JP5044655B2 - 電気化学的テストストリップ用の伝達物質としてルテニウムヘキサミンを使用する試薬調合物 - Google Patents

Description

（１．優先権）
本願は、米国特許法第１１９条に基づき、２００６年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６０／８５０，２２１号「電気化学的テストストリップ用のルテニウムベースの伝達物質を使用する試薬調合物（A REAGENT FORMULATION USING A RUTHENIUM BASED MEDIATOR FOR ELECTROCHEMICAL TEST STRIPS）」の優先権の利益を主張し、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。

（２．関連技術の説明）
ライフスキャン社（LifeScan Inc.）から入手可能なOneTouch（登録商標）Ultra（登録商標）全血検査キットに使用されているような電気化学的グルコーステストストリップは、糖尿病患者の血液サンプル中のグルコースの濃度を測定するように設計されている。グルコースの測定は、酵素グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）によるグルコースの特異的酸化に基づく。グルコーステストストリップで発生し得る反応を、下記の数式１および数式２に要約する。

数式１に示すように、グルコースは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ_（ｏｘ））の酸化型によってグルコン酸に酸化される。ＧＯ_（ｏｘ）が「酸化型酵素」とも呼ばれる点に留意すべきである。数式１の反応中に、酸化型酵素ＧＯ_（ｏｘ）は、ＧＯ_{（ｒｅｄ）}として示される還元された状態（すなわち「還元型の酵素」）に変換される。次に、数式２に示すように、還元されたＧＯ_{（ｒｅｄ）}は、Ｆｅ（ＣＮ）_６ ^３−（酸化型伝達物質またはフェリシアニドと呼ばれる）との反応によりＧＯ_（ｏｘ）に再酸化される。ＧＯ_{（ｒｅｄ）}の酸化された状態ＧＯ_（ｏｘ）への再生中に、Ｆｅ（ＣＮ）_６ ^３−は、Ｆｅ（ＣＮ）_６ ^４−（還元型伝達物質またはフェロシアニドと呼ばれる）に還元される。

上記反応を２つの電極間に試験電圧を印加して行うと、電極表面で還元型伝達物質の電気化学的再酸化によって試験電流が生成されうる。このように、理想的な環境では、上記化学反応中に生成されるフェロシアニド量は、電極間に配置されたサンプル中のグルコース量に正比例するため、生成される試験電流は、サンプル中のグルコース量に比例する。フェリシアニドなどの伝達物質は、グルコースオキシダーゼなどの酵素から電子を受容し、電子を電極に供与する化合物である。サンプル中のグルコース濃度が増加すると、生成される還元型伝達物質の量も増加する。よって、還元型伝達物質の再酸化によって発生する試験電流とグルコース濃度との間には直接的な関係がある。より詳細には、電気的インタフェース間の電子の移動の結果、試験電流の流れ（酸化されるグルコース１モルにつき２モルの電子）が発生する。このため、グルコースの導入によって生じた試験電流は、グルコース電流と呼ぶことができる。

血中グルコース濃度を知ることは、特に糖尿病を患う人々においては、非常に重要となりうるため、一般の人が、いつでも自身のグルコース濃度を測定するために血液を採取し、検査することができるように、上記の原則を利用したテストメーターが開発されている。生成されたグルコース電流は、テストメーターによって検出され、単純な数式により試験電流をグルコース濃度に関連付けるアルゴリズムを使用して、グルコース濃度の値に変換される。一般に、テストメーターは、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）および伝達物質（例えば、フェリシアニド）に加えて、サンプル受容室およびサンプル受容室内に配された少なくとも２つの電極を有する使い捨てテストストリップと連動して作動する。使用時に、使用者は、指または他の都合のよい部位を刺して出血させ、血液サンプルをサンプル受容室に導き、上記化学反応を開始させる。

電気化学の観点では、メーターは２つの機能を併せ持つ。第１に、メーターは、電気的インタフェースを分極化させ、炭素作用電極表面で電流が流れるのを可能にする分極電圧（OneTouch（登録商標）Ultra（登録商標）の場合は約４００ｍＶ）を供給する。第２に、メーターは、陽極（作用電極）−陰極（参照電極）間の外部回路を流れる電流を測定する。このため、テストメーターは、２電極モードで動作する単純な電気化学システムであるとみなすことができるが、実際には、グルコースの測定を容易にしたり、テストメーターにおいて他の機能を実行するために、第３の、時には、第４の電極を使用することもできる。

前述したように、還元型伝達物質の量は、数式１および数式２に記載の反応に基づき、生理液中に存在するグルコース濃度に比例していなければならない。特定の状況下では、例えば、フェリシアニドなどの酸化型伝達物質が、湿潤環境下でフェロシアニド（還元型伝達物質）に変換されることがある。グルコース非依存性の反応によって還元型伝達物質が生成されることにより、測定されるグルコース濃度が異常に高いものとなり、試験の精度に影響を及ぼす。

また、妨害化合物が存在する場合もまた、妨害化合物が作用電極で酸化されることがあるため、試験電流が異常に高くなることがある。更に、酸化型伝達物質が妨害化合物によって還元されることがあり、生成された還元型伝達物質が作用電極で酸化されることがある。妨害化合物の影響を低減する方策の１つに、作用電極−参照電極間で比較的低い試験電圧を使用するというものがある。低い試験電圧を使用するために、試薬調合物は酸化還元電圧の低い伝達物質の必要とする。

このように、出願人は、湿度の存在下で還元された状態に変換されず、酸化還元電圧が比較的低い伝達物質を使用することが大いに求められていることを認識している。更に、このような伝達物質は、ロバストな方法でテストストリップ上に容易にコーティングすることができ、正確かつ精密なグルコース測定を可能にする試薬調合物に組み込まれる必要がある。

一実施形態では、検体を測定可能なテストストリップが提供される。テストストリップは、作用電極および参照電極を有してもよく、試薬調合物は、作用電極に配置される。試薬調合物は、テストストリップ上にコーティングされうる。試薬調合物は、酵素、ルテニウムヘキサミン伝達物質、並びに、酵素およびルテニウムヘキサミン伝達物質を溶解させる溶媒を含む。ルテニウムヘキサミンの濃度範囲は、溶液の約１５％〜約２０％（伝達物質の重量／体積）である。酵素は、グルコースオキシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼのいずれであってもよい。グルコースオキシダーゼを使用する場合、単位体積あたりの酵素活性は、約１５００単位／ｍＬ〜約８０００単位／ｍＬの範囲でありうる。酵素を溶解させるための溶液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、またはシトラコナートなどの緩衝液であればよい。リン酸緩衝液を使用する場合、ｐＨは約７であればよい。

別の実施形態では、試薬調合物は、親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有するフィラーを更に含んでよい。一実施形態では、フィラーは、例えば、Cab-o-Sil
TS 610などのシリカであればよい。調合物は、スクリーン印刷の工程を使用して前記作用電極に配置してよい。スクリーンは、複数本の織成された糸を固定するフレームを有してよい。複数本の織成された糸は、試薬調合物を通過させる複数の開放された矩形の空間を形成してよい。複数本の織成された糸は、糸間隔および糸径を有してよい。糸間隔は、１センチメートルあたり糸約９０本〜約１２０本の範囲でありうる。糸径は、約３０ミクロン〜約５０ミクロンの範囲でありうる。

別の態様では、テストストリップは、基板、２つの電極、および試薬を有する。略平面基板は、第１端から第２端に延在している。第１の電極および第２の電極が、第１端および第２端の一方の近くの基盤上に配置され、その上に試薬層が配置されている。試薬層は、緩衝液中に、約１５％〜約２０％（重量／体積）の濃度範囲のルテニウムヘキサミントリクロリドを含み、摂氏４０℃、相対湿度７５％で７日間貯蔵後に、血液サンプルを約４００ミリボルトで試験するときに、テストストリップが基準に対するバイアスの増加を基本的に示さない。

更に別の態様では、基板、２つの電極、および試薬を有するテストストリップが提供される。略平面基板は、第１端から第２端に延在している。第１の電極および第２の電極が、第１端および第２端の一方の近くの基板上に配置され、その上に試薬層が配置されている。試薬層は、緩衝液中に、約１５％〜約２０％（重量／体積）の濃度範囲のルテニウムヘキサミントリクロリドを含む試薬層を有し、尿酸濃度が約０ｍｇ／ｄＬ〜約２０ｍｇ／ｄＬの、約７０ｍｇ／ｄＬの血中グルコースサンプルを用いて、約４００ミリボルトで試験する際に、テストストリップが基準に対するバイアスの増加を基本的に示さない。

更に別の態様では、基板、２つの電極、および試薬を有するテストストリップが提供される。略平面基板は、第１端から第２端に延在している。第１の電極および第２の電極は、第１端および第２端の一方の近くの基板上に配置され、その上に試薬層が配置されている。試薬層は、緩衝液中に、酵素と、約１５％〜約２０％（重量／体積）の濃度範囲のルテニウムヘキサミントリクロリドを含む試薬層を有し、ゲンチシン酸濃度が約０ｍｇ／ｄＬ〜約５０ｍｇ／ｄＬの、約７０ｍｇ／ｄＬの血中グルコースサンプルを用いて、約４００ミリボルトで試験する際に、前記テストストリップが基準に対するバイアスの増加を基本的に示さない。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を利用した実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解することができるであろう。

組み立てられていないテストストリップの従来技術の実施形態の上面分解斜視図を示す。 図１に示す従来技術のテストストリップの組み立て後の上面図を示す。 図１および図２に示す従来技術のテストストリップに接続されたテストメーターの上面図を示す。 図１および図２のテストストリップと電気的接続を形成している図３のテストメーターの簡略模式図を示す。 検体濃度を算出するために使用されうる試験電流を生成する試験期間ｔ_Ｔにおける、図３のテストメーターから、図１および図２のテストストリップへの印加試験電圧の印加を示すグラフである。 検体濃度を算出するために使用されうる試験電流を生成する試験期間ｔ_Ｔにおける、図３のテストメーターから、図１および２のテストストリップへの試験電圧の印加および開回路期間の別の実施形態を示すグラフである。 流体を検出するための印加試験電圧、開回路期間、検体濃度を測定するための別の印加試験電圧の連続印加を示す図５ｂのグラフの拡大図である。 図１および図２のテストストリップに血液サンプルを適用したときに、図５ａの印加試験電圧によって発生する試験電流を示すグラフである。 別の実施形態における組み立てられていないテストストリップの上部分解斜視図を示す。 室温、乾燥環境（塗りつぶしの円）、あるいは４０℃、相対湿度（ＲＨ）７５％（中抜きの四角）で７日間保管したフェリシアニドベースの試薬層を使用するテストストリップについて、テストストリップ測定の基準測定に対する平均バイアスを示すグラフである。 室温、乾燥環境（塗りつぶしの円）、あるいは４０℃、相対湿度（ＲＨ）７５％（中抜きの四角）で７日間保管したルテニウムベースの試薬層を使用するテストストリップについて、テストストリップ測定の基準測定に対する平均バイアスを示すグラフである。 血液サンプル中の尿酸濃度が変動したときの、フェリシアニドベースの試薬層（中抜きの三角）またはルテニウムベースの試薬層（塗りつぶしの菱形）を使用するテストストリップについて、テストストリップ測定の基準測定に対する平均バイアスを示すグラフである。 血液サンプル中のゲンチシン酸濃度が変動したときの、フェリシアニドベースの試薬層（中抜きの三角）またはルテニウムベースの試薬層（塗りつぶしの菱形）を使用するテストストリップについて、テストストリップ測定の基準測定に対する平均バイアスを示すグラフである。

本発明の実施形態は、電気化学テストストリップに使用するための試薬調合物を対象としている。より詳細には、実施形態は、高湿度の環境条件で高い安定性を示す、および／または、妨害化合物の酸化を低減させるか、この両方を実現するテストストリップの製造を可能にする伝達物質としてルテニウムヘキサミンを使用する。一実施形態では、ロバストな方法でテストストリップに容易にコーティングすることができ、正確かつ精密なグルコース測定を可能にする試薬調合物について記載される。

図１は、従来技術のテストストリップ１００の分解斜視図であり、テストストリップ１００は、基板５に配置された６つの層を有する。これらの６つの層は、導電層５０、絶縁層１６、試薬層２２、接着層６０、親水層７０、およびトップ層８０でありうる。テストストリップ１００は、一連の工程で生産することができ、例えば、米国特許出願公開第２００５／００９６４０９号明細書、国際公開第２００４／０４０９４８号、国際公開第２００４／０４０２９０号、国際公開第２００４／０４０２８７号、国際公開第２００４／０４０２８５号、国際公開第２００４／０４０００５号、国際公開第２００４／０３９８９７号、および国際公開第２００４／０３９６００号に記載されているスクリーン印刷工程を使用して、導電層５０、絶縁層１６、試薬層２２、接着層６０が、基板５に連続的に蒸着される。別の実施形態では、米国特許第６，１７９，９７９号明細書に記載されているインクジェット工程を使用して、試薬層２２を蒸着してもよい。親水層７０およびトップ層８０は、ロールストックから配置され、基板５に積層されうる。テストストリップ１００は、図１および図２に示すように末端部３および基端部４を有する。

完全に組み立てられたテストストリップ１００は、図２に示すように、サンプル受容室９２に血液サンプルを導入するための入口９０を有する。入口９０は、テストストリップ１００の末端部３をカットすることによって形成することができる。図３に示すように、血液サンプル９４は、入口９０に適用され、グルコースを測定することができるように、サンプル受容室９２に充填される。試薬層２２に隣接する第１の接着パッド２４と第２の接着パッド２６の側端は、それぞれ、サンプル受容室９２の壁を画定する。サンプル受容室９２の底部すなわち「床」は、基板５、導電層５０および絶縁層１６の一部を含む。サンプル受容室９２の上部すなわち「屋根」は、先端親水部３２を含む。

テストストリップ１００では、図１に示すように、導電層５０は、参照電極１０、第１の作用電極１２、第２の作用電極１４、第１の接点１３、第２の接点１５、参照接点１１、第１の作用電極トラック８、第２の作用電極トラック９、参照電極トラック７、およびストリップ検出バー１７を有する。導電層は、米国特許第５，６５３，９１８号明細書に記載されているようなカーボンインクである。第１の接点１３、第２の接点１５、および参照接点１１は、テストメーター２００に電気的に接続するように構成されている。第１の作用電極トラック８は、第１の作用電極１２から第１の接点１３への電気的に連続した経路を提供する。同様に、第２の作用電極トラック９は、第２の作用電極１４から第２の接点１５への電気的に連続した経路を提供する。同様に、参照電極トラック７は、参照電極１０から参照接点１１への電気的に連続した経路を提供する。

図１において、絶縁層１６は、液体試料によって湿らされうる参照電極１０、第１の作用電極１２、および第２の作用電極１４の一部を露出させ開口１８を有する。例えば、絶縁層１６は、エルコン社（Ercon Inc.）（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入可能なErcon E6110-116 Jet Black Insulayer（登録商標）インクなどである。

試薬層２２は、図１に示すように、導電層５０、基板５、および絶縁層１６の一部に配置されうる。試薬層２２は、酵素や、グルコースと選択的に反応する伝達物質などの化学物質を含んでいてもよい。酵素の例としては、グルコースオキシダーゼが、伝達物質の例としては、フェリシアニドが挙げられる。

本発明に使用するのに適した酵素の例は、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを含んでよい。より詳細には、グルコースデヒドロゲナーゼは、ピロロキノリンキノンコファクタ（ＰＱＱと略されるか、一般名のメトキサチンで呼ばれることがある）を含みうる。本発明に使用するのに適した伝達物質の例は、フェリシアニドまたはルテニウムヘキサミントリクロリド（［Ｒｕ^III（ＮＨ_３）_６］Ｃｌ_３を含んでよく、単にルテニウムヘキサミンと呼ばれることもある。数式１および数式２に示す反応中に、グルコース濃度を算出するために電気化学的に測定される比例する量の還元型伝達物質が生成される。本実施形態に使用するのに適した試薬調合物またはインクの例は、米国特許第５，７０８，２４７号明細書、米国特許第６，０４６，０５１号明細書、米国特許第６，２４１，８６２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２１７９１８号明細書、国際公開第０１／６７０９９号、および国際公開第０１／７３１２４号に記載されている。

試薬層２２は、酵素インクまたは調合物から形成されてよく、導電層に配置され、乾燥される。酵素インクまたは調合物は、通常、グルコースなどの検体の電気化学的検出のために使用される物質を分散および／または溶解させるための、緩衝液などの液体を含む。調合物に適しうる緩衝液は、リン酸塩、クエン酸塩、およびシトラコナートである。

一実施形態では、調合物は、ｐＨが約７の２００ｍＭリン酸緩衝液と、濃度範囲が約５％以上、好ましくは約１０％以上、更に好ましくは約１５％〜約２０％（伝達物質の重量／緩衝液の体積に基づくパーセンテージ）のルテニウムヘキサミン伝達物質を含みうる。約７というｐＨは、ルテニウムヘキサミンを伝達物質として使用するときに、このｐＨにおいてグルコースオキシダーゼが十分に高い活性を有することから選択された。ルテニウムヘキサミン濃度の上限は、その溶解性に基づいて選択されうる。酵素インクが２０％以上のルテニウムヘキサミン濃度を有するように調製される場合、試験中に溶解しないルテニウムヘキサミンの固体粒子が、試薬層２２に存在することがある。未溶解のルテニウムヘキサミンが存在する場合には、テストストリップ間の精度が低下することがある。酵素インクが１５％未満のルテニウムヘキサミン濃度を有するように調製する場合、ルテニウムヘキサミンの濃度と共に試験電流値の大きさが低下しうる。一般に、ルテニウムヘキサミン濃度のわずかな変化によって、試験電流値にばらつきが生じ、ひいてはストリップロット間にばらつきが生じるため、試験電流値の大きさがルテニウムヘキサミンの濃度に左右されることは望ましくない。

一実施形態では、調合物の酵素活性は、約１５００単位／ｍＬ〜約８０００単位／ｍＬの範囲でありうる。酵素活性の範囲は、酵素活性のレベルが上記の範囲内にある限り、グルコース電流が調合物中の酵素活性のレベルに左右されないように選択されうる。得られるグルコース電流が、酵素活性のわずかな変動に左右されないように、酵素活性は、十分に大きいものでなければならない。例えば、酵素活性が１５００単位／ｍＬ未満の場合、グルコース電流は、調合物中の酵素活性量に左右される。一方、酵素活性のレベルが８０００単位／ｍＬ以上の場合、グルコースオキシダーゼが調合物に十分に溶解されないという溶解度の問題が生じうる。グルコースオキシダーゼは、バイオザイム・ラボラトリーズ・インターナショナル・リミテッド（Biozyme Laboratories International Limited）（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から商業的に入手可能である。グルコースオキシダーゼは、酵素活性の単位が、ｐＨ７で２５℃におけるｏ−ジアニシジンアッセイに基づく場合に、約２５０単位／ｍｇの酵素活性を有しうる。

疎水性ドメインおよび親水性ドメインの両方を含むフィラーを含有する酵素インクが、スクリーン印刷工程を使用して作用電極に配置されうる。フィラーの例としては、シリカがあり、これには、例えば、マサチューセッツ州ボストンのキャボット社（Cabot
Inc.）から商業的に入手可能なCab-o-Sil TS 610などがある。通常は、スクリーンは、複数本の織成された糸を固定する矩形のフレームの形でありうる。複数本の織成された糸は、酵素インクを通過させる複数の開放された矩形の空間を形成する。開放空間の密度および大きさは、導電層に蒸着される酵素インクの量に影響する。酵素インクの蒸着に影響する織成された糸の特性は、糸間隔および糸径である。糸間隔は、１センチメートルあたり糸約９０本〜約１２０本の範囲でありうる。糸径は、約３０ミクロン〜約５０ミクロンの範囲でありうる。より詳細には、一実施形態では、ルテニウムヘキサミンとグルコースオキシダーゼを含む酵素インクのスクリーン印刷に適したスクリーンは、１センチメートルあたり約１２０本の糸間隔と約３４ミクロンの糸径を有しうる。

テストストリップ１００では、接着層６０は、図１に示すように、第１の接着パッド２４、第２の接着パッド２６、および第３の接着パッド２８を有する。接着層６０は、英国ハートフォードシャー、トリングに位置するテープ・スペシャリティーズ・リミテッド（Tape
Specialties LTD）から商業的に入手可能な水性アクリルコポリマー圧感接着剤（部品番号Ａ６４３５）を含んでよい。接着層６０は、絶縁層１６、導電層５０、および基板５の一部に配置される。接着層６０は、親水層７０をテストストリップ１００に結合する。

親水層７０は、先端親水部３２および基端親水部３４を有する。親水層７０は、３Ｍから商業的に入手可能な防曇性コーティングなどの１つの親水性面を有するポリエステルでありうる。

テストストリップ１００では、トップ層８０は、図１に示すように、透明部３６および不透明部３８を有する。トップ層８０は、親水層７０に配置され、接着されている。トップ層８０は、ポリエステルでありうる。透明部３６は、先端親水部３２と実質的に重なっており、ユーザがサンプル受容室９２が十分満たされていることを視覚的に確認できる点に注目すべきである。不透明部３８は、ユーザが、例えば、サンプル受容室９２内の血液などの着色流体とトップ層８０の不透明部３８との間の高いコントラストを観察するのを助ける。

図３は、テストストリップ１００に接続するのに適したテストメーター２００を示す。テストメーター２００は、ディスプレイ２０２、ハウジング２０４、複数のユーザインタフェースボタン２０６、およびストリップポートコネクタ２０８を有する。テストメーター２００は、ハウジング２０４内に、メモリ２１０、マイクロプロセッサ２１２、試験電圧を印加し、また、複数の試験電流値を測定するための電子部品（図４の１０４、１０６を参照）などの電子回路を更に有する。テストストリップ１００の基端部分４は、ストリップポートコネクタ２０８に挿入されうる。ディスプレイ２０２は、グルコース濃度を出力し、また、試験の実施方法をユーザに指示するためのユーザインタフェースを表示するために使用されうる。ユーザは、複数のユーザインタフェースボタン２０６により、ユーザインタフェースソフトウェアを操作してテストメーター２００を操作することができる。

図４は、テストストリップ１００とインタフェースで接続したテストメーター２００の簡略図を示す。テストメーター２００は、第１のコネクタ１０３、第２のコネクタ１０２、および参照コネクタ１０１を有し、これらは、それぞれ、第１の接点１３、第２の接点１５、参照接点１１との電気的接続を形成している。上記３つのコネクタは、ストリップポートコネクタ２０８の一部である。試験の実行時、第１の試験電圧源１０４は、第１の作用電極１２と参照電極１０の間に第１の試験電圧Ｖ_１を引加する。第１の試験電圧Ｖ_１の結果、テストメーター２００は、第１の試験電流Ｉ_１を測定しうる。同様に、第２の試験電圧源１０６は、第２の作用電極１４と参照電極１０の間に第２の試験電圧Ｖ_２を引加する。第２の試験電圧Ｖ_２の結果、テストメーター２００は、第２の試験電流Ｉ_２を測定しうる。一実施形態では、第１の試験電圧Ｖ_１と第２の試験電圧Ｖ_２はほぼ等しく、第１の測定が第１の作用電極１２によって実行され、第２の測定が第２の作用電極１４によって実行され、グルコース測定の２回の実行が可能となる。２回のグルコース測定を使用することで、この２つの結果の平均値を求め精度を向上させることができる。以下の説明を簡潔にするために、正確なグルコース濃度を測定するためのアルゴリズムについて、１つの作用電極と参照電極についてのみ記載する。本発明は、１つの作用電極と参照電極に限定されるものではなく、複数の作用電極を各種実施形態に適用可能であることは当業者にとって明らかである。

図５ａは、テストストリップ１００によって生理的流体が検出された時点から始まる試験期間ｔ_Ｔの間に、テストメーター２００によってテストストリップ１００に印加される試験電圧を示すグラフである。図５ａでは、示されている試験電圧は、４００ｍＶである。図５ａに示すように、生理的流体の適用前は、テストメーター２００は、流体検出電圧が４００ｍＶの流体検出モードにある。試験電圧と流体検出電圧が異なりうることは、当業者にとって明らかであろう。図５ａにおいて、テストメーターは、時間ｔ_０における生理的流体の検出前の流体検出期間ｔ_ＦＤの間、流体検出モードにある。流体検出モードでは、テストメーター２００は、流体が入口９０に適用され、サンプル受容室９２に導入される時点を決定し、流体は、第１の作用電極１２および参照電極１０の両方を湿らせる。生理的流体が、第１の作用電極１２および参照電極１０の両方を接触するように覆っているときは、第１の作用電極１２および参照電極１０が事実上短絡している点に留意されたい。テストメーター２００が、例えば、測定試験電流が十分に増加したことにより、生理的流体が適用されたことを認識すると、テストメーター２００は、時間ｔ_０でゼロ秒マーカーを割り当て、試験期間ｔ_Ｔを開始する。例えば、図５ａに示すように、試験期間ｔ_Ｔは、約５．４秒である。試験期間ｔ_Ｔが終了すると、試験電圧は除去される。

別の実施形態では、サンプル受容室９２内で流体が検出された後の開回路期間を含む試験電圧波形が引加されうる。例えば、図５ｂに示す試験電圧は、流体検出期間ｔ_ＦＤの間、４００ｍＶである。テストメーター２００が、例えば、試験電流が、所定の期間（例えば、約２０ミリ秒）に所定のしきい値（例えば、約５０ナノアンペア）以上のレベルに増大したことにより、生理的流体が適用されたことを認識すると、テストメーター２００は、時間ｔ_０でゼロ秒マーカーを割り当て、開回路期間ｔ_０Ｃの間、開回路を適用する。例えば、図５ｃに示すように、開回路期間ｔ_０Cは約３００ミリ秒である。開回路期間ｔ_０Ｃが終了すると、テストメーターは、約２００ミリ秒〜約５．４秒の期間の間、約２５０ミリボルトの試験電圧を印加する。

一般に、テストストリップで使用されている伝達物質のレドックス電圧に比べプラスの試験電圧を使用することが望ましい。より詳細には、試験電圧は、得られる試験電流が、試験電圧のわずかな変動に左右されないことを保障する十分な大きさ分レドックス電圧よりも高くなければならない。レドックス電圧は、ある公称電圧を有する電極に十分に近いときに電子を受け取るか供与する伝達物質の固有の親和性を表している点に留意されたい。試験電圧が伝達物質のレドックス電圧に対して十分にプラスである場合、伝達物質は急速に酸化される。実際、伝達物質は、正方向に十分に大きな試験電圧（すなわち制限試験電圧）では非常に急速に酸化されるため、試験電流の大きさは、電極表面への伝達物質の拡散（すなわち、制限試験電流）によって制限される。第１の作用電極１２がカーボンインクで伝達物質がフェリシアニドである実施形態では、約＋４００ｍＶの試験電圧が制限試験電圧として十分であろう。第１の作用電極１２がカーボンインクで伝達物質がＲｕ^III（ＮＨ_３）_６である実施形態では、約＋２５０ｍＶの試験電圧が制限試験電圧として十分であろう。他の伝達物質と電極材料の組み合わせにおいては、必要な制限試験電圧が異なることは当業者にとって明らかであろう。

制限試験電圧を印加するように設計されているテストメーターは、制限試験電流の大きさに影響を与えることなく印加試験電圧にある程度の変動を有することができる。試験電圧を厳重に制御する必要がなく、テストメーターを比較的廉価な電子部品で構成することができるため、テストメーターが制限試験電圧を印加することが望ましい。要約すれば、制限試験電圧を引加するテストメーターは、低コストの部品を使用して、正確かつ精密にグルコース濃度をロバストに測定することができる。

図６は、試験期間ｔ_Ｔにテストストリップ１００が生成する試験電流を示すグラフである。一般に、テストストリップ１００が生理的流体によって最初に湿らされると、試験電流が急上昇し、最大ピーク時ｔ_ｐにおいてピークに達する。ピーク最大値後は、試験電流は徐々に低下する。試験電流の全体的な大きさは、グルコース濃度の増加に伴って大きくなる。

十分に正確かつ精密なグルコース濃度を得るために、テストストリップ１００は、第１の作用電極１２および第２の作用電極１４のための十分に再現性が高く、十分に画定された電気活性領域を有していなければならない。試験電流の大きさは、作用電極の一方の領域に正比例する。例えば、テストストリップ間で第１の作用電極１２の領域の変動が大きい場合、複数のテストストリップを試験する際、測定されるグルコース濃度の変動も大きくなる。したがって、測定されるグルコース濃度の変動が比較的小さくなるように、第１の作用電極１２と第２の作用電極１４の変動が比較的小さいことが重要である。

図１および図２に示す第１の作用電極１２および第２の作用電極１４の領域は、スクリーン印刷工程によって画定することができる。スクリーン印刷工程によって作成されるテストストリップのバッチは、十分に精密なグルコース濃度測定値（例えば５％ＣＶ未満）を出力することができる。しかしながら、特定の状況および条件の下では、さらに精密な電気活性領域を有するテストストリップバッチを製造することが必要となる場合がある。例えば、非常に少量（例えば、１マイクロリットル未満）の血液を使用してグルコースを測定することができるテストストリップを設計することが、顧客の要望により求められていた。これらの理論の１つは、使用する血液が少なければ、グルコース測定手順における痛みが軽減されるというものである。

サンプル量の少ないテストストリップを設計するための方策の一つは、第１の作用電極および第２の作用電極の領域を減らすことである。しかしながら、第１の作用電極および第２の作用電極が小さくなるため、スクリーン印刷工程の非理想性が、作用電極の精度に著しく影響し始める可能性がある。例えば、スクイジーによってスクリーンの伸縮が変動すると、作用電極の大きさが変わりうる。また、スクリーンは、一般に、導電層または絶縁層を蒸着するための複数の矩形開口を有する。特に作用電極の大きさが矩形開口の大きさと等しい場合には、複数の矩形開口を使用すると、導電層または絶縁層のいずれかの端がギザギザになることがある。図１および図２に示す従来技術の実施形態では、第１の作用電極１２は、スクリーン印刷された導電層５０によって画定される２側面２０、およびスクリーン印刷された絶縁層１６によって画定される他の２側面１９を有する。絶縁層１６が、第１の作用電極トラック９をカバーするのを助けるために使用される点に留意すべきである。このように、スクリーン印刷の不利を被ることのない精密な電極領域を有しうるテストストリップを製造する工程を開発することが求められている。更に、電極領域を画定するため、および／または、作用電極トラックをカバーするための絶縁層を必要としない簡潔な製造工程を開発することが求められている。

一実施形態では、テストストリップは、第１の作用電極および第２の作用電極の電気活性領域の正確さおよび精度を改良するためのレーザーアブレーションの工程を使用して生産されうる。導電層のレーザーアブレーションの工程により、スクリーン印刷などの他の工程に比べ、電極領域のエッジ解像力を良好に制御することが可能になる。また、レーザーアブレーションの工程は、絶縁層を必要とすることなく電極領域を実質的に画定するために使用することができる。

図７は、組み立てられていないテストストリップ５００の上部分解斜視図を示しており、これは、前述の試薬調合物を使用することもできる実施形態である。テストストリップ１００と同様に、テストストリップ５００は、導電層５０１、試薬層５７０、およびトップテープ８１を有する。テストストリップ５００は、末端部５７６、基端部５７８、および２つの側面５７４を有する。

本明細書に記載する各種実施形態は、特に血中グルコース濃度の測定に適合されているが、本明細書に記載のテストストリップが、他の検体の電気化学的測定の精度を向上させるのを可能にするためにも適合されうることは、当業者にとって明らかであろう。テストストリップの実施形態によって測定することができる他の検体の例としては、血中の乳酸、エタノール、コレステロール、アミノ酸、コリン、ヘモグロビン、およびフルクトサミンが挙げられる。

＜実施例１＞
試薬層を、以下のようにスクリーン印刷に適した酵素インクとして調製した。１００ｍｌの２００ｍＭ水溶性リン酸緩衝液をｐＨ７に調整した。５ｇのヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、１ｇのポリ（ビニルピロリドン酢酸ビニル）（PVP-VA S-630）、０．５ｍｌのDC 1500Dow Corning消泡剤を１００ｍＬのリン酸塩緩衝液に添加して混合物を調製し、均質化により混合した。混合物を一晩放置して、気泡を消散させ、酵素インクの調合物の原液として使用した。次に、Cab-o-Sil TS610の総量の約４／５が添加されるまで、７．５ｇのCab-o-Sil TS610を混合物に手で徐々に添加した。残りのCab-o-Sil TS610は、均質化による混合によって添加した。次に、混合物を１２時間回転させた（rolled）。次に、約１８ｇのルテニウムヘキサミン（［Ｒｕ^III（ＮＨ_３）_６］Ｃｌ_３）を添加し、溶解するまで均質化によって混合した。最後に、２．８ｇのグルコースオキシダーゼ酵素製剤（２５０単位／ｍｇ）を添加して、溶液に完全に混合させた。得られた調合物は、印刷に使用可能な状態であるか、冷蔵保管可能なものであった。

＜実施例２＞
実施例１で説明したルテニウムベースの試薬調合物を使用して、テストストリップ１００の第１のバッチを調製した。ルテニウムヘキサミンの代わりにフェリシアニド伝達物質を使用する試薬調合物を用いて、実施例１と同様の方法で、テストストリップ１００の第２のバッチを調製した。テストストリップ１００の第１のバッチおよび第２のバッチの一部を、室温、乾燥環境で、７日間保管した。テストストリップ１００の第１のバッチおよび第２のバッチの別の部分を、４０℃、相対湿度７０％の環境で、７日間保管した。

テストストリップの第１のバッチおよび第２のバッチを、＋４００ｍＶの試験電圧を使用してテストメーターで試験した。グルコース濃度が約７０ｍｇ／ｄＬ〜約６００ｍｇ／ｄＬの範囲の血液サンプルを試験した。

図８は、４０℃、相対湿度（ＲＨ）７５％（中抜きの四角）で７日間保管した場合、テストストリップの第２のバッチの基準測定に対する平均バイアスが、基準測定に対する正のバイアスを有することを示すグラフである。一般に、基準測定に対する正のバイアスは、低いグルコース濃度で最大であり、本例の場合、約７０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度において、基準測定に対して約６０％のバイアスであった。これに対して、室温、乾燥環境で７日間保管したテストストリップの第２のバッチは、図８の塗りつぶしの丸に示すように、基準測定に対するバイアスが基本的に増加しなかった。このように、比較的高い湿度にさらされたフェリシアニドを含むテストストリップは、基準測定に対するバイアスの増加を示す。

図９は、４０℃、相対湿度（ＲＨ）７５％（中抜きの四角）、あるいは、室温、乾燥環境（塗りつぶしの円）に７日間保管したテストストリップの第１のバッチの基準測定に対する平均バイアスが、基準測定に対してバイアスの全体的な増加を示さなかったことを示すグラフである。このため、比較的高い湿度にさらされたルテニウムを含むテストストリップは、フェリシアニドを含むテストストリップとは対照的に、基準測定に対するバイアスの増加を示さない。

＜実施例３＞
テストストリップの第１のバッチおよび第２のバッチ（実施例２に記載）を、＋４００ｍＶの試験電圧を使用してテストメーターで試験した。グルコース濃度が約７０ｍｇ／ｄＬで、尿酸濃度が約０ｍｇ／ｄＬ〜約２０ｍｇ／ｄＬの範囲の血液サンプルを試験した。

図１０の中抜きの三角で示すように、テストストリップの第２のバッチでは、テストストリップ測定値の基準測定に対する平均バイアスは、尿酸量の増加に伴ってほぼ直線的に増加した。したがって、フェリシアニドベースの試薬層を使用したテストストリップは、妨害化合物である尿酸が、フェリシアニドによって酸化され、非グルコース関連の試験電流を増加させうることが示された。

図１０の塗りつぶしの菱形で示すように、テストストリップの第１のバッチでは、テストストリップ測定値の基準測定に対する平均バイアスは、尿酸量の増加に伴って増加することはなかった。したがって、ルテニウムベースの試薬層を使用したテストストリップは、潜在的妨害化合物である尿酸が、ルテニウムによって酸化されることはなく、グルコース選択的測定を可能にすることが示された。

＜実施例４＞
テストストリップの第１のバッチおよび第２のバッチ（実施例２に記載）を、＋４００ｍＶの試験電圧を使用してテストメーターで試験した。グルコース濃度が約７０ｍｇ／ｄＬで、ゲンチシン酸濃度が約０ｍｇ／ｄＬ〜約５０ｍｇ／ｄＬの範囲の血液サンプルを試験した。

図１１の中抜きの三角で示すように、テストストリップの第２のバッチでは、テストストリップ測定値の基準測定に対する平均バイアスは、ゲンチシン酸量の増加に伴ってほぼ直線的に増加した。したがって、フェリシアニドベースの試薬層を使用したテストストリップは、妨害化合物であるゲンチシン酸が、フェリシアニドによって酸化され、非グルコース関連の試験電流を増加させうることが示された。

図１１の塗りつぶし菱形で示すように、テストストリップの第１のバッチでは、テストストリップ測定値の基準測定に対する平均バイアスは、ゲンチシン酸量の増加に伴って増加することはなかった。したがって、ルテニウムベースの試薬層を使用するテストストリップは、潜在的妨害化合物であるゲンチシン酸が、ルテニウムによって酸化されることはなく、グルコース選択的測定を可能にすることが示された。

本発明を、特定の変形例および説明図について記載したが、本発明が、記載した変形例や図に限定されるものではないことを当業者は認めるであろう。また、上記方法および工程が、所定の順序で発生する所定の事象を示している場合、ステップにより実施形態が意図された目的のために機能しうる限り、所定のステップは、記載の順序で実行される必要はなく、どのような順序で実行されてもよいことを意図している。したがって、本開示の精神の範囲内にあるまたは特許請求の範囲に記載されている本発明と均等な本発明の変形例が存在する限りにおいて、本特許がこのような変形例をもカバーすることを意図する。

Claims (14)

1. テストストリップをコーティングするための調合物であって、前記調合物は、
   グルコースオキシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される酵素と、
   ルテニウムヘキサミン伝達物質と、
   前記酵素および前記ルテニウムヘキサミン伝達物質を溶解させ、かつその中でルテニウムヘキサミンが１５％〜２０％（重量／体積）の濃度範囲を含む溶液と、
   を含む、調合物。
2. 前記酵素はグルコースオキシダーゼであり、かつ前記グルコースオキシダーゼは１５００単位／ｍＬ〜８０００単位／ｍＬの活性範囲を有する、請求項１に記載の調合物。
3. 前記溶液は、リン酸塩、クエン酸塩、およびシトラコナートからなる群から選択される緩衝液である、請求項１に記載の調合物。
4. 前記緩衝液は、リン酸塩でありかつ７のｐＨを有する、請求項３に記載の調合物。
5. 前記調合物は、親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有するフィラーを更に含む、請求項１に記載の調合物。
6. 前記フィラーはシリカを含む、請求項５に記載の調合物。
7. テストストリップであって、
   第１端から第２端に延在する平面の基板と、
   前記第１端および前記第２端の一方の近くの前記基板上に配置された第１の電極および第２の電極と、
   グルコースオキシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される酵素と、ルテニウムヘキサミントリクロリドが１５％〜２０％（重量／体積）の濃度範囲を含む緩衝液中のルテニウムヘキサミントリクロリドと、を有する試薬層と、
   を含む、テストストリップ。
8. 前記酵素はグルコースオキシダーゼであり、かつ前記グルコースオキシダーゼは１５００単位／ｍＬ〜８０００単位／ｍＬの活性範囲を有する、請求項７に記載のテストストリップ。
9. 前記緩衝液は、リン酸塩、クエン酸塩、およびシトラコナートからなる群から選択される、請求項７に記載のテストストリップ。
10. 前記緩衝液は、リン酸塩でありかつ７のｐＨを有する、請求項９に記載のテストストリップ。
11. 前記テストストリップは作用電極および参照電極を含み、前記試薬層は前記作用電極上に配置される、請求項７に記載のテストストリップ。
12. 前記試薬層は、親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有するフィラーを更に含む、請求項７に記載のテストストリップ。
13. 前記フィラーはシリカを含む、請求項１２に記載のテストストリップ。
14. 前記試薬層は、スクリーン印刷の工程を使用して前記作用電極上に配置され、前記スクリーンは、複数本の織成された糸を有し、前記複数本の織成された糸は、前記試薬層を通過させる複数の開放された矩形空間を形成し、前記複数本の織成された糸は、ある糸間隔およびある糸径を有し、前記糸間隔は、１センチメートルあたり９０本〜１センチメートルあたり１２０本の範囲にあり、前記糸径は、３０ミクロン〜５０ミクロンの範囲にありうる、請求項１２に記載のテストストリップ。

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