JP5049011B2 - 変異体lightによるt細胞腫瘍浸潤の増大 - Google Patents
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Description
免疫応答性宿主において確立された腫瘍を浸潤する活性化T細胞が少量であることは、宿主が腫瘍を処理できないことを説明する。動物モデル及び臨床研究における実験は、免疫系は個々の腫瘍細胞を認識して殺傷させ得る死滅させ得るが、一般に宿主は確立された固形腫瘍を根絶し得ないことを示している。宿主が確立された腫瘍に対して効果的に応答できないことに対するいくつかの説明があり得る:1)組織に移動する腫瘍細胞(特に、非造血系起源の腫瘍細胞)の不適当な数のためにリンパ組織において直接または間接の提示が弱いことが原因で、初期T細胞初回抗原刺激が欠如していること;2)腫瘍組織周囲の生物学的障壁が原因で、腫瘍部位へ移動する免疫細胞の数が不適当であること;3)レパートリーが限定されていることが原因で、腫瘍増殖と戦うことができない活性化された抗原特異的T細胞が消耗しているか、または短命であること;4)T細胞が腫瘍に対して非応答性であるか、または腫瘍を認識しないこと;5)免疫系を活性化するための阻害的微小環境であるか、または腫瘍内部の刺激が欠如していること。
変異体LIGHTは、T細胞の初回抗原刺激のためのケモカイン、接着分子、および共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出し、腫瘍細胞を殺傷する。
腫瘍細胞上のLIGHTmの発現は、腫瘍拒絶反応を促進する。腫瘍Ag104Aおよびその誘導体を腫瘍モデルの一つとして使用した。Ag104Aは元来、C3H(H−2k)マウスの自然骨肉腫に由来し、C3HマウスまたはB6C3F1マウスにおいて、極低用量のAg104A投与(104)でも、浸潤をほとんど生じずに累進的に増殖し得る。強力な抗原Ldを腫瘍に導入する場合、その腫瘍は免疫認識に対して耐性であり続け、このことが強力な腫瘍障壁である可能性が示唆される。変異したLIHGTmをレトロウイルスによってトランスフェクトしたAg104Ldは、その表面上にLIGHTmを安定に発現する。
繊維肉腫Ag104Ldは高い腫瘍形成能を持ち、104の細胞をレシピエントマウスC3B6F1に皮下注射した場合、100%増殖した(表1)。腫瘍上に発現した抗原Ldに対するT細胞が充満する、2C T細胞レセプター(TCR)トランスジェニックマウスは、同一の抗原を含む皮膚移植が拒絶された後でさえこれを根絶することができなかったと報告されている(Hans,1997)。腫瘍特異的T細胞を腫瘍内へ向かわせ、腫瘍部位にてこれを活性化する方法は、臨床的な癌免疫治療と同様に、拒絶反応についての決定的な超えるべき障害物であると思われる。腫瘍環境内で発現したLIGHTは、それぞれLTβR並びにHVEMを介して、腫瘍内部へT細胞を誘引して活性化し、腫瘍拒絶反応へ導くことによって、寛容性を打破し得る(図2)。これを実証するため、レトロウイルスベクターMFGを利用するレトロウイルス形質導入によって、LIGHTをこの腫瘍細胞株で発現させた。当初、形質導入後、腫瘍細胞表面にてLIGHT発現は検出されなかった。LIGHTは、その配列上に、腫瘍細胞株の表面上で安定して存在することを妨げ得るタンパク質分解部位を有しているので、膜上のLIGHTタンパク質分解を減少させるLIGHTの変異版(LIGHTm)が使用された(図3A)。変異体LIGHTm/MFGのAg104Ldへのレトロウイルスによる形質導入の後、LTβR−Igによって、形質導入された腫瘍細胞の表面上でLIGHTm発現を検出した(図3B)。このような細胞をAg104Ld−LIGHTmバルクと定義した。さらに、LIGHTm発現Ag104Ld腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。他に指定されていない限り、ほとんどの実験において、このクローンの一つであるH10を使用した。変異体LIGHTmはそのレセプターであるLTβR及びHVEMの双方に結合することができた。試験したAg104Ld−LIGHTmバルク並びに全クローンは、LIGHTm、LTβR及びHVEMのレセプターに結合し、可溶性LTβR及びHVEMによって染色可能であることによって示した。LTβR−Ig及びHVEM−Igによる、Ag104Ld−LIGHTmバルク及びクローンH10の典型的な染色プロフィールを示した(図3B)。親腫瘍細胞並びにLIGHTトランスフェクト体の増殖は、組織培養物並びにRAG−1−/−マウスの双方において同じであった(図3D)。様々な数のLIGHTm発現腫瘍細胞、バルクもしくはクローンH10を、C3B6F1マウスに皮下接種した。レシピエントは、5X106の最高用量の注入投与したLIGHTm発現腫瘍細胞を拒絶した。これは親腫瘍が100%累進的に増殖する用量の500倍であった(表1)。LIGHTm発現腫瘍細胞バルク並びにクローH10の代表的な増殖反応速度、ならびに親腫瘍を5X106接種した時の、典型的な増殖反応速度を図3Cに示した。Ag104Ld−LIGHTmは、接種後初めの2週間は増殖し、続いて親腫瘍が増殖を続ける場合に退行し、3〜4週間で宿主を殺傷した(図3C)。
可溶性LTβRでLIGHTmの機能を遮断する場合、LIGHTm発現腫瘍が増殖したことから、腫瘍拒絶反応はLIGHTm依存的であるもようである(表1)。腫瘍拒絶反応はリンパ球に依存する。リンパ球が欠如したRAG−1−/−マウスでは、LIGHTm発現Ag104Ldは親腫瘍と同程度累進的に増殖した(図3D)。抗CD8+抗体によってCD8+T細胞が失活しているC3B6F1マウスはこれらの腫瘍を拒絶しなかったため、CD4+T細胞ではなくCD8+T細胞がLIGHT発現Ag104Ldの拒絶反応を媒介するのに必須であった(表1)。一方、CD4+T細胞はこの腫瘍拒絶に必要ではない。
LIGHTm媒介腫瘍拒絶反応の基礎となる可能性のある機構を調べるため、5X106のLIGHTm発現Ag104Ldもしくは同じメンバーの親腫瘍細胞をC3B6F1マウスに皮下注射した。腫瘍接種後10〜14日目、LIGHTm発現腫瘍細胞が拒絶される前に腫瘍組織を回収した。この腫瘍組織をHE染色すると、大量のリンパ球が浸潤していることが示された(図5)一方、親腫瘍ではごく僅かな浸潤しか見られなかった(図5)。免疫蛍光染色によって、浸潤しているリンパ球の内、大量のThy1.2+T細胞(図5)、特にCD8+T細胞がLIGHTm発現腫瘍内部に存在していることを確認した(図5)。
LIGHTは、T細胞増殖を導く強力な共刺激活性を有することが報告されている。LIGHTの変異体形態では、分子の膜貫通部位に極近い、細胞外ドメインにおけるタンパク質分解部位に相当する4つのアミノ酸を欠失させた(図3A)。LIGHTm分子内の変異は、LIGHTmの共刺激効果に影響する。細胞外ドメインを短くした形態であるアミノ酸85〜239のみを含有し、精製を容易にするためのフラッグペプチドを有する組み換えLIGHTmタンパク質を作製した(組み換えLIGHTm)(図4A)。改変したLIGHTmの細胞外ドメインは、T細胞を共刺激するに十分であった。この試験のため、プレート結合組み換えLIGHTmを用いたインビトロ共刺激アッセイを用いて、準最適用量のCD3に対する固定化抗CD3モノクローナル抗体存在下で精製マウスT細胞を刺激した。固定化組み換えLIGHTmは、準最適量のCD3に対する抗体存在下で、用量依存の様式で強力に精製マウスT細胞の増殖を刺激した(図4B)。LIGHTm分子から欠失しているタンパク質分解部位を除いたアミノ酸85〜239である、改変されたLIGHTmの細胞外ドメインは、T細胞レセプターの関係が生じる場合、T細胞増殖の共刺激に十分であった。
CD8+T細胞の浸潤はLIGHTm媒介腫瘍環境よる腫瘍拒絶に相関した。LIGHTmはT細胞に対する強力な共刺激効果を有するので、別の強力な共刺激分子であるB7.1が大量のT細胞の浸潤に関連した腫瘍拒絶反応を媒介するために十分か否かが問題となった。Ag104Ld−LIGHTmと同じ方法で形質導入した5X106のAg104Ld−B7.1腫瘍細胞を、C3B6F1マウスに皮下接種した。これらの腫瘍はレシピエントにおいて累進的に増殖した。この腫瘍組織に対するHE染色は、リンパ球の浸潤をほとんど示さなかった(図5)。抗Thy−1.2並びに抗CD8を用いた免疫蛍光染色は、Ag104Ld−B7.1腫瘍組織が、親の腫瘍Ag104Ldと比較して同等のレベルのT細胞(CD8+T細胞浸潤を含む)を含むことを明らかにし(図5)、これはLIGHTm発現Ag104Ld(図5)と比較して実質的に少ない。このデータは、二つの共刺激分子(B7.1並びにCD48)を発現するAg104Ldが2C TCRトランスジェニックマウスによって拒絶されなかった(Hans,1997 JEM)という従来の所見と一致した。これら一連の証拠は、これらの腫瘍モデルにおいて、強力な共刺激だけでは腫瘍拒絶反応を媒介するのに十分ではないことが示唆された。
問題は、LIGHT媒介腫瘍環境について何が特異であるかということであった。LIGHTmはT細胞上に発現されるレセプターHVEMに結合し、これを介してLIGHTmはT細胞の共刺激を媒介する模様であるが、LTβRはLIGHTmと相互作用する別のレセプターである。LTβRシグナル伝達は、ケモカインSLC及び接着分子MAdCAM−1に対する重要な制御因子であり、ナイーブT細胞が二次リンパ組織へ帰着するのを制御する。腫瘍環境におけるLIGHTmはこれらの腫瘍間質細胞上のLTβRと相互作用して、腫瘍環境内のSLC及びMAdCAM−1をアップレギュレートすると思われる。接種後10〜14日目に、親Ag104LdあるいはLIGHTm発現Ag104Ldのいずれかから腫瘍組織を回収した。リアルタイムRT−PCRによって、LIGHTm陽性腫瘍塊は親腫瘍よりもSLCを高レベルに発現することが示された(図6A)。Ag104Ld−LIGHTm中のSLC量を検出するELISAによって、この結果を独立して確認した(図6B)。親腫瘍ではSLCはごく僅かにしか検出されなかった(図6B)。LIGHTm発現腫瘍において、より高いSLCが検出されたことが、単に、腫瘍環境(RAG−1−/−腫瘍担体からの組織)中により多く存在するT細胞に対する反応がより活発に進行していることに起因する可能性を除くため。リンパ球欠損マウス中で増殖するAg104Ld−LIGHTm腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのSLCを含有していた(図6B)。さらに、RAG−1−/−マウスにおいてLIGHTm陽性及びLIGHTm陰性腫瘍の双方が等しく増殖したことは、ケモカインSLC単独では腫瘍拒絶の媒介に不十分であることを示唆している。これらのデータは、C3B6F1腫瘍保持動物(TBA)から回収された他の5対のLIGHTm陽性及びLIGHTm陰性腫瘍試料由来の組織切片の免疫化学的染色に一致した。SLC及びヘマトキシリンで二重染色した腫瘍組織で明確に示されたように、高密度の浸潤するリンパ球に囲まれたLIGHT発現腫瘍内の間質に富む部位領域で、SLCの非常に強い染色が検出された(図6C)。しかし、LIGHTm陰性の腫瘍組織上の間質に富む部位領域においてはSLCは検出されなかった(図6C)。また、コントロール腫瘍の場合と同じく、B7.1発現腫瘍由来の組織もまた、SLC染色は見られず、浸潤するリンパ球はほとんど存在しなかった(図6C)。
LIGHTm媒介腫瘍環境は、ナイーブT細胞の導入を可能にする可能性のある高レベルのケモカインSLC及び接着分子MAdCAM−1を含有する。直接に関連する三つの疑問は、1)このような環境がナイーブT細胞を動員することができるか否か、2)インビボにおいて、LIGHTm存在下でナイーブT細胞が腫瘍内で活性化され得るか否か、3)抗原を保時する腫瘍がこれらT細胞によって拒絶され得るか否か、であった。Ag104が発現する抗原Ldは、腫瘍細胞の表面で、ハウスキーピング遺伝子α−ケトグルタル酸脱水素酵素由来のペプチドを提示する同種異系MHCクラスI分子である。C3B6F1(H−2kXb)あるいはB6(H−2k)宿主において、2C T細胞反応は、抗原が修飾されて抗原提示細胞(APC)によって交差提示されると宿主から消滅するLdを、そのナイーブ形態において必要とするため、養子移入した2C TCRトランスジェニックT細胞のみが直接Ldを提示するAg104腫瘍細胞を認識する。皮下で増殖する腫瘍はリンパ組織内の直接経路を介してT細胞を初回抗原刺激するには極めて無効果である。3〜5×105のCFSE標識2C T細胞をこのC3B6F1宿主に養子移入して24時間後にAg104Ldを皮下接種した。腫瘍流入リンパ節あるいは他の非流入リンパ節または脾臓において、2C T細胞の増殖は、Ag104Ld腫瘍誘発後7日目まで、蛍光色素CFSE希釈液によって検出されないか、あるいは測定されなかった。この7日間の観察の間、二次リンパ器官における2C T細胞は、その表面のCD25あるいはCD69、CD44が低量であることによって示されるように、ナイーブ表現型を維持した。これらは、多くの理由によって抗原を有効に交差提示することができない場合、腫瘍細胞上に発現した抗原に特異的なT細胞が活性化されない可能性のあることを示唆している。最終的に、5×106もの腫瘍抗原特異的2C T細胞を宿主に移入した時でさえ、106のAg104Ld腫瘍細胞はC3B6F1マウスによって拒絶されなかった。
LIGHTm媒介腫瘍環境はナイーブT細胞を動員することができ、この腫瘍内部でナイーブT細胞を活性化して腫瘍拒絶を引き起こす。この発見の潜在的治療効果は、LIGHTm発現腫瘍細胞を定着した親腫瘍に注入することによって示された。これらの定着した腫瘍の拒絶を導く抗原の存在下で、当該処置によってリンパ様環境を作り出し、ナイーブT細胞を誘引することができ、続いて共刺激を介して腫瘍特異的T細胞を活性化することができた。105のAg104LdをC3B6F1レシピエントに皮下接種し、この腫瘍を14日間定着させた。次に106のLIGHTm発現Ag104Ld腫瘍細胞をこの定着した親腫瘍内部に注入した。コントロールとして同量のPBSを同じ方法で親腫瘍に注入した。LIGHTm発現腫瘍細胞で処理した定着した親腫瘍は、退縮して消失し始めるまでの10〜15日間増殖を続けた(図8)。PBSで処理したAg104Ld腫瘍は攻撃的に増殖した。
図10は、腫瘍細胞におけるインビボの変異体LIGHTの発現の存在に相関して、腫瘍体積が減少することを図示する。
(マウス、細胞株及び試薬)
4〜8週齢のメスC3HXC57BL/6 F1(C3B6F1)マウスは、National Cancer Institute、Frederick Cancer Research Facility(Frederick, MD)から購入した。C57BL/6−RAG−1−欠損(RAG−1−/−)マウスは、Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)から購入した。RAG−2欠損/B6を遺伝子バックグラウンドとするH−Y TCRトランスジェニックマウス(H−Yマウス)はTaconic Farms(Germantown,NY)から購入した。B6にて10代継代されたRAG−1欠損を遺伝子バックグラウンドとする2C TCRトランスジェニックマウス(2Cマウス)はJ.Chen(Massachusetts Institute of Technology,Boston,MA)によって提供された。OT−1 TCRトランスジェニックマウス(OT−1マウス)はA.Ma(The University of Chicago)によって提供された。RAG−1−/−マウス、H−Yマウス、2Cマウス、OT−1マウスはシカゴ大学の特別な病原菌が存在しない施設内で繁殖及び飼育した。動物の飼育と使用は施設ガイドラインに従った。
pMFG−S−変異体LIGHTmを産生するため、pcDNA3.1−変異体LIGHTmをNcoI及びBamHIで分解し、NcoI及びBamHI分解pMFG−S−TPAプラスミドに連結させた(Dr.Mulligan RC,Massachusetts Institute of Technology,Boston,MA)。変異LIGHTmを含有するウイルスを産生するφNxEcoパッケージング細胞は、カルシウム沈降法によるMFG−S−変異LIGHTmを用いた一過性トランスフェクションによって作製した。感染したAg104Ld腫瘍細胞(Ag104Ld−LIGHTmバルク)による変異体LIGHTmの発現を、変異体LIGHTmを認識するウサギ抗血清を用いた細胞染色によって分析した。続いて、この形質移入した変異体LIGHTm発現Ag104Ld腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。Ag104Ld−LIGHTmクローンH10は、今回の実験で使用したこれらクローンの一つである。
腫瘍細胞を背面下部、即ちマウスの尾付け根から0.5〜1cm上部に、皮下接種した。腫瘍の増殖を3〜4日ごとにキャリパーを使用して測定した。立方センチメートルで表す体積は式V=πabc/6によって算出した。ここでa、b及びcは3つの直交する径である。
組織学的試験のための腫瘍組織を、記載した時に採取して10%中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋してヘマトキシリン及びエオシンで染色した。SLCの免疫組織化学染色のために、腫瘍組織を採取し、OCT化合物(Miles−Yeda,Rehovot,Israel)内に包埋して−70℃で凍結した。凍結切片(厚さ5〜10μm)を、PBS中の冷2%ホルマリンで固定し、0.1%サポニン/PBSで透過性を持たせた。この切片を、加湿チャンバー内において常温で30分、0.1%サポニン/PBS中の5%ヤギ血清で前ブロッキングした。SLCに対する染色は、最初に、ブロッキング緩衝液中に1/25に希釈したビオチン化ヤギ抗SLC抗体(R&D systems Inc.Minneapolis,MN)でインキュベートして行った。2時間後にアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギIg抗体(Vector Laboratories Inc.Burlingame,CA)を加えた。免疫蛍光染色のため、加湿チャンバー内において常温で30分、切片をPBS中の2%正常マウス血清、ウサギ血清及びヤギ血清でブロッキングした。ブロッキング溶液を、ブロッキング溶液で1/100に希釈した50μlの一次抗体PE結合抗Th1.2抗体(BD PharMingen)またはPE結合抗CD8(BD PharMingen)に置き換え、切片を加湿チャンバー内にて常温で1時間インキュベートした。検体は、10%の1,4−ジアゾビシクロ[2.2.2]オクタンを含有するMowiol 4−88(BD Biosceiences,La Jolla,CA)上にのせた。Zeiss Axioplan顕微鏡(Zeiss,Oberkochen,ドイツ)及びPhotometrics PXL CCDカメラ(Photometrics,Tucson,AZ)を使用して、サンプルは48時間以内に分析した。Openlab v2.0.6(Improvision,Lexington,MA)を使用して、非隣接デコンボリューションを行った。
腫瘍ホモジェネートを調製してCCL21についてアッセイを行った。腫瘍保持マウスから相当量の腫瘍組織を回収して秤量し、タンパク質分解酵素阻害剤を含有するPBS中でホモジェナイズして遠心分離し、その上清を回収した。ポリスチレン96ウェルマイクロタイタープレート(Immulon 4,Dynatech Laboratories,Chantilly,VA)をPBS中の2μmlヤギ抗マウスCCL21でコーティングし、次に常温で30分間、PBS中の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした。洗浄後、既知濃度の標準液(Recombinant CCL21,50ng/ml,R&D)の連続希釈物とサンプルとを加え、常温で2時間インキュベートした。3回の洗浄後、ビオチン化ウサギ抗SLC抗体をウェルに加えた。2時間インキュベーションおよび洗浄後、50μlの1/1000希釈アルカリホスファターゼ結合アビジン(Dako)を1時間加えて発色させた。自動プレートリーダー(Spectra−Max 340,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上にて405nmで発色を測定した。CCL21の量をELISAによって標準曲線から判定し、組織重量に応じて正規化した。データは平均値±標準偏差である。
リアルタイムPCRを行った。Absolute RNA miniprep Kit(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて腫瘍から全RNAを単離し、DNaseI(Life Technologies,Grand Island,NY)で消化して染色体DNAを除去した。残存するDNaseIを、75℃、20分間で不活化し、RNAの保全性は臭化エチジウム染色ゲルによる可視化によって評価した。First Strand cDNA Synthesisキット(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、5μgの全RNAをcDNAに逆転写した。このリアルタイム定量PCR分析はABI Prism 7700配列検出システム(PE Applied Biosystems)で行った。CCL21に対するプライマー配列は、5’−AGACTCAGGAGCCCAAAGCA−3’(順方向プライマー)(配列番号2)および5’−GTTGAAGCAGGGCAAGGGT−3’(逆方向プライマー)(配列番号3)であり、CCL21に対するプローブは、5’−CCACCTCATGCTGGCCTCCGTC−3’(配列番号4)であった。MAdCAM−1に対するプライマーは、5’−GACACCAGCTTGGGCAGTGT−3’(順方向プライマー)(配列番号5)および5’−CAGCATGCCCCGTACAGAG−3’(逆方向プライマー)(配列番号6)であり、MAdCAM−1に対するプローブは、5’−CAGACCCTCCCAGGCAGCAGTATCC−3’(配列番号7)であった。GAPDHに対するプライマーは、5’−TTCACCACCATGGAGAAGGC−3’(順方向プライマー)(配列番号8)および5’−GGCATGGACTGTGGTCATGA−3’(逆方向プライマー)(配列番号9)であり、GAPDHに対するプローブは、5’−TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG−3’(配列番号10)であった。CCL21ならびにMAdCAM−1プローブを6−カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識した。GAPDHプローブをテトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(TET)で標識した。各cDNAサンプルをAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含むTaqMan Universal PCR master mixture(PE Applied Biosystems)を製造者の使用説明書に従って用いて、CCL21およびGAPDHまたはMAdCAM−1およびGAPDHについて二本鎖で増幅した。PCRの条件は、50℃で2分、95℃で10分、95℃で15秒および60℃で1分を40サイクルであった。比較CT(増幅プロットと臨界値との間の交差する点にある臨界サイクル数)法を使用して標的遺伝子の濃度を決定し、内部GAPDHコントロールに対して標準化した。
これらの実験のため、GEArray Q series Mouse Chemokines and Receptors Gene Array membrane(SuperArray,Bethesda,MD)を使用した。Absolute RNA miniprep Kit(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて腫瘍由来の全RNAを単離し、DNaseI(Life Technologies,Grand Island,NY)で消化して染色体DNAを除去した。残存するDNaseIを、75℃、20分間で不活性化した。RNAの保全性は臭化エチジウム染色ゲルで可視化することによって評価した。このマイクロアレイは、製造者の使用説明書に従って使用された。簡単には、提供された試薬を使用して、MMLV逆転写酵素を用いた逆転写によって全RNAからcDNAを調製し、[−32P]dCTP(3,000Ci/mM)で放射性物質標識し、次いで正確に特定された条件下で整列されたDNAを含む陽性荷電のナイロン膜とハイブリダイズした。洗浄後、このアレイをホスホイメージャー(phosphorimager)によって可視化した。ハウスキーピング遺伝子PUC18、アクチンおよびGAPDHに対するハイブリダイゼーションシグナルの強度に基づいて積荷を調整し、Image Quantソフトウエアを使用してホスホイメージャーにより記録したデジタル画像をデジタルデータに変換して後に、遺伝子発現を定量した。GEArray Analyzerソフトウエアを製造者の使用説明書に従って使用して生データを解析した。
製造者(Miltenyi Biotec,Auburn,California)による指示どおりに磁場におけるネガティブ選択法によってT細胞を精製した。単離したT細胞の精製度は、95%を超えており、これはCD3に対するモノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーで評価した。0.2g/mlのCD3に対するモノクローナル抗体でコーティングしたプレートをさらに37℃で4時間、LIGHTm−flagでコーティングした。洗浄後、精製T細胞(1×106細胞/ml)をこのウェル内で培養した。CD28に対するモノクローナル抗体(1μg/ml)を可溶化形態で使用した。全てのアッセイにおいて、3日間の培養中最後の15時間に1Ci/ウェルの3H−チミジンを添加して、T細胞の増殖を測定した。3H−チミジンの取り込みは、TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard instrument,Meriden,CT)にて測定した。
変異体LIGHTmがLTbRおよびHVEMに結合することを確認するために、変異体LIGHTをトランスフェクトしたAG104Ld腫瘍細胞(AG104Ld−LIGHTm)を、LTbR−IgまたはHVEM−Ig(0.02mg/ml)と共にインキュベートして洗浄し、それぞれPE結合ロバ抗ヒトIgG抗体またはFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体で染色した。Ldの発現分析のため、腫瘍細胞を抗Ld抗体とインキュベートして洗浄し、FITC結合抗マウスIgG抗体と共にインキュベートした。CFSE標識2C T細胞の増殖を検出するため、単離したリンパ節(LN)細胞、脾細胞、および腫瘍浸潤T細胞(TIL)を、ビオチン化1B2抗体で染色して洗浄し、CyC結合ストレプトアビジンおよびPE結合抗CD8抗体で染色した。CFSE標識2C T細胞およびCD44の発現を分析するため、単離したLN細胞、脾細胞またはTILをビオチン化1B2抗体で染色して洗浄し、PE結合ストレプトアビジンとCyC結合抗CD44抗体との混合物で染色した。CFSE標識2C T細胞とCD62L発現の分析のため、単離したLN細胞、脾細胞またはTILをビオチン化1B2抗体で染色して洗浄し、CyC結合ストレプトアビジンおよびPE結合抗CD62Lで染色した。サンプルを、FACScanで分析し、データをCELLQuestソフトウエアまたはFlowJoソフトウエアを用いて分析した。
LN細胞および脾細胞を2Cマウスから単離し、CD8+T細胞濃縮キット(Miltenyi Biotec,Auburn,California)を用いてCD8+T細胞をネガティブ選択した。分析の際、濃縮されたCD8+細胞のうちの>90%が2Cレセプターを発現していた。腫瘍増殖のアッセイのため、約3×106の2C T細胞をH−YマウスまたはOT−1マウスに移入した。同数の2C T細胞を各実験にて各マウスに移入した。CFSE標識T細胞を移入するため、2×107/mlのT細胞を、10μM CFSEを用いてPBS溶液中37℃、30分間で標識した。この細胞を同量のFCS用いて1分間でクエンチして3回洗浄した。3×106のCFSE標識T細胞を、0.2ml容量で腫瘍保有マウスの後眼窩叢内に静脈内注射した。指示した時間に、鼡径リンパ節(DLN)、他のリンパ節(非流入リンパ節[NDLN])、脾臓または腫瘍から細胞を単離した。
CD4+細胞についてモノクローナル抗体(mAb)GK1.5(Dialynas DM JI 1983)、CD8+細胞についてmAb 2,34(Sarmiento M 1980 JI)を使用する標準的手順(免疫学に関する現在のプロトコール)によって、マウスのリンパ球サブセットを除去した。FACSによる脾細胞およびリンパ節の実験によって、除去したサブセットが、全リンパ球のうちの<0.5%であり、他のサブセットは正常レベルであることが示された。マウス内でLIGHTmを遮断するため、腫瘍誘発の同日および誘発の1週間後にLTβR−Ig(100μg/注射)を腹膜内で投与した。
最初に腫瘍組織内の血液混入を減少させるためにマウスを飼育した。腫瘍組織を採取してPBSで洗浄し、切断して小片とした。これを37℃の振盪インキュベーターにて、2% FCSおよび1.25mg/mlのコラゲナーゼD(コラゲナーゼD溶液)を添加したDMEMに40分間再懸濁した。40分後に単細胞懸濁液を回収し、全腫瘍組織が解離して単細胞懸濁液となるまで、細胞凝集塊をさらに40分間コラゲナーゼD溶液中で消化した。
LIGHTmをコードする核酸の患者への送達は、患者が直接、核酸あるいは核酸保有ベクターに暴露される直接送達、または最初に生検から得た腫瘍細胞をインビトロでこの核酸で形質転換して放射線処理し、次いで患者へ移植する間接送達のいずれかであり得る。これらの手法は、腫瘍の抑制あるいは他の疾患の治療のための遺伝子治療にて施行されている。
核酸配列をインビボに直接投与し、そこでそれらを発現させてコードされるタンパク質を産生した。これは、以下による当該分野で公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る:例えば、この核酸塩基配列を適当な核酸発現ベクターの一部分として構築し、それらが細胞内に入るように投与すること、欠損させたもしくは弱毒化したレトロウイルスベクターあるいは他のウイルスベクター(米国特許第4,980,286号)を使用して感染させること、または裸のDNAを直接注射、または微粒子照射、もしくは脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト試薬を用いたコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルによるカプセル化、の使用、または核に入ることが知られているペプチドと結合させてそれらを投与すること、またはレセプター媒介性エンドサイトーシスに関わるリガンドに結合させてそれを投与すること(これは、このレセプターを発現する細胞型を特異的に標的とするために使用され得る)など。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現のために相同組み換えによって宿主細胞DNA内に取り込ませ得る。
本発明の抗体をコードする核酸塩基配列を含むウイルスベクターは、特定の核酸の送達するために使用される。例えば、レトロウイルスベクターが、使用され得る。このレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要な構成要素を含む。遺伝子治療で使用する、所望のタンパク質をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター内にクローン化され、これによって、遺伝子の患者への送達が容易になる。アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され得る別のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に呼吸器上皮へ遺伝子を送達するのに魅力的なビヒクルであり、アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞に感染することができるという利点を有する。アデノ随伴ウイルス(AAV)もまた、遺伝子治療での使用が提案されている(米国特許第5,436,146号)。レンタウイルス(Lentavirus)は、遺伝子治療での使用に有望である。
遺伝子治療の別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクトまたはウイルス感染のような方法によって組織培養物中の細胞に遺伝子の移入する工程を包含する。通常、移入の方法としては、選別可能なマーカーの細胞への移入が挙げられる。次いで、細胞は選別を受け、移入遺伝子を取り込み発現している細胞が単離される。次いで、この細胞は患者へ送達される。この方法で核酸は、得られる組み換え細胞をインビボ投与するのに先立って細胞内に導入される。そのような導入は、当該分野で公知の任意の方法(トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、この核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性トランスフェクト、微小核体媒介性トランスフェクト、スフェロプラストなどが挙げられるが、これらに限定されない)によって実行され得る。この技術は、細胞への安定した核酸移入を提供するはずであり、この結果、核酸は、その細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、そしてその細胞の子孫によって発現可能である。
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」は、腫瘍特異的免疫反応を誘発する組成物(例えば、LIGHTm抗原およびアジュバント)をいう。これらのワクチンとしては、予防的なもの(新たな腫瘍を予防する)および治療的なもの(親腫瘍を根絶する)が挙げられる。変異体LIGHTをコードするDNAワクチンのようなワクチンベクターは、腫瘍に対する免疫応答を誘発するために使用され得る。ワクチン組成物を一部位(例えば、腫瘍から離れた部位)へ投与することによって、この応答は、患者自身の免疫系により誘発される。この免疫反応は、身体中の腫瘍細胞(例えば、原発腫瘍細胞および転移腫瘍細胞の両方)の根絶をもたらし得る。腫瘍ワクチンを作製する方法は、当該分野で周知である(例えば、米国特許第5,994,523号および同第6,207,147号(これらの各々が、本明細書中で参考として援用される)を参照する)。
(肺のクローン形成アッセイ)
(材料)
1)DMEM 5% FCS(+p/s、HEPES)
2)コラゲナーゼ4型(Sigma)
3)60μM 6−チオグアニン
4)50ml コニカルチューブ
5)6ウェル組織培養プレート
6)37℃振盪インキュベーター/組織インキュベーター
7)解剖器具:ハサミ、膝状ハサミおよび鉗子
8)70μmナイロン細胞ストレーナー
9)ACK溶解液
10)メタノール
11)0.03%(w/v)メチレンブルー溶液
注意:全ての溶液および器具は滅菌でなければならず、従って無菌操作が使用されるべきである。
肺一個当たり約25mlの培地にコラゲナーゼを加えて1.5mg/ml濃度の培地を作製する。
1.マウスから肺を取り出し、6ウェルのプレートへ移す
2.約200μlの培地を肺に加える
3.膝状ハサミを用いて、肺を小片に切り刻む
4.閉じたハサミの曲線部分を利用して、切り刻んだ肺を5mlコラゲナーゼ培地の50mlコニカルチューブへ移す
5.ウェルへ5mlの培地を加えてピペットで取り出し、残りの肺小片をコニカルチューブへ移す
6.37℃で20分間、175rpmの振盪インキュベーターに置く
7.上清を細胞ストレーナーに通してきれいな50mlコニカルチューブへそそぐ−細胞ストレーナー上の任意の肺小片は、二次消化のためにコニカルチューブへ戻す
a.消化物からの上清を含む試験管を、1500rpmで5分間遠心分離して遠心沈降させる
b.遠心沈降後、上清を捨てる
c.1mlのコラゲナーゼを含まない新鮮培地に、ペレットを再懸濁する
8.5分間ACK溶解する
9.細胞数を数える
10.3×105、3×104、3×103の細胞を12ウェルプレートにプレーティングする
11.60μMの6−チオグアニンを各ウェルに加える
12.プレートを、5% CO2、5〜10日間、37℃の組織インキュベーター内に置く。
(必ずしも必要ではないが、コロニー数の計数が容易になる)
1.組織培養プレートから培養培地を捨てる
2.各プレートに5mlのメタノールを加えて揺り回し、細胞を固定する。室温で5分間インキュベートする
a.注意:コロニーは白色に変わるはずである
3.メタノールを捨て、各プレートを5mlの蒸留水穏やかにリンスする
a.重要な注意:細胞が固定されるまで、細胞を水と接触させない
4.各プレートに5mlの0.03%(w/v)メチレンブルー溶液を添加する。揺り回してプレート全体が覆われるようにし、室温で5分間インキュベートする
5.染色液を捨て、5mlの蒸留水で穏やかにリンスする
6.プレートを空気乾燥させ、その後、青色のコロニーを計数する
1つのコロニーが、1つのクローン形成性転移細胞を表す。
引用された刊行物は、それらが本発明に関する範囲で参考として援用される。
Claims (15)
- 腫瘍に対するT細胞の有効な抗腫瘍活性を誘導するための組成物であって、該組成物は、
プロテアーゼ耐性変異体LIGHTをコードするcDNA分子を含み、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、組成物。 - プロテアーゼ耐性変異体LIGHT発現腫瘍細胞を含む、治療ワクチンであって、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、治療ワクチン。
- プロテアーゼ耐性変異体LIGHTおよび腫瘍細胞中の腫瘍抗原を含む、予防ワクチンであって、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、予防ワクチン。
- ナイーブT細胞を初回抗原刺激するために必要とされるケモカイン、接着分子、および同時刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作製することによって、腫瘍を破壊または拒絶するための組成物であって、該組成物は、
プロテアーゼ耐性変異体LIGHTをコードするcDNA分子を含み、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、組成物。 - 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項4に記載の組成物。
- プロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質をコードする変異体cDNAであって、該変異体cDNAは、LIGHTタンパク質の79〜82位に由来する、タンパク質分解性部位EKLIをコードしない、変異体cDNA。
- LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、プロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質であって、ここで、該変異体LIGHTタンパク質は、腫瘍細胞の表面上に安定に存在する、変異体タンパク質。
- 前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項7に記載のプロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質。
- プロテアーゼ耐性変異体LIGHTで形質転換された、宿主細胞であって、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、宿主細胞。
- プロテアーゼ耐性変異体LIGHT cDNA分子を有する、ベクターであって、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、ベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 候補抗腫瘍化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)プロテアーゼ耐性変異体LIGHT発現細胞およびコントロール細胞を得る工程であって、ここで、該変異体LIGHTは、該LIGHTタンパク質をプロテアーゼ耐性にするために膜貫通ドメインと細胞外ドメインのアミノ酸85位との間のプロテアーゼ切断部位を欠失させたLIGHTのアミノ酸配列を有する、工程;
(b)該候補抗腫瘍化合物を該LIGHT発現細胞およびコントロール細胞に投与する工程;ならびに
(c)コントロール細胞と比較して該変異体LIGHT発現細胞における腫瘍細胞の減少または死滅が起こるか否かを決定する工程、を包含する方法。 - 前記プロテアーゼ切断部位がEKLIである、請求項7に記載のプロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質。
- 前記変異体LIGHTタンパク質が腫瘍特異的T細胞を活性化する、請求項7に記載のプロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質。
- 前記タンパク質がヒトタンパク質である、請求項7に記載のプロテアーゼ耐性変異体LIGHTタンパク質。
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