JP5051454B2 - アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、癌の予防・治療剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本願発明者らは、前立腺癌の治療標的分子を検索する目的で、前立腺癌患者から摘出された前立腺組織を、病理組織学的に腫瘍部分と非腫瘍部分とに分離し、非腫瘍部分と腫瘍部分との間で発現量に差のある遺伝子を解析した。その結果、非腫瘍部分と比較して腫瘍部分に特異的に高発現している遺伝子として、PCA−1(ヒトAlkBホモローグ3(human AlkB homolog 3:hABH3)とも呼ばれる)と呼ばれる遺伝子のクローニングに成功した(第123回日本薬学会年会要旨集4、p.15、2003年)。近年、PCA−1はDNA,RNAアルキル化損傷修復酵素であることが確認され、癌の予防との関連が示唆されている(ネイチャー(Nature)、第421巻、p859−863、2003年/Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.99,No.26,pp.16660−16665,2002)。また、本発明者らは、アルキル化剤であるmethyl methanesulfonate処理した前立腺癌細胞株の生存率が、PCA−1発現ベクターの導入により上昇したことを見出している(第26回日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集、p.525、2003年)。
しかし、PCA−1の前立腺癌細胞内における生物学的機能は必ずしも明らかではない。そのため、PCA−1の前立腺癌細胞内における生物学的機能を解明し、それらに基づく前立腺癌の予防・治療薬の開発が求められている。
本発明の目的は、PCA−1の前立腺癌細胞内におけるPCA−1の生物学的機能を解明し、それらに基づく癌の予防・治療薬や、そのスクリーニング方法等を提供することである。
[1]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなるアポトーシス促進剤。
[2]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の(i)又は(ii)である、上記[1]記載の剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
[3]アポトーシスがカスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性である、上記[1]記載の剤。
[4]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる細胞増殖阻害剤。
[5]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の(i)又は(ii)である、上記[4]記載の剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
[6]細胞増殖がMAPキナーゼシグナリング依存性である、上記[4]記載の剤。
[7〕PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる癌の予防・治療剤。
[8]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物が、以下の(i)又は(ii)である、上記[7]記載の剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
[9]癌が前立腺癌である、上記[7]記載の剤。
[10]PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法。
[11]アポトーシスがカスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性である、上記[10]記載の方法。
[12]PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iii)からなる群から選択される、上記[10]記載の方法:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能。
[13]PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、細胞増殖阻害用化合物のスクリーニング方法。
[14]細胞増殖がMAPキナーゼシグナリング依存性である、上記[13]記載の方法。
[15]PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択される、上記[13]記載の方法:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。
[16]PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
[17]癌が前立腺癌である、上記[16]記載の方法。
[18]PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択される、上記[16]記載の方法:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。
[19]以下の工程を含む、FLIPのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程;
(2)前記細胞中のFLIPのユビキチン化を評価する工程。
[20]以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
[21]以下の工程を含む、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
[22]癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法である、上記[19]〜[21]記載の方法。
[23]癌が前立腺癌である、上記[22]記載の方法。
[24]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、アポトーシスの促進方法。
[25]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、細胞増殖の阻害方法。
[26]PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の有効量を投与することを含む、癌の予防・治療方法。
[27]アポトーシス促進剤を製造するための、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
[28]細胞増殖阻害剤を製造するための、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
[29]癌の予防・治療剤を製造するための、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用。
本発明の剤の有効成分である、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物は、PCA−1のアポトーシス阻害作用、細胞増殖増強作用をキャンセルし、癌細胞の抗癌剤抵抗性や細胞増殖を低下させるので、アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、及び癌の予防・治療剤として有用である。また、PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することにより、新規作用メカニズムを有するアポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、及び癌の予防・治療用化合物をスクリーニングすることができる。
図2は、PCA−1過剰発現細胞株における細胞増殖(BrdU取り込み)を示すグラフである。白カラム:HygB、斜線カラム:Clone 2、黒カラム:Clone 31(図3、9、11において同じ)。
図3は、EGF存在下でのPCA−1過剰発現細胞株における細胞増殖に対するERK阻害剤(U0126)の効果を示すグラフである。
図4は、PCA−1過剰発現細胞株におけるEGF誘導性ERKの活性化及びCyclin D1の発現、及びそれに対するERK阻害剤(U0126)の効果を示すウェスタンブロッティングである。pERK:phospho−ERK。
図5は、PCA−1過剰発現細胞株におけるFLIPタンパク質の増大した発現を示すウェスタンブロッティングである。
図6は、PCA−1過剰発現細胞株におけるFLIPタンパク質のユビキチン化の阻害を示すウェスタンブロッティングの結果である。I.B.:イムノブロッティング、*:ユビキチン化FLIP。
図7は、FLIP過剰発現細胞株(DU145/FLIP)の2つのクローン(Clone 1,Clone 12)におけるFLIPタンパク質の増大した発現を示すウェスタンブロッティングの結果である。
図8は、FLIP過剰発現細胞株におけるFLIP−Raf−1相互作用、及びそれに対するPCA−1 siRNAの効果を示すウェスタンブロッティングの結果である。I.P.:免疫沈降。
図9は、PCA−1によるパクリタキセル誘導性アポトーシスの阻害(上グラフ)、及びpMEK1−Raf−1相互作用の誘導(下図)を示す。
図10は、PCA−1によるパクリタキセル誘導性アポトーシスの阻害効果及びERK活性化効果に対するU0126及びPD98059の作用を示す。
図11は、PCA−1によるTRAIL誘導性アポトーシスの阻害を示す。
図12は、細胞増殖及びアポトーシスに対するPCA−1の効果を模式的に示す。
後述の実施例等に示されるように、PCA−1の強発現により、パクリタキセルやTRAILにより誘導されるアポトーシスが阻害され、EGF等のMAPキナーゼシグナリングを介した細胞増殖が亢進し、抗癌剤抵抗性が増強される。このことから、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物は、パクリタキセルやTRAIL等により誘導されるアポトーシスを促進し、EGF等のMAPキナーゼシグナリングを介した細胞増殖を阻害することにより、癌細胞の抗癌剤抵抗性を阻害し、癌を予防・治療し得ることが理解される。従って、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる剤は、アポトーシス促進用として、細胞増殖阻害用として、また癌の予防・治療用として有用である。
PCA−1の発現とは、PCA−1の翻訳産物(即ち、ポリペプチド)が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。
PCA−1の機能とは、PCA−1の翻訳産物が有する生物学的機能(活性)をいう。後述の実施例に示されるように、PCA−1の強発現により、FLIPのユビキチン化が阻害され、FLIPポリペプチド発現量が上昇し、FLIP−Raf−1相互作用が増大し、MAPキナーゼシグナリングが増強され、サイクリンD1発現が増大する。従って、PCA−1の機能として、例えば、FLIPのユビキチン化を阻害する機能(結果としてFLIPポリペプチド発現量を増大させる機能をも含む)、FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能、MAPキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンD1発現を増大させる機能等を挙げることができる。その他、DNA,RNAアルキル化損傷修復機能(ネイチャー(Nature)、(イギリス)、第421巻、p859−863、2003年)等もPCA−1の機能に含まれる。
ユビキチン化とは、ユビキチンがタンパク質に多数鎖状に結合する現象をいう。ユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームにより認識され、分解される。従って、PCA−1によりFLIPのユビキチン化が阻害されると、FLIPの分解速度が低下し、結果として、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が増大する。
FLIP(FADD−like ICE inhibitory protein)はカスパーゼ8のドミナントネガティブ分子として作用することが知られている(Yonehara S.,Cell Struct.Funct.,28(1),1−2,2003)。即ち、カスパーゼ8はFADDと相互作用し、FASL誘導性(FASを介する)アポトーシス、TRAIL誘導性(DR4又はDR5を介する)アポトーシス、TNF−α誘導性(TNFRを介する)アポトーシス等のカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスを誘導するが、FLIPはカスパーゼ8にかわってFADDに結合することにより、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスを抑制する。また、FLIPはRaf−1と相互作用し、Raf−1を活性化させることが知られている(Kataoka T.,et al,Curr.Biol.,10(11),640−648,2000)。従って、細胞内のFLIPポリペプチド発現量が増大すると、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスが抑制され、また、FLIP−Raf−1相互作用が増大し、Raf−1が活性化される。
活性化されたRaf−1は、Raf−1/MEK1/ERKのリン酸化カスケード(MAPキナーゼシグナリング)を活性化する。MAPキナーゼシグナリングが活性化されると、その下流にある様々な転写因子が直接的又は間接的に活性化され、細胞の増殖、分化等に関わる種々の遺伝子(サイクリンD1等)の発現が誘導され、細胞の増殖、分化が誘導される。
本発明の剤において、PCA−1の発現を抑制する化合物は、PCA−1の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
PCA−1の機能を抑制する化合物は、PCA−1ポリペプチドに結合したり、該ポリペプチドを修飾したり、或いは該ポリペプチドの安定性を低下させたりすること等により、上述のPCA−1の機能(例えば、FLIPのユビキチン化を阻害する機能、FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能、MAPキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンD1発現を増大させる機能等)を抑制する作用を有する化合物をいう。
PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物としては、例えば以下の(i)、(ii)等を挙げることが出来る。
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
本発明において、PCA−1ポリペプチドは、任意の哺乳動物のPCA−1ポリペプチドであり得る。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラットハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は好ましくはヒトである。
哺乳動物のPCA−1ポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型PCA−1ポリペプチド(例えば、配列番号2)で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)等が挙げられる。
また、野生型PCA−1ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも「PCA−1ポリペプチド」に包含される。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型PCA−1ポリペプチドのアミノ酸配列と約90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは約98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型PCA−1ポリペプチドと実質的に同質の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント(好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである)における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合(%)を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族アミノ酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性アミノ酸(Gln、Asn)、塩基性アミノ酸(Lys、Arg、His)、酸性アミノ酸(Glu、Asp)、水酸基を有するアミノ酸(Ser、Thr)、側鎖の小さいアミノ酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない(即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowieら,Science,247:1306−1310(1990)を参照)。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873−5877(1993)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら,Nucleic Acids Res.,25:3389−3402(1997))]、Needlemanら,J.Mol.Biol.,48:444−453(1970)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、MyersおよびMiller,CABIOS,4:11−17(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている]、Pearsonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられるが、それらに限定されない。アミノ酸配列の相同性は、上記プログラムにより、そのデフォルトパラメータを用いて適宜算出され得る。例えばアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST−2(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(マトリックス=BLOSUM62;ギャップオープン=11;ギャップエクステンション=1;x_ドロップオフ=50;期待値=10;フィルタリング=ON)にて計算することができる。
「実質的に同質の機能」とは、例えば、PCA−1ポリペプチドの機能が性質的に野生型PCA−1ポリペプチドと同質であることを示す。したがって、PCA−1ポリペプチドの機能が野生型PCA−1ポリペプチドと同等(例えば約0.1〜10倍、好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうPCA−1ポリペプチドの機能としては、上述の機能(FLIPのユビキチン化を阻害する機能、FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能、MAPキナーゼシグナリングを増強する機能、サイクリンD発現を増大させる機能、DNA,RNAアルキル化損傷修復機能)等を挙げることができる。それぞれの機能は、後述の(2.PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含むスクリーニング方法)の項に記載された方法により評価することができる。
PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、PCA−1ポリペプチドをコードするcDNA、mRNA、初期転写産物(未成熟mRNA)、染色体DNAのヌクレオチド配列が含まれ、より具体的には、例えばヒト野生型PCA−1ポリペプチドをコードするcDNAのヌクレオチド配列(例えば配列番号1)、ヒト野生型PCA−1ポリペプチドをコードする染色体DNAのヌクレオチド配列(例えばGenBankアクセッション番号:NT_009237)等を挙げることが出来る。
目的とする核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的とする核酸と生理的な条件(例えば細胞内等)でハイブリダイズすることができる核酸は、該目的とする核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、更に好ましくは約95%以上、最も好ましくは100%の相補性を有することをいう。本明細書におけるヌクレオチド配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸(以下、「アンチセンスPCA−1」ともいう)は、クローン化された、あるいは決定されたPCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、PCA−1遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスPCA−1は、PCA−1ポリペプチドをコードする遺伝子(染色体DNA)から転写されるRNA(mRNA又は初期転写産物)と生理的な条件下(例えば細胞内等)でハイブリダイズすることができ、mRNAの合成(プロセッシング)または機能(タンパク質への翻訳)を阻害することができる。
アンチセンスPCA−1の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてPCA−1ポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするmRNAまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さを考慮すれば、約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、PCA−1をコードする核酸(例えばmRNA又は初期転写産物)の5’端ヘアピンループ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、PCA−1をコードする核酸内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、PCA−1遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスPCA−1は、PCA−1ポリペプチドをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、PCA−1ポリペプチドをコードする二本鎖DNAと結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型(リン酸結合のP=OをP=Sに置換)や2’−O−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。
PCA−1をコードするmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスPCA−1に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度)をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res.,29(13):2780−2788(2001)]。
PCA−1をコードするmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴRNA(siRNA)もまた、アンチセンスPCA−1に包含される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAの一方の鎖に相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来[Nature,411(6836):494−498(2001)]、リボザイムの代替技術として広く利用されている。siRNAの大きさは、RNAiを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、15bp以上、好ましくは20bp以上であり得る。RNAi活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。
上述のPCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター(例えば適用対象である哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター)の下流に、PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR、ラウス肉腫ウイルスLTR、MoMuLV由来LTR、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター;β−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し得る。さらに、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等)をさらに含有することもできる。
PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、PCA−1ポリペプチドに特異的に結合することにより、PCA−1の機能を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)2)、組換え抗体(例えば、単鎖抗体)であってもよい。
例えば、ポリクローナル抗体は、PCA−1ポリペプチドあるいはそのフラグメント(必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる)を抗原として、市販のアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し(部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく)、最終免疫から約3〜約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法(例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2−14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年)により作成することができる。例えば、マウスにPCA−1ポリペプチドあるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例えば、NS−1,P3X63Ag8など)を細胞融合してPCA−1ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法[J.Immunol.Methods,81(2):223−228(1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma,7(6):627−633(1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学(臨時増刊号),Vol.6,No.10,1988」、特公平3−73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4−506458号公報、特開昭62−296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics,Vol.15,p.146−156,1997」、「Nature Genetics,Vol.7,p.13−21,1994」、特表平4−504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、6月号、第40〜第50頁、1995年」、「Nature,Vol.368,p.856−859,1994」、特表平6−500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、より効果的にPCA−1の機能を抑制するために、PCA−1ポリペプチドの機能性部位(DNA,RNAアルキル化損傷修復活性部位等)を特異的に認識し、当該部位が担う機能の低下をもたらすような抗体が選択され得る。
PCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体とは、PCA−1ポリペプチドに対する変異の導入によりその機能(活性)が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、PCA−1ポリペプチドと競合することで間接的にその機能(活性)を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、PCA−1ポリペプチドをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位(DNA,RNAアルキル化損傷修復活性部位等)における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異(例えば、1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加)が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、PCRや公知の変異導入試薬を用いる自体公知の方法により作製できる。
上述のPCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体や、PCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸も、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物として好ましい。該核酸は、適切な発現ベクター(例えば、適用対象である哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)内で機能可能な発現ベクター)中の適切なプロモーター(例えば適用対象である哺乳動物の細胞(前立腺癌細胞等)でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター)の下流に機能的に連結された態様で提供され得る。
発現ベクター、使用されるプロモーターとしては、上述の「PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクター」と同様のものを用いることができる。また、発現ベクターは、PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体や、PCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し得る。さらに、発現ベクターは、上述の「PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクター」と同様に、選択マーカー遺伝子をさらに含有することもできる。
本発明の剤は、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の有効成分を溶解させた液剤、有効量の有効成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン(lipfectamine)、DOGS(トランスフェクタム;ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン)、DOPE(1,2−ジオールエオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOTAP(1,2−ジオールエオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DDAB(ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物)、DHDEAB(N,N−ジ−n−ヘキサアデシル−N,N−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物)、HDEAB(N−n−ヘキサアデシル−N,N−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物)、ポリブレン、あるいはポリ(エチレンイミン)(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
また、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物がポリペプチド(抗体、ドミナントネガティブ変異体等)である場合、該ポリペプチドの細胞内への導入効率を高めるために、本発明の剤は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト(ナカライテスク社製)、プロベクチン(IMGENEX社製)等を用いることが出来る。
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.0001〜約5000mg/kgである。
1つの態様において、本発明の剤はアポトーシス促進用であり得る(アポトーシス促進剤)。この場合、該アポトーシスは、カスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性であることが好ましい。カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスとしては、FASL誘導性アポトーシス、TRAIL誘導性アポトーシス、TNF−α誘導性アポトーシス等を挙げることができる。カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスが好ましいのは、本発明の剤の有効成分によりPCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIPによるカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスの抑制が解除され得るからである。また、パクリタキセル誘導性アポトーシスが好ましいのは、パクリタキセル誘導性アポトーシスはパクリタキセル自体により誘導され得るMAPキナーゼ(ERK等)の活性化により阻害されるが(McDaid H.M.et al,Mol.Pharmacol.,60(2),290−301,2001)、本発明の剤の有効成分によりPCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIPとRaf−1との相互作用が低下し、Raf−1の活性化が抑制され、その結果、MAPキナーゼシグナリングの活性化が抑制され得るからである。
本発明のアポトーシス促進剤は、上述の哺乳動物の所望の組織(例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等)由来の細胞(組織から分離された細胞(培養された細胞も含む)、正常細胞、癌細胞、細胞株等)、好ましくは前立腺癌細胞のアポトーシスを促進し得る。
1つの態様において、本発明の剤は細胞増殖阻害用であり得る(細胞増殖阻害剤)。本発明の剤の有効成分によりPCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIP−Raf−1相互作用が減少し、その結果、MAPキナーゼシグナリングが抑制されるので、本発明の剤はMAPキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖を好適に阻害し得る。MAPキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖としては、例えば、EGF等の成長因子依存性細胞増殖等を挙げることができる。
本発明の細胞増殖阻害剤は、上述の哺乳動物の所望の組織(例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等)由来の細胞(組織から分離された細胞(培養された細胞も含む)、正常細胞、癌細胞、細胞株等)、好ましくは前立腺癌細胞の増殖を阻害し得る。
1つの態様において、本発明の剤は癌の予防・治療用であり得る(癌の予防・治療剤)。この場合、癌は上述の哺乳動物の所望の組織(例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等)由来の癌であり得るが、好ましくは前立腺癌である。「前立腺癌」とは、前立腺において発生した癌を広く包含する概念であり、前立腺に発生した腺癌のみならず、扁平上皮癌、移行上皮癌、神経内分泌癌、未分化癌等をも包含する。好ましくは、前立腺癌は前立腺に発生した腺癌である。前立腺癌においては、PCA−1が高発現しており(第123回日本薬学会年会要旨集4、p15、2003年)、本発明の剤が特に有効であり得る。
(2.PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法)
上述の様に、PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物は、アポトーシス(カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス、パクリタキセル誘導性アポトーシス等)を促進し、MAPキナーゼシグナリング依存性細胞増殖(EGP等の成長因子依存性細胞増殖等)を阻害することにより、癌細胞の抗癌剤抵抗性を阻害し、癌を予防・治療し得る。従って、PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することにより、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物を獲得することができる。
スクリーニング方法に供される被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
例えば、PCA−1の発現を抑制し得る化合物を選択する場合、被検化合物とPCA−1の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1の発現量を測定し、該発現量を被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1の発現量と比較する。
PCA−1の発現を測定可能な細胞とは、PCA−1遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。PCA−1遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、PCA−1を天然で発現可能な細胞であり得、一方、PCA−1遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、PCA−1遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。
PCA−1を天然で発現可能な細胞は、PCA−1を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。PCA−1を天然で発現可能な細胞としては、例えば、前記哺乳動物の前立腺癌細胞等を挙げることができる。
PCA−1遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、PCA−1遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。PCA−1遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。PCA−1遺伝子転写調節領域は、PCA−1遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約2kbpまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において1以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つPCA−1遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP(緑色蛍光蛋白質)遺伝子、GUS(β−グルクロニダーゼ)遺伝子、LUC(ルシフェラーゼ)遺伝子、CAT(クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子等が挙げられる。
PCA−1遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、PCA−1遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、PCA−1遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、PCA−1遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、上述のPCA−1遺伝子を天然で発現可能な細胞(例えば前立腺癌細胞等)を用いることが好ましい。
PCA−1の発現を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約12〜約72時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、PCA−1の発現を測定可能な細胞として、PCA−1を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、PCA−1遺伝子の産物、例えば、転写産物(mRNA)又は翻訳産物(ポリペプチド)を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT−PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(Methods in Enzymol.70:419−439(1980))、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。一方、PCA−1の発現を測定可能な細胞として、PCA−1遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1の発現量が、被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1の発現量は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
比較の結果、PCA−1の発現を抑制し得ると判断された化合物を、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物として得ることが出来る。
PCA−1の機能を抑制し得る化合物を選択する場合、被検化合物の存在下でPCA−1の機能(活性)を測定し、該機能(活性)を被検化合物の不在下におけるPCA−1の機能(活性)と比較する。
例えば、PCA−1の機能として、FLIPのユビキチン化を阻害する機能を測定する場合、PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるFLIPユビキチン化阻害活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるFLIPユビキチン化阻害活性と比較する。この場合、ユビキチン化されたFLIPのプロテアソームによる分解を抑制する目的で、プロテアソーム阻害剤(例えばMG132等)の存在中で細胞と被検化合物とを接触させてもよい。
用いられる細胞としては、PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えばPCA−1、FLIP、及びFLIPユビキチン化に関わる酵素等が機能可能な態様で発現している細胞等を挙げることが出来る。PCA−1、FLIP、及びFLIPユビキチン化に関わる酵素等は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞としては、例えば、FLIPユビキチン化の存在が確認されている細胞へPCA−1遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたPCA−1により該FLIPユビキチン化が阻害された細胞等を挙げることができる。「FLIPユビキチン化の存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「FLIPユビキチン化の存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。
PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、PCA−1の発現を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触と同様に、適切な培養培地(例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地)中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約1時間〜約72時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性が測定される。FLIPユビキチン化の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からFLIPを免疫沈降し、FLIP中に結合したユビキチンの量をウエスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。この場合、FLIPユビキチン化の程度が小さいほど「PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性」が強いと判断され、「PCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性」が抑制されると、FLIPユビキチン化の程度が大きくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。発現量の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIPユビキチン化阻害活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
PCA−1の機能として、FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能を測定する場合、PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるFLIP−Raf−1相互作用増大活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるFLIP−Raf−1相互作用増大活性と比較する。
用いられる細胞としては、PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えば、PCA−1、FLIP、及びRaf−1を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。PCA−1、FLIP、及びRaf−1等は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性を測定可能な細胞としては、例えば、FLIP−Raf−1相互作用の存在が確認されている細胞へPCA−1遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたPCA−1により該FLIP−Raf−1相互作用が増大された細胞等を挙げることができる。「FLIP−Raf−1相互作用の存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「FLIP−Raf−1相互作用の存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。
PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地(例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地)中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約1分間〜約72時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性が測定される。FLIP−Raf−1相互作用の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からFLIPを免疫沈降し、FLIPと共沈降したRaf−1の量をウェスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。この場合、FLIP−Raf−1相互作用の程度が大きいほど「PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性」が強いと判断され、「PCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性」が抑制されると、FLIP−Raf−1相互作用の程度が小さくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のFLIP−Raf−1相互作用増大活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
PCA−1の機能として、MAPキナーゼシグナリングを増強する機能を測定する場合、PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるMAPキナーゼシグナリング増強活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるMAPキナーゼシグナリング増強活性と比較する。
用いられる細胞としては、PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な限り特に限定されないが、例えば、PCA−1、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子(Raf−1、MEK1、ERK等)を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。PCA−1、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞としては、例えば、MAPキナーセシグナリングの存在が確認されている細胞へPCA−1遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたPCA−1により該MAPキナーゼシグナリングが増強された細胞等を挙げることができる。「MAPキナーゼシグナリングの存在が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「MAPキナーゼシグナリングの存在が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。MAPキナーゼシグナリングは、通常、細胞の活性化に依存するので、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、前立腺癌細胞等を用いる場合、EGF等のMAPキナーゼシグナリングを活性化させ得る成長因子により該細胞は刺激され得る。
PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地(例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地)中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約1分間〜約72時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性が測定される。MAPキナーゼシグナリングの測定は、自体公知の方法により行うことができ、通常、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子(Raf−1、MEK1、ERK等)のリン酸化が指標とされる。例えば、γ32P−ATPの存在中で培養された細胞を用いて、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子(Raf−1、MEK1、ERK等)に対する抗体等により細胞の抽出液からMAPキナーゼシグナリングを構成する分子を免疫沈降し、リン酸化により該分子中に取り込まれた32Pを定量することによりMAPキナーゼシグナリングを測定することが出来る。またリン酸化されたMAPキナーゼシグナリングを構成する分子に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティング等によりリン酸化の程度を測定してもよい。この場合、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子のリン酸化の程度が大きいほど「PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性」が強いと判断され、「PCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性」が抑制されると、MAPキナーゼシグナリングを構成する分子のリン酸化の程度が小さくなる。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のMAPキナーゼシグナリング増強活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
PCA−1の機能として、サイクリンD1発現を増大させる機能を測定する場合、PCA−1のサイクリンD1発現増大活性を測定可能な細胞と被検化合物とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるサイクリンD1発現増大活性を測定し、これを被検化合物を接触させない対照細胞におけるサイクリンD1発現増大活性と比較する。
用いられる細胞としては、PCA−1のサイクリンD1発現増大活性を測定可能である限り特に限定されないが、例えば、PCA−1、サイクリンD1を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。PCA−1は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。サイクリンD1は天然に発現し得るものが好ましい。PCA−1のサイクリンD1発現増大活性を測定可能な細胞としては、例えば、サイクリンD1発現能力が確認されている細胞へPCA−1遺伝子を導入することにより得られた細胞であって、導入されたPCA−1によりサイクリンD1発現が増強された細胞等を挙げることができる。「サイクリンD1発現能力が確認されている細胞」は、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。「サイクリンD1発現能力が確認されている細胞」は、好ましくは前立腺癌細胞である。サイクリンD1発現は、通常、細胞の活性化(特にMAPキナーゼシグナリングの活性化)に依存するので、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、前立腺癌細胞等を用いる場合、EGF等のMAPキナーゼシグナリングを活性化させ得る成長因子により該細胞は刺激され得る。
PCA−1のサイクリンD1発現増大活性を測定可能な細胞に対する被検化合物の接触は、上述と同様に適切な培養培地(例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地)中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約1分間〜約72時間である。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のサイクリンD1発現増大活性が測定される。サイクリンD1発現量は、サイクリンD1遺伝子の産物、例えば、転写産物(mRNA)又は翻訳産物(ポリペプチド)を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT−PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(Methods in Enzymol.70:419−439(1980))、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。この場合、サイクリンD1発現量が大きいほど「PCA−1のサイクリンD1発現増大活性」が強いと判断され、「PCA−1のサイクリンD1発現増大活性」が抑制されると、サイクリンD1発現量の程度が低下する。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のサイクリンD1発現増大活性が、被検化合物を接触させない対照細胞における該活性と比較される。該活性の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるPCA1のサイクリンD1発現増大活性は、被検化合物を接触させた細胞におけるPCA−1のサイクリンD1発現増大活性の測定に対し、事前に測定した活性であっても、同時に測定した活性であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から、同時に測定した活性であることが好ましい。
比較の結果、PCA−1の機能を抑制し得ると判断された化合物を、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、又は癌の予防・治療用化合物として選択することが出来る。
本発明のスクリーニング方法において、特にアポトーシス促進用化合物をスクリーニングする場合、該アポトーシスは、好ましくは、カスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性であり得る。カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスとしては、FASL誘導性アポトーシス、TRAIL誘導性アポトーシス、TNF−α誘導性アポトーシス等を挙げることができる。カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスが好ましいのは、本発明の剤の有効成分によりPCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIPによるカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスの抑制が解除され得るからである。また、パクリタキセル誘導性アポトーシスが好ましいのは、パクリタキセル誘導性アポトーシスはパクリタキセル自体により誘導され得るMAPキナーゼ(ERK等)の活性化により阻害されるが(McDaid H.M.et al,Mol.Pharmacol.,60(2),290−301,2001)、本発明の剤の有効成分によりPCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIPとRaf−1との相互作用が低下し、Raf−1の活性化が抑制され、その結果、MAPキナーゼシグナリングの活性化が抑制され得るからである。
また、上述のようなPCA−1のアポトーシスへの関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、PCA−1の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、アポトーシス促進用化合物をスクリーニングする場合、PCA−1の機能は、好ましくは、以下の(i)〜(iii)からなる群から選択され得る:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能。
また、PCA−1の発現又は機能が抑制されると、PCA−1のFLIPのユビキチン化阻害機能が抑制され、FLIPのユビキチン化が増強され、細胞内のFLIPのポリペプチド発現量が減少することにより、FLIP−Raf−1相互作用が減少し、その結果、MAPキナーゼシグナリングが減弱し、サイクリンD1発現が抑制され、最終的に細胞増殖が阻害される。従って、このようなPCA−1の作用メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、特に細胞増殖阻害用化合物をスクリーニングする場合、該細胞増殖は好ましくはMAPキナーゼシグナリング依存性であり得る。MAPキナーゼシグナリング依存性の細胞増殖としては、例えば、EGF等の成長因子依存性細胞増殖等を挙げることができる。
また、上述のようなPCA−1の細胞増殖への関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、PCA−1の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、細胞増殖阻害用化合物をスクリーニングする場合、PCA−1の機能は、好ましくは、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択され得る:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。
本発明のスクリーニング方法において、特に癌の予防・治療用化合物をスクリーニングする場合、癌は上述の哺乳動物の所望の組織(例えば、前立腺、胸腺、肝臓、精巣等)由来の癌であり得るが、好ましくは前立腺癌である。前立腺癌においては、PCA−1が高発現しており(第123回日本薬学会年会要旨集4、p15、2003年)、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物が特に有効であり得る。
また、上述のようなPCA−1のアポトーシス及び細胞増殖への関与メカニズムを考慮すると、本発明の方法において、PCA−1の機能を抑制し得る化合物を選択することにより、癌の予防・治療用化合物をスクリーニングする場合、PCA−1の機能は、好ましくは、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択され得る:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、アポトーシス促進剤、細胞増殖阻害剤、又は癌(前立腺癌等)の予防・治療剤とすることができる。
(3.FLIPのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法)
後述の実施例に示されるように、PCA−1の強発現により、FLIPのユビキチン化が阻害され、FLIPポリペプチド発現が上昇し、結果として、アポトーシスが阻害され、細胞増殖が増強され、また抗癌剤抵抗性となる。従って、PCA−1が発現している細胞において、FLIPのユビキチン化を促進し得る化合物が得られれば、アポトーシス促進用化合物、細胞増殖阻害用化合物、及び癌の予防・治療用化合物として有用である。特に、前立腺癌においては、PCA−1が高発現しているので(第123回日本薬学会年会要旨集4、p15、2003年)、PCA−1が発現している細胞において、FLIPのユビキチン化を促進し得る化合物は、前立腺癌の予防・治療用化合物として特に有用であり得る。従って、本発明は、以下の工程を含む、FLIPのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法を提供するものである:
(1)PCA−1発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程;
(2)前記細胞中のFLIPのユビキチン化を評価する工程。
PCA−1発現細胞としては、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できるが、好ましくは前立腺癌細胞が用いられる。該細胞におけるPCA−1発現量は、FLIPのユビキチン化を阻害し得る程度の発現量であれば、特に限定されないが、FLIPのユビキチン化を確実に阻害するため、PCA−1無発現細胞(例えばPCA−1に対するsiRNAの導入により、PCA−1の機能的発現が阻害された細胞)と比較して、FLIPのユビキチン化を約1/2、好ましくは約1/10にまで阻害し得る程度の発現量であることが好ましい。該細胞において、PCA−1は天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよいが、より強力かつ確実なPCA−1発現を達成するため、遺伝子導入により強制的にPCA−1を発現させることが好ましい。遺伝子導入によるPCA−1発現は、PCA−1を発現し得る発現ベクターを上記細胞へ導入することにより達成される。該発現ベクターは、導入対象である細胞内で機能可能なプロモーターの下流にPCA−1をコードする核酸が機能的に連結された態様で提供される。
工程(1)において、PCA−1発現細胞がプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理される。被検化合物は、上述の(2.PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法)において使用されるものと同様である。プロテアソーム阻害剤を用いるのは、プロテアソームによるユビキチン化されたFLIPの分解を抑制することにより、被検化合物のFLIPユビキチン化促進活性を正確に評価するためである。プロテアソーム阻害剤としては、MG132等を挙げることができる。
PCA−1発現細胞の被検化合物による処理は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約12〜約72時間である。また、培地中のプロテアソーム阻害剤の濃度は、ユビキチン化FLIPのプロテアソームによる分解が阻害される限り限定されないが、例えばMG132を使用する場合には、該濃度は通常約10〜約30μMである。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるFLIPユビキチン化が評価される。FLIPユビキチン化の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、細胞の抽出液からFLIPを免疫沈降し、FLIP中に結合したユビキチンの量をウェスタンブロッティングにより定量することで評価することができる。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるFLIPユビキチン化が、被検化合物を接触させない対照細胞におけるFLIPユビキチン化と比較される。FLIPユビキチン化の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるFLIPユビキチン化は、被検化合物を接触させた細胞におけるFLIPユビキチン化の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
比較の結果、対照細胞と比較してFLIPユビキチン化の程度を増大させた化合物が、FLIPユビキチン化促進用化合物として選択される。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、FLIPユビキチン化促進剤、アポトーシス抑制剤、細胞増殖阻害剤、又は癌(前立腺癌等)の予防・治療剤とすることができる。
(4.アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法)
後述の実施例等に示されるように、PCA−1の強発現により、パクリタキセルにより誘導されるアポトーシスが阻害され、パクリタキセルに対して抵抗性が獲得される。また、PCA−1の強発現により、TRAIL等により誘導されるカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスが阻害され、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子(FASL、TRAIL、TNF−R、抗FAS抗体等)に対して抵抗性が獲得される。従って、PCA−1が発現している細胞において、パクリタキセルやカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により誘導されるアポトーシスを促進し得る化合物が得られれば、パクリタキセルやカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子に対して抵抗性を獲得したような癌の予防・治療用化合物として有用である。特に、前立腺癌においては、PCA−1が高発現しているので(第123回日本薬学会年会要旨集4、p15、2003年)、パクリタキセルやカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により誘導されるアポトーシスを促進し得る化合物は、前立腺癌の予防・治療用化合物として特に有用である。従って、本発明は、以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法を提供するものである:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
更に、本発明は、以下の工程を含む、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法を提供する:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルやカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。
PCA−1発現細胞としては、当業者であれば容易に同定でき、例えば上述の哺乳動物の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できるが、好ましくは前立腺癌細胞が用いられる。該細胞におけるPCA−1発現量は、パクリタキセル誘導性アポトーシス又はカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスを阻害し得る程度の発現量であれば、特に限定されないが、該アポトーシスを確実に阻害することにより鋭敏なスクリーニング方法を構築するため、PCA−1無発現細胞(例えばPCA−1に対するsiRNAにより、PCA−1の機能的発現が阻害された細胞)と比較して、パクリタキセル誘導性アポトーシス又はカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスを約1/2、好ましくは約1/10にまで阻害し得る程度の発現量であることが好ましい。該細胞において、PCA−1は天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよいが、より強力かつ確実なPCA−1発現を達成するため、遺伝子導入により強制的にPCA−1を発現させることが好ましい。遺伝子導入によるPCA−1発現は、PCA−1を発現し得る発現ベクターを上記細胞へ導入することにより達成される。該発現ベクターは、導入対象である細胞内で機能可能なプロモーターの下流にPCA−1をコードする核酸が機能的に連結された態様で提供される。
工程(1)においては、PCA−1発現細胞が被検化合物存在中でパクリタキセル又はカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により処理される。被検化合物は、上述の(2.PCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を選択することを含むスクリーニング方法)において使用されるものと同様である。
PCA−1発現細胞の被検化合物による処理は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約12〜約72時間である。また、培地中のパクリタキセルの濃度は、PCA−1無発現細胞においてアポトーシスを誘導し得る濃度範囲であれば特に限定されないが、例えば約0.1〜約20μMである。培地中のカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子の濃度は、PCA−1無発現細胞においてアポトーシスを誘導し得る濃度範囲であれば特に限定されず、該誘導因子の種類やスクリーニングに使用される細胞の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子としてTRAILを使用する場合、培地中のTRAILの濃度は、約1〜約1000ng/mlである。
次に、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの度合いが評価される。アポトーシスの測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、DNAのヌクレオソーム単位で切断された断片を「DNAラダー」として検出するアガロースゲル電気泳動法、50〜300kbpの高分子DNA断片を生じるアポトーシスを検出するパルスフィード電気泳動法、組織内のアポトーシス検出のためにDNA切断端を検出するin situ end labeling法(TUNEL法)、蛍光色素を用いて細胞染色後、細胞サイズの変化やDNA含量低下細胞の検出、あるいは生死細胞の検出などをフローサイトメトリーで行う方法などを使用することができる。
次いで、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの度合いが、被検化合物を接触させない対照細胞におけるアポトーシスの度合いと比較される。アポトーシスの度合いの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検化合物を接触させない対照細胞におけるアポトーシスは、被検化合物を接触させた細胞におけるアポトーシスの測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
比較の結果、対照細胞と比較してパクリタキセル誘導性又はカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシスの度合いを増大させた化合物が、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物又はカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス促進用化合物として選択される。
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る化合物は、医薬品開発のための候補化合物とすることができ、また、上記の本発明の剤と同様に、製剤化することにより、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進剤、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス促進剤、又は癌(前立腺癌等)の予防・治療剤とすることができる。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
(材料及び方法)
1)細胞株と遺伝子、遺伝子導入細胞株の作製
細胞株はヒト前立腺癌細胞株DU145(ATCCより購入)をRPMI培地(10%血清存在下)で培養し使用した。PCA−1 vectorよりヒトPCA−1 geneを切り出し、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしているベクター,pIRES/Neoに導入した(以下pIRES/Neo/PCA−1)。同遺伝子をDU145に遺伝子導入(lipofection法)し、48時間後にネオマイシンを加え約2ヶ月間培養を行い、ネオマイシンに抵抗性を示すクローン(DU145/PCA−1)を少なくとも2クローン抽出し、以後の実験に供した。コントロールとしては、空ベクターを導入し同様の条件下で培養したクローン(DU145/Neo)を使用した。
また、FLIP(FLICE−like inhibitory protein)については、RT−PCR法によりcDNAを作製しpME18S−FLAG2に組み込み、ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするベクター,pTK−Hyg vector(Clonetech Laboratories Japan,Ltd.,Tokyo,Japan)とともにDU145に遺伝子導入(lipofection法)した。ハイグロマイシン存在下に約2ヶ月間培養を行い、ハイグロマイシンに抵抗性を示すクローン(DU145/FLIP)を少なくとも2クローン抽出し、実験に供した。コントロールとしては空ベクターを導入し同様の条件下で培養したクローン(DU145/HygB)を使用した。
2)PCA−1のノックダウン
PCA−1に対するsiRNA(CCGAGAGUGAACCUGACC:配列番号3)をpRNA−H1.1/Hygro vectorに組み込み、DU145に一過性トランスフェクション(lipofection法)を行った。発現抑制、ノックダウン効果はウェスタンブロット法で確認した。
3)FLIPユビキチン化アッセイ
細胞をMG132で刺激後、回収し抗FLIP抗体で免疫沈降した後、抗FLIP抗体ならびに抗ユビキチン抗体を用いてウェスタンブロットを行い、FLIP分子のユビキチン化を検討した。
4)細胞増殖の検索
MTS
[(3−(4,5−dimethylthiazol−2−yl)−5−(3−carboxymethoxyphenyl)−2−(4−sulphonyl)−2H−tetrazolium,inner salt]試薬(Promega,Tokyo,Japan)を用い、添付のプロトコールに従って実験を行った。
(結果)
1)epidermal growth factorを介した細胞増殖に及ぼすPCA−1の機能について
無血清条件下で36時間における細胞増殖を検討した。非刺激では有意差はなかったが(図2)、EGF(10ng/ml)刺激下ではコントロール(DU145/Neo)に比較してPCA−1過剰発現細胞株(DU145/PCA−1)の方が、細胞増殖が1.5倍から2倍に上昇し、この効果はextracellular stress−regulated kinase(ERK)の阻害剤(U0126)の前処理により阻害(cancel)された(図3)。
また、DU145/PCA−1ではコントロール(DU145/Neo)に比較して、EGF誘導性ERKの活性化ならびにその標的遺伝子であるcyclin D1の発現が有意に上昇していた(図4)。ERKの活性化はphospho−ERKの発現をウェスタンブロット法で検索することにより判定した。
2)PCA−1によるFLIPユビキチン化の阻害とFLIP−Raf−1結合の促進について
DU145/PCA−1では、コントロール(DU145/Neo)に比較してFLIPの蛋白発現が有意に上昇していた(ウェスタンブロット法による)(図5)が、RT−PCR法で見る限り、mRNA量には有意差を認めなかった。そこで、FLIPのユビキチン化に及ぼすPCA−1の役割を解析した。MG132処理後、FLIPのユビキチン化についてみると、コントロール(DU145/Neo)ではFLIPのユビキチン化を確認できたが、DU145/PCA−1ではFLIPのユビキチン化が阻害された(図6)。
興味深いことに、FLIPのみを強発現させたDU145(DU145/FLIP)では、FLIP−Raf−1相互作用がみられるが、この現象はPCA−1 siRNAの一過性強発現により内因性PCA−1をノックダウンさせることにより阻害(cancel)された(図8)。
以上より、PCA−1は、FLIPのユビキチン化を阻害することでFLIPのタンパク質発現量を高めるだけでなく、FLIPとRaf−1との相互結合(interaction)に影響し、Raf−1以下の細胞増殖シグナルを高めると考えられた。
3)パクリタキセル誘導性アポトーシスに及ぼすPCA−1の役割について
コントロール細胞株(DU145/Neo)ならびにDU145/PCA−1をパクリタキセル(100nM)で刺激し、48時間後にアポトーシスの定量をフローサイトメトリーを用いて行った。その結果、DU145/PCA−1ではコントロール株(DU145/Neo)に比較してパクリタキセル誘導性アポトーシスが有意に阻害された(図9)。また、DU145/PCA−1ではコントロール(DU145/Neo)に比較してパクリタキセルによるERK活性化が促進され、ERK阻害剤(U0126)を用いると、PCA−1によるパクリタキセル誘導性アポトーシス阻害効果がcancelされることもわかった(図10)。
以上より、PCA−1はパクリタキセルによるERK活性化を促進させることでアポトーシス誘導を阻害すると考えられた。
4)Tumor necrosis factor−related apoptosis−inducing ligand(TRAIL)誘導性アポトーシスに及ぼすPCA−1の役割について
TRAILは前立腺癌における次世代抗癌剤として注目され、そのメカニズムにFLIPが抑制的に作用することが報告されている。そこで、PCA−1のTRAIL誘導性アポトーシスの影響を解析した。DU145/PCA−1ならびにコントロール(DU145/Neo)をTRAIL50ng/mlで刺激し、24時間後にアポトーシス誘導をフローサイトメトリーで解析したところ、DU145/PCA−1ではコントロールに比較して有意にアポトーシス誘導が阻害された(図11)。
以上の結果から示唆される、細胞増殖及びアポトーシスに対するPCA−1の効果を示す模式図を図12に示す。
実施例2
(材料及び方法)
1)細胞株
ヒト前立腺癌細胞株DU145(ATCCより購入)をRPMI1640培地(10%牛胎児血清存在下)で培養し使用した。
2)PCA−1のsiRNAによるノックダウン
PCA−1に対するsiRNA(gaaagaagcugacuggauauu(配列番号4)、gcacauuugagaugagaaauu(配列番号5)、gagagaagcuucacugaaauu(配列番号6))をDU145にDharmaFECT1(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて一過性にトランスフェクションした。発現抑制、ノックダウン効果はreal−time PCRならびにPCA−1定量ELISA法で確認した。なおコントロールsiRNA(auccgcgcgauaguacgua(配列番号7))は、GEヘルスケアバイオサイエンスから購入した。
3)PCA−1のreal−time PCR
SYBE ExScript RT−PCR kit(タカラバイオ)を用い、real−time PCRを行った。使用したPCA−1、GAPDH特異的プライマー、及びPCR条件を以下に示す。
プライマー塩基配列
Real−time PCR条件
4)PCA−1のEnzyme−Linked Immunosorbent Assay(ELISA)
Trapping抗体(ウサギ抗PCA−1抗体)を96穴プレートに添加(1μg/穴)し、湿箱に入れ一晩4℃でインキュベートした。1%Tween20を含むPBSでプレートを洗浄後、ブロッキング剤を添加して室温で1.5時間放置した。洗浄後detection抗体(マウス抗PCA−1抗体クローン2−5A,0.25μg/穴)を添加し、1.5時間室温放置した。洗浄後、測定サンプル(100μl/穴)を添加し、1.5時間室温放置した。洗浄後、3次抗体(HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体,2ng/穴)を添加し、2時間室温放置した。最終洗浄後に発色剤を添加し(50μl/穴)、30min後に415nmで吸光度を測定した。
5)WST−1法
DU145にsiRNAをトランスフェクションした2日後、細胞を回収し96穴プレートに1x104/mlの細胞を100μl播種した。その後、24時間ごとに1−methoxy PMS(1−methoxy−5−methylphenazinium.methylsulfate)溶液とWST−1(2−(4−Iodophenyl)−3−(4−nitrophenyl)−5−(2,4−disulfophenyl)−2H−tetrazolium,monosodium salt)溶液を1:9で混合したものを各ウェル10μl添加し、1時間後に450nmで吸光度を測定した。対照波長として630nmを使用した。なおトランスフェクションを開始した日をday0とする。
6)アポトーシス解析
DU145にPCA−1 siRNAをトランスフェクション後、回収しethanolで固定した。その後、propidium iodideを用いて染色し,フローサイトメーターによりアポトーシス細胞の割合を解析した。
(結果)
1)PCA−1 siRNAによるノックダウン
PCA−1 siRNAをトランスフェクションした3日後(day3)にRNAを調製し、real−time PCRを行った。その結果、コントロールsiRNAトランスフェクタントに比べ、3種のPCA−1 siRNAのトランスフェクタントともPCA−1 mRNAが約20%以下であった。またPCA−1 ELISA系を用いた蛋白質レベルでの定量でも、PCA−1 siRNAトランスフェクタントでは検出限界(20pg)以下であった。この結果は使用したPCA−1 siRNAで効果的なノックダウンができたことを示す。
2)PCA−1のノックダウンによるアポトーシスの誘導
PCA−1をノックダウンしたDU145の増殖をWST−1により解析した。コントロールsiRNAトランスフェクション細胞では経時的に顕著な増殖が認められた。一方、PCA−1をノックダウンした細胞ではday6まで,ほとんど増殖が認められなかった。下表は、day3の吸光度を1とし、測定した日の吸光度を比で表している。
3)PCA−1のノックダウンによるアポトーシスの誘導
PCA−1ノックダウンによるDU145のアポトーシス解析を行った。Day2では,コントロールあるいはPCA−1 siRNAトランスフェクタントともアポトーシス細胞はほとんど認められなかった。しかし,時間経過とともにPCA−1ノックダウン細胞では顕著なアポトーシス割合の増加が認められた。
本出願は日本で出願された特願2005−227274(出願日:2005年8月4日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (26)
- 以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌細胞に対するアポトーシス促進剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6に示される塩基配列を有する核酸である、請求項1記載の剤。
- アポトーシスがカスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性である、請求項1または2記載の剤。
- 以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌細胞に対する細胞増殖阻害剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6に示される塩基配列を有する核酸である、請求項4記載の剤。
- 細胞増殖がMAPキナーゼシグナリング依存性である、請求項4または5記載の剤。
- 以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含有してなる、前立腺癌の予防・治療剤:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6に示される塩基配列を有する核酸である、請求項7記載の剤。
- PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法。
- アポトーシスがカスパーゼ8/FADD依存性又はパクリタキセル誘導性である、請求項9記載の方法。
- PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iii)からなる群から選択される、請求項9記載の方法:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能。 - PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、細胞増殖阻害用化合物のスクリーニング方法。
- 細胞増殖がMAPキナーゼシグナリング依存性である、請求項12記載の方法。
- PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択される、請求項12記載の方法:
(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。 - PCA−1の発現又は機能を抑制し得る化合物を選択することを含む、癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法。
- 癌が前立腺癌である、請求項15記載の方法。
- PCA−1の機能が、以下の(i)〜(iv)からなる群から選択される、請求項15記載の方法:(i)FLIPのユビキチン化を阻害する機能;
(ii)FLIP−Raf−1相互作用を増大させる機能;
(iii)MAPキナーゼシグナリングを増強する機能;
(iv)サイクリンD発現を増大させる機能。 - 以下の工程を含む、FLIPのユビキチン化促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞をプロテアソーム阻害剤存在中で被検化合物により処理する工程;
(2)前記細胞中のFLIPのユビキチン化を評価する工程。 - 以下の工程を含む、パクリタキセル誘導性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でパクリタキセルにより処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。 - 以下の工程を含む、カスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス促進用化合物のスクリーニング方法:
(1)PCA−1発現細胞を被検化合物存在中でカスパーゼ8/FADD依存性アポトーシス誘導因子により処理する工程;
(2)前記細胞のアポトーシスの度合いを評価する工程。 - 癌の予防・治療用化合物のスクリーニング方法である、請求項18〜20記載の方法。
- 癌が前立腺癌である、請求項21記載の方法。
- 前立腺癌細胞に対するアポトーシス促進剤を製造するための、以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - 前立腺癌細胞に対する細胞増殖阻害剤を製造するための、以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - 前立腺癌の予防・治療剤を製造するための、以下の(i)又は(ii)のPCA−1の発現又は機能を抑制する化合物の使用:
(i)PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸;
(ii)PCA−1ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はPCA−1ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはそれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。 - PCA−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6に示される塩基配列を有する核酸である、請求項23〜25のいずれかに記載の使用。
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