JP5038639B2

JP5038639B2 - 培養人工骨

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Publication number: JP5038639B2
Application number: JP2006059392A
Authority: JP
Inventors: 信幸遠藤; 真佐竹; 英一北薗; 博章兼子; 美佳茅島
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2026-03-06
Also published as: JP2007236450A

Description

本発明は培養人工骨に関する。

近年、損傷が大きい生体組織や臓器の治療法として、細胞の分化、増殖能を利用し、元の生体組織及び臓器に再構築する再生医療の研究が活発になってきている。骨再生もその1つである。

骨は再生能力に優れた組織であり、骨折した場合、適切に整復及び固定することにより、ほぼ元通りの形態に再生されることが可能である。しかし、その再生能力にも限界があり、骨形成条件が不良な大きな骨欠損を伴う場合、整復及び固定することだけでは再生は不可能である。

その場合の治療法として、自家骨移植が多く行われてきた。自家骨移植は、抗原性がなく、骨再生を誘導することができる骨芽細胞を含むため骨誘導能を持つという利点から最も優れた移植骨である。しかしながら、この手法は、自家骨を骨盤や腓骨など健常部から採取するために侵襲性が高く、また採取部の術後骨折などの合併症が起こり易く、さらには採取量に限界があるため大きな欠損には適用できないという欠点を有している。
そこで近年、自家骨の代わりに正常な骨に置き換わる生体吸収性の人工骨の研究が行われてきた。その理由として、人工骨移植は移植骨を採取するための侵襲がなく、多くの骨量を確保することができ、欠損の大きさに関係なく使用できるなど有用性が高いことが挙げられる。しかし、従来の人工骨には、自家骨が持つほどの骨誘導能がないという欠点があった。実際、人工骨として生体吸収性ポリマーの鋳造により作製された多孔体が知られている（特許文献１）。

このような背景から、大きな欠損を持つ骨を再生させるため、高い骨誘導能を持ち、正常な骨に置き換わる生体吸収性の移植用材料として、培養人工骨の開発が望まれている。
培養人工骨として、連通孔の少なくとも１つが直径２０μｍ以上である多孔体に培養骨組織が組み込まれているものがすでに公知である（特許文献２）。しかしながら、多孔体の特性の好ましい形態として本発明で開示している繊維構造体については示唆されていない。また、繊維構造体にて、間葉系幹細胞を増殖させたもの、あるいは前骨芽細胞を増殖させたものについてそれぞれ開示されているが、繊維構造体としての好ましい形態については何ら記載がされていない（特許文献３）、あるいは実質的に平面の繊維構造体であり、本発明で開示している３次元構造を有するものではなく、さらには骨分化誘導因子なしでは骨誘導能も認められていない（非特許文献１）。補綴材として、好ましい形態について記載された３次元の繊維構造を持ち、かつ骨誘導能を有する材料については、まだ報告されていない。

米国特許第５８６３２９７号明細書特開２００３−１９９８１５号公報ＷＯ０３／０１８０７７号パンフレットＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２７，５９６−６０６（２００６）

本発明は、損傷により大きな欠損を持つ骨を治療するため、骨誘導可能な細胞を骨再生の誘導に不可欠な骨芽細胞へと分化誘導する能力が高い補綴材、並びに骨分化誘導可能な細胞、からなる培養人工骨を提供することを目的とする。ここで損傷とは、外傷による外因性損傷や、疾患などによる内因性損傷を含む。また、本発明は、補綴材が生体吸収性多孔体からなる培養人工骨を提供することを目的とする。

本発明者は、生体吸収性ポリマーからなる特定の平均繊維径の繊維構造体で、特定の平均見かけ密度及び高さの多孔体からなる補綴材には、骨誘導可能な細胞を骨芽細胞へと分化誘導する能力が高いことを見出し、この補綴材と骨誘導可能な細胞を組み合わせることで、本発明を完成した。

すなわち本発明は、（ｉ）平均繊維径が０．０５〜１０μｍの生体吸収性ポリマーの繊維構造体から構成され、平均見かけ密度が１０〜３５０kg/ｍ^３、高さが０．５mm以上の多孔体からなる補綴材、並びに（ii）補綴材に含有された骨誘導可能な細胞、からなる培養人工骨である。

本発明の培養人工骨は、骨誘導可能な細胞を骨芽細胞へと分化誘導する能力が高い３次元構造を持つ補綴材、並びに骨誘導可能な細胞からなるため、骨の再生に有効である。本発明の培養人工骨は、補綴材による骨芽細胞への分化誘導能が高いので、損傷部位の大きい骨の再生に有効であることが期待される。また本発明の培養人工骨は、補綴材が生体吸収性材料により構成されているので生体に吸収されるという利点がある。

以下、本発明について詳述する。
なお、本明細書全体にわたって、細胞を含有していない人工骨と区別するために、細胞を補綴材に含有した本発明のような人工骨を「培養人工骨」と称す。

＜培養人工骨＞
（補綴材）
本発明の培養人工骨を構成する補綴材は、単数または複数の繊維が積層され、集積されて形成された自己支持能がある３次元の繊維構造体からなる。繊維構造体の平均繊維径は０．０５〜１０μｍであり、鋳造により作製された多孔体よりも比表面積が大きく、細胞が接着する十分な面積を取ることができる。平均繊維径が、０．０５μｍよりも小さいと該繊維構造体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が１０μｍよりも大きいと繊維の比表面積が小さく生着する細胞数が少なくなるため好ましくない。より好ましくは平均繊維径が０．２〜１０μｍ、さらに好ましくは平均繊維径が０．２〜８μｍである。

また、繊維の任意の横断面は略真円でも異形でも良い。繊維の任意の横断面が異形であると、繊維の比面積は増大するので、細胞の培養時に、細胞が繊維表面に接着する十分な面積をとることができる。
ここで、繊維の任意の横断面が異形であるとは、繊維の任意の横断面が略真円形状をとらないいずれの形状も指し、繊維表面が一様に凹部及び／又は凸部を有して粗面化されている場合を含む。

前記異形形状は、繊維表面の微細な凹部、繊維表面の微細な凸部、繊維表面の繊維軸方向に筋状に形成された凹部、繊維表面の繊維軸方向に筋状に形成された凸部及び、繊維表面の微細孔部からなる群から選ばれた少なくとも１種によることが好ましく、これらは単独で形成されていても複数が混在していても良い。
ここで、上記の「微細な凹部」、「微細な凸部」、とは、繊維表面に０．１〜１μｍの凹部または凸部が形成されていることをいい、「微細孔」とは、０．１〜１μｍの径を有する細孔が繊維表面に存在することをいう。また、上記筋状に形成された凹部及び／又は凸部は、０．１〜１μｍ幅の畝形状が繊維軸方向に形成されていることをいう。

本発明の繊維構造体から構成される多孔体からなる補綴材は、平均見かけ密度が１０〜３５０kg/ｍ^３である。平均見かけ密度が１０kg/ｍ^３より低いと細胞侵入性は良いものの機械強度が低く、また３５０kg/ｍ^３より高いと細胞が侵入するのが困難となり足場材料としては好ましくない。平均見かけ密度は得られた多孔体の体積（面積×厚み）と質量とを測定し算出することができる。平均見かけ密度は好ましくは５０〜３００kg/ｍ^３である。さらに好ましくは、１００〜２５０kg/ｍ^３である。

本発明の多孔体からなる補綴材は、円柱、多角柱、円錐台、多角錐台などの三次元形であって、高さが０．５mm以上であり、高さの上限は問わず、細胞培養基材として使用する部位に依存するといえるが、好ましくは高さが1.０mm以上、さらに好ましくは高さが２．０mm以上である。高さが０．５mmより低いと機械強度が低く、膝関節など負荷の高い組織の細胞培養基材としては好ましくない。

本発明の多孔体からなる補綴材は、所望の形状に合わせた成形体が提供できるという特徴を有する。求められる厚みを持った基材が提供できるので、例えば不織布を重ねて圧着させたような積層体に比べて、界面剥離が無く形状安定性に優れることから、高い負荷が掛かるような部位における細胞培養基材として有用である。

本発明の補綴材を構成する生体吸収性ポリマーは、好ましくは主として脂肪族ポリエステルからなる。脂肪族ポリエステルとしては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、及びこれらの共重合体などが挙げられる。これらのうち、脂肪族ポリエステルとしては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、及びこれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の生体吸収性多孔体は、生体吸収性ポリマー以外の第２成分をさらに含有しても良い。該成分には、例えばＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＴＧＦ−β（β型形質転換増殖因子）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＢＭＰ（骨形成因子）などの細胞増殖因子などが挙げられる。

（骨誘導可能な細胞）
本発明の培養人工骨は、補綴材に骨誘導可能な細胞が含有されている。骨組織は、骨芽細胞により形成されており、骨芽細胞が産生する細胞外基質が重要な役割を果たしていることが考えられる。よって、この骨芽細胞を移植することにより骨再生が促進される。しかし、骨芽細胞は、生体の骨組織の表面に存在するため、この細胞を採取するのは困難で、健常な組織を傷付けるという点で問題がある。そこで、注射針などで採取可能な骨髄由来細胞をはじめとする骨分化誘導が可能な細胞を利用することは、健常な骨組織を傷付けないという点から好ましい。

骨誘導可能な細胞は、骨髄由来細胞が好ましい。骨髄由来細胞としては、間葉系幹細胞などが挙げられる。また、骨芽細胞が含まれていても良い。
骨誘導可能な細胞は、自家細胞が好ましい。
骨誘導可能な細胞の継代数は、好ましくは７回以下、さらに好ましくは５回以下である。

（培養人工骨）
本発明の培養人工骨は、補綴材に骨誘導可能な細胞を播種し、含有させている。含有される骨誘導可能な細胞は、播種される時点及び播種されてからインビトロで培養された時点で細胞数が、１×１０^３〜１×１０^７個/ｃｍ^３であることが好ましい。より好ましくは細胞数が１×１０^４〜１×１０^７個/ｃｍ^３、さらに好ましくは細胞数が１×１０^５〜１×１０^７個/ｃｍ^３である。含有の仕方は、補綴材の表面でも、内部まで浸潤していても良い。

本発明の培養人工骨は、生体吸収性ポリマー、骨誘導可能な細胞以外の第３成分をさらに含有しても良い。該成分には、例えば、ＢＭＰ（骨形成因子）やβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅなどの骨分化誘導因子及びこれらの組み合わせなどが挙げられる。

（製造方法）
本発明の培養人工骨の製造方法は、（ｉ）補綴材を準備する工程、（ii）補綴材に骨誘導可能な細胞を含有させる工程からなる。補綴材及び骨誘導可能な細胞は、培養人工骨の項で説明したとおりである。
（ii）の工程は、補綴材に骨誘導可能な細胞を播種しただけでも、播種してからインビトロで培養しても良い。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例で使用した材料、測定方法は以下の通りである。

（１）ポリ乳酸−ポリグルコール酸共重合体：Absorbable Polymers International社製の50/50 Poly（DY-lactide-co-glycolide）、固有粘度：1.05ｄL/ｇ、３０℃、ヘキサフルオロイソプロパノール
（２）塩化メチレン、エタノール：和光純薬工業（株）製
（３）ラット間葉系幹細胞：大日本住友製薬（株）ラボラトリープロダクツ部製
（４）PBS：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
（５）α−MEM：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
（６）Antibiotics Antimycotics：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
（７）FBS：ＨＹＣＬＯＮＥ社製
（８）骨芽細胞分化用サプリメント：大日本住友製薬（株）ラボラトリープロダクツ部製
（９）トリプシン-EDTA（０．２５％トリプシン、１ｍM EDTA・４Na）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
（１０）TritonX-100：Ｓｉｇｍａ社製
（１１）Pico Green(登録商標) ds DNA Quantitationkit：Molecular Probe社製
（１２）酢酸マグネシウム四水和物：和光純薬工業（株）製
（１３）硫酸亜鉛七水和物：和光純薬工業（株）製
（１４）N−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸：同仁化学研究所（株）製
（１５）２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール：シグマアルドリッチジャパン社製
（１６）１ｍｏｌ／Ｌ塩酸：和光純薬工業（株）製
（１７）ｐ−ニトロフェニルりん酸二ナトリウム六水和物：和光純薬工業（株）製
（１８）１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液：和光純薬工業（株）製
（１９）ｐ−ニトロフェノール：Ｓｉｇｍａ社製

＜実施例１＞
（補綴材の製造）
ポリ乳酸−ポリグリコール酸（モル比５０／５０）共重合体１．５ｇ、塩化メチレン／エタノール＝７．５／１（重量部／重量部）８．５ｇを室温（２５℃）で混合し１５重量％のドープ溶液を調製した。図１に示す装置を用いて（ノズルと電極の間に静電除去器（春日電機(株)）及び巻き取り機（ＨＥＩＤＯＮ）を設置する）、１２０分間吐出し、巻き取り器７で紡糸された糸を巻き取り、繊維構造体を得た。このときの巻き取り機の回転数は１００ｒｐｍであった。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から巻き取り器７までの距離は２０ｃｍ、噴出ノズル１から静電除去器８までの距離は３５ｃｍ、噴出ノズル１３から電極５までの距離は５５ｃｍであった。生検トレパンを用いて直径５ｍｍの円柱状のものを切り出した。得られた補綴材の繊維径、高さ及び平均見かけ密度を表１に示す。繊維径については、試料をスパッタコーティング（Ｐｔ１．０ｎｍ）処理し、ＳＥＭ（ＪＳＭ−５３１０型（日本電子製）、加速電圧：２．０ｋＶ、撮影角度３０°）により観察を行った。高さについてはノギスを用いて測定した。補綴材の見かけ密度については下記式により算出した。
ρ＝４ｍ／πｄ^２ｈ
（ρ:多孔体の見かけ密度、ｍ:質量、ｄ:直径、ｈ:高さ）
図２に実施例１で得られた補綴材の光学顕微鏡写真（ＤＩＧＩＴＡＬＭＩＣＲＯＳＣＯＰＥＥ，ＫＥＹＥＮＣＥ社、倍率：４５０倍）を示す。

（ラット間葉系幹細胞の調製）
大日本住友製薬（株）ラボラトリープロダクツ部から購入したラット間葉系幹細胞を１５％FBS及び１％Antibiotics Antimycoticsを含むα−MEM中にて５％ＣＯ_２下で培養した。継代を繰り返し、継代数２で凍結保存しておいたラット間葉系幹細胞を３７℃のウォーターバスで溶解し、あらかじめ３７℃に保温しておいたＰＢＳ中に移した。数回ピペッティングした後、９００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離を行った。上清を除去し、１５％FBS及び１％Antibiotics Antimycoticsを含むα−MEMに懸濁し、８．６×１０^５個／ｍＬのラット間葉系幹細胞の懸濁液を調製した。

（培養人工骨の製造）
先に製造した補綴材に先に調製したラット間葉系幹細胞を１×１０^６個／ｃｍ^３となるように含有させた。この培養人工骨を１５％FBS及び１％Antibiotics Antimycoticsを含むα−MEMを用いて、２週間培養した（ｎ＝４）。培地交換は３回／週で行った。

（評価）
２週後に０．２％TritonX−１００で室温、５分間処理し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液からＤＮＡ及びアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の抽出液を調製した。この抽出液から、Pico Green(登録商標) ds DNA Quantitationkitを用いてＤＮＡ量を、国際臨床化学会の勧告案に基づく反応緩衝液を用いてＡＬＰ活性を測定し、ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性を算出した。

（１）ＤＮＡ量測定
キットに含まれているλＤＮＡスタンダード及びＴＥを用いて、段階希釈系列の標準ＤＮＡ溶液を調製した。これら標準ＤＮＡ溶液及び試料を１００μＬずつ９６穴マイクロプレートに入れた。キットに含まれているＲｅａｇｅｎｔを１００μＬずつ加え、よく撹拌後、室温で５分間静置した。その後、蛍光マイクロプレートリーダーにて４８５ｎｍの波長で励起して５３５ｎｍの波長にて蛍光を測定した。標準ＤＮＡ溶液の値から検量線を作成し、それを基に試料のＤＮＡ量を算出した。その結果を表２に示す。

（２）ＡＬＰ活性測定
骨芽細胞の指標とされているＡＬＰはｐ−ニトロフェノールリン酸を基質とし、ｐ−ニトロフェノールとリン酸を生成する。そこで生成されるｐ−ニトロフェノールの吸光度変化を測定することでＡＬＰ活性を算出した。ＡＬＰ活性の測定に用いた反応緩衝液は活性化剤、ＡＭＰ緩衝液、ＡＬＰ基質液、反応停止液、ｐ−ニトロフェノール希釈液及び１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェノール原液であった。活性化剤は、酢酸マグネシウム四水和物（終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、硫酸亜鉛七水和物（終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びN−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる。ＡＭＰ緩衝液は、活性化剤（終濃度２％）及び２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（終濃度０．３５ｍｏｌ／Ｌ）からなり、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐH＝１０．４〜１０．５に調整した。ＡＬＰ基質液は、ＡＭＰ緩衝液及びｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（終濃度１６ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる。反応停止液は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液からなる。ｐ−ニトロフェノール希釈液は、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（終濃度０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる。１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェノール原液は、ｐ−ニトロフェノール希釈液及びｐ−ニトロフェノール（終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる。

１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェノール原液及びｐ−ニトロフェノール希釈液を用いて、段階希釈系列の標準ｐ−ニトロフェノール溶液を調製した。これら標準ｐ−ニトロフェノール溶液２００μＬに当量の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、１００μＬずつ９６穴マイクロプレートに入れた。マイクロプレートリーダーにて波長４０５ｎｍの波長で吸光度を測定し、検量線を作成した。次に、試料１０μＬにＡＬＰ基質液９０μＬを加え、３７℃で１０分間処理した。その後、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。上清１００μＬを９６穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。標準ｐ−ニトロフェノール溶液の検量線から、試料のｐ−ニトロフェノール量を算出してから、ＡＬＰ活性を下記式により求めた。その結果を表３に示す。
ＡＬＰ活性＝試料のｐ−ニトロフェノール濃度×反応停止後の試料溶液量／反応時間
×（抽出液量／測定に使用した抽出液量）

（３）ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性
（１）及び（２）で算出されたＤＮＡ量及びＡＬＰ活性を用いて、下記式によりＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性を求めた。その結果を表４に示す。
ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性＝ＡＬＰ活性／ＤＮＡ量

＜参考例１＞
コントロール群（ｎ＝３）として、補綴材を用いず、ラット間葉系幹細胞を１２穴マイクロプレートに５×１０^３個／ｃｍ^２となるように播種し、２週間単層培養した。培地交換は３回／週で行った。実施例１と同様に評価を行いＤＮＡ量、ＡＬＰ活性及びＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性を求めた。その結果を表２〜４に示す。
実施例１の培養人工骨は参考例１のコントロール群に比べ、２．３倍高い骨分化誘導能が認められた。

＜実施例２＞
（補綴材の製造）
実施例１と同様に、表１に示すような補綴材を得て、ラット間葉系幹細胞を調製し、培養人工骨を体積比５％となるように骨芽細胞分化用サプリメントを添加した１５％FBS及び１％Antibiotics Antimycoticsを含むα−MEMを用いて、２週間培養し培養人工骨（ｎ＝４）を得て、実施例１と同様にＤＮＡ量、ＡＬＰ活性及びＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性を求めた。その結果を表２〜４に示す。

＜参考例２＞
コントロール群として、補綴材を用いず、体積比５％となるように骨芽細胞分化用サプリメントを添加した１５％FBS及び１％Antibiotics Antimycoticsを含むα−MEMを用いて、２週間培養した以外は、実施例２と同様に評価を行った。その結果を表２〜４に示す。
実施例２の培養人工骨は、参考例２のコントロール群に比べ、１．２倍高い骨分化誘導能が認められた。

以上の結果より、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの生体吸収性ポリマーの繊維構造体から構成され、平均見かけ密度が１０〜３５０kg/ｍ^３、高さが０．５mm以上の多孔体からなる補綴材は骨誘導可能な細胞を骨分化誘導する能力が高いことが確認できた。これにより、本発明の培養人工骨は、骨欠損治療用材料として優れていることが分かった。

本発明の培養人工骨は、再生医療における骨治療用材料として有用である。

補綴材の製造に用いる装置の一例である。実施例１で得られた補綴材の光学顕微鏡写真である。

符号の説明

１．溶液噴出ノズル
２．紡糸液
３．紡糸液保持槽
４．電極
５．電極
６．高電圧発生器
７．巻き取り装置
８．静電除去装置

Claims

（ｉ）平均繊維径が０．０５〜１０μｍの生体吸収性ポリマーの繊維構造体から構成され、平均見かけ密度が５０〜３００ｋｇ／ｍ^３、高さが２．０ｍｍ以上の多孔体からなる補綴材、並びに（ii）補綴材に含有された骨誘導可能な細胞、からなる培養人工骨。
該多孔体の平均繊維径が、０．２〜８μｍであることを特徴とする請求項１に記載の培養人工骨。
該生体吸収性ポリマーが、主として脂肪族ポリエステルからなる請求項１に記載の培養人工骨。
該脂肪族ポリエステルが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、及びそれらの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３に記載の培養人工骨。
平均見かけ密度が、１００〜２５０kg/ｍ^３であることを特徴とする請求項１に記載の培養人工骨。
骨誘導可能な細胞が、骨髄由来細胞であることを特徴とする請求項１に記載の培養人工骨。
該骨髄由来細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の培養人工骨。
骨誘導可能な細胞が、７回以下の継代数であることを特徴とする請求項１に記載の培養人工骨。
骨誘導可能な細胞が、１×１０^３〜１×１０^７個/ｃｍ^３の濃度で補綴材に含有されていることを特徴とする請求項１に記載の培養人工骨。