｒａｆ−１／ＥＲＫ／シグナルを介してパクリタキセル誘導アポトーシスを阻害することが明らかとなった。一方、ＦＬＩＰを強発現させても、内在性ＰＣＡ−１の発現をｓｉＲＮＡによってｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎさせると、同様の現象は認められなかったことから、ＦＬＩＰ／Ｒａｆ−１／ＥＲＫシグナルが機能するためにはＰＣＡ−１は不可欠であると考えられた。以上の知見より、ＰＣＡ−１は前立腺癌細胞における抗癌剤抵抗性獲得メカニズムや細胞増殖の因子として重要な役割を果たしており、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制することにより、抗癌剤抵抗性を阻害し、細胞増殖を抑制し、前立腺癌を予防・治療し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなるアポトーシス促進剤。
［２］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、上記［１］記載の剤：
（ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
［３］アポトーシスがカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性である、上記［１］記載の剤。
［４］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる細胞増殖阻害剤。
［５］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、上記［４］記載の剤：
（ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
［６］細胞増殖がＭＡＰキナーゼシグナリング依存性である、上記［４］記載の剤。
［７〕ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる癌の予防・治療剤。
［８］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、上記［７］記載の剤：
（ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
［９］癌が前立腺癌である、上記［７］記載の剤。
［１０］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法。
［１１］アポトーシスがカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性である、上記［１０］記載の方法。
［１２］ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される、上記［１０］記載の方法：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能。
［１３］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、細胞増殖阻害用化合物のスクリーニング方法。
［１４］細胞増殖がＭＡＰキナーゼシグナリング依存性である、上記［１３］記載の方法。
［１５］ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択される、上記［１３］記載の方法：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
（ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
［１６］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
［１７］癌が前立腺癌である、上記［１６］記載の方法。
［１８］ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択される、上記［１６］記載の方法：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
（ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
［１９］以下の工程を含む、ＦＬＩＰのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程；
（２）前記細胞中のＦＬＩＰのユビキチン化を評価する工程。
［２０］以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程；
（２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
［２１］以下の工程を含む、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程；
（２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
［２２］癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法である、上記［１９］〜［２１］記載の方法。
［２３］癌が前立腺癌である、上記［２２］記載の方法。
［２４］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、アポトーシスの促進方法。
［２５］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、細胞増殖の阻害方法。
［２６］ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、癌の予防・治療方法。
［２７］アポトーシス促進剤を製造するための、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
［２８］細胞増殖阻害剤を製造するための、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
［２９］癌の予防・治療剤を製造するための、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
本発明の剤の有効成分である、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物は、ＰＣＡ−１のアポトーシス阻害作用、細胞増殖増強作用をキャンセルし、癌細胞の抗癌剤抵抗性や細胞増殖を低下させるので、アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、及び癌の予防・治療剤として有用である。また、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することにより、新規作用メカニズムを有するアポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、及び癌の予防・治療用化合物をスクリーニングすることができる。

図１は、ＰＣＡ−１過剰発現細胞株（ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１）の２つのクローン（Ｃｌｏｎｅ ２，Ｃｌｏｎｅ ３１）におけるＰＣＡ−１タンパク質の増大した発現を示すウェスタンブロッティングである。ＨｙｇＢは空ベクターが導入されたコントロールを示す。
図２は、ＰＣＡ−１過剰発現細胞株における細胞増殖（ＢｒｄＵ取り込み）を示すグラフである。白カラム：ＨｙｇＢ、斜線カラム：Ｃｌｏｎｅ ２、黒カラム：Ｃｌｏｎｅ ３１（図３、９、１１において同じ）。
図３は、ＥＧＦ存在下でのＰＣＡ−１過剰発現細胞株における細胞増殖に対するＥＲＫ阻害剤（Ｕ０１２６）の効果を示すグラフである。
図４は、ＰＣＡ−１過剰発現細胞株におけるＥＧＦ誘導性ＥＲＫの活性化及びＣｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現、及びそれに対するＥＲＫ阻害剤（Ｕ０１２６）の効果を示すウェスタンブロッティングである。ｐＥＲＫ：ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ。
図５は、ＰＣＡ−１過剰発現細胞株におけるＦＬＩＰタンパク質の増大した発現を示すウェスタンブロッティングである。
図６は、ＰＣＡ−１過剰発現細胞株におけるＦＬＩＰタンパク質のユビキチン化の阻害を示すウェスタンブロッティングの結果である。Ｉ．Ｂ．：イムノブロッティング、＊：ユビキチン化ＦＬＩＰ。
図７は、ＦＬＩＰ過剰発現細胞株（ＤＵ１４５／ＦＬＩＰ）の２つのクローン（Ｃｌｏｎｅ １，Ｃｌｏｎｅ １２）におけるＦＬＩＰタンパク質の増大した発現を示すウェスタンブロッティングの結果である。
図８は、ＦＬＩＰ過剰発現細胞株におけるＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用、及びそれに対するＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡの効果を示すウェスタンブロッティングの結果である。Ｉ．Ｐ．：免疫沈降。
図９は、ＰＣＡ−１によるパクリタキセル誘導性アポトーシスの阻害（上グラフ）、及びｐＭＥＫ１−Ｒａｆ−１相互作用の誘導（下図）を示す。
図１０は、ＰＣＡ−１によるパクリタキセル誘導性アポトーシスの阻害効果及びＥＲＫ活性化効果に対するＵ０１２６及びＰＤ９８０５９の作用を示す。
図１１は、ＰＣＡ−１によるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの阻害を示す。
図１２は、細胞増殖及びアポトーシスに対するＰＣＡ−１の効果を模式的に示す。

（１．ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる剤）
後述の実施例等に示されるように、ＰＣＡ−１の強発現により、パクリタキセルやＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスが阻害され、ＥＧＦ等のＭＡＰキナーゼシグナリングを介した細胞増殖が亢進し、抗癌剤抵抗性が増強される。このことから、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物は、パクリタキセルやＴＲＡＩＬ等により誘導されるアポトーシスを促進し、ＥＧＦ等のＭＡＰキナーゼシグナリングを介した細胞増殖を阻害することにより、癌細胞の抗癌剤抵抗性を阻害し、癌を予防・治療し得ることが理解される。従って、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる剤は、アポトーシス促進用として、細胞増殖阻害用として、また癌の予防・治療用として有用である。
ＰＣＡ−１の発現とは、ＰＣＡ−１の翻訳産物（即ち、ポリペプチド）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。
ＰＣＡ−１の機能とは、ＰＣＡ−１の翻訳産物が有する生物学的機能（活性）をいう。後述の実施例に示されるように、ＰＣＡ−１の強発現により、ＦＬＩＰのユビキチン化が阻害され、ＦＬＩＰポリペプチド発現量が上昇し、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用が増大し、ＭＡＰキナーゼシグナリングが増強され、サイクリンＤ１発現が増大する。従って、ＰＣＡ−１の機能として、例えば、ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能（結果としてＦＬＩＰポリペプチド発現量を増大させる機能をも含む）、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能、ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンＤ１発現を増大させる機能等を挙げることができる。その他、ＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復機能（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（イギリス）、第４２１巻、ｐ８５９−８６３、２００３年）等もＰＣＡ−１の機能に含まれる。
ユビキチン化とは、ユビキチンがタンパク質に多数鎖状に結合する現象をいう。ユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームにより認識され、分解される。従って、ＰＣＡ−１によりＦＬＩＰのユビキチン化が阻害されると、ＦＬＩＰの分解速度が低下し、結果として、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が増大する。
ＦＬＩＰ（ＦＡＤＤ−ｌｉｋｅ ＩＣＥ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）はカスパーゼ８のドミナントネガティブ分子として作用することが知られている（Ｙｏｎｅｈａｒａ Ｓ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，２８（１），１−２，２００３）。即ち、カスパーゼ８はＦＡＤＤと相互作用し、ＦＡＳＬ誘導性（ＦＡＳを介する）アポトーシス、ＴＲＡＩＬ誘導性（ＤＲ４又はＤＲ５を介する）アポトーシス、ＴＮＦ−α誘導性（ＴＮＦＲを介する）アポトーシス等のカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスを誘導するが、ＦＬＩＰはカスパーゼ８にかわってＦＡＤＤに結合することにより、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスを抑制する。また、ＦＬＩＰはＲａｆ−１と相互作用し、Ｒａｆ−１を活性化させることが知られている（Ｋａｔａｏｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１０（１１），６４０−６４８，２０００）。従って、細胞内のＦＬＩＰポリペプチド発現量が増大すると、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスが抑制され、また、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用が増大し、Ｒａｆ−１が活性化される。
活性化されたＲａｆ−１は、Ｒａｆ−１／ＭＥＫ１／ＥＲＫのリン酸化カスケード（ＭＡＰキナーゼシグナリング）を活性化する。ＭＡＰキナーゼシグナリングが活性化されると、その下流にある様々な転写因子が直接的又は間接的に活性化され、細胞の増殖、分化等に関わる種々の遺伝子（サイクリンＤ１等）の発現が誘導され、細胞の増殖、分化が誘導される。
本発明の剤において、ＰＣＡ−１の発現を抑制する化合物は、ＰＣＡ−１の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
ＰＣＡ−１の機能を抑制する化合物は、ＰＣＡ−１ポリペプチドに結合したり、該ポリペプチドを修飾したり、或いは該ポリペプチドの安定性を低下させたりすること等により、上述のＰＣＡ−１の機能（例えば、ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能、ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンＤ１発現を増大させる機能等）を抑制する作用を有する化合物をいう。
ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
本発明において、ＰＣＡ−１ポリペプチドは、任意の哺乳動物のＰＣＡ−１ポリペプチドであり得る。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラットハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は好ましくはヒトである。
哺乳動物のＰＣＡ−１ポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型ＰＣＡ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）等が挙げられる。
また、野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも「ＰＣＡ−１ポリペプチド」に包含される。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドと実質的に同質の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。アミノ酸配列の相同性は、上記プログラムにより、そのデフォルトパラメータを用いて適宜算出され得る。例えばアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン＝１１；ギャップエクステンション＝１；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて計算することができる。
「実質的に同質の機能」とは、例えば、ＰＣＡ−１ポリペプチドの機能が性質的に野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドと同質であることを示す。したがって、ＰＣＡ−１ポリペプチドの機能が野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドと同等（例えば約０．１〜１０倍、好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうＰＣＡ−１ポリペプチドの機能としては、上述の機能（ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能、ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンＤ発現を増大させる機能、ＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復機能）等を挙げることができる。それぞれの機能は、後述の（２．ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含むスクリーニング方法）の項に記載された方法により評価することができる。
ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、初期転写産物（未成熟ｍＲＮＡ）、染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列が含まれ、より具体的には、例えばヒト野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば配列番号１）、ヒト野生型ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＴ＿００９２３７）等を挙げることが出来る。
目的とする核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的とする核酸と生理的な条件（例えば細胞内等）でハイブリダイズすることができる核酸は、該目的とする核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書におけるヌクレオチド配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスＰＣＡ−１」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、ＰＣＡ−１遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＰＣＡ−１は、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードする遺伝子（染色体ＤＮＡ）から転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と生理的な条件下（例えば細胞内等）でハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
アンチセンスＰＣＡ−１の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＰＣＡ−１ポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さを考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＰＣＡ−１をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、ＰＣＡ−１をコードする核酸内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、ＰＣＡ−１遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスＰＣＡ−１は、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。
ＰＣＡ−１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＰＣＡ−１に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
ＰＣＡ−１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスＰＣＡ−１に包含される。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。ｓｉＲＮＡの大きさは、ＲＮＡｉを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、１５ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上であり得る。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
上述のＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し得る。さらに、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、ＰＣＡ−１ポリペプチドに特異的に結合することにより、ＰＣＡ−１の機能を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
例えば、ポリクローナル抗体は、ＰＣＡ−１ポリペプチドあるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスにＰＣＡ−１ポリペプチドあるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合してＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、より効果的にＰＣＡ−１の機能を抑制するために、ＰＣＡ−１ポリペプチドの機能性部位（ＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復活性部位等）を特異的に認識し、当該部位が担う機能の低下をもたらすような抗体が選択され得る。
ＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体とは、ＰＣＡ−１ポリペプチドに対する変異の導入によりその機能（活性）が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＡ−１ポリペプチドと競合することで間接的にその機能（活性）を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位（ＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復活性部位等）における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知の変異導入試薬を用いる自体公知の方法により作製できる。
上述のＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体や、ＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸も、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物として好ましい。該核酸は、適切な発現ベクター（例えば、適用対象である哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）内で機能可能な発現ベクター）中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（前立腺癌細胞等）でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に機能的に連結された態様で提供され得る。
発現ベクター、使用されるプロモーターとしては、上述の「ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクター」と同様のものを用いることができる。また、発現ベクターは、ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体や、ＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し得る。さらに、発現ベクターは、上述の「ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクター」と同様に、選択マーカー遺伝子をさらに含有することもできる。
本発明の剤は、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の有効成分を溶解させた液剤、有効量の有効成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン（ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオールエオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオールエオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
また、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物がポリペプチド（抗体、ドミナントネガティブ変異体等）である場合、該ポリペプチドの細胞内への導入効率を高めるために、本発明の剤は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）等を用いることが出来る。
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
１つの態様において、本発明の剤はアポトーシス促進用であり得る（アポトーシス促進剤）。この場合、該アポトーシスは、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性であることが好ましい。カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスとしては、ＦＡＳＬ誘導性アポトーシス、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシス、ＴＮＦ−α誘導性アポトーシス等を挙げることができる。カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスが好ましいのは、本発明の剤の有効成分によりＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰによるカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスの抑制が解除され得るからである。また、パクリタキセル誘導性アポトーシスが好ましいのは、パクリタキセル誘導性アポトーシスはパクリタキセル自体により誘導され得るＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ等）の活性化により阻害されるが（ＭｃＤａｉｄ Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０（２），２９０−３０１，２００１）、本発明の剤の有効成分によりＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰとＲａｆ−１との相互作用が低下し、Ｒａｆ−１の活性化が抑制され、その結果、ＭＡＰキナーゼシグナリングの活性化が抑制され得るからである。
本発明のアポトーシス促進剤は、上述の哺乳動物の所望の組織（例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等）由来の細胞（組織から分離された細胞（培養された細胞も含む）、正常細胞、癌細胞、細胞株等）、好ましくは前立腺癌細胞のアポトーシスを促進し得る。
１つの態様において、本発明の剤は細胞増殖阻害用であり得る（細胞増殖阻害剤）。本発明の剤の有効成分によりＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用が減少し、その結果、ＭＡＰキナーゼシグナリングが抑制されるので、本発明の剤はＭＡＰキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖を好適に阻害し得る。ＭＡＰキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖としては、例えば、ＥＧＦ等の成長因子依存性細胞増殖等を挙げることができる。
本発明の細胞増殖阻害剤は、上述の哺乳動物の所望の組織（例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等）由来の細胞（組織から分離された細胞（培養された細胞も含む）、正常細胞、癌細胞、細胞株等）、好ましくは前立腺癌細胞の増殖を阻害し得る。
１つの態様において、本発明の剤は癌の予防・治療用であり得る（癌の予防・治療剤）。この場合、癌は上述の哺乳動物の所望の組織（例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等）由来の癌であり得るが、好ましくは前立腺癌である。「前立腺癌」とは、前立腺において発生した癌を広く包含する概念であり、前立腺に発生した腺癌のみならず、扁平上皮癌、移行上皮癌、神経内分泌癌、未分化癌等をも包含する。好ましくは、前立腺癌は前立腺に発生した腺癌である。前立腺癌においては、ＰＣＡ−１が高発現しており（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ１５、２００３年）、本発明の剤が特に有効であり得る。
（２．ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法）
上述の様に、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物は、アポトーシス（カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス、パクリタキセル誘導性アポトーシス等）を促進し、ＭＡＰキナーゼシグナリング依存性細胞増殖（ＥＧＰ等の成長因子依存性細胞増殖等）を阻害することにより、癌細胞の抗癌剤抵抗性を阻害し、癌を予防・治療し得る。従って、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することにより、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物を獲得することができる。
スクリーニング方法に供される被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
例えば、ＰＣＡ−１の発現を抑制し得る化合物を選択する場合、被検化合物とＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１の発現量を測定し、該発現量を被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１の発現量と比較する。
ＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞とは、ＰＣＡ−１遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＰＣＡ−１遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＰＣＡ−１を天然で発現可能な細胞であり得、一方、ＰＣＡ−１遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。
ＰＣＡ−１を天然で発現可能な細胞は、ＰＣＡ−１を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。ＰＣＡ−１を天然で発現可能な細胞としては、例えば、前記哺乳動物の前立腺癌細胞等を挙げることができる。
ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域は、ＰＣＡ−１遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＰＣＡ−１遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＰＣＡ−１遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＰＣＡ−１遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＰＣＡ−１遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、上述のＰＣＡ−１遺伝子を天然で発現可能な細胞（例えば前立腺癌細胞等）を用いることが好ましい。
ＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞として、ＰＣＡ−１を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＰＣＡ−１遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。一方、ＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞として、ＰＣＡ−１遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１の発現量が、被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１の発現量は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
比較の結果、ＰＣＡ−１の発現を抑制し得ると判断された化合物を、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物として得ることが出来る。
ＰＣＡ−１の機能を抑制し得る化合物を選択する場合、被検化合物の存在下でＰＣＡ−１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被検化合物の不在下におけるＰＣＡ−１の機能（活性）と比較する。
例えば、ＰＣＡ−１の機能として、ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能を測定する場合、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化阻害活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化阻害活性と比較する。この場合、ユビキチン化されたＦＬＩＰのプロテアソームによる分解を抑制する目的で、プロテアソーム阻害剤（例えばＭＧ１３２等）の存在中で細胞と被検化合物とを接触させてもよい。
用いられる細胞としては、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えばＰＣＡ−１、ＦＬＩＰ、及びＦＬＩＰユビキチン化に関わる酵素等が機能可能な態様で発現している細胞等を挙げることが出来る。ＰＣＡ−１、ＦＬＩＰ、及びＦＬＩＰユビキチン化に関わる酵素等は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞としては、例えば、ＦＬＩＰユビキチン化の存在が確認されている細胞へＰＣＡ−１遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたＰＣＡ−１により該ＦＬＩＰユビキチン化が阻害された細胞等を挙げることができる。「ＦＬＩＰユビキチン化の存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「ＦＬＩＰユビキチン化の存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。
ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、ＰＣＡ−１の発現を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触と同様に、適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１時間〜約７２時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性が測定される。ＦＬＩＰユビキチン化の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からＦＬＩＰを免疫沈降し、ＦＬＩＰ中に結合したユビキチンの量をウエスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。この場合、ＦＬＩＰユビキチン化の程度が小さいほど「ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性」が強いと判断され、「ＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性」が抑制されると、ＦＬＩＰユビキチン化の程度が大きくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。発現量の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰユビキチン化阻害活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
ＰＣＡ−１の機能として、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能を測定する場合、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性と比較する。
用いられる細胞としては、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えば、ＰＣＡ−１、ＦＬＩＰ、及びＲａｆ−１を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。ＰＣＡ−１、ＦＬＩＰ、及びＲａｆ−１等は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性を測定可能な細胞としては、例えば、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の存在が確認されている細胞へＰＣＡ−１遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたＰＣＡ−１により該ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用が増大された細胞等を挙げることができる。「ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。
ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性が測定される。ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からＦＬＩＰを免疫沈降し、ＦＬＩＰと共沈降したＲａｆ−１の量をウェスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。この場合、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の程度が大きいほど「ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性」が強いと判断され、「ＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性」が抑制されると、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用の程度が小さくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用増大活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
ＰＣＡ−１の機能として、ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能を測定する場合、ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性と比較する。
用いられる細胞としては、ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えば、ＰＣＡ−１、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子（Ｒａｆ−１、ＭＥＫ１、ＥＲＫ等）を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。ＰＣＡ−１、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞としては、例えば、ＭＡＰキナーセシグナリングの存在が確認されている細胞へＰＣＡ−１遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたＰＣＡ−１により該ＭＡＰキナーゼシグナリングが増強された細胞等を挙げることができる。「ＭＡＰキナーゼシグナリングの存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「ＭＡＰキナーゼシグナリングの存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。ＭＡＰキナーゼシグナリングは、通常、細胞の活性化に依存するので、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、前立腺癌細胞等を用いる場合、ＥＧＦ等のＭＡＰキナーゼシグナリングを活性化させ得る成長因子により該細胞は刺激され得る。
ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性が測定される。ＭＡＰキナーゼシグナリングの測定は、自体公知の方法により行うことができ、通常、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子（Ｒａｆ−１、ＭＥＫ１、ＥＲＫ等）のリン酸化が指標とされる。例えば、γ^３２Ｐ−ＡＴＰの存在中で培養された細胞を用いて、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子（Ｒａｆ−１、ＭＥＫ１、ＥＲＫ等）に対する抗体等により細胞の抽出液からＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子を免疫沈降し、リン酸化により該分子中に取り込まれた^３２Ｐを定量することによりＭＡＰキナーゼシグナリングを測定することが出来る。またリン酸化されたＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティング等によりリン酸化の程度を測定してもよい。この場合、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子のリン酸化の程度が大きいほど「ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性」が強いと判断され、「ＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性」が抑制されると、ＭＡＰキナーゼシグナリングを構成する分子のリン酸化の程度が小さくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のＭＡＰキナーゼシグナリング増強活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
ＰＣＡ−１の機能として、サイクリンＤ１発現を増大させる機能を測定する場合、ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるサイクリンＤ１発現増大活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるサイクリンＤ１発現増大活性と比較する。
用いられる細胞としては、ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性を測定可能である限り特に限定されないが、例えば、ＰＣＡ−１、サイクリンＤ１を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。ＰＣＡ−１は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。サイクリンＤ１は天然に発現し得るものが好ましい。ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性を測定可能な細胞としては、例えば、サイクリンＤ１発現能力が確認されている細胞へＰＣＡ−１遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたＰＣＡ−１によりサイクリンＤ１発現が増強された細胞等を挙げることができる。「サイクリンＤ１発現能力が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「サイクリンＤ１発現能力が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。サイクリンＤ１発現は、通常、細胞の活性化（特にＭＡＰキナーゼシグナリングの活性化）に依存するので、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、前立腺癌細胞等を用いる場合、ＥＧＦ等のＭＡＰキナーゼシグナリングを活性化させ得る成長因子により該細胞は刺激され得る。
ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性が測定される。サイクリンＤ１発現量は、サイクリンＤ１遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。この場合、サイクリンＤ１発現量が大きいほど「ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性」が強いと判断され、「ＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性」が抑制されると、サイクリンＤ１発現量の程度が低下する。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＰＣＡ１のサイクリンＤ１発現増大活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるＰＣＡ−１のサイクリンＤ１発現増大活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
比較の結果、ＰＣＡ−１の機能を抑制し得ると判断された化合物を、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物として選択することが出来る。
本発明のスクリーニング方法において、特にアポトーシス促進用化合物をスクリーニングする場合、該アポトーシスは、好ましくは、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性であり得る。カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスとしては、ＦＡＳＬ誘導性アポトーシス、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシス、ＴＮＦ−α誘導性アポトーシス等を挙げることができる。カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスが好ましいのは、本発明の剤の有効成分によりＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰによるカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスの抑制が解除され得るからである。また、パクリタキセル誘導性アポトーシスが好ましいのは、パクリタキセル誘導性アポトーシスはパクリタキセル自体により誘導され得るＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ等）の活性化により阻害されるが（ＭｃＤａｉｄ Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０（２），２９０−３０１，２００１）、本発明の剤の有効成分によりＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰとＲａｆ−１との相互作用が低下し、Ｒａｆ−１の活性化が抑制され、その結果、ＭＡＰキナーゼシグナリングの活性化が抑制され得るからである。
また、上述のようなＰＣＡ−１のアポトーシスへの関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、ＰＣＡ−１の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、アポトーシス促進用化合物をスクリーニングする場合、ＰＣＡ−１の機能は、好ましくは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択され得る：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能。
また、ＰＣＡ−１の発現又は機能が抑制されると、ＰＣＡ−１のＦＬＩＰのユビキチン化阻害機能が抑制され、ＦＬＩＰのユビキチン化が増強され、細胞内のＦＬＩＰのポリペプチド発現量が減少することにより、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用が減少し、その結果、ＭＡＰキナーゼシグナリングが減弱し、サイクリンＤ１発現が抑制され、最終的に細胞増殖が阻害される。従って、このようなＰＣＡ−１の作用メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、特に細胞増殖阻害用化合物をスクリーニングする場合、該細胞増殖は好ましくはＭＡＰキナーゼシグナリング依存性であり得る。ＭＡＰキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖としては、例えば、ＥＧＦ等の成長因子依存性細胞増殖等を挙げることができる。
また、上述のようなＰＣＡ−１の細胞増殖への関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、ＰＣＡ−１の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、細胞増殖阻害用化合物をスクリーニングする場合、ＰＣＡ−１の機能は、好ましくは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択され得る：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
（ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
本発明のスクリーニング方法において、特に癌の予防・治療用化合物をスクリーニングする場合、癌は上述の哺乳動物の所望の組織（例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等）由来の癌であり得るが、好ましくは前立腺癌である。前立腺癌においては、ＰＣＡ−１が高発現しており（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ１５、２００３年）、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物が特に有効であり得る。
また、上述のようなＰＣＡ−１のアポトーシス及び細胞増殖への関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、ＰＣＡ−１の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、癌の予防・治療用化合物をスクリーニングする場合、ＰＣＡ−１の機能は、好ましくは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択され得る：
（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
（ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
（ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
（ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、又は癌（前立腺癌等）の予防・治療剤とすることができる。
（３．ＦＬＩＰのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法）
後述の実施例に示されるように、ＰＣＡ−１の強発現により、ＦＬＩＰのユビキチン化が阻害され、ＦＬＩＰポリペプチド発現が上昇し、結果として、アポトーシスが阻害され、細胞増殖が増強され、また抗癌剤抵抗性となる。従って、ＰＣＡ−１が発現している細胞において、ＦＬＩＰのユビキチン化を促進し得る化合物が得られれば、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、及び癌の予防・治療用化合物として有用である。特に、前立腺癌においては、ＰＣＡ−１が高発現しているので（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ１５、２００３年）、ＰＣＡ−１が発現している細胞において、ＦＬＩＰのユビキチン化を促進し得る化合物は、前立腺癌の予防・治療用化合物として特に有用であり得る。従って、本発明は、以下の工程を含む、ＦＬＩＰのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法を提供するものである：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程；
（２）前記細胞中のＦＬＩＰのユビキチン化を評価する工程。
ＰＣＡ−１発現細胞としては、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できるが、好ましくは前立腺癌細胞が用いられる。該細胞におけるＰＣＡ−１発現量は、ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害し得る程度の発現量であれば、特に限定されないが、ＦＬＩＰのユビキチン化を確実に阻害するため、ＰＣＡ−１無発現細胞（例えばＰＣＡ−１に対するｓｉＲＮＡの導入により、ＰＣＡ−１の機能的発現が阻害された細胞）と比較して、ＦＬＩＰのユビキチン化を約１／２、好ましくは約１／１０にまで阻害し得る程度の発現量であることが好ましい。該細胞において、ＰＣＡ−１は天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよいが、より強力かつ確実なＰＣＡ−１発現を達成するため、遺伝子導入により強制的にＰＣＡ−１を発現させることが好ましい。遺伝子導入によるＰＣＡ−１発現は、ＰＣＡ−１を発現し得る発現ベクターを上記細胞へ導入することにより達成される。該発現ベクターは、導入対象である細胞内で機能可能なプロモーターの下流にＰＣＡ−１をコードする核酸が機能的に連結された態様で提供される。
工程（１）において、ＰＣＡ−１発現細胞がプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理される。被検化合物は、上述の（２．ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法）において使用されるものと同様である。プロテアソーム阻害剤を用いるのは、プロテアソームによるユビキチン化されたＦＬＩＰの分解を抑制することにより、被検化合物のＦＬＩＰユビキチン化促進活性を正確に評価するためである。プロテアソーム阻害剤としては、ＭＧ１３２等を挙げることができる。
ＰＣＡ−１発現細胞の被検化合物による処理は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。また、培地中のプロテアソーム阻害剤の濃度は、ユビキチン化ＦＬＩＰのプロテアソームによる分解が阻害される限り限定されないが、例えばＭＧ１３２を使用する場合には、該濃度は通常約１０〜約３０μＭである。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化が評価される。ＦＬＩＰユビキチン化の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からＦＬＩＰを免疫沈降し、ＦＬＩＰ中に結合したユビキチンの量をウェスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化が、被検化合物を接触させない対照細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化と比較される。ＦＬＩＰユビキチン化の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化は、被検化合物を接触させた細胞におけるＦＬＩＰユビキチン化の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
比較の結果、対照細胞と比較してＦＬＩＰユビキチン化の程度を増大させた化合物が、ＦＬＩＰユビキチン化促進用化合物として選択される。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、ＦＬＩＰユビキチン化促進剤、アポトーシス抑制剤、細胞増殖阻害剤、又は癌（前立腺癌等）の予防・治療剤とすることができる。
（４．アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法）
後述の実施例等に示されるように、ＰＣＡ−１の強発現により、パクリタキセルにより誘導されるアポトーシスが阻害され、パクリタキセルに対して抵抗性が獲得される。また、ＰＣＡ−１の強発現により、ＴＲＡＩＬ等により誘導されるカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスが阻害され、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子（ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−Ｒ、抗ＦＡＳ抗体等）に対して抵抗性が獲得される。従って、ＰＣＡ−１が発現している細胞において、パクリタキセルやカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により誘導されるアポトーシスを促進し得る化合物が得られれば、パクリタキセルやカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子に対して抵抗性を獲得したような癌の予防・治療用化合物として有用である。特に、前立腺癌においては、ＰＣＡ−１が高発現しているので（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ１５、２００３年）、パクリタキセルやカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により誘導されるアポトーシスを促進し得る化合物は、前立腺癌の予防・治療用化合物として特に有用である。従って、本発明は、以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法を提供するものである：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程；
（２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
更に、本発明は、以下の工程を含む、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法を提供する：
（１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルやカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程；
（２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
ＰＣＡ−１発現細胞としては、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できるが、好ましくは前立腺癌細胞が用いられる。該細胞におけるＰＣＡ−１発現量は、パクリタキセル誘導性アポトーシス又はカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスを阻害し得る程度の発現量であれば、特に限定されないが、該アポトーシスを確実に阻害することにより鋭敏なスクリーニング方法を構築するため、ＰＣＡ−１無発現細胞（例えばＰＣＡ−１に対するｓｉＲＮＡにより、ＰＣＡ−１の機能的発現が阻害された細胞）と比較して、パクリタキセル誘導性アポトーシス又はカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスを約１／２、好ましくは約１／１０にまで阻害し得る程度の発現量であることが好ましい。該細胞において、ＰＣＡ−１は天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよいが、より強力かつ確実なＰＣＡ−１発現を達成するため、遺伝子導入により強制的にＰＣＡ−１を発現させることが好ましい。遺伝子導入によるＰＣＡ−１発現は、ＰＣＡ−１を発現し得る発現ベクターを上記細胞へ導入することにより達成される。該発現ベクターは、導入対象である細胞内で機能可能なプロモーターの下流にＰＣＡ−１をコードする核酸が機能的に連結された態様で提供される。
工程（１）においては、ＰＣＡ−１発現細胞が被検化合物存在中でパクリタキセル又はカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により処理される。被検化合物は、上述の（２．ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法）において使用されるものと同様である。
ＰＣＡ−１発現細胞の被検化合物による処理は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。また、培地中のパクリタキセルの濃度は、ＰＣＡ−１無発現細胞においてアポトーシスを誘導し得る濃度範囲であれば特に限定されないが、例えば約０．１〜約２０μＭである。培地中のカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子の濃度は、ＰＣＡ−１無発現細胞においてアポトーシスを誘導し得る濃度範囲であれば特に限定されず、該誘導因子の種類やスクリーニングに使用される細胞の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子としてＴＲＡＩＬを使用する場合、培地中のＴＲＡＩＬの濃度は、約１〜約１０００ｎｇ／ｍｌである。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの度合いが評価される。アポトーシスの測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、ＤＮＡのヌクレオソーム単位で切断された断片を「ＤＮＡラダー」として検出するアガロースゲル電気泳動法、５０〜３００ｋｂｐの高分子ＤＮＡ断片を生じるアポトーシスを検出するパルスフィード電気泳動法、組織内のアポトーシス検出のためにＤＮＡ切断端を検出するｉｎ ｓｉｔｕ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ法（ＴＵＮＥＬ法）、蛍光色素を用いて細胞染色後、細胞サイズの変化やＤＮＡ含量低下細胞の検出、あるいは生死細胞の検出などをフローサイトメトリーで行う方法などを使用することができる。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの度合いが、被検化合物を接触させない対照細胞におけるアポトーシスの度合いと比較される。アポトーシスの度合いの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるアポトーシスは、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
比較の結果、対照細胞と比較してパクリタキセル誘導性又はカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシスの度合いを増大させた化合物が、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物又はカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス促進用化合物として選択される。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進剤、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス促進剤、又は癌（前立腺癌等）の予防・治療剤とすることができる。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例１
（材料及び方法）
１）細胞株と遺伝子、遺伝子導入細胞株の作製
細胞株はヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣより購入）をＲＰＭＩ培地（１０％血清存在下）で培養し使用した。ＰＣＡ−１ ｖｅｃｔｏｒよりヒトＰＣＡ−１ ｇｅｎｅを切り出し、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしているベクター，ｐＩＲＥＳ／Ｎｅｏに導入した（以下ｐＩＲＥＳ／Ｎｅｏ／ＰＣＡ−１）。同遺伝子をＤＵ１４５に遺伝子導入（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法）し、４８時間後にネオマイシンを加え約２ヶ月間培養を行い、ネオマイシンに抵抗性を示すクローン（ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１）を少なくとも２クローン抽出し、以後の実験に供した。コントロールとしては、空ベクターを導入し同様の条件下で培養したクローン（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）を使用した。
また、ＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ−ｌｉｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）については、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを作製しｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬＡＧ２に組み込み、ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするベクター，ｐＴＫ−Ｈｙｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とともにＤＵ１４５に遺伝子導入（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法）した。ハイグロマイシン存在下に約２ヶ月間培養を行い、ハイグロマイシンに抵抗性を示すクローン（ＤＵ１４５／ＦＬＩＰ）を少なくとも２クローン抽出し、実験に供した。コントロールとしては空ベクターを導入し同様の条件下で培養したクローン（ＤＵ１４５／ＨｙｇＢ）を使用した。
２）ＰＣＡ−１のノックダウン
ＰＣＡ−１に対するｓｉＲＮＡ（ＣＣＧＡＧＡＧＵＧＡＡＣＣＵＧＡＣＣ：配列番号３）をｐＲＮＡ−Ｈ１．１／Ｈｙｇｒｏ ｖｅｃｔｏｒに組み込み、ＤＵ１４５に一過性トランスフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法）を行った。発現抑制、ノックダウン効果はウェスタンブロット法で確認した。
３）ＦＬＩＰユビキチン化アッセイ
細胞をＭＧ１３２で刺激後、回収し抗ＦＬＩＰ抗体で免疫沈降した後、抗ＦＬＩＰ抗体ならびに抗ユビキチン抗体を用いてウェスタンブロットを行い、ＦＬＩＰ分子のユビキチン化を検討した。
４）細胞増殖の検索
ＭＴＳ
［（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ］試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、添付のプロトコールに従って実験を行った。
（結果）
１）ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒを介した細胞増殖に及ぼすＰＣＡ−１の機能について
無血清条件下で３６時間における細胞増殖を検討した。非刺激では有意差はなかったが（図２）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激下ではコントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）に比較してＰＣＡ−１過剰発現細胞株（ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１）の方が、細胞増殖が１．５倍から２倍に上昇し、この効果はｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）の阻害剤（Ｕ０１２６）の前処理により阻害（ｃａｎｃｅｌ）された（図３）。
また、ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ではコントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）に比較して、ＥＧＦ誘導性ＥＲＫの活性化ならびにその標的遺伝子であるｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現が有意に上昇していた（図４）。ＥＲＫの活性化はｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫの発現をウェスタンブロット法で検索することにより判定した。
２）ＰＣＡ−１によるＦＬＩＰユビキチン化の阻害とＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１結合の促進について
ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１では、コントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）に比較してＦＬＩＰの蛋白発現が有意に上昇していた（ウェスタンブロット法による）（図５）が、ＲＴ−ＰＣＲ法で見る限り、ｍＲＮＡ量には有意差を認めなかった。そこで、ＦＬＩＰのユビキチン化に及ぼすＰＣＡ−１の役割を解析した。ＭＧ１３２処理後、ＦＬＩＰのユビキチン化についてみると、コントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）ではＦＬＩＰのユビキチン化を確認できたが、ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ではＦＬＩＰのユビキチン化が阻害された（図６）。
興味深いことに、ＦＬＩＰのみを強発現させたＤＵ１４５（ＤＵ１４５／ＦＬＩＰ）では、ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用がみられるが、この現象はＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡの一過性強発現により内因性ＰＣＡ−１をノックダウンさせることにより阻害（ｃａｎｃｅｌ）された（図８）。
以上より、ＰＣＡ−１は、ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害することでＦＬＩＰのタンパク質発現量を高めるだけでなく、ＦＬＩＰとＲａｆ−１との相互結合（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）に影響し、Ｒａｆ−１以下の細胞増殖シグナルを高めると考えられた。
３）パクリタキセル誘導性アポトーシスに及ぼすＰＣＡ−１の役割について
コントロール細胞株（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）ならびにＤＵ１４５／ＰＣＡ−１をパクリタキセル（１００ｎＭ）で刺激し、４８時間後にアポトーシスの定量をフローサイトメトリーを用いて行った。その結果、ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ではコントロール株（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）に比較してパクリタキセル誘導性アポトーシスが有意に阻害された（図９）。また、ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ではコントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）に比較してパクリタキセルによるＥＲＫ活性化が促進され、ＥＲＫ阻害剤（Ｕ０１２６）を用いると、ＰＣＡ−１によるパクリタキセル誘導性アポトーシス阻害効果がｃａｎｃｅｌされることもわかった（図１０）。
以上より、ＰＣＡ−１はパクリタキセルによるＥＲＫ活性化を促進させることでアポトーシス誘導を阻害すると考えられた。
４）Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）誘導性アポトーシスに及ぼすＰＣＡ−１の役割について
ＴＲＡＩＬは前立腺癌における次世代抗癌剤として注目され、そのメカニズムにＦＬＩＰが抑制的に作用することが報告されている。そこで、ＰＣＡ−１のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの影響を解析した。ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ならびにコントロール（ＤＵ１４５／Ｎｅｏ）をＴＲＡＩＬ５０ｎｇ／ｍｌで刺激し、２４時間後にアポトーシス誘導をフローサイトメトリーで解析したところ、ＤＵ１４５／ＰＣＡ−１ではコントロールに比較して有意にアポトーシス誘導が阻害された（図１１）。
以上の結果から示唆される、細胞増殖及びアポトーシスに対するＰＣＡ−１の効果を示す模式図を図１２に示す。
実施例２
（材料及び方法）
１）細胞株
ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣより購入）をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％牛胎児血清存在下）で培養し使用した。
２）ＰＣＡ−１のｓｉＲＮＡによるノックダウン
ＰＣＡ−１に対するｓｉＲＮＡ（ｇａａａｇａａｇｃｕｇａｃｕｇｇａｕａｕｕ（配列番号４）、ｇｃａｃａｕｕｕｇａｇａｕｇａｇａａａｕｕ（配列番号５）、ｇａｇａｇａａｇｃｕｕｃａｃｕｇａａａｕｕ（配列番号６））をＤＵ１４５にＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて一過性にトランスフェクションした。発現抑制、ノックダウン効果はｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲならびにＰＣＡ−１定量ＥＬＩＳＡ法で確認した。なおコントロールｓｉＲＮＡ（ａｕｃｃｇｃｇｃｇａｕａｇｕａｃｇｕａ（配列番号７））は、ＧＥヘルスケアバイオサイエンスから購入した。
３）ＰＣＡ−１のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ＳＹＢＥ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。使用したＰＣＡ−１、ＧＡＰＤＨ特異的プライマー、及びＰＣＲ条件を以下に示す。
プライマー塩基配列

Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ条件

４）ＰＣＡ−１のＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
Ｔｒａｐｐｉｎｇ抗体（ウサギ抗ＰＣＡ−１抗体）を９６穴プレートに添加（１μｇ／穴）し、湿箱に入れ一晩４℃でインキュベートした。１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄後、ブロッキング剤を添加して室温で１．５時間放置した。洗浄後ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体（マウス抗ＰＣＡ−１抗体クローン２−５Ａ，０．２５μｇ／穴）を添加し、１．５時間室温放置した。洗浄後、測定サンプル（１００μｌ／穴）を添加し、１．５時間室温放置した。洗浄後、３次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体，２ｎｇ／穴）を添加し、２時間室温放置した。最終洗浄後に発色剤を添加し（５０μｌ／穴）、３０ｍｉｎ後に４１５ｎｍで吸光度を測定した。
５）ＷＳＴ−１法
ＤＵ１４５にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした２日後、細胞を回収し９６穴プレートに１ｘ１０^４／ｍｌの細胞を１００μｌ播種した。その後、２４時間ごとに１−ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ．ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）溶液とＷＳＴ−１（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）溶液を１：９で混合したものを各ウェル１０μｌ添加し、１時間後に４５０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長として６３０ｎｍを使用した。なおトランスフェクションを開始した日をｄａｙ０とする。
６）アポトーシス解析
ＤＵ１４５にＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクション後、回収しｅｔｈａｎｏｌで固定した。その後、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを用いて染色し，フローサイトメーターによりアポトーシス細胞の割合を解析した。
（結果）
１）ＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡによるノックダウン
ＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした３日後（ｄａｙ３）にＲＮＡを調製し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。その結果、コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクタントに比べ、３種のＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクタントともＰＣＡ−１ ｍＲＮＡが約２０％以下であった。またＰＣＡ−１ ＥＬＩＳＡ系を用いた蛋白質レベルでの定量でも、ＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡトランスフェクタントでは検出限界（２０ｐｇ）以下であった。この結果は使用したＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡで効果的なノックダウンができたことを示す。
２）ＰＣＡ−１のノックダウンによるアポトーシスの誘導
ＰＣＡ−１をノックダウンしたＤＵ１４５の増殖をＷＳＴ−１により解析した。コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞では経時的に顕著な増殖が認められた。一方、ＰＣＡ−１をノックダウンした細胞ではｄａｙ６まで，ほとんど増殖が認められなかった。下表は、ｄａｙ３の吸光度を１とし、測定した日の吸光度を比で表している。

３）ＰＣＡ−１のノックダウンによるアポトーシスの誘導
ＰＣＡ−１ノックダウンによるＤＵ１４５のアポトーシス解析を行った。Ｄａｙ２では，コントロールあるいはＰＣＡ−１ ｓｉＲＮＡトランスフェクタントともアポトーシス細胞はほとんど認められなかった。しかし，時間経過とともにＰＣＡ−１ノックダウン細胞では顕著なアポトーシス割合の増加が認められた。

本発明の剤の有効成分である、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物は、ＰＣＡ−１のアポトーシス阻害作用、細胞増殖増強作用をキャンセルし、癌細胞の抗癌剤抵抗性や細胞増殖を低下させるので、アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、及び癌の予防・治療剤として有用である。また、ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することにより、新規作用メカニズムを有するアポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、及び癌の予防・治療用化合物をスクリーニングすることができる。
本出願は日本で出願された特願２００５−２２７２７４（出願日：２００５年８月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (26)

1. 以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌細胞に対するアポトーシス促進剤：
   （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
   （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
2. ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に示される塩基配列を有する核酸である、請求項１記載の剤。
3. アポトーシスがカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性である、請求項１または２記載の剤。
4. 以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌細胞に対する細胞増殖阻害剤：
   （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
   （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
5. ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に示される塩基配列を有する核酸である、請求項４記載の剤。
6. 細胞増殖がＭＡＰキナーゼシグナリング依存性である、請求項４または５記載の剤。
7. 以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌の予防・治療剤：
   （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
   （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
8. ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に示される塩基配列を有する核酸である、請求項７記載の剤。
9. ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法。
10. アポトーシスがカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性又はパクリタキセル誘導性である、請求項９記載の方法。
11. ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される、請求項９記載の方法：
    （ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
    （ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
    （ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能。
12. ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、細胞増殖阻害用化合物のスクリーニング方法。
13. 細胞増殖がＭＡＰキナーゼシグナリング依存性である、請求項１２記載の方法。
14. ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択される、請求項１２記載の方法：
    （ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
    （ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
    （ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
    （ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
15. ＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
16. 癌が前立腺癌である、請求項１５記載の方法。
17. ＰＣＡ−１の機能が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択される、請求項１５記載の方法：（ｉ）ＦＬＩＰのユビキチン化を阻害する機能；
    （ｉｉ）ＦＬＩＰ−Ｒａｆ−１相互作用を増大させる機能；
    （ｉｉｉ）ＭＡＰキナーゼシグナリングを増強する機能；
    （ｉｖ）サイクリンＤ発現を増大させる機能。
18. 以下の工程を含む、ＦＬＩＰのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法：
    （１）ＰＣＡ−１発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程；
    （２）前記細胞中のＦＬＩＰのユビキチン化を評価する工程。
19. 以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法：
    （１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程；
    （２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
20. 以下の工程を含む、カスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法：
    （１）ＰＣＡ−１発現細胞を被検化合物存在中でカスパーゼ８／ＦＡＤＤ依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程；
    （２）前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
21. 癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法である、請求項１８〜２０記載の方法。
22. 癌が前立腺癌である、請求項２１記載の方法。
23. 前立腺癌細胞に対するアポトーシス促進剤を製造するための、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用：
    （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
    （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
24. 前立腺癌細胞に対する細胞増殖阻害剤を製造するための、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用：
    （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
    （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
25. 前立腺癌の予防・治療剤を製造するための、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のＰＣＡ−１の発現又は機能を抑制する化合物の使用：
    （ｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
    （ｉｉ）ＰＣＡ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はＰＣＡ−１ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
26. ＰＣＡ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に示される塩基配列を有する核酸である、請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用。

Images