JP5038128B2 - Drug carrier - Google Patents

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Description

本発明は、分子集合体に薬物を担持させ、分子集合体の構成成分の一部である両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用して薬物動態を制御する薬物運搬体製剤に関する。   TECHNICAL FIELD The present invention relates to a drug carrier preparation for controlling pharmacokinetics by utilizing a phenomenon in which a drug is carried on a molecular assembly and an amphiphilic molecule that is a part of a component of the molecular assembly is released from the molecular assembly. .

現在、薬物を分子集合体中に組み込んだ薬物運搬体をドラッグデリバリーシステムとして利用する試みが盛んに研究され、一部は既に臨床応用されている。例えば、親水性の薬物に関しては、リン脂質分子が集合して構築する二分子膜小胞体、いわゆるリポソームの内水相に内包させた薬物運搬体がある。また、疎水性の薬物に関しては、ｏ／ｗエマルジョンであるリピッドマイクロスフェア、界面活性剤または両親媒性高分子が構築するミセルなどの分子集合体の疎水部に物理的に溶解あるいは化学的に担持させた薬物運搬体がある。あるいはリポソームの二分子膜疎水部に疎水性薬物を包埋させる場合もある。
これらの薬物運搬体を例えば血中に投与すると、主に細網内皮系の発達した臓器（例えば脾臓、肝臓など）の貪食細胞に取り込まれるため、血中滞留時間は著しく短く、これらの臓器を標的にする薬物運搬体に適用が限られる。そのため、血中滞留時間を延長させる方策が採られている。例えば水溶性で生体適合性の高い高分子であるポリエチレングリコール鎖などを被覆したリポソームが、いわゆるステルスリポソームとして多用されている。この技術は、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉらの血清アルブミンをポリエチレングリコール鎖で修飾する研究からはじまり、すでに１９９０年代前半にアデノシンデアミナーゼ、アスパラギナーゼを修飾したものが臨床認可されている。ポリエチレングリコール鎖にて蛋白質を修飾することで、抗原性の減少、血中滞留性の増大などの効果が得られることが報告されている。
ポリエチレングリコール鎖の表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−リポソーム）は、細網内皮系の取り込みを回避し、長時間血中に滞留することができる。この特性を生かした、固形癌組織へのパッシブターゲティングがドラッグデリバリーシステムの戦略の一つになっている。
一般的に固形癌組織は、分岐の多い新生血管が異常に発達し、その血管壁は薄く不連続という特徴を有している。血中滞留性の高いＰＥＧ−リポソームは、そのサイズを３００ｎｍ以下にすると、癌組織の透過性の高い血管壁を介して血中から間質へ漏出することが可能となり、一旦出たものは管腔側に戻りにくく蓄積するようになる。そのため、ＰＥＧ−リポソームは、低分子の薬物よりも固形癌組織に高い集積性が得られるという効果、すなわち、ＥＰＲ効果を持っており、腫瘍組織へのターゲティングにおいては重要な要素のひとつである。
最近では、リポソーム表面に組織や臓器を特異的に認識する抗体、インテグリンの一部、またはリガンド分子を担持して、積極的な認識によって組織または臓器をターゲティングする試みが検討されている。これをアクティブターゲティングと呼んでいる。血中滞留時間を延長させる目的でポリエチレングリコール鎖にて表面修飾されたリポソームでは、この認識部位がポリエチレングリコール鎖で隠されているとアクティブターゲティングが阻害されるため、ポリエチレングリコール鎖の末端の一部に認識部位を結合させる方法が採用されている。
一方、別の側面であるリポソームの安定性から考えると、分子集合体であるリポソームはそれを構成する両親媒性分子を何らかのエネルギー照射にて水中に分散させ、疎水性相互作用により自己集合する現象を利用して調製するため、物理化学的には準安定状態である。従って、保存時に凝集または融合が起こり、やがて沈殿が起こる場合がある。そのため、血中安定性も考慮してリポソームの構成脂質には負電荷脂質またはコレステロールを混合させ、ポリエチレングリコール鎖または糖鎖でリポソームの表面を修飾することにより、その解決が図られてきた。そのため、ポリエチレングリコール鎖によるリポソームの表面修飾の方法が重要であり、ポリエチレングリコール鎖をジアシルホスファチジルエタノールアミンまたはコレステロールに結合させた脂質が広く使用されている。このポリエチレングリコール結合ジアシル型脂質はリン脂質二分子膜小胞体から遊離することが報告されている（Ｊ．Ｒ．Ｓｉｌｖｉｕｓ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３１５３，１９９３、Ｋ．Ｓｏｕ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ，１１，３７２，２０００）。この脂質の遊離速度は、ポリエチレングリコール鎖の分子量と疎水部の大きさ（アシル鎖を構成する炭素数）、すなわち親水性−疎水性バランスによって左右され、親水部が相対的に大きい脂質が遊離し易い。そこで、我々は、モノデンドロン構造を利用して、一本のポリエチレングリコール鎖と多数のアルキル鎖を結合させた脂質を開発し、分子量の大きなポリエチレングリコール鎖を結合させても脱離し難い一連の両親媒性分子を手にすることができた（特許第３１８１２７６号公報）。At present, many attempts have been made to use a drug carrier incorporating a drug in a molecular assembly as a drug delivery system, and some have already been clinically applied. For example, regarding a hydrophilic drug, there is a drug transporter encapsulated in an inner aqueous phase of a so-called liposome, which is a bilayer vesicle formed by assembling phospholipid molecules. As for hydrophobic drugs, they are physically dissolved or chemically supported in the hydrophobic part of molecular aggregates such as lipid microspheres that are o / w emulsions, micelles constructed by surfactants or amphiphilic polymers. There is a drug carrier. Alternatively, a hydrophobic drug may be embedded in the hydrophobic part of the bilayer membrane of the liposome.
When these drug carriers are administered into blood, for example, they are taken up by phagocytic cells mainly in organs with developed reticuloendothelial system (eg, spleen, liver, etc.), so the residence time in blood is remarkably short. Limited application to targeted drug carriers. Therefore, measures have been taken to extend the residence time in blood. For example, liposomes coated with polyethylene glycol chains, which are water-soluble and highly biocompatible polymers, are frequently used as so-called stealth liposomes. This technique began with a study of modifying Abuchowski et al.'S serum albumin with a polyethylene glycol chain, and adenosine deaminase and asparaginase were already clinically approved in the early 1990s. It has been reported that by modifying a protein with a polyethylene glycol chain, effects such as a decrease in antigenicity and an increase in blood retention can be obtained.
Polyethylene glycol chain surface modified liposomes (PEG-liposomes) avoid reticuloendothelial uptake and can stay in the blood for extended periods of time. One of the strategies of drug delivery system is passive targeting to solid cancer tissue that takes advantage of this property.
In general, solid cancer tissue is characterized by abnormal development of new blood vessels with many branches and thin and discontinuous blood vessel walls. When the size of the PEG-liposome with high blood retention is 300 nm or less, it becomes possible to leak from the blood to the interstitium through the highly permeable blood vessel wall of the cancer tissue. Accumulate on the cavity side with difficulty. Therefore, PEG-liposomes have an effect that higher accumulation can be obtained in a solid cancer tissue than a low-molecular-weight drug, that is, an EPR effect, and is one of important factors in targeting to tumor tissue.
Recently, an attempt to target a tissue or organ by positive recognition by carrying an antibody, a part of an integrin or a ligand molecule that specifically recognizes the tissue or organ on the liposome surface has been studied. This is called active targeting. In liposomes surface-modified with a polyethylene glycol chain for the purpose of extending the residence time in the blood, if this recognition site is hidden by the polyethylene glycol chain, active targeting is inhibited, so part of the end of the polyethylene glycol chain A method of binding the recognition site to the is adopted.
On the other hand, considering the stability of the liposome, which is another aspect, the liposome that is a molecular assembly is a phenomenon in which the amphiphilic molecules that compose it are dispersed in water by some energy irradiation and self-assembled by hydrophobic interaction. Therefore, it is metastable in terms of physico-chemistry. Therefore, aggregation or fusion may occur during storage, and precipitation may occur over time. Therefore, in consideration of the stability in blood, the solution has been achieved by mixing negatively charged lipids or cholesterol with the lipids constituting the liposomes and modifying the surface of the liposomes with polyethylene glycol chains or sugar chains. Therefore, the method of surface modification of liposomes with polyethylene glycol chains is important, and lipids in which polyethylene glycol chains are bound to diacylphosphatidylethanolamine or cholesterol are widely used. This polyethylene glycol-linked diacyl lipid has been reported to be released from phospholipid bilayer endoplasmic reticulum (JR Silvivus and MJ Zuckermann, Biochemistry, 32, 3153, 1993, K. Sou, et. al, Bioconjugate, 11, 372, 2000). The release rate of this lipid depends on the molecular weight of the polyethylene glycol chain and the size of the hydrophobic part (the number of carbons constituting the acyl chain), that is, the hydrophilic-hydrophobic balance, and the lipid having a relatively large hydrophilic part is released. easy. Therefore, we have developed a lipid that combines a single polyethylene glycol chain and a number of alkyl chains using the monodendron structure, and a series of parents that are difficult to detach even when a polyethylene glycol chain with a large molecular weight is bound. I was able to get medicinal molecules (Japanese Patent No. 3181276).

上述した研究背景の中で、本発明者らは、これまで合成した一連のポリエチレングリコール結合脂質を用いて、ポリエチレングリコール結合脂質のポリエチレングリコール鎖の末端に更に親水性の認識部位、例えば蛋白質などを結合させた場合、親水性−疎水性バランスがより親水性に傾くために遊離が起きてしまうことを明らかにした。このため、親水性の認識部位が遊離しないように当該認識部位をリポソームの表面に安定担持させる目的で、結合脂質の疎水部を大きくさせることを検討してきた。しかし、結果的には依然として遊離が起こり、完全に遊離を抑えることは困難であった。そして、完全に遊離を抑制する分子設計としては、例えば膜貫通蛋白質のようにペプチド鎖を複数回膜に貫通させた分子構造が必要であると思われた。これに対し、本発明者らは蛋白質結合ポリエチレングリコール鎖結合脂質の遊離現象を好ましくないものと考えずに、むしろ遊離速度を制御することによって、リポソームの血中滞留性の制御や薬物の徐放性の制御につながるとの発想の転換から、遊離現象を積極的に利用する方針への変更を検討するに至った。
本発明者らは、両親媒性分子からなる分子集合体に薬物を担持させ、分子集合体を構成する脂質（例えばポリエチレングリコール結合脂質）の遊離現象を利用し、薬物運搬体の体内動態が制御される薬物運搬体製剤を提供することを本発明の課題のひとつとした。さらに拡張して、希釈効果（濃度変化）、温度変化、ｐＨ変化、化学反応など様々な外部刺激によってその遊離が促進されれば、薬物運搬体の体内動態の積極的な制御法として利用できるので、これも課題のひとつとした。そして、本課題をリン脂質の分子集合体であるリポソームのみならず、エマルジョンまたはミセルなどの分子集合系を基盤とした薬物運搬体全体への適応に拡大させることも検討した。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、分子集合体を構成する両親媒性分子を所定の分子構造とし、当該分子集合体の外部環境を変えることで両親媒性分子の遊離を任意に調節し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体である。より具体的に、本発明は、以下に示した薬物運搬体等を提供するものである。
（１）薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体。
（２）遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） １
または
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｃ）−（薬物） ２
［式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｃは疎水部と薬物とを結合する部位である］で表されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（３）遊離する両親媒性分子が、
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ３
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ４
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］で表され、この両親媒性分子の遊離によって生体内における薬物動態が制御される（１）記載の薬物運搬体。
（４）（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ５
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水部とを結合する部位である］で表される両親媒性分子５が担持されている分子集合体であって、該分子集合体に導入されている
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ３
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位である］で表される両親媒性分子３が両親媒性分子５の認識を阻害する状態にあって、両親媒性分子３の遊離によって両親媒性分子５の認識能が発現されることで生体内における薬物動態が制御されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（５）遊離する両親媒性分子の疎水部が２本以上１８本以下の炭化水素鎖を含有するものである（１）から（４）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（６）遊離する両親媒性分子の結合部位Ｂにオリゴ糖鎖、オリゴペプチド鎖、ポリエステル鎖、ビニル系オリゴマーまたはデンドロン構造を含む（５）記載の薬物運搬体。
（７）遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部） ６
または
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物） ７
［式中、結合部位Ａは薬物と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位である］で表されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（８）遊離する両親媒性分子が、
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部） ８
または
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子） ９
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子） １０
または
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｅ）−（認識部位） １１
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］で表され、この両親媒性分子の遊離によって生体内における薬物動態が制御されるものである（１）記載の薬物運搬体。
（９）遊離する両親媒性分子の親水部または親水性高分子がポリエチレングリコールを含有するものである（１）から（８）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１０）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、この分子集合体の分散液の希釈によるものである（１）から（９）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１１）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、温度変化によるものである（１）から（１０）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１２）分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも１種の濃度変化によるものである（１）から（１１）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１３）遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部に、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びシッフ塩基からなる群から選択される少なくとも１種の結合を含有し、かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離がこれらの結合の加水分解によるものである（１）から（１２）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１４）遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部にジスルフィド結合を含有し、かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、ジスルフィド結合の還元によるものである（１）から（１３）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１５）両親媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によって、分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである（１）から（１４）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１６）分子集合体が小胞体構造を有するものである（１）から（１５）までのいずれかに記載の薬物運搬体。
（１７）両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部または全体的な破壊によって、小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである（１６）記載の薬物運搬体。
本発明によれば、その目的に応じて運搬する薬物の体内動態を制御することができる薬物運搬体が提供される。In the above research background, the present inventors used a series of polyethylene glycol-bound lipids synthesized so far, and added a hydrophilic recognition site such as a protein to the end of the polyethylene glycol chain of the polyethylene glycol-bound lipid. It has been clarified that liberation occurs because the hydrophilic-hydrophobic balance tends to become more hydrophilic when bonded. For this reason, it has been studied to increase the hydrophobic part of the binding lipid for the purpose of stably supporting the recognition site on the surface of the liposome so that the hydrophilic recognition site is not released. However, as a result, release still occurred, and it was difficult to completely suppress the release. And for molecular design that completely suppresses release, it seems that a molecular structure in which a peptide chain penetrates the membrane multiple times, such as a transmembrane protein, is necessary. On the other hand, the present inventors do not consider the release phenomenon of protein-bound polyethylene glycol chain-bound lipids unfavorable, but rather control the release rate of liposomes and control the release of drugs by controlling the release rate. From the change of the idea that it leads to sex control, we came to consider a change to the policy of actively using the liberation phenomenon.
The present inventors have the drug carried on a molecular assembly composed of amphipathic molecules, and controlled the pharmacokinetics of the drug carrier by utilizing the release phenomenon of the lipid (eg, polyethylene glycol-binding lipid) constituting the molecular assembly. An object of the present invention is to provide a drug carrier preparation to be used. If it is further expanded and its release is promoted by various external stimuli such as dilution effect (concentration change), temperature change, pH change, chemical reaction, etc., it can be used as an active control method of drug carrier pharmacokinetics This was also one of the issues. We have also studied the expansion of this subject to include not only liposomes, which are phospholipid molecular assemblies, but also whole drug carriers based on molecular assembly systems such as emulsions or micelles.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor made amphiphilic molecules constituting a molecular assembly into a predetermined molecular structure, and released amphiphilic molecules by changing the external environment of the molecular assembly. Has been found to be arbitrarily adjustable, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is a drug carrier including a molecular assembly carrying a drug, and a part of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly is released from the molecular assembly due to a change in the external environment. This is a drug carrier whose pharmacokinetics in the living body are controlled. More specifically, the present invention provides the following drug carriers and the like.
(1) A drug carrier including a molecular assembly on which a drug is supported, wherein a part of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly is released from the molecular assembly due to a change in the external environment, A drug carrier whose pharmacokinetics are controlled in vivo.
(2) The released amphiphilic molecule is
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion) 1
Or (hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part)-(binding site C)-(drug) 2
[Wherein the binding site A is a site that binds the hydrophilic portion and the drug, the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, and the binding site C is a site that binds the hydrophobic portion and the drug. The drug carrier according to (1), which is represented by
(3) The released amphiphilic molecule is
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) 3
Or (recognition site)-(binding site E)-(hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion) 4
[Wherein, the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, the binding site D is a site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic portion, and the binding site E is a recognition site and a highly hydrophilic site. The drug carrier according to (1), wherein the pharmacokinetics in vivo is controlled by the release of the amphiphilic molecule.
(4) (recognition site)-(binding site E)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) 5
[Wherein the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, and the binding site E is a site that binds the recognition site and the hydrophilic portion]. (Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion) 3
[Wherein the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, and the binding site D is a site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic portion] In a state where the recognition of the amphiphilic molecule 5 is inhibited, the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 is expressed by the release of the amphiphilic molecule 3, whereby the pharmacokinetics in the living body is controlled ( 1) The drug carrier according to the above.
(5) The drug carrier according to any one of (1) to (4), wherein the hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule contains 2 or more and 18 or less hydrocarbon chains.
(6) The drug carrier according to (5), which contains an oligosaccharide chain, oligopeptide chain, polyester chain, vinyl oligomer or dendron structure at the binding site B of the liberated amphiphilic molecule.
(7) The released amphiphilic molecule is
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)-(Binding site B)-(Hydrophilic portion) 6
Or (drug)-(binding site A)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion)-(binding site A)-(drug) 7
The drug according to (1), wherein the binding site A is a site that binds the drug and the hydrophilic portion, and the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion. Carrier.
(8) The released amphiphilic molecule is
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion) 8
Or (hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion)-(binding site D)-(hydrophilic) Polymer) 9
Or (recognition site)-(binding site E)-(hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part)-(binding site B)-(hydrophilic part) )-(Binding site D)-(hydrophilic polymer) 10
Or (recognition site)-(binding site E)-(hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part)-(binding site B)-(hydrophilic part) )-(Binding site D)-(hydrophilic polymer)-(binding site E)-(recognition site) 11
[Wherein, the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, the binding site D is a site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic portion, and the binding site E is a recognition site and a highly hydrophilic site. The drug carrier according to (1), wherein the pharmacokinetics in vivo is controlled by the release of the amphiphilic molecule.
(9) The drug carrier according to any one of (1) to (8), wherein the hydrophilic part or hydrophilic polymer of the liberated amphiphilic molecule contains polyethylene glycol.
(10) The drug carrier according to any one of (1) to (9), wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to dilution of a dispersion of the molecular assembly.
(11) The drug carrier according to any one of (1) to (10), wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to a temperature change.
(12) The release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to a change in concentration of at least one selected from the group consisting of protons, alkali metal ions, and alkaline earth metal ions. ) The drug carrier according to any of the above.
(13) At least one type of bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond and a Schiff base is contained in the site or hydrophobic part that binds the hydrophilic part and the hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule. The drug carrier according to any one of (1) to (12), wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is caused by hydrolysis of these bonds.
(14) The site where the hydrophilic part and hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule are bonded or the hydrophobic part contains a disulfide bond, and the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to reduction of the disulfide bond. The drug carrier according to any one of (1) to (13).
(15) Any one of (1) to (14), wherein the drug held in the molecular assembly is released by partial or total destruction of the molecular assembly structure accompanying the release of the amphiphilic molecule. A drug carrier according to any one of the above.
(16) The drug carrier according to any one of (1) to (15), wherein the molecular assembly has an endoplasmic reticulum structure.
(17) The drug carrier according to (16), wherein the drug retained in the aqueous phase of the endoplasmic reticulum is released by partial or total destruction of the endoplasmic reticulum structure accompanying the release of the amphiphilic molecule. .
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the drug delivery body which can control the pharmacokinetics of the drug delivered according to the objective is provided.

図１Ａは、本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図である。
図１Ｂは、本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図である。
図２は、ＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動を比較したグラフである。
図３は、蛋白質担持リポソームからの蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離挙動を比較したグラフである。
図４は、還元剤添加による蛋白質結合リポソームからの蛋白質の脱離挙動を比較したグラフである。
図５は、糖脂質のアルキル鎖数の相違による糖脂質のＣＭＣ測定結果を示したグラフである。
図６は、蛋白質の相違による蛋白質結合リポソームからの蛋白質結合膜脂質の脱離速度を比較したグラフである。
図７は、蛋白質分子量の相違による蛋白質結合リポソームからの蛋白質結合糖脂質の脱離速度を比較したグラフである。
図８は、ｐＨ応答性リポソームの低ｐＨによる加水分解後の薄層クロマトグラフィ検出結果を示した図である。
図９は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子のｐＨ変化による放出挙動を示したグラフである。
図１０は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子の各ｐＨにおける経時的な放出挙動を示したグラフである。
図１１は、ｐＨ応答性リポソーム中に内包された蛍光分子のｐＨ変化による放出挙動を示したグラフである。
図１２は、ジスルフィド脂質を含むリポソーム中に内包されたカルセインの還元剤添加による放出挙動を示したグラフである。
図１３は、種々のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率のリポソーム分散液に対してＣｏｎ Ａ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。
図１４は、図１３の０．５分後、５分後の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）変化をＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率に対してプロットしたグラフである。
図１５は、２ｍｏｌ％ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入リポソームに１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）を導入した系を、希釈倍率を変化させて希釈し、この系にＣｏｎ Ａ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。
図１６は、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅが活性化血小板と特異的に結合すること、並びにＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅにＰＥＧを導入することにより結合が抑制されることを示したグラフである。
図１７は、ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅのＰＥＧ脱離に伴う活性化血小板への結合率を比較したグラフである。FIG. 1A is a diagram showing a model structure of an amphiphilic molecule used in the drug carrier of the present invention.
FIG. 1B is a diagram showing a model structure of an amphiphilic molecule used in the drug carrier of the present invention.
FIG. 2 is a graph comparing the desorption behavior of PEG lipids from the endoplasmic reticulum.
FIG. 3 is a graph comparing the desorption behavior of protein-bound transmembrane lipids from protein-loaded liposomes.
FIG. 4 is a graph comparing the desorption behavior of proteins from protein-bound liposomes with the addition of a reducing agent.
FIG. 5 is a graph showing the CMC measurement results of glycolipids due to differences in the number of alkyl chains of glycolipids.
FIG. 6 is a graph comparing the desorption rates of protein-bound membrane lipids from protein-bound liposomes due to protein differences.
FIG. 7 is a graph comparing the desorption rates of protein-bound glycolipids from protein-bound liposomes due to differences in protein molecular weight.
FIG. 8 shows the results of thin layer chromatography detection after hydrolysis of pH-responsive liposomes at a low pH.
FIG. 9 is a graph showing the release behavior of fluorescent molecules encapsulated in pH-responsive liposomes due to changes in pH.
FIG. 10 is a graph showing the release behavior of fluorescent molecules encapsulated in pH-responsive liposomes over time at each pH.
FIG. 11 is a graph showing the release behavior of a fluorescent molecule encapsulated in a pH-responsive liposome according to pH change.
FIG. 12 is a graph showing the release behavior of calcein encapsulated in liposomes containing disulfide lipid by addition of a reducing agent.
FIG. 13 is a graph showing the change over time of the turbidity (OP value, λ = 600 nm) of the dispersion when the Con A solution was added to the liposome dispersion with various MP-Glu2C18 introduction rates. is there.
FIG. 14 is a graph in which changes in turbidity (OP value, λ = 600 nm) after 0.5 minutes and 5 minutes in FIG. 13 are plotted against the MP-Glu2C18 introduction rate.
FIG. 15 shows a dispersion obtained when a system in which 1 mol% PEG lipid (P125-2C14) was introduced into 2 mol% MP-Glu2C18-introduced liposomes was diluted by changing the dilution ratio, and a Con A solution was added to this system. It is the graph which showed the time-dependent change of turbidity (OP value, (lambda) = 600nm).
FIG. 16 is a graph showing that H12-vesicle specifically binds to activated platelets and that binding is suppressed by introducing PEG into H12-vesicle.
FIG. 17 is a graph comparing the binding rate of PEG (H12) -vesicle to activated platelets accompanying PEG elimination.

本発明者らの分子集合科学に基づいた研究知見によれば、すべての分子集合体の構成分子は集合体と水相との間で平衡状態をとっており、リン脂質の場合にはその平衡は極めて集合体側に傾いている。しかし、親水性の高いポリエチレングリコール結合脂質、疎水性の低い一本鎖の脂肪酸、あるいはリン脂質のリゾ体などはより多くの分子が水相に遊離している状態で平衡となっている。そして、両親媒性分子の親水性−疎水性バランスの変化によってその両親媒性分子の遊離状態が制御される現象は、この平衡論に基づいて理解されている。例えば、分子集合体の水性分散液において、分子集合体が濃厚な状態では、遊離させたい両親媒性分子の平衡は集合体に傾いている。これを希釈すると、平衡状態は水相への遊離状態に傾き、遊離させたい両親媒性分子は遊離して新たな平衡状態に達する。また、平衡状態は温度の関数であるため、温度を上昇させると両親媒性分子は遊離して新たな平衡状態に達する。この様な物理的な因子で遊離を制御することができる。また、化学的な因子としては、両親媒性分子の疎水部や疎水部と親水部との結合部位を化学的に切断して疎水部を小さくすることによって、親水性−疎水性のバランスが親水性側に傾き、遊離を促進させることができる。切断される化学結合としては、加水分解性のエステル結合、アミド結合、ウレタン結合またはシッフ塩基等、または還元剤にて切断されるジスルフィド結合などが利用できる。
具体的に、本発明者らは、親水性−疎水性バランスを調節できる両親媒性分子として、大きな親水部を持つポリエチレングリコール型脂質、例えばジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質、グリセロールのジアシル誘導体の水酸基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質、三官能性アミノ酸（グルタミン酸やリジン）のジアルキル誘導体のカルボキシル基やアミノ基にポリエチレングリコールを共有結合させた脂質などの、いわゆる大きな親水部に対してそれを二分子膜に安定固定させるための大きな疎水部を持つ必要性から分子設計を行い、多アシル型脂質の発明に至っている（特許第３１８１２７６号）。本発明者らは、これらの両親媒性分子を用いて、親水性−疎水性バランスが両親媒性分子の遊離速度に及ぼす影響を解析し、大きな疎水部を有する両親媒性分子のリポソームへの固定と遊離に関して、本発明の基礎となる多くの知見を集積し、さらに遊離を促進する物理的因子、化学的因子を整理した。
また、本発明者は、ポリエチレングリコール型脂質の固定とは逆の発想で、この脂質の遊離によって、むしろ効果的に外部刺激に応じた薬物の体内動態が制御できるという発想に至った。
以下、本発明の薬物運搬体についてより具体的に説明する。
まず、本発明の薬物運搬体に用いられる分子集合体について述べる。本発明の薬物運搬体に用いられる分子集合体は、薬物を担持させることができるものであれば特に限定されない。そのような分子集合体としては、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、その他分子集合体（チューブ、ファイバー、リボン、シート等）を用いることができる。この分子集合体の構成成分としては、外部環境の変化によって分子集合体から遊離しうる両親媒性分子と、この遊離性両親媒性分子と分子集合体を形成する性質がある高分子とが含まれる。分子集合体を形成する高分子としては、遊離性の両親媒性分子と分子集合体を形成する性質があるものであれば特に限定されず、合成または天然の高分子を使用することができる。合成高分子としては、例えば、両親媒性のブロック共重合体または多糖類などの親水性の主鎖に疎水性の置換基を持つくし型高分子、あるいは両親媒性の膜タンパク質などが挙げられる。これらの高分子が形成する分子集合体の形状は高分子ミセルが一般的であるが、小胞体状またはファイバー状、チューブ状、シート状のものであってもよい。あるいは、ポリ［Ｎ−２（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＰＨＰＭＡ）またはポリ［Ｎ−（イソプロピル）アクリルアミド］（ＰＮＩＰＡＭ）などの温度応答性のビニル系ポリマーなどが転移温度以上で形成する凝集体も分子集合体の構成成分として使用できる。
水と混じり合わないトリグリセリドなどの油滴をリン脂質などの界面活性剤などで安定化させたｏ／ｗエマルジョンやリピドマイクロスフェアは、脂溶性の薬物の安定分散に多用される。この場合、薬物としては、特に限定されるものではないが、例えばドキソルビシン誘導体またはパクリタキセルまたはメトトレキセートなどを用いることができる。
薬物運搬体として汎用されるリン脂質小胞体あるいはリポソームは、脂質及び／又はリポタンパク質によって、水性媒質中で分子間相互作用（疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合など）することにより、共有結合を介さずに構成された膜を持つ小胞構造の分子集合体であり、その膜は単層（一枚の二分子膜）又は多重層（ラメラ）膜を形成するものである。そのサイズは数十ナノメートルから数十マイクロメートルのものがあるが、好ましくは１０ナノメートルから１マイクロメートル、より好ましくは３０ナノメートルから３００ナノメートルである。その他、二分子膜のシート状、リボン状、チューブ状またはファイバー状などの集合形態があり、これらも本発明でいう分子集合体に含まれる。
小胞体構造を有する分子集合体は、小胞体の内水相または二分子膜に水溶性や脂溶性の薬物を保持させることができ、これにより血中滞留時間を延長させることができるので好ましい。小胞体構造を有するものの中でも、特にリン脂質小胞体あるいはリポソームが好ましい。
リン脂質小胞体あるいはリポソームは薬物運搬体の領域で開発が進んでおり、リン脂質単独、あるいはリン脂質とコレステロール及び／又は脂肪酸との混合脂質によって構成される。
リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質などが挙げられる。これらのリン脂質は、エン（二重結合）、イン（三重結合）、ジエン、ジイン、トリエンなどの不飽和部を含有しても良いし、ビニル基などの重合性基、例えばスチリル基を含有しても良い。重合性リン脂質の具体例としては、１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）ホスファチジルコリン、１，２−ジ（オクタデカ−２，４−ジエノイル）ホスファチジン酸、１，２−ビスエレオステアロイルホスファチジルコリンなどが挙げられる。リン脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜７０モル％であることが好ましく、２０〜５０モル％であることがより好ましい。
アシル鎖を構成する脂肪酸としては、炭素数１２〜２０の飽和または不飽和脂肪酸が用いられる。例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オクタデカ−２，４−ジエン酸などがある。更には、グリセロール骨格ではなく、３官能性アミノ酸、例えばグルタミン酸やリジン骨格を持つ両イオン性などのアミノ酸型脂質も使用することができる。脂肪酸の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることがより好ましい。
分子集合体には、負電荷脂質を成分として添加することもできる。膜成分中に負電荷脂質を混合させることで小胞体同士の凝集が抑制され、被覆層数が減少して内包効率を増大させることができるからである。負電荷脂質としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、アニオン性アミノ酸型脂質などが使用できる。負電荷脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることが特に好ましい。
また、分子集合体には、脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤として添加してもよい。そのようなステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられるが、好ましくはコレステロールである。ステロール類の含有量に制限はないが、小胞体膜の安定性を考慮すれば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０モル％である。
本発明において、分子集合体には、外部環境の変化によって分子集合体から遊離しうる両親媒性分子が含まれる。当該両親媒性分子の含有量は、標的となる臓器・組織、薬物の種類、薬物の担持部位、担持方法、分子集合体の形態等に応じて適宜決定されるものであり、特に制限はないが、例えば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜１００モル％であることが好ましく、０．０５〜５０モル％であることがより好ましく、０．１〜３０モル％であることが特に好ましい。
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、一般に公知の方法を用いることができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などで製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールやエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
このような分子集合体に薬物を担持させる方法は、薬物の種類等に応じて適宜選択すればよい。水溶性薬剤の場合には、例えば、リポソーム製造時に薬剤を水相に溶解させて調製することができる。あるいは、リポソームを製造した後に外水相に水溶性薬剤を添加し、リポソーム膜の透過性を利用して、内水相に薬剤を導入させることができる。内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。脂溶性薬剤の場合には、例えば、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬剤を混合して、上述した方法でリポソームを形成させることにより、二分子膜の疎水部に薬物を導入することができる。また、官能基をもった両親媒性分子を含有するリポソームを形成させた後に、リポソーム表面に露出している官能基に、水相での化学反応を用いて薬物を担持させることもできる。あるいは、あらかじめリポソームを製造した後、水と混じり合う有機溶媒に薬剤を溶解させ、これを外水相に添加して薬剤を二分子膜の疎水部に導入させることができる。
次に、本発明の薬物運搬体の具体的態様について述べる。
本発明においては、分子集合体の外部環境の変化によって、分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用する。本発明の薬物運搬体は、この両親媒性分子の遊離現象によって、生体内における薬物動態を制御するものである。「外部環境」とは、分子集合体をとりまく環境を意味し、温度、ｐＨ、分子集合体の希釈度、イオン環境、還元的雰囲気などが挙げられる。
分子集合体から遊離する両親媒性分子は、その分子内の親水部−疎水部バランスによって分子集合体からの遊離速度を制御することが可能である。遊離速度は、標的となる臓器・組織、薬物の種類、薬物の担持部位、担持方法、分子集合体の形態等に応じて適宜調節することができる。例えば、親水部に対し疎水部の比率が大きくなるように設計することにより、遊離速度を低下させることができる。逆に、疎水部に対し親水部の比率を大きくすることにより遊離速度を増大させることができる。
本発明の薬物運搬体は、分子集合体から一部の両親媒性分子が遊離することによって薬物動態を制御できるものであれば特に限定されない。本発明の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子の親水部、疎水部、薬物及び親水性高分子の組み合わせ並びに制御法により、例えば次の４つの態様が挙げられる。
本発明の第１の態様は、遊離する両親媒性分子の親水部あるいは疎水部に薬物を担持させることによって薬物動態を制御する態様である（図１Ａ（ａ））。本発明の第２の態様は、遊離する両親媒性分子の親水部に、親水性高分子、又は認識部位が結合した親水性高分子を担持させることによって薬物動態を制御する態様である（図１Ａ（ｂ））。本発明の第３の態様は、両親媒性分子が分子集合体から遊離してリポソーム等のキャリアー表面の認識部位が発現することによって薬物動態を制御する態様である（アクティブターゲティング、図１Ａ（ｃ））。本発明の第４の態様は、遊離する両親媒性分子が特に膜貫通型の構造を有することによって薬物動態を制御する態様である（図１Ｂ（ｄ））。以下、各態様について説明する。
（第１の態様）
本発明の第１の態様の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子が薬物、親水部及び疎水部から構成されており、遊離する両親媒性分子に薬物を担持させることによって薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ａ））。本態様における分子集合体から遊離する薬物を結合させた両親媒性分子（以下「薬物結合両親媒性分子」ということがある。）の構造としては、両親媒性分子１および２：
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） １
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｃ）−（薬物） ２
［式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｃは疎水部と薬物とを結合する部位である］が挙げられる。
（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）は、リン脂質、スフィンゴ脂質、またはアミノ酸型脂質などとして知られる公知の全ての両親媒性分子を対象とすることができる。親水部には、通常の両親媒性分子の親水部として用いられるものの他、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリグルタミン酸、ポリペプチドなどの親水性の高分子を含有する場合もある。
結合部位Ｂは、親水部と疎水部とを結合する部位であり、両親媒性分子において通常このような機能をもつものとして知られているものであれば特に限定されない。結合部位Ｂは、グリセロール、オリゴ糖類、オリゴペプチド類、ポリエステル類、ビニル系オリゴマー、グルタミン酸またはリジンなどのアミノ酸、あるいはこれらから構成される多分岐構造、たとえばデンドロン構造などを介して、一つの親水部と一つまたは二つ以上の疎水部とを結合している。これらの中でも、結合部位Ｂは、オリゴ糖鎖、オリゴペプチド鎖、ポリエステル鎖、ビニル系オリゴマーおよびデンドロン構造からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。例えば、グリシンユニットをスペーサーとしたグルタミン酸の繰返しからなるオリゴペプチド鎖は、側鎖にカルボン酸基を任意の数だけもっており、そこに疎水部をアミド結合またはエステル結合にて任意の数だけ導入することができ、親水部はオリゴペプチド鎖のＮ末端に結合できる。あるいは、オリゴアクリル酸またはオリゴビニルアルコールのカルボン酸基またはヒドロキシル基に疎水部を高分子反応にて結合させることができる。例えば、イニファーター重合にてこれらのオリゴマーを重合させた場合、分子量を制御するとともに、末端に官能基を導入させることができるため、この末端に親水部を結合させることができる。あるいは、グルタミン酸またはリジンからなるモノデンドロンでは、末端の官能基の数を世代数にて制御できる。第一世代では２個、第二世代では４個、第三世代では８個となる。ここに疎水部を結合させることによって疎水部の数を制御することができる。親水部はモノデンドロンの逆側に１個ある官能基に結合させることができる。
疎水部は、両親媒性分子に十分な疎水性を付与できるものであれば特に限定されない。例えば、疎水部としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和高級アルコール、不飽和高級アルコール、ステロイド類などが使用される。これらは直鎖であってもよく分岐鎖であってもよい。
本発明においては、遊離する両親媒性分子の疎水部が２本以上の炭化水素鎖を有することが好ましい。ここでいう「疎水部が２本以上の炭化水素鎖を有する」とは、結合部位Ｂに炭化水素鎖が２本以上結合する場合をいう。炭化水素鎖は分岐鎖であってもよく、分岐鎖としては、例えば、長鎖にイソプレノイド構造を持つものが挙げられる。
炭化水素鎖の数は特に限定されないが、２本以上が好ましい。炭化水素鎖の数には上限は特に設定されないが、合成が容易である点で通常は１８本以下であることが好ましい。
疎水部に導入される炭化水素鎖としては、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖が好ましく、立体障害を最小にすることができ分子集合体に導入しやすいことから、特にアルキル鎖が好ましい。これらの炭化水素鎖は、両親媒性分子の疎水部として十分な疎水性を示し、かつ、分子集合体への導入を阻害しない範囲であれば、置換基を有していてもよい。また、炭化水素鎖は、酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ−（ただし、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を表す。）等で、中断されていてもよい。炭化水素鎖の炭素数は特に限定されるものではないが、４〜２４が好ましく、１０〜２０がより好ましく、１２〜１８が特に好ましい。なお、結合部位Ｂとしてグルタミン酸またはリジンを含む場合には、これらの持つ２個のカルボン酸基または２個のアミノ基に、上記の疎水部を結合させることもできる。
具体的に、（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）で表される両親媒性分子としては、ポリエチレングリコール脂質、糖脂質、ペプチド結合脂質、蛋白質（抗体、酵素等）結合脂質、核酸等薬物結合両親媒性分子、多アシル鎖型脂質、膜貫通型脂質などが採用できる。ポリエチレングリコール脂質の例としては、分子量２００Ｄａから１２５００Ｄａ程度、好ましくは１０００Ｄａから５０００Ｄａ程度の片末端、あるいは両末端にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、マレイミド基等の置換基を持つポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などが挙げられ、またそれらの末端置換基を活性化した誘導体も含まれる。糖脂質は還元性末端基を有するもので、分岐または直鎖の糖重合度が２〜４００のオリゴ糖や多糖であればよく、天然糖または合成糖のいずれでも良い。オリゴ糖は、例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、ガラクース、マンノース、グルコサミン等の一種又は二種以上がα結合またはβ結合した糖であり、例えば、マルトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、セロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ラクトオリゴ糖、メリオリゴ糖、イヌロオリゴ糖などが挙げられる。多糖類では、デンプン、セルロース、ムコ多糖類（ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマンタン硫酸、ケタラン硫酸、ヘパリン等）、キチン、キトサン、その他多糖類の分解物、細胞、細菌由来の複合糖質等が挙げられる。
本態様において、薬物は、結合部位Ａによって親水部に結合された式１で表される両親媒性分子１、または、結合部位Ｃによって疎水部末端に結合された式２で表される両親媒性分子２によって分子集合体に共集合により導入される。結合部位Ａ、Ｃは、それぞれ薬物を親水部または疎水部と結合する部位である。結合部位Ａ、Ｃとしては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ジスルフィド結合、メルカプト基とマレイミド基とが付加した結合などが挙げられる。
本発明の薬物運搬体に担持させることのできる薬物は、少なくとも標的となる臓器または組織の一つに作用するものであれば特に限定されない。そのような薬物としては、例えば、酵素、ペプチド又はタンパク質、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ、プラスミド、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官および肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などがある。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオグルカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはオキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、カタラーゼ、キモトリプシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。これらの薬物は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
この分子集合体を、例えば、血中に投与すると、分子集合体が希釈されることによって、リポソームに担持された薬物結合両親媒性分子が遊離する。遊離した薬物結合両親媒性分子は、血流に乗って循環し、吸収・代謝・***される。このため、薬物結合両親媒性分子は平衡に達することなく分子集合体から一方的に遊離する。遊離速度は、薬物結合両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが親水性側に傾いた両親媒性分子ほど速い。この遊離速度は、親水部における親水性高分子の分子量または電荷量、あるいは疎水部におけるアルキル長鎖などの炭化水素鎖の長さまたは本数によって制御することができる。
両親媒性分子１または２の親水性−疎水性バランスは、薬物の種類、標的となる臓器または組織、病態、両親媒性分子１または２自体の動態などに応じて適宜設計すればよい。この様な両親媒性分子１または２は、上述した方法により分子集合体、例えばリン脂質からなるリポソームの二分子膜に導入することができる。
第１の態様において、両親媒性分子１および２の含有量は、薬物の種類、標的となる臓器または組織、病態などに応じて適宜決定されるものではあるが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜３０モル％であることが好ましく、０．１〜１０モル％であることが特に好ましい。
（第２の態様）
本発明の第２の態様の薬物運搬体は、遊離する両親媒性分子の親水部に、親水性高分子、又は認識部位が結合した親水性高分子を担持させることによって薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ｂ））。本発明の第２の態様の薬物運搬体は、第１の態様の「薬物」の部分が「親水性高分子」となっており、基本的に親水性高分子、親水部及び疎水部を含むものである。また、本態様には、親水性高分子に、さらに認識部位が結合されたものも含まれる。
本態様における分子集合体から遊離する両親媒性分子の構造としては、分子内に親水性高分子が結合した両親媒性分子３および４：
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ３
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ４
［式中、結合部位Ｂは親水部と疎水部とを結合する部位であり、結合部位Ｄは親水性高分子と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｅは認識部位と親水性高分子とを結合する部位である］が挙げられる。
式３または４で表される両親媒性分子は、例えばリン脂質と共集合させることにより、リポソームの表面を親水性高分子によって修飾することができるものである。親水性高分子としては、第１の態様の親水部の説明で記載したものと同じものを使用できる。親水性高分子の分子量は２００Ｄａから２００００Ｄａ程度であることが好ましく、２０００Ｄａから１２５００Ｄａ程度であることが特に好ましい。親水性高分子がポリエチレングリコール鎖であれば、修飾していないリポソームと比較してリポソームの血中滞留時間を大幅に延長させる効果がある。また、親水性高分子自体を、臓器または組織を構成する細胞に認識されやすい多糖類とすることにより、その臓器または組織に対する特異性を高めることができる。特に、両親媒性分子４は、例えば表面修飾ポリエチレングリコール鎖などの親水性高分子の末端にオリゴペプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有しており、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。
本発明では、両親媒性分子３または４が外部環境の変化で遊離することによって、薬物運搬体の体内動態をより精度よく制御することができる。例えば、リポソームを修飾しているポリエチレングリコール結合脂質がリポソームの血中滞留時間を増大させているが、これがリポソームから遊離することによって、血中滞留時間を短くすることができる。遊離する速度は、ポリエチレングリコールの分子量または疎水部の大きさによって調節できる。また、両親媒性分子４を導入したリポソームでは、両親媒性分子４を認識する臓器または組織を構成する細胞への特異的な集積性を高めることができるが、両親媒性分子４の遊離によって特異性が低下して、さらに遊離した両親媒性分子４がその被認識部位に結合して、両親媒性分子４が修飾されているリポソームの認識を阻害するのでより特異性が低下する。更には、両親媒性分子３および４を混合してリポソーム表面に導入し、更にそれらの遊離速度を各々制御することによってより精度高く薬物運搬体の体内動態を制御することができる。
結合部位ＤまたはＥは、それぞれ親水性高分子と親水部との結合、あるいは親水性高分子と認識部位との結合であれば特に限定されない。そのような結合部位ＤまたはＥとしては、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ジスルフィド結合、メルカプト基とマレイミド基との縮合結合やアルデヒド基とアミノ基とのシッフ塩基などが挙げられる。
認識部位としては、標的となる臓器または組織を特異的に認識するものであれば特に限定されない。認識部位の一例としては、上記記載のオリゴ糖、抗体、ペプチドホルモン、レクチン、糖タンパク等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
第２の態様において、両親媒性分子３および４の含有量は、所望の血中対流時間や認識能に応じて適宜決定されるものではあるが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜５０モル％であることが好ましく、０．１〜２０モル％であることが特に好ましい。
（第３の態様）
本発明の第３の態様の薬物運搬体は、分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が遊離することによって分子集合体表面の認識部位が発現し、それにより薬物動態を制御するというものである（図１Ａ（ｃ））。本態様の薬物運搬体としては、例えば、両親媒性分子５が担持されている分子集合体であって、該分子集合体に導入されている両親媒性分子３が両親媒性分子５の認識を阻害する状態にあって、両親媒性分子３の遊離によって両親媒性分子５の認識能が発現されることで薬物動態が制御される薬物運搬体が挙げられる。
本態様において、両親媒性分子５および３：
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ５
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部） ３
［式中、結合部位Ｂおよび結合部位Ｄは前記と同じ意味であり、結合部位Ｅは認識部位と親水部とを結合する部位である。］を共に分子集合体の表面に共集合させる場合、両親媒性分子３の親水性高分子は、両親媒性分子５の認識部位よりも分子量が大きい親水性高分子であることが好ましい。このような組み合わせで両親媒性分子を用いることにより、親水性高分子によって分子集合体表面の認識部位を、臓器または組織の細胞による認識から阻害することができる。この状態で分子集合体を血中に投与すると希釈効果等の外部環境の変化によって両親媒性分子３が遊離する。これに伴って、両親媒性分子５の認識部位がリポソームの表面に露出するとその認識部位によって臓器または組織を構成する細胞への特異的な集積性が高まるため、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。さらに、両親媒性分子５が遊離することによって特異的な集積性が低下し、これによっても薬物運搬体の体内動態を制御できる。両親媒性分子５の有する認識部位としては、第２の態様で述べたものと同じものを例示することができる。
例えば、両親媒性分子５としては、グルタミン酸またはリジンなどの親水部の末端にオリゴペプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有するものが挙げられる。特に糖鎖は糖結合タンパク質であるレクチンによって構造特異的に認識されることから、糖鎖を認識部位として有する両親媒性分子５を含む分子集合体は、細胞膜表面上のタンパク質や糖鎖などのリガンドやレセプターを特異的に認識するキャリアとして利用することができ、有用性が高い。
両親媒性分子３としては、第２の態様において述べたものと同じものを例示することができる。本態様では、両親媒性分子３の有するポリエチレングリコール鎖などの親水性高分子によって、両親媒性分子５の認識能が阻害される。両親媒性分子３における親水性高分子は、両親媒性分子５の認識能を阻害できるものであれば特に制限されないが、分子量が２００Ｄａから２００００Ｄａ程度であることが好ましく、２０００Ｄａから１２５００Ｄａ程度であることが特に好ましい。
第３の態様において、両親媒性分子５の含有量は、所望の認識能に応じて適宜決定されるものではあるが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜５０モル％であることが好ましく、０．１〜３０モル％であることが特に好ましい。また、両親媒性分子３の含有量は、両親媒性分子５の認識能を阻害できる範囲であれば制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜３０モル％であることが好ましく、０．０５〜１０モル％であることが特に好ましい。
なお、両親媒性分子３の遊離速度は、親水性高分子の分子量または電荷量あるいは疎水部の大きさによって制御することができる。両親媒性分子５の遊離速度についても同様の方法で制御することができる。従って、これらの両親媒性分子の相対的な遊離速度は目的に応じて適宜設計することができる。
（第４の態様）
本発明の第４の態様は、分子集合体の膜を貫通する膜貫通型両親媒性分子が遊離することによって、薬物運搬体の体内動態を制御するというものである（図１Ｂ（ｄ））。上述した第１〜３の態様で例示した両親媒性分子の構造は、遊離する両親媒性分子が、簡単には親水部−疎水部で示される構造で分類されるものであるが、本発明に用いられる両親媒性分子は親水部−疎水部−親水部で示される構造で分類されるものであっても良い。本態様においては、このような構造を有する両親媒性分子が好ましい。
本態様に用いられる両親媒性分子としては、具体的には、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部） ６
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物） ７
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部） ８
（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子） ９
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子） １０
（認識部位）−（結合部位Ｅ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｄ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ｄ）−（親水性高分子）−（結合部位Ｅ）−（認識部位） １１
［式中、結合部位Ａ、結合部位Ｂ、結合部位Ｄおよび結合部位Ｅは前記と同じ意味である。］で表される両親媒性分子などが挙げられる。
これらの両親媒性分子は、例えば、リポソームの二分子膜において二分子膜を貫通する構造で集合体中に導入される。疎水部は一本鎖でも二本鎖以上でも構わないが、これは結合部位Ｂによって決まる。また、疎水部の長さは二分子膜を貫通できる長さであれば構わないが、炭素数では２０〜５０、好ましくは２８〜３６である。両親媒性分子７または９のような対称型の構造は合成が容易であるが、例えばリポソームを形成した場合にリポソームの内水相側にも親水性高分子または薬物が配向することになる。このことは遊離速度の制御、即ち薬物動態の制御として都合が良い場合もあるが、親水性高分子または薬物がリポソーム表面に露出しないため、これらが有効に機能し得ず、無駄になる場合がある。後者の場合には、リポソームに両親媒性分子を導入した後、表面に露出している両親媒性分子の末端にのみ薬物または親水性高分子を結合部位Ａまたは結合部位Ｄを介して結合させることもできる。膜貫通型両親媒性分子の場合、遊離速度の制御は親水性−疎水性バランスのほか、内水相に面している親水部の大きさや電荷量も重要な因子となる。すなわち、膜貫通型両親媒性分子の疎水性が低くても、内水相に面している親水性が強ければ膜貫通型両親媒性分子はリポソームから遊離し難くなる。
第４の態様において、両親媒性分子６〜１１の含有量は特に制限されないが、それぞれ、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０．０１〜１００モル％であることが好ましく、０．１〜２５モル％であることが特に好ましい。
（両親媒性分子の遊離速度の制御方法）
両親媒性分子の分子集合体からの遊離現象は、外部環境の変化により生じる。「外部環境」とは、前述したように分子集合体をとりまく環境を意味し、外部環境としては、例えば、分子集合体を希釈するための希釈液、分子集合体の温度を変化させる周囲温度、分子集合体のｐＨを変化させるための周囲水素イオン濃度などが挙げられる。このように外部環境の変化としては、血中投与した際の希釈による平衡状態から非平衡状態へのシフトに限らない。平衡状態は温度によってもシフトする。例えば、温度が上昇すると平衡状態は遊離側にシフトするので、遊離を促進させることができる。さらに分子集合体の運動性にも影響を受ける。例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンリポソームの場合、ゲル−液晶相転移温度は４２℃にあるが、相転移温度以下の３５℃よりも相転移温度付近の４０℃や相転移温度以上の４３℃の方が膜の分子充填状態が乱れて遊離し易くなる。従って、カイロ、赤外線、マイクロウエーブまたはカテーテルなどによる局所加温によって分子集合体から両親媒性分子を局所的に遊離させることができる。あるいは酸化鉄の微粒子をリポソームに内包させて、これをマイクロウエーブで加温させることによって、当該リポソームの温度を局所的に制御できる。相転移温度は、相転移温度の異なる脂質の組合せとその組成、例えばジミリストイルフォスファチジルコリンとジパルミトイルフォスファチジルコリンの組成を変えることにより変化させることができる。また、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）などの温度応答性高分子が遊離する両親媒性分子の親水性高分子であれば、相転移温度以下では親水性が高まり遊離し易くなる。
分子集合体からの両親媒性分子の遊離速度は、例えば、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンの濃度変化を利用することにより調節することができる。例えば、親水部にアミノ基を持たせれば、低ｐＨでのアミノ基のプロトン化によって親水性が向上し遊離速度が大きくなる。また、親水部にカルボン酸基を持たせれば、高ｐＨでのカルボン酸基の解離によって親水性が向上し遊離速度が大きくなる。
あるいは、遊離する両親媒性分子の結合部位または疎水部にエステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びシッフ塩基からなる群から選択される少なくとも１種の結合を含有し、分子集合体からの両親媒性分子遊離現象がこれらの結合の加水分解によるものであることも好ましい。例えば、結合部位Ｂがリジンであり、そのカルボキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入し、更にはアミノ基には長鎖脂肪酸をアミド結合させて疎水部を導入した両親媒性分子、または結合部位が２−アミノペンタン二酸などのジカルボン酸誘導体であり、そのカルボキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入した両親媒性分子、あるいはグリセロールに脂肪酸をエステル結合させて疎水部を導入した両親媒性分子は、ｐＨの低下によって加水分解が起こり、その結合が解離することによって両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが大きく親水性側に傾き、分解された両親媒性分子の遊離が起こる。この遊離によってリポソームの二分子膜の分子充填状態が大きく乱れ、内包された薬物の放出が促進されるので、薬物運搬体の体内動態を制御することができる。この体内動態は、血流または臓器、組織のみならず細胞内をも含めることができ、ｐＨ変化に応答して両親媒性分子を遊離する系は細胞内での動態制御にも用いられる。
また、親水部にリン酸基を持つ両親媒性分子は、カルシウムイオンなどの２価のカチオンと結合し、親水性−疎水性バランスが疎水性側に傾き、その遊離速度が低下する。本発明においてはこの現象も利用することができる。更には、クエン酸などのキレート剤によってこのカルシウムイオンを捕捉することによって、抑制されていた遊離速度を促進させることもできる。一般に、解離基を親水部にもち、これによって親水性−疎水性バランスが制御されている両親媒性分子では、水相のイオン強度の増大に伴って電荷遮蔽が起こるため、このバランスは疎水性側に移動して遊離速度が減少する。
遊離する両親媒性分子の結合部位Ｂまたは疎水部にジスルフィド結合を含有し、分子集合体からの両親媒性分子の遊離現象が、ジスルフィド結合の還元による切断であることも好ましい。このような両親媒性分子としては、例えば、システインのアミノ基に脂肪酸をアミド結合にて導入し、もう一つの疎水部をアルカンチオールのジスルフィド結合にてシステインのメルカプト基に導入し、カルボン酸基には親水部を導入させたものが挙げられる。あるいは、疎水部のアルキル鎖にジスルフィド基を導入させる方法も有効である。これは上記の両親媒性分子６から１１までの膜貫通型両親媒性分子の疎水部に導入する場合も含まれる。ジスルフィド基は複数導入することができる。結合部位に導入する場合は、結合部位Ｂに導入するのが好ましい。
これらのジスルフィド基は、生体内または細胞内の還元作用、例えばシステインまたはグルタチオンなどによる還元によって切断されると、両親媒性分子の親水性−疎水性バランスが親水性側に傾き、切断された両親媒性分子が遊離する。本発明はこの現象を利用するものである。
その他、外部環境の変化による両親媒性分子の分子集合体からの遊離を促進する方法としては、ずり応力、振動、光反応、ラジカル反応、活性酸素による過酸化反応、生体由来の界面活性作用などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。According to the research findings based on the molecular assembly science of the present inventors, the constituent molecules of all the molecular assemblies are in an equilibrium state between the assembly and the aqueous phase. Is extremely inclined to the assembly side. However, polyethylene glycol-binding lipids with high hydrophilicity, single-chain fatty acids with low hydrophobicity, or lyso-forms of phospholipids are in equilibrium with more molecules free in the aqueous phase. The phenomenon in which the liberated state of the amphiphilic molecule is controlled by a change in the hydrophilic-hydrophobic balance of the amphiphilic molecule is understood based on this equilibrium theory. For example, in an aqueous dispersion of molecular aggregates, when the molecular aggregates are dense, the equilibrium of the amphiphilic molecules to be released is inclined to the aggregates. When this is diluted, the equilibrium state is inclined to the free state to the aqueous phase, and the amphiphilic molecules to be released are released to reach a new equilibrium state. In addition, since the equilibrium state is a function of temperature, when the temperature is raised, the amphiphilic molecules are released and reach a new equilibrium state. Release can be controlled by such physical factors. Also, as a chemical factor, the hydrophilic-hydrophobic balance is made hydrophilic by chemically cutting the hydrophobic part of the amphiphilic molecule or the binding part between the hydrophobic part and the hydrophilic part to make the hydrophobic part small. Tilt to the sex side and promote liberation. As the chemical bond to be cleaved, a hydrolysable ester bond, amide bond, urethane bond, Schiff base, or the like, or a disulfide bond cleaved by a reducing agent can be used.
Specifically, the present inventors have covalently bonded polyethylene glycol to an amino group of a polyethylene glycol type lipid having a large hydrophilic part, such as diacylphosphatidylethanolamine, as an amphiphilic molecule capable of adjusting the hydrophilic-hydrophobic balance. So-called lipids, lipids in which polyethylene glycol is covalently bonded to hydroxyl groups of diacyl derivatives of glycerol, lipids in which polyethylene glycol is covalently bonded to carboxyl groups or amino groups of dialkyl derivatives of trifunctional amino acids (glutamic acid and lysine), etc. Molecular design has been carried out based on the necessity of having a large hydrophobic portion for stably fixing the large hydrophilic portion to the bimolecular membrane, leading to the invention of a polyacyl lipid (Japanese Patent No. 3181276). The present inventors analyzed the influence of the hydrophilic-hydrophobic balance on the release rate of the amphiphilic molecule using these amphiphilic molecules, and the amphiphilic molecule having a large hydrophobic portion to the liposome. Regarding the immobilization and release, a lot of knowledge that is the basis of the present invention was accumulated, and further, physical factors and chemical factors that promote the release were arranged.
Further, the inventor of the present invention has an idea opposite to the fixation of polyethylene glycol type lipid, and has come to the idea that the release of this lipid can rather effectively control the pharmacokinetics of a drug in response to an external stimulus.
Hereinafter, the drug carrier of the present invention will be described more specifically.
First, the molecular assembly used for the drug carrier of the present invention will be described. The molecular assembly used in the drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as it can carry a drug. Examples of such molecular assemblies include polymer assemblies, polymer micelles, emulsions, lipid microspheres, bilayer vesicles (liposomes), and other molecular assemblies (tubes, fibers, ribbons, sheets, etc.). Can be used. Components of this molecular assembly include amphiphilic molecules that can be released from the molecular assembly due to changes in the external environment, and polymers that have the property of forming molecular assemblies with this free amphiphilic molecule. It is. The polymer that forms a molecular assembly is not particularly limited as long as it has a property of forming a molecular assembly with a free amphiphilic molecule, and a synthetic or natural polymer can be used. Examples of the synthetic polymer include a comb polymer having a hydrophobic substituent in a hydrophilic main chain such as an amphiphilic block copolymer or polysaccharide, or an amphiphilic membrane protein. . The shape of the molecular aggregate formed by these polymers is generally polymer micelles, but may be in the shape of an endoplasmic reticulum, a fiber, a tube, or a sheet. Alternatively, an aggregate formed by a temperature-responsive vinyl polymer such as poly [N-2 (hydroxypropyl) methacrylamide] (PHPMA) or poly [N- (isopropyl) acrylamide] (PNIPAM) is formed at a transition temperature or higher. It can be used as a component of a molecular assembly.
O / w emulsions and lipid microspheres in which oil droplets such as triglycerides that do not mix with water are stabilized with a surfactant such as phospholipid are frequently used for the stable dispersion of fat-soluble drugs. In this case, the drug is not particularly limited, and for example, doxorubicin derivative, paclitaxel, methotrexate or the like can be used.
Phospholipid vesicles or liposomes, which are widely used as drug carriers, undergo intermolecular interactions (hydrophobic interactions, electrostatic interactions, hydrogen bonds, etc.) in aqueous media by lipids and / or lipoproteins. A molecular assembly having a vesicle structure having a membrane formed without a covalent bond, and the membrane forms a monolayer (one bilayer membrane) or a multilayer (lamellar) membrane. The size ranges from several tens of nanometers to several tens of micrometers, but is preferably 10 nanometers to 1 micrometer, more preferably 30 nanometers to 300 nanometers. In addition, there are aggregate forms such as a bilayer sheet, ribbon, tube, or fiber, and these are also included in the molecular assembly referred to in the present invention.
A molecular assembly having an endoplasmic reticulum structure is preferred because it can retain a water-soluble or fat-soluble drug in the inner aqueous phase or bilayer membrane of the endoplasmic reticulum, thereby prolonging the residence time in blood. Among those having an endoplasmic reticulum structure, phospholipid vesicles or liposomes are particularly preferable.
Phospholipid vesicles or liposomes have been developed in the area of drug carriers, and are composed of phospholipids alone or mixed lipids of phospholipids and cholesterol and / or fatty acids.
Examples of the phospholipid include egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated egg yolk lecithin, hydrogenated soybean lecithin, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, sphingomyelin, various glycolipids, and the like. These phospholipids may contain unsaturated moieties such as ene (double bond), in (triple bond), diene, diyne, and triene, or contain a polymerizable group such as a vinyl group, such as a styryl group. You may do it. Specific examples of the polymerizable phospholipid include 1,2-di (octadeca-trans-2, trans-4-dienoyl) phosphatidylcholine, 1,2-di (octadeca-2,4-dienoyl) phosphatidic acid, 1,2 -Biseleosteroylphosphatidylcholine and the like. The phospholipid content is preferably 5 to 70 mol%, more preferably 20 to 50 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly.
As the fatty acid constituting the acyl chain, a saturated or unsaturated fatty acid having 12 to 20 carbon atoms is used. Examples include myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, octadeca-2,4-dienoic acid, and the like. Furthermore, instead of the glycerol skeleton, trifunctional amino acids such as amphoteric amino acid lipids having a glutamic acid or lysine skeleton can also be used. The content of the fatty acid is preferably 1 to 70 mol%, more preferably 5 to 30 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly.
A negatively charged lipid can also be added as a component to the molecular assembly. This is because mixing the negatively charged lipids in the membrane component suppresses aggregation of the endoplasmic reticulum, reduces the number of coating layers, and increases the encapsulation efficiency. As the negatively charged lipid, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylinositol, diacylphosphatidylserine, an anionic amino acid type lipid and the like can be used. The content of the negatively charged lipid is preferably 1 to 70 mol%, particularly preferably 5 to 30 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipid of the molecular assembly.
Further, sterols may be added to the molecular assembly as a stabilizer as a membrane component of the lipid vesicle. Examples of such sterols include all steroids having perhydrocyclopentanophenanthrene such as ergosterol and cholesterol, preferably cholesterol. Although there is no restriction | limiting in content of sterols, when the stability of an endoplasmic reticulum membrane is considered, it is preferable that it is 5-50 mol% with respect to the total mole number of the lipid of a molecular assembly, More preferably, 15 -40 mol%.
In the present invention, the molecular assembly includes amphiphilic molecules that can be released from the molecular assembly due to changes in the external environment. The content of the amphiphilic molecule is appropriately determined according to the target organ / tissue, the type of drug, the drug loading site, the loading method, the form of the molecular assembly, etc., and is not particularly limited. Is, for example, preferably from 0.01 to 100 mol%, more preferably from 0.05 to 50 mol%, more preferably from 0.1 to 30 mol, based on the total number of moles of the constituent lipid of the molecular assembly. % Is particularly preferred.
The method for producing the molecular assembly is not particularly limited, and generally known methods can be used. For example, liposome production methods include hydration and dispersion of single or mixed lipid powders or thin films, high pressure extrusion (extrusion) method, ultrasonic irradiation method, stirring (vortex mixing, homogenizer) method, freezing Formed by melting method, microfluidizer method, etc., or injecting a solution of single or mixed lipid dissolved in organic solvent into aqueous phase, then removing organic solvent such as ethanol or ether by vacuum or dialysis A method or a method in which a single or mixed lipid is dispersed in an aqueous phase together with a nonionic surfactant such as sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, Triton X or lauryl ether to form an emulsion and removed by dialysis, Other methods such as reverse phase evaporation and incubation are used. Can.
The method of loading the drug on such a molecular assembly may be appropriately selected according to the type of drug. In the case of a water-soluble drug, for example, it can be prepared by dissolving the drug in an aqueous phase at the time of liposome production. Alternatively, a water-soluble drug can be added to the outer aqueous phase after producing the liposome, and the drug can be introduced into the inner aqueous phase using the permeability of the liposome membrane. The water-soluble drug not encapsulated can be separated from the encapsulated endoplasmic reticulum by gel filtration, ultracentrifugation or ultrafiltration membrane treatment. In the case of a fat-soluble drug, for example, the drug is introduced into the hydrophobic part of the bilayer by mixing the drug in a state where a single or mixed lipid is dissolved in an organic solvent and forming liposomes by the method described above. can do. In addition, after a liposome containing an amphiphilic molecule having a functional group is formed, a drug can be supported on the functional group exposed on the surface of the liposome using a chemical reaction in an aqueous phase. Alternatively, after liposomes are produced in advance, the drug can be dissolved in an organic solvent mixed with water and added to the outer aqueous phase to introduce the drug into the hydrophobic part of the bilayer membrane.
Next, specific embodiments of the drug carrier of the present invention will be described.
In the present invention, a phenomenon is used in which some amphiphilic molecules constituting the molecular assembly are released from the molecular assembly due to a change in the external environment of the molecular assembly. The drug carrier of the present invention controls pharmacokinetics in a living body by the release phenomenon of the amphiphilic molecule. “External environment” means an environment surrounding the molecular assembly, and includes temperature, pH, dilution of the molecular assembly, ionic environment, reducing atmosphere, and the like.
An amphiphilic molecule released from a molecular assembly can control the release rate from the molecular assembly by the hydrophilic-hydrophobic balance in the molecule. The release rate can be appropriately adjusted according to the target organ / tissue, the type of drug, the drug loading site, the loading method, the form of the molecular assembly, and the like. For example, the release rate can be reduced by designing the ratio of the hydrophobic part to the hydrophilic part to be large. Conversely, the release rate can be increased by increasing the ratio of the hydrophilic part to the hydrophobic part.
The drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as the pharmacokinetics can be controlled by releasing some amphiphilic molecules from the molecular assembly. The drug carrier of the present invention includes, for example, the following four modes depending on the hydrophilic part, hydrophobic part, combination of drug and hydrophilic polymer, and control method of the amphiphilic molecule to be released.
The first aspect of the present invention is an aspect in which the pharmacokinetics is controlled by loading a drug on the hydrophilic or hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule (FIG. 1A (a)). The second aspect of the present invention is an aspect in which the pharmacokinetics is controlled by supporting a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer having a recognition site bound to the hydrophilic part of the liberated amphiphilic molecule (FIG. 1A (b)). A third aspect of the present invention is an aspect in which pharmacokinetics is controlled by releasing amphipathic molecules from a molecular assembly and expressing a recognition site on a carrier surface such as a liposome (active targeting, FIG. 1A (c). )). The fourth aspect of the present invention is an aspect in which pharmacokinetics is controlled by the liberated amphiphilic molecule having a transmembrane structure (FIG. 1B (d)). Hereinafter, each aspect will be described.
(First aspect)
In the drug carrier according to the first aspect of the present invention, the released amphiphilic molecule is composed of a drug, a hydrophilic part and a hydrophobic part, and the pharmacokinetics is controlled by loading the drug on the released amphiphilic molecule. (FIG. 1A (a)). In the present embodiment, the structure of the amphiphilic molecule to which the drug released from the molecular assembly is bound (hereinafter sometimes referred to as “drug-bound amphiphilic molecule”) includes amphiphilic molecules 1 and 2:
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion) 1
(Hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part)-(binding site C)-(drug) 2
[Wherein the binding site A is a site that binds the hydrophilic portion and the drug, the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, and the binding site C is a site that binds the hydrophobic portion and the drug. Is].
(Hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) can target all known amphiphilic molecules known as phospholipids, sphingolipids, amino acid type lipids and the like. The hydrophilic part may contain hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, polysaccharides, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyglutamic acid, and polypeptides in addition to those used as the hydrophilic part of ordinary amphiphilic molecules. .
The binding site B is a site that binds the hydrophilic part and the hydrophobic part, and is not particularly limited as long as it is generally known to have such a function in an amphiphilic molecule. The binding site B is a single hydrophilic moiety via a glycerol, oligosaccharide, oligopeptide, polyester, vinyl oligomer, amino acid such as glutamic acid or lysine, or a multi-branched structure composed of these, for example, a dendron structure. And one or more hydrophobic parts. Among these, the binding site B is preferably at least one selected from the group consisting of an oligosaccharide chain, an oligopeptide chain, a polyester chain, a vinyl oligomer, and a dendron structure. For example, an oligopeptide chain consisting of repeating glutamic acid with a glycine unit as a spacer has an arbitrary number of carboxylic acid groups in the side chain, and an arbitrary number of hydrophobic portions are introduced into it by amide bonds or ester bonds. And the hydrophilic moiety can be attached to the N-terminus of the oligopeptide chain. Alternatively, the hydrophobic portion can be bonded to the carboxylic acid group or hydroxyl group of oligoacrylic acid or oligovinyl alcohol by a polymer reaction. For example, when these oligomers are polymerized by iniferter polymerization, the molecular weight can be controlled and a functional group can be introduced at the terminal, so that a hydrophilic part can be bonded to the terminal. Alternatively, in the case of a monodendron composed of glutamic acid or lysine, the number of terminal functional groups can be controlled by the number of generations. 2 for the first generation, 4 for the second generation, and 8 for the third generation. The number of hydrophobic parts can be controlled by bonding hydrophobic parts here. The hydrophilic part can be bonded to one functional group on the opposite side of the monodendron.
The hydrophobic part is not particularly limited as long as it can impart sufficient hydrophobicity to the amphiphilic molecule. For example, saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, saturated higher alcohols, unsaturated higher alcohols, steroids and the like are used as the hydrophobic portion. These may be linear or branched.
In the present invention, it is preferable that the hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule has two or more hydrocarbon chains. Here, “the hydrophobic part has two or more hydrocarbon chains” means that two or more hydrocarbon chains are bonded to the binding site B. The hydrocarbon chain may be a branched chain, and examples of the branched chain include those having a long chain and an isoprenoid structure.
The number of hydrocarbon chains is not particularly limited, but is preferably 2 or more. The upper limit of the number of hydrocarbon chains is not particularly set, but it is usually preferably 18 or less from the viewpoint of easy synthesis.
As the hydrocarbon chain introduced into the hydrophobic portion, an alkyl chain, an alkenyl chain or an alkynyl chain is preferable, and an alkyl chain is particularly preferable because steric hindrance can be minimized and introduced into a molecular assembly. These hydrocarbon chains may have a substituent as long as they are sufficiently hydrophobic as the hydrophobic portion of the amphiphilic molecule and do not inhibit introduction into the molecular assembly. The hydrocarbon chain may be interrupted by an oxygen atom, a sulfur atom, -NR- (wherein R represents an alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group which may have a substituent). Good. Although carbon number of a hydrocarbon chain is not specifically limited, 4-24 are preferable, 10-20 are more preferable, and 12-18 are especially preferable. In addition, when glutamic acid or lysine is included as the binding site B, the above hydrophobic portion can be bonded to two carboxylic acid groups or two amino groups possessed by these.
Specifically, the amphiphilic molecules represented by (hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) include polyethylene glycol lipids, glycolipids, peptide-binding lipids, protein (antibodies, enzymes, etc.)-Binding lipids. Drug-binding amphiphilic molecules such as nucleic acids, polyacyl chain lipids, transmembrane lipids, and the like can be employed. Examples of the polyethylene glycol lipid include polyethylene glycol having a molecular weight of about 200 Da to about 12500 Da, preferably about 1000 Da to about 5000 Da, or having a substituent such as amino group, carboxyl group, hydroxyl group, maleimide group at both ends, ethylene glycol, Examples thereof include copolymers with propylene glycol, and derivatives obtained by activating terminal substituents thereof are also included. The glycolipid has a reducing end group, and may be any oligosaccharide or polysaccharide having a branched or linear sugar polymerization degree of 2 to 400, and may be either a natural sugar or a synthetic sugar. The oligosaccharide is, for example, a sugar in which one or more of glucose, fructose, xylose, galactose, mannose, glucosamine and the like are α-bonded or β-bonded, such as maltooligosaccharide, laminari-oligosaccharide, cellooligosaccharide, isomaltoligosaccharide, Examples include gentiooligosaccharide, nigerooligosaccharide, lactoligosaccharide, merioligosaccharide, and inooligosaccharide. For polysaccharides, starch, cellulose, mucopolysaccharide (hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, dermantan sulfate, ketalan sulfate, heparin, etc.), chitin, chitosan, other polysaccharide degradation products, cells, bacterial derived complex carbohydrates, etc. Is mentioned.
In this embodiment, the drug is an amphiphilic molecule 1 represented by Formula 1 bound to the hydrophilic part by the binding site A or an amphiphile represented by Formula 2 bound to the end of the hydrophobic part by the binding site C. It is introduced into the molecular assembly by the sex molecule 2 by co-assembly. The binding sites A and C are sites for binding the drug to the hydrophilic part or the hydrophobic part, respectively. Examples of the binding sites A and C include an amide bond, an ester bond, an ether bond, a urethane bond, a disulfide bond, and a bond in which a mercapto group and a maleimide group are added.
The drug that can be carried on the drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as it acts on at least one target organ or tissue. Examples of such drugs include enzymes, peptides or proteins, various antibiotics, various peptide hormones, DNA, RNA, SiRNA, plasmids, various anticancer agents, drugs for central nervous system, drugs for peripheral nerves, and sensory senses. Organ, Cardiovascular, Respiratory, Gastrointestinal, Hormonal, Urogenital and Anal, Skin, Oral, Vitamin, Nourishing, Blood and Body Fluids Drugs, artificial dialysis drugs, other metabolic drugs, cell stimulants, oncology drugs, radiopharmaceuticals, allergy drugs, herbal medicines and medicines based on Kampo prescriptions, antibiotic drugs, chemotherapeutic drugs, biological drugs, There are diagnostic drugs. Examples of peptides or proteins include various cytokines such as interleukins, cell transfer factors, fibrinogen, collagen, keratin, proteoglucan, etc. as an extracellular matrix agent or oligos as part of its structure, or oxytocin, Examples thereof include functional polypeptides such as bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin. Examples of the enzyme include catalase, chymotrypsin, cytochrome, amylase and the like, but are not limited thereto. These drugs may be used alone or in combination of two or more.
When this molecular assembly is administered into blood, for example, the drug-binding amphiphilic molecule supported on the liposome is released by diluting the molecular assembly. The released drug-binding amphiphilic molecules circulate in the bloodstream and are absorbed, metabolized and excreted. For this reason, drug-bound amphiphilic molecules are unilaterally released from the molecular assembly without reaching equilibrium. The release rate is faster for amphiphilic molecules in which the hydrophilic-hydrophobic balance of the drug-bound amphiphilic molecule is inclined toward the hydrophilic side. This release rate can be controlled by the molecular weight or charge amount of the hydrophilic polymer in the hydrophilic part, or the length or number of hydrocarbon chains such as alkyl long chains in the hydrophobic part.
The hydrophilic-hydrophobic balance of the amphiphilic molecule 1 or 2 may be appropriately designed according to the type of drug, target organ or tissue, disease state, kinetics of the amphiphilic molecule 1 or 2 itself, and the like. Such an amphiphilic molecule 1 or 2 can be introduced into a bimolecular membrane of a liposome composed of a molecular assembly, for example, a phospholipid, by the method described above.
In the first embodiment, the content of the amphiphilic molecules 1 and 2 is appropriately determined according to the type of drug, the target organ or tissue, the disease state, etc. It is preferably 0.01 to 30 mol%, particularly preferably 0.1 to 10 mol%, based on the total number of moles of lipids.
(Second aspect)
The drug carrier according to the second aspect of the present invention controls pharmacokinetics by supporting a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer having a recognition site bonded to the hydrophilic part of the released amphiphilic molecule. (FIG. 1A (b)). In the drug carrier of the second aspect of the present invention, the “drug” part of the first aspect is a “hydrophilic polymer” and basically includes a hydrophilic polymer, a hydrophilic part and a hydrophobic part. It is a waste. Further, this embodiment includes those in which a recognition site is further bound to a hydrophilic polymer.
As the structure of the amphiphilic molecule released from the molecular assembly in this embodiment, the amphiphilic molecules 3 and 4 in which a hydrophilic polymer is bonded in the molecule:
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) 3
(Recognition site)-(binding site E)-(hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion) 4
[Wherein, the binding site B is a site that binds the hydrophilic portion and the hydrophobic portion, the binding site D is a site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic portion, and the binding site E is a recognition site and a highly hydrophilic site. It is a site that binds to a molecule].
The amphiphilic molecule represented by the formula 3 or 4 can modify the surface of the liposome with a hydrophilic polymer, for example, by co-assembling with a phospholipid. As the hydrophilic polymer, the same polymer as described in the description of the hydrophilic portion of the first aspect can be used. The molecular weight of the hydrophilic polymer is preferably about 200 Da to 20000 Da, and particularly preferably about 2000 Da to 12,500 Da. If the hydrophilic polymer is a polyethylene glycol chain, the retention time in the blood of the liposome is greatly prolonged as compared with an unmodified liposome. Further, by making the hydrophilic polymer itself a polysaccharide that is easily recognized by cells constituting the organ or tissue, the specificity to the organ or tissue can be enhanced. In particular, the amphiphilic molecule 4 has a recognition site such as an oligopeptide chain or sugar chain at the end of a hydrophilic polymer such as a surface-modified polyethylene glycol chain, and controls the pharmacokinetics of the drug carrier. Can do.
In the present invention, the pharmacokinetics of the drug carrier can be controlled more accurately by releasing the amphiphilic molecule 3 or 4 due to a change in the external environment. For example, the polyethylene glycol-binding lipid that modifies the liposome increases the blood residence time of the liposome, but the release time from the liposome can shorten the blood residence time. The liberation rate can be adjusted by the molecular weight of polyethylene glycol or the size of the hydrophobic part. In addition, liposomes into which amphipathic molecules 4 are introduced can enhance specific accumulation in cells constituting organs or tissues that recognize the amphipathic molecules 4, but the release of the amphipathic molecules 4 The specificity is further lowered, and the liberated amphiphilic molecule 4 binds to the site to be recognized and inhibits the recognition of the liposome in which the amphiphilic molecule 4 is modified, so that the specificity is further lowered. Furthermore, the pharmacokinetics of the drug carrier can be controlled with higher accuracy by mixing the amphiphilic molecules 3 and 4 and introducing them onto the liposome surface and further controlling their release rates.
The binding site D or E is not particularly limited as long as it is a bond between the hydrophilic polymer and the hydrophilic portion or a bond between the hydrophilic polymer and the recognition site. Examples of such bonding sites D or E include amide bonds, ester bonds, ether bonds, urethane bonds, disulfide bonds, condensation bonds between mercapto groups and maleimide groups, and Schiff bases between aldehyde groups and amino groups. It is done.
The recognition site is not particularly limited as long as it specifically recognizes a target organ or tissue. Examples of recognition sites include, but are not limited to, the oligosaccharides, antibodies, peptide hormones, lectins, glycoproteins and the like described above.
In the second embodiment, the contents of the amphiphilic molecules 3 and 4 are appropriately determined according to the desired blood convection time and recognition ability, but each of the total lipids constituting the molecular assembly is included in each molecule. The number is preferably from 0.01 to 50 mol%, particularly preferably from 0.1 to 20 mol%, based on the number.
(Third aspect)
In the drug carrier according to the third aspect of the present invention, the recognition site on the surface of the molecular assembly is expressed by releasing some of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly, thereby controlling the pharmacokinetics. (FIG. 1A (c)). The drug carrier of this embodiment is, for example, a molecular assembly in which an amphiphilic molecule 5 is supported, and the amphiphilic molecule 3 introduced into the molecular assembly is recognized by the amphiphilic molecule 5. And a drug carrier whose pharmacokinetics is controlled by expressing the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 by the release of the amphiphilic molecule 3.
In this embodiment, amphiphilic molecules 5 and 3:
(Recognition site)-(Binding site E)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion) 5
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part) 3
[Wherein, the binding site B and the binding site D have the same meaning as described above, and the binding site E is a site that binds the recognition site and the hydrophilic portion. ] Are co-assembled on the surface of the molecular assembly, the hydrophilic polymer of the amphiphilic molecule 3 is preferably a hydrophilic polymer having a larger molecular weight than the recognition site of the amphiphilic molecule 5. By using an amphiphilic molecule in such a combination, the recognition site on the surface of the molecular assembly can be inhibited from being recognized by cells of the organ or tissue by the hydrophilic polymer. When the molecular assembly is administered into the blood in this state, the amphiphilic molecule 3 is released due to a change in the external environment such as a dilution effect. Along with this, when the recognition site of the amphipathic molecule 5 is exposed on the surface of the liposome, the recognition site increases the specific accumulation in the cells constituting the organ or tissue, thereby controlling the pharmacokinetics of the drug carrier. can do. Furthermore, the specific accumulation property is lowered by the release of the amphipathic molecule 5, and the pharmacokinetics of the drug carrier can be controlled also by this. As the recognition site | part which the amphiphilic molecule 5 has, the same thing as what was described in the 2nd aspect can be illustrated.
For example, examples of the amphiphilic molecule 5 include those having a recognition site such as an oligopeptide chain or a sugar chain at the end of a hydrophilic portion such as glutamic acid or lysine. In particular, since a sugar chain is recognized in a structure-specific manner by a lectin that is a sugar-binding protein, a molecular assembly including an amphipathic molecule 5 having a sugar chain as a recognition site may be a protein or sugar chain on the cell membrane surface. It can be used as a carrier that specifically recognizes ligands and receptors, and is highly useful.
Examples of the amphiphilic molecule 3 include the same ones described in the second embodiment. In this embodiment, the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 is inhibited by a hydrophilic polymer such as a polyethylene glycol chain of the amphiphilic molecule 3. The hydrophilic polymer in the amphiphilic molecule 3 is not particularly limited as long as it can inhibit the recognition ability of the amphiphilic molecule 5, but the molecular weight is preferably about 200 Da to 20000 Da, and about 2000 Da to 12,500 Da. It is particularly preferred.
In the third embodiment, the content of the amphiphilic molecule 5 is appropriately determined according to the desired recognition ability, but is 0.01 to 50 with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly. It is preferable that it is mol%, and it is especially preferable that it is 0.1-30 mol%. Further, the content of the amphiphilic molecule 3 is not limited as long as the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 can be inhibited, but is 0.01 to 30 with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly. It is preferable that it is mol%, and it is especially preferable that it is 0.05-10 mol%.
The release rate of the amphiphilic molecule 3 can be controlled by the molecular weight or charge amount of the hydrophilic polymer or the size of the hydrophobic portion. The release rate of the amphiphilic molecule 5 can also be controlled by the same method. Therefore, the relative release rate of these amphiphilic molecules can be appropriately designed according to the purpose.
(Fourth aspect)
The fourth aspect of the present invention is to control the pharmacokinetics of the drug carrier by releasing the transmembrane amphipathic molecules that penetrate the membrane of the molecular assembly (FIG. 1B (d)). . The structures of the amphiphilic molecules exemplified in the first to third embodiments described above are those in which the liberated amphiphilic molecules are simply classified by the structure represented by the hydrophilic part-hydrophobic part. The amphiphilic molecules used in the above may be classified according to the structure represented by hydrophilic part-hydrophobic part-hydrophilic part. In this embodiment, an amphiphilic molecule having such a structure is preferable.
As an amphiphilic molecule used in this embodiment, specifically,
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)-(Binding site B)-(Hydrophilic portion) 6
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)-(Binding site B)-(Hydrophilic portion)-(Binding site A)-(Drug) 7
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion) 8
(Hydrophilic polymer)-(binding site D)-(hydrophilic part)-(binding site B)-(hydrophobic part)-(binding site B)-(hydrophilic part)-(binding site D)-(highly hydrophilic) Molecule) 9
(Recognition site)-(Binding site E)-(Hydrophilic polymer)-(Binding site D)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)-(Binding site B)-(Hydrophilic portion) -(Binding site D)-(hydrophilic polymer) 10
(Recognition site)-(Binding site E)-(Hydrophilic polymer)-(Binding site D)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)-(Binding site B)-(Hydrophilic portion) -(Binding site D)-(hydrophilic polymer)-(binding site E)-(recognition site) 11
[Wherein, the binding site A, the binding site B, the binding site D and the binding site E have the same meaning as described above. ] Amphiphilic molecules represented by
These amphiphilic molecules are introduced into the aggregate in a structure that penetrates the bilayer membrane in the bilayer membrane of the liposome, for example. The hydrophobic part may be single-stranded or double-stranded, but this is determined by the binding site B. The length of the hydrophobic part may be any length as long as it can penetrate the bilayer membrane, but the number of carbon atoms is 20 to 50, preferably 28 to 36. A symmetrical structure such as the amphiphilic molecule 7 or 9 is easy to synthesize. For example, when a liposome is formed, a hydrophilic polymer or drug is also oriented on the inner aqueous phase side of the liposome. This may be convenient for controlling the release rate, that is, controlling pharmacokinetics, but since the hydrophilic polymer or drug is not exposed to the liposome surface, they may not function effectively and may be wasted. is there. In the latter case, after introducing the amphiphilic molecule into the liposome, the drug or the hydrophilic polymer is bonded to the end of the amphiphilic molecule exposed on the surface via the binding site A or the binding site D. You can also In the case of a transmembrane amphiphilic molecule, the release rate is controlled by the hydrophilic-hydrophobic balance as well as the size of the hydrophilic portion facing the inner aqueous phase and the amount of charge. That is, even if the transmembrane amphiphilic molecule is low in hydrophobicity, the transmembrane amphiphilic molecule is difficult to be released from the liposome if the hydrophilicity facing the inner aqueous phase is strong.
In the fourth embodiment, the content of the amphiphilic molecules 6 to 11 is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 100 mol% with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly, It is especially preferable that it is 0.1-25 mol%.
(Method for controlling the release rate of amphiphilic molecules)
The phenomenon of liberation of amphiphilic molecules from the molecular assembly is caused by changes in the external environment. The “external environment” means an environment surrounding the molecular assembly as described above, and examples of the external environment include a diluent for diluting the molecular assembly, an ambient temperature for changing the temperature of the molecular assembly, Ambient hydrogen ion concentration for changing the pH of the molecular assembly. Thus, the change in the external environment is not limited to a shift from an equilibrium state to a non-equilibrium state due to dilution when administered in blood. The equilibrium state also shifts with temperature. For example, when the temperature rises, the equilibrium state shifts to the free side, so that the release can be promoted. It is also affected by the mobility of molecular assemblies. For example, in the case of dipalmitoyl phosphatidylcholine liposomes, the gel-liquid crystal phase transition temperature is 42 ° C., but 40 ° C. near the phase transition temperature and 43 ° C. above the phase transition temperature are more membranes than 35 ° C. below the phase transition temperature. The molecular packing state is disturbed and easily released. Therefore, the amphiphilic molecules can be locally released from the molecular assembly by local heating with a warmer, infrared ray, microwave, catheter or the like. Alternatively, the temperature of the liposome can be locally controlled by encapsulating fine particles of iron oxide in the liposome and heating it with a microwave. The phase transition temperature can be changed by changing the combination of lipids having different phase transition temperatures and the composition thereof, for example, the composition of dimyristoylphosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylcholine. In addition, hydrophilic polymers such as poly- (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), which are amphiphilic molecules that liberate from temperature-responsive polymers, are highly hydrophilic at the phase transition temperature or lower and easily released.
The release rate of the amphiphilic molecule from the molecular assembly can be adjusted, for example, by utilizing changes in the concentration of protons, alkali metal ions, and alkaline earth metal ions. For example, if an amino group is provided in the hydrophilic part, the hydrophilicity is improved by the protonation of the amino group at low pH, and the release rate is increased. Further, if the hydrophilic portion has a carboxylic acid group, the hydrophilicity is improved by the dissociation of the carboxylic acid group at a high pH, and the release rate is increased.
Alternatively, it contains at least one bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and a Schiff base at the binding site or hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule, and is amphiphilic from the molecular assembly. It is also preferred that the molecular release phenomenon is due to hydrolysis of these bonds. For example, the binding site B is lysine, a long chain alcohol is ester-bonded to the carboxyl group to introduce a hydrophobic part, and an amino group is bonded to a long-chain fatty acid by amide bond to introduce a hydrophobic part. The molecule or the binding site is a dicarboxylic acid derivative such as 2-aminopentanedioic acid, and the carboxyl group is esterified with a long-chain alcohol to introduce a hydrophobic moiety, or fatty acid is esterified to glycerol. The amphiphilic molecule introduced with the hydrophobic part was hydrolyzed by a decrease in pH, and when the bond was dissociated, the hydrophilic-hydrophobic balance of the amphiphilic molecule was greatly inclined to the hydrophilic side and decomposed. The release of amphiphilic molecules occurs. This release greatly disturbs the molecular packing state of the bilayer membrane of the liposome and promotes the release of the encapsulated drug, so that the pharmacokinetics of the drug carrier can be controlled. This pharmacokinetics can include not only blood flow, organs, and tissues but also cells, and a system that releases amphipathic molecules in response to changes in pH is also used to control kinetics in cells.
In addition, an amphiphilic molecule having a phosphate group in the hydrophilic portion binds to a divalent cation such as calcium ion, and the hydrophilic-hydrophobic balance is inclined to the hydrophobic side, and the release rate is reduced. This phenomenon can also be used in the present invention. Furthermore, the suppressed release rate can be promoted by capturing this calcium ion with a chelating agent such as citric acid. In general, in amphiphilic molecules having a hydrophilic group and a hydrophilic-hydrophobic balance controlled thereby, charge shielding occurs with an increase in the ionic strength of the aqueous phase, so this balance is hydrophobic. Moves to the side and the release rate decreases.
It is also preferable that the binding site B or the hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule contains a disulfide bond, and the release phenomenon of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is cleavage by disulfide bond reduction. As such an amphiphilic molecule, for example, a fatty acid is introduced into an amino group of cysteine by an amide bond, and another hydrophobic part is introduced into a mercapto group of cysteine by a disulfide bond of alkanethiol, and a carboxylic acid group May include those having a hydrophilic portion introduced therein. Alternatively, a method of introducing a disulfide group into the hydrophobic alkyl chain is also effective. This also includes the case of introduction into the hydrophobic part of the transmembrane amphipathic molecules 6 to 11 described above. A plurality of disulfide groups can be introduced. When introduced into the binding site, it is preferably introduced into the binding site B.
When these disulfide groups are cleaved by a reducing action in vivo or in cells, for example, by reduction with cysteine or glutathione, the hydrophilic-hydrophobic balance of the amphiphilic molecule is inclined to the hydrophilic side, and the cleaved parents The mesophilic molecule is released. The present invention utilizes this phenomenon.
Other methods for promoting the release of amphipathic molecules from molecular aggregates due to changes in the external environment include shear stress, vibration, photoreaction, radical reaction, peroxidation reaction with active oxygen, and surface-active effects derived from living organisms. However, it is not limited to these.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.

本実施例では、リジンをスペーサー（結合部位Ｂに相当する）として親水部にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部に２本のアルキル基を有する化合物を合成した。
（Ａ）まず、リジンのカルボキシル基に保護基を以下のようにして導入した。すなわち、Ｌ−リジン（５．１ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（１４．７ｇ、７７．３ｍｍｏｌ）およびベンジルアルコール（１４．０ｇ、１２４．１ｍｍｏｌ）を溶媒ベンゼン（３０ｍＬ）に溶解させ、生成水を除去しながら、１００℃で６時間還流させた。溶媒を減圧除去した後、残分に対し、ジエチルエーテルにて再沈殿精製を３回行った。この精製した生成物をメタノール／ジエチルエーテルの混合溶媒から４℃で再結晶し、濾過し、乾燥してカルボキシル基をベンジルエステルで保護したリジン誘導体１（化合物１）を白色固体として得た（１８．０ｇ、収率８８％）。
リジン誘導体１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３０３４；２９５２［νＮ−Ｈ（ＮＨ３ ＋）］；１７４９［νＣ＝Ｏ（エステル）］；１６００［δＮ−Ｈ（ＮＨ３ ＋）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２８，１．４０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；１．５１（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．８０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；２．２９（ｓ，６Ｈ，−ＣＨ３）；２．７０（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．０９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；５．２５（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２）；７．１２，７．４８（８Ｈ，ｐ−Ｔｏｓ−ａｒｏｍａ．）；７．３５−７．４２（５Ｈ，ａｒｏｍａ．）；７．６７，８．３８（ｓ，６Ｈ，−ＮＨ３ ＋）。
（Ｂ）リジン誘導体１のアミノ基に疎水性基としてアルキル基を以下のようにして導入した。すなわち、パルミチン酸（３．２ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．６ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）を溶媒クロロホルムに溶解させ２５℃で３０分間撹拌した後、リジン誘導体１（３．０ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を４℃で１２時間撹拌し、グラスフィルター（Ｇ４）で濾過した後、溶媒を減圧除去した。残分をクロロホルム（１００ｍＬ）に再溶解させ、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回、水で３回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧除去した。メタノール（２００ｍＬ）から４℃で再結晶し、濾過後、乾燥して各アミノ基にそれぞれアルキル基をアミド結合させたリジン誘導体２（化合物２）を白色固体として得た（２．９ｇ、収率７９％）。
リジン誘導体２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３１１［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７４８［νＣ＝Ｏ（エステル）］；１６４０［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２３（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．４６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．５８（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．６６，１．８２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１２，２．２０（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．１６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．５８（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；５．１３（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２）；５．６５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；６．１６（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．２９−７．３７（５Ｈ，ａｒｏｍａ．）。
（Ｃ）リジン誘導体２（１．５２ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をクロロホルム／メタノール混合溶媒（１０／７（容量／容量））に溶解させ、１規定の水酸化ナトリウム水溶液（３．４ｍＬ）を添加した。この反応混合物を２５℃で４時間撹拌した後、１規定塩酸水溶液を添加し（ｐＨ３．０まで）、溶媒を減圧除去した。残分を水およびメタノールで洗浄し、乾燥してジパルミトイルリジン誘導体３（化合物３）を白色固体として得た（１．３ｇ、収率９８％）。
ジパルミトイルリジン誘導体３の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４５（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
ＭＳ（ＬＣＱ）：Ｃ３８Ｈ７４Ｎ２Ｏ４についての計算値：６２３．０：実測値：６２３．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｄ）パルミチン酸の代わりにミリスチン酸、ステアリン酸を用いた以外は上記（Ｂ）および（Ｃ）と同様の操作により、それぞれ白色固体のジアルキルリジン誘導体（ジミリストイルリジン誘導体４（化合物４）およびジステアロイル誘導体５（化合物５））を得た。
ジミリストイルリジン誘導体４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４０（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，４２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
ジステアロイル誘導体５の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１７２１［νＣ＝Ｏ（カルボニル）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３６（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．４７（ｍ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．５５，１．６７（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．０２，２．０９（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；４．１４（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）；７．５５（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；７．７８（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）；１２．２３（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）。
（Ｅ）ジパルミトイルリジン誘導体３とポリエチレングリコールとを以下のようにして結合させた。すなわち、ジパルミトイルリジン誘導体３（１２５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（４１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をクロロホルムに溶解し、４℃で１時間撹拌した後、分子量５０００のモノメトキシアミノポリエチレングリコール（５００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を溶解したクロロホルム溶液中に滴下した。この反応混合物を２５℃で６時間撹拌した後、グラスフィルター（Ｇ４）で濾過し、濾液をジエチルエーテルに滴下した。沈殿物を濾過回収し、乾燥した後、シリカゲルカラム（溶媒：クロロホルム／メタノール＝６／１（容量／容量）で両親媒性化合物６（化合物６）を単離した（５００ｍｇ、収率８８％）。
化合物６の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．２７，２．３８（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１４．１２；２２．６８；２５．７４；２８．７５；２９．３４；２９．５３；２９．６５；３１．９２；３６．３５；３８．１３；５９．０２；７０．４４；７１．９５。
（Ｆ）上記（Ｅ）と同様の操作により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量と疎水基の炭素数が異なる組合わせで次の化合物を得た。
Ｐ５０−２Ｃ１４の分析結果：ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５５（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１５，２．２３（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
Ｐ１２５−２Ｃ１４の分析結果：ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３２９４［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３４［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５３［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．１５，２．２３（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。
Ｐ１２５−２Ｃ１６の分析結果：ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２）
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６３（モノスポット）。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３０５［νＮ−Ｈ（アミド）］；１６３８［νＣ＝Ｏ（アミド）］；１５５６［δＮ−Ｈ（アミド）］。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−，ｌｙｓγ−ＣＨ２）；１．３２（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓδ−ＣＨ２）；１．６３−１．８０（８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−，−Ｎ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−，ｌｙｓβ−ＣＨ２）；２．２７，２．３８（ｔ，４Ｈ，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；３．２９（ｍ，２Ｈ，ｌｙｓε−ＣＨ２）；３．３８（３Ｈ，−Ｏ−ＣＨ３）；３．４３（２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．６６（ＰＥＧ）；４．３９（ｓ，１Ｈ，ｌｙｓα−ＣＨ２）。In this example, lysine was used as a spacer (corresponding to the binding site B) to synthesize a compound having polyethylene glycol (PEG) in the hydrophilic part and two alkyl groups in the hydrophobic part.
(A) First, a protecting group was introduced into the carboxyl group of lysine as follows. That is, L-lysine (5.1 g, 35.2 mmol), p-toluenesulfonic acid (14.7 g, 77.3 mmol) and benzyl alcohol (14.0 g, 124.1 mmol) were dissolved in the solvent benzene (30 mL). While removing the produced water, the mixture was refluxed at 100 ° C. for 6 hours. After removing the solvent under reduced pressure, the residue was purified by reprecipitation with diethyl ether three times. This purified product was recrystallized from a mixed solvent of methanol / diethyl ether at 4 ° C., filtered and dried to obtain lysine derivative 1 (compound 1) having a carboxyl group protected with a benzyl ester as a white solid (18 0.0 g, 88% yield).
Analysis results of lysine derivative 1:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.2 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3034; 2952 [ν N—H (NH 3 + )]; 1749 [ν C═O (ester)]; 1600 [δ N—H (NH 3 + )].
1 H-NMR spectrum (DMSO-d6, 500 MHz, δ (ppm)): 1.28, 1.40 (m, 2H, lysβ-CH 2 ); 1.51 (m, 2H, lysγ-CH 2 ); 1.80 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 2.29 (s, 6H, —CH 3 ); 2.70 (m, 2H, lysε-CH 2 ); 4.09 (s, 1H, lysα) -CH 2); 5.25 (s, 2H, -CH 2); 7.12,7.48 (8H, p-Tos-aroma);. 7.35-7.42 (5H, aroma).; 7.67,8.38 (s, 6H, -NH 3 +).
(B) An alkyl group as a hydrophobic group was introduced into the amino group of lysine derivative 1 as follows. Specifically, palmitic acid (3.2 g, 12.4 mmol) and N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (2.6 g, 12.4 mmol) were dissolved in a solvent chloroform and stirred at 25 ° C. for 30 minutes, and then lysine derivative 1 (3 0.0 g, 5.12 mmol) and triethylamine (1.2 g, 11.4 mmol) were added. The reaction mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours, filtered through a glass filter (G4), and then the solvent was removed under reduced pressure. The residue was redissolved in chloroform (100 mL) and washed 3 times with a saturated aqueous solution of sodium carbonate and 3 times with water. After the chloroform layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure. Recrystallization from methanol (200 mL) at 4 ° C., filtration and drying gave lysine derivative 2 (compound 2) in which an alkyl group was amide-bonded to each amino group (2.9 g, yield). 79%).
Analysis result of lysine derivative 2:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.53 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3311 [ν N—H (amide)]; 1748 [ν C═O (ester)]; 1640 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H ( Amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.85 (t, 6H, —CH 3 ); 1.23 (s, 50H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 ); 1.46 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.58 (m, 4H, —N—CO—C—CH 2 —); 1.66, 1.82 (m, 2H, lysβ-) CH 2); 2.12,2.20 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 3.16 (m, 2H, lysε-CH 2); 4.58 (s, 1H, lysα- CH 2); 5.13 (s, 2H, -CH 2); 5.65 (br, 1H, -NH-CO -); 6.16 (d, 1H, -NH-CO -); 7.29 -7.37 (5H, aroma.).
(C) Lysine derivative 2 (1.52 g, 2.13 mmol) was dissolved in a chloroform / methanol mixed solvent (10/7 (volume / volume)), and 1N aqueous sodium hydroxide solution (3.4 mL) was added. . The reaction mixture was stirred at 25 ° C. for 4 hours, 1N aqueous hydrochloric acid solution was added (up to pH 3.0), and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was washed with water and methanol and dried to obtain dipalmitoyllysine derivative 3 (compound 3) as a white solid (1.3 g, yield 98%).
Analysis result of dipalmitoyl lysine derivative 3:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.45 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3305 [ν N—H (amide)]; 1721 [ν C═O (carbonyl)]; 1638 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H ( Amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.84 (t, 6H, —CH 3 ); 1.24 (s, 50H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 1.36 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.47 (m, 4H, —N—CO—C—CH 2 —); 1.55, 1.67 (m, 2H, lysβ-) CH 2); 2.02,2.09 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 2.99 (m, 2H, lysε-CH 2); 4.14 (s, 1H, lysα- CH 2); 7.55 (br, 1H, -NH-CO -); 7.78 (d, 1H, -NH-CO -); 12.23 (br, 1H, -COOH).
MS (LCQ): calcd for C38H74N2O4: 623.0: found: 623.5 (M + H) + .
(D) A white solid dialkyl lysine derivative (dimyristoyl lysine derivative 4 (compound 4) and a white solid, respectively) by the same operation as (B) and (C) except that myristic acid and stearic acid were used instead of palmitic acid. Distearoyl derivative 5 (compound 5)) was obtained.
Analysis results of dimyristoyl lysine derivative 4:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.40 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3305 [ν N—H (amide)]; 1721 [ν C═O (carbonyl)]; 1638 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H ( Amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.84 (t, 6H, —CH 3 ); 1.24 (s, 42H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 1.36 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.47 (m, 4H, —N—CO—C—CH 2 —); 1.55, 1.67 (m, 2H, lysβ-) CH 2); 2.02,2.09 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 2.99 (m, 2H, lysε-CH 2); 4.14 (s, 1H, lysα- CH 2); 7.55 (br, 1H, -NH-CO -); 7.78 (d, 1H, -NH-CO -); 12.23 (br, 1H, -COOH).
Analysis result of distearoyl derivative 5:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.53 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3305 [ν N—H (amide)]; 1721 [ν C═O (carbonyl)]; 1638 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H ( Amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.84 (t, 6H, —CH 3 ); 1.24 (s, 56H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 1.36 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.47 (m, 4H, —N—CO—C—CH 2 —); 1.55, 1.67 (m, 2H, lysβ-) CH 2); 2.02,2.09 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 2.99 (m, 2H, lysε-CH 2); 4.14 (s, 1H, lysα- CH 2); 7.55 (br, 1H, -NH-CO -); 7.78 (d, 1H, -NH-CO -); 12.23 (br, 1H, -COOH).
(E) Dipalmitoyllysine derivative 3 and polyethylene glycol were bound as follows. That is, dipalmitoyl lysine derivative 3 (125 mg, 0.2 mmol) and DCC (41 mg, 0.2 mmol) were dissolved in chloroform, stirred at 4 ° C. for 1 hour, and then monomethoxyaminopolyethylene glycol (500 mg, 0 mmol) having a molecular weight of 5000. 0.1 mmol) and dimethylaminopyridine (24 mg, 0.2 mmol) were added dropwise to a chloroform solution. The reaction mixture was stirred at 25 ° C. for 6 hours, filtered through a glass filter (G4), and the filtrate was added dropwise to diethyl ether. The precipitate was collected by filtration and dried, and then the amphiphilic compound 6 (compound 6) was isolated with a silica gel column (solvent: chloroform / methanol = 6/1 (volume / volume)) (500 mg, yield 88%). .
Analysis result of Compound 6:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.73 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3294 [ν N—H (amide)]; 1634 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H (amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (s, 50H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 ); 1.32 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.63-1.80 (8H, —CH 2 —CN—, —N—CO—C—CH 2 —, lysβ-CH 2 ); ); 2.27,2.38 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 3.29 (m, 2H, lysε-CH 2); 3.38 (3H, -O-CH 3) 3.43 (2H, —CH 2 —NH—); 3.66 (PEG); 4.39 (s, 1H, lysα-CH 2 );
13 C-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 14.12; 22.68; 25.74; 28.75; 29.34; 29.53; 29.65; 31.92; 35; 38.13; 59.02; 70.44; 71.95.
(F) By the same operation as in the above (E), the following compounds were obtained with a combination in which the molecular weight of polyethylene glycol (PEG) and the carbon number of the hydrophobic group were different.
Analysis result of P50-2C14: PEG molecular weight (5000), hydrophobic group (— (CH 2 ) 14 CH 3 × 2)
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.55 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3294 [ν N—H (amide)]; 1634 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H (amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (s, 46H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 ); 1.32 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.63-1.80 (8H, —CH 2 —CN—, —N—CO—C—CH 2 —, lysβ-CH 2 ); 2.15; 2.23 (t, 4H, —N—CO—CH 2 —); 3.29 (m, 2H, lysε-CH 2 ); 3.38 (3H, —O—CH 3 ) 3.43 (2H, —CH 2 —NH—); 3.66 (PEG); 4.39 (s, 1H, lysα-CH 2 );
Analysis result of P125-2C14: PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— (CH 2 ) 14 CH 3 × 2)
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.50 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3294 [ν N—H (amide)]; 1634 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H (amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (s, 46H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 ); 1.32 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.63-1.80 (8H, —CH 2 —CN—, —N—CO—C—CH 2 —, lysβ-CH 2 ); 2.15; 2.23 (t, 4H, —N—CO—CH 2 —); 3.29 (m, 2H, lysε-CH 2 ); 3.38 (3H, —O—CH 3 ) 3.43 (2H, —CH 2 —NH—); 3.66 (PEG); 4.39 (s, 1H, lysα-CH 2 );
Analysis result of P125-2C16: PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— (CH 2 ) 16 CH 3 × 2)
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): Rf: 0.63 (monospot).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3305 [ν N—H (amide)]; 1638 [ν C═O (amide)]; 1556 [δ N—H (amide)].
1 H-NMR spectrum (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (s, 50H, —CH 2 —CH 2 —, lysγ-CH 2 ); 1.32 (m, 2H, lysδ—CH 2 ); 1.63-1.80 (8H, —CH 2 —CN—, —N—CO—C—CH 2 —, lysβ-CH 2 ); ); 2.27,2.38 (t, 4H, -N-CO-CH 2 -); 3.29 (m, 2H, lysε-CH 2); 3.38 (3H, -O-CH 3) 3.43 (2H, —CH 2 —NH—); 3.66 (PEG); 4.39 (s, 1H, lysα-CH 2 );

本実施例では、実施例１の方法で得られたリジン型ＰＥＧ脂質（以下「ＰＥＧ脂質」という）の小胞体への導入安定度および小胞体凝集抑制効果をＰＥＧ脂質構造との相関から明らかにした。
小胞体分散液（１７．０ｍＭ，１５．０ｍＬ）にＰＥＧ脂質水溶液（１７．０μＭ，２２．６ｍＬ）を混合後３７℃にて撹拌しＰＥＧ脂質導入小胞体分散液を得た。このＰＥＧ脂質導入小胞体分散液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．０）で６倍希釈し、１２時間後まで経時的に導入量を測定した。導入量は以下のように算出できる（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｈ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９１，１２，８６１）。
ＰＥＧ脂質導入小胞体分散液を超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）して、未導入ＰＥＧ脂質を分離した後、真空乾燥してＣＤＣｌ３に溶解した。不溶成分をＰＴＦＥフィルター（０．２μｍ）で除去した後、１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、ＤＰＰＣコリンメチルプロトン（δ＝３．３６ｐｐｍ）とＰＥＧ鎖メチレンプロトン（δ＝３．６４ｐｐｍ）の面積比を利用して導入率を算出した。超遠心分離を行ったものと行っていないものの小胞体コリンメチルプロトンの積分値を一定としたときのＰＥＧ鎖メチレンプロトンの積分値をそれぞれＨＰＥＧ＋、ＨＰＥＧ−とし、ＰＥＧ脂質の仕込み濃度をＡ（ｍｏｌ％）とすると、ＰＥＧ脂質導入量は次式から算出できる。
［ＰＥＧ−ｌｉｐｉｄ］＝Ａ×（ＨＰＥＧ＋／ＨＰＥＧ−） （ｍｏｌ％）
ＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により６倍希釈した後のＰＥＧ脂質の小胞体からの脱離挙動の観測結果（１Ｈ−ＮＭＲ）を図２に示した。図２中の記号はそれぞれ、（●）Ｐ５０−２Ｃ１４，（○）Ｐ１２５−２Ｃ１４，（▲）Ｐ５０−２Ｃ１６，（△）Ｐ１２５−２Ｃ１６，（□）Ｐ１２５−２Ｃ１８，（■）Ｐ１２５−４Ｃ１６，（◆）Ｐ５０−ＤＰＰＥ，（◇）Ｐ１２５−ＤＳＰＥを表す。２本鎖のＰＥＧ脂質については、Ｐ１２５−２Ｃ１８（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２））、Ｐ１２５−４Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×４））およびＰ５０−２Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２））では脱離が認められなかったのに対し、Ｐ１２５−ＤＳＰＥ（ＰＥＧ分子量（１２５００）がジステアロイルホスファチジルエタノールアミンＤＳＰＥに結合したＰＥＧ脂質）やＰ１２５−２Ｃ１６（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１４ＣＨ３×２））では３時間後には各々約８％、約１０％が小胞体から脱離した。他方、Ｐ５０−２Ｃ１４（ＰＥＧ分子量（５０００）、疎水基（−（ＣＨ２）１２ＣＨ３×２））、Ｐ１２５−２Ｃ１４（ＰＥＧ分子量（１２５００）、疎水基（−（ＣＨ２）１２ＣＨ３×２））では１２時間後にそれぞれ約２０、３０％が小胞体から脱離した。従ってＰＥＧ鎖の分子量の増大あるいはアルキル鎖長を短くすることでリポソーム表面のＰＥＧ鎖が脱離し易くなり、血中滞留性の制御ならびに指向性の増大が可能となった。
さらに、Ｐ５０−２Ｃ１６では脱離が認められないのに対し、Ｐ５０−ＤＰＰＥ（ＰＥＧ分子量（５０００）疎水基（−（ＣＨ２）１６ＣＨ３×２））では２０％程度が脱離した。なお、Ｐ５０−ＤＰＰＥは、ＰＥＧ分子量（５０００）がジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ−ＤＰＰＥでは、リン脂質頭部の親水性による脂質全体の親水性増大の影響が考えられる一方で、リジン型ＰＥＧ脂質ではその影響がないばかりでなく、リジン骨格におけるアミド結合部と小胞体リン脂質エステル部の水素結合が安定導入に寄与していると考えられる。In this example, the stability of the introduction of lysine-type PEG lipid (hereinafter referred to as “PEG lipid”) obtained by the method of Example 1 into the endoplasmic reticulum and the inhibitory effect on the endoplasmic reticulum aggregation were revealed from the correlation with the PEG lipid structure did.
A PEG lipid aqueous solution (17.0 μM, 22.6 mL) was mixed with the vesicle dispersion (17.0 mM, 15.0 mL) and stirred at 37 ° C. to obtain a PEG lipid-introduced vesicle dispersion. This PEG lipid-introduced vesicle dispersion was diluted 6-fold with phosphate buffer (PBS, pH 7.0), and the amount introduced was measured over time until 12 hours later. The amount introduced can be calculated as follows (Yoshioka, H. Biomaterials 1991, 12, 861).
The PEG lipid-introduced vesicle dispersion was subjected to ultracentrifugation (33,000 rpm, 30 min) to separate unintroduced PEG lipids, followed by vacuum drying and dissolution in CDCl 3 . After removing insoluble components with a PTFE filter (0.2 μm), 1 H-NMR measurement was performed, and the area ratio of DPPC choline methyl proton (δ = 3.36 ppm) to PEG chain methylene proton (δ = 3.64 ppm) was determined. Utilization rate was calculated. The integrated values of PEG chain methylene protons, when the integrated value of endoplasmic reticulum choline methyl proton is constant, with and without ultracentrifugation, are H PEG + and H PEG- , respectively, and the charged concentration of PEG lipid is A Assuming (mol%), the amount of PEG lipid introduced can be calculated from the following equation.
[PEG-lipid] = A × (H PEG + / H PEG− ) (mol%)
Desorption behavior of PEG lipid from endoplasmic reticulum The observation result (1H-NMR) of the desorption behavior of PEG lipid from the endoplasmic reticulum after 6-fold dilution with PBS (pH 7.0) is shown in FIG. The symbols in FIG. 2 are (●) P50-2C14, (◯) P125-2C14, (▲) P50-2C16, (Δ) P125-2C16, (□) P125-2C18, (■) P125-4C16, (♦) P50-DPPE, (◇) P125-DSPE. For double-stranded PEG lipids, P125-2C18 (PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— (CH 2 ) 16 CH 3 × 2)), P125-4C16 (PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— ( CH 2 ) 14 CH 3 × 4)) and P50-2C16 (PEG molecular weight (5000), hydrophobic group (— (CH 2 ) 14 CH 3 × 2)) showed no desorption, whereas P125- 3 hours later with DSPE (PEG lipid with PEG molecular weight (12500) bound to distearoylphosphatidylethanolamine DSPE) and P125-2C16 (PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— (CH 2 ) 14 CH 3 × 2)) About 8% and about 10% were detached from the endoplasmic reticulum, respectively. On the other hand, P50-2C14 (PEG molecular weight (5000), hydrophobic group (— (CH 2 ) 12 CH 3 × 2)), P125-2C14 (PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (— (CH 2 ) 12 CH 3 ×) In 2)), about 20 and 30% were detached from the endoplasmic reticulum after 12 hours, respectively. Therefore, by increasing the molecular weight of the PEG chain or shortening the alkyl chain length, the PEG chain on the liposome surface can be easily detached, and the retention in blood and the directivity can be increased.
Furthermore, P50-2C16 did not desorb, whereas P50-DPPE (PEG molecular weight (5000) hydrophobic group (— (CH 2 ) 16 CH 3 × 2)) desorbed about 20%. P50-DPPE is a PEG lipid having a PEG molecular weight (5000) bound to dipalmitoyl phosphatidylethanolamine. In PEG-DPPE, the hydrophilicity of the whole lipid due to the hydrophilicity of the phospholipid head can be considered, but not only in the lysine-type PEG lipid, but also in the lysine skeleton, the amide bond part and the endoplasmic reticulum phosphorus It is considered that hydrogen bonds in the lipid ester part contribute to stable introduction.

１．新規膜貫通型脂質の合成
ジアミノＰＥＧ（Ｍ．ｗ．＝２２０）を出発物質として、まず片末端をｔ−ブトキシ（Ｂｏｃ）基で保護した。ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基を用いると最後の脱保護操作（接触還元、又は強酸）で疎水部のジスルフィドが切断される恐れがあるため、弱酸でも脱保護が可能なＢｏｃ基を選択した。また、Ｂｏｃ基の切断を防ぐため、酸の混入と加熱をできるだけ避けた。
４，７，１０−Ｔｒｉｏｘａ−１，１３−ｔｒｉｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（６．６ｇ、３０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルムに溶解し、無水ｔ−ブトキシカルボニル（（Ｂｏｃ）２Ｏ、３．３ｇ、１５ｍｍｏｌ）の蒸留クロロホルム溶液（１００ｍＬ）を徐々に滴下して反応させた。４℃で６時間攪拌後、溶媒を減圧除去し、ベンゼンに再溶解して不溶の塩成分をろ過した。シリカゲルカラム（中性、溶媒：クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）精製により片末端のみをＢｏｃ基で保護したＰＥＧ脂質誘導体（７）（化合物７）を淡黄色粘稠液体で得た（２．４ｇ、収率５０％）。
ＰＥＧ脂質誘導体７の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２７（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３６３（νＮ−Ｈ）；１７０９（νＣ＝Ｏ）；１５２０（νＮ−Ｈ）；１２７１（νＣ−Ｏ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）；１．７１−１．７８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−）；２．７５−２．８１（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ）；３．２０−３．３９（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−）；３．４９−３．６５（ｍ，１２Ｈ，ＰＯＥ）。
２，２’−ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（２−ＰＤ、４．３ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２０ｍＬ蒸留ＴＨＦ中で１時間攪拌して脱酸素後、１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ（１．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を徐々に滴下させ、３７℃で１０時間、チオール・ジスルフィド交換反応により１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌの両末端にＰＤ基を導入した（０．８２ｇ、収率４０％）。溶媒を減圧除去し、フラッシュカラム（シリカゲル、溶媒：クロロホルム／酢酸エチル（１０／１）（容量／容量））により精製を行った。２−ＰＤは１，１０−ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌに対して４当量仕込んだが、アルキル鎖が数倍長い副生成物が得られて収率が低下したと考えられる。化合物８は１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにて構造確認を行った。再び化合物８（０．７７ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２０ｍＬ蒸留ＴＨＦ中で１時間攪拌して脱酸素を行い、１０−ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（０．７９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を徐々に滴下して１０時間反応させた。ジエチルエーテルにて再沈殿精製を２回行い、クロロホルムより再結晶して炭素鎖が３０のジカルボン酸誘導体９（化合物９）を白色固体で得た（１．１ｇ、収率９３％）。
化合物８及び９の分析結果：
（化合物８）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／酢酸エチル（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７（モノスポット））。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２３−１．３８（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−）；１．６５−１．７１（ｍ，４Ｈ，−Ｓ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．７９（ｔ，４Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−）；７．０５−８．４６（ｍ，８Ｈ，−Ｃ５ＮＨ４）。
（化合物９）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／アセトン（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３０３８（νＯ−Ｈ）：１６９４（νＣ＝Ｏ）；１２２９（νＣ−Ｏ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：１．２９−１．３９（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．６１−１．７０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−，−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−）；２．３５（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６８（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）。
ジカルボン酸誘導体（化合物９）（０．２０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（０．３０ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び片末端アミノＰＥＧ（化合物７）（０．７４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルム中で１２時間反応させ、アミド結合を形成させた。４％クエン酸水溶液、及び水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去した後、フラッシュカラム（シリカゲル、溶媒：クロロホルム／アセトン（２／１）（容量／容量））により精製して化合物１０を白色個体で得た（０．３５ｇ、収率９１％）。
化合物１０の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／アセトン（２／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４４（モノスポット））。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１．２８−１．３７（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．４４（ｓ，１８Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）；１．５６−１．７０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−）；１．７３−１．８０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ−）；２．１３−２．１６（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６６−２．６９（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）；３．３１−３．２２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−）；３．３３−３．３７（ｑ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．５３−３．６６（ｍ，２４Ｈ，ＰＯＥ）。
化合物１０（０．１５６ｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を５ｍＬジクロロメタンに溶解し、２，６−Ｌｕｔｉｄｉｎｅ（０．８２ｍＬ、１．５Ｍ）及びＴｒｉｍｃｔｈｙｌｓｉｌｙｌ Ｔｒｉｆｌａｔｅ（０．８９ｍＬ、１Ｍ）を加えて室温で１時間攪拌した。ニンヒドリンスプレーでアミノ基の出現を確認後、耐酸ポンプにて６０〜７０℃で溶媒を減圧除去し、水で２回洗浄した後、ジエチルエーテルにて再沈殿精製を行って、膜貫通型脂質（１１）（化合物１１）を淡黄色固体で得た（０．１２ｇ、収率９３％）。
膜貫通型脂質１１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１９（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３２６（νＮ−Ｈ）；１６３７（νＣ＝Ｏ）；１５４０（νＮ−Ｈ）；１２５２（νＣ−Ｏ）；１１１４（νＣ−Ｏ−Ｃ）；１３１４（νＣ−Ｓ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：１．２８−１．４３（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−）；１．５９−１．８０（ｍ，２０Ｈ，−ＣＨ２−Ｃ−ＣＯ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｓ−／−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ）；２．１３−２．１６（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）；２．６６−２．６９（ｔ，８Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−）；２．８７−２．８９（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ−Ｏ−）；３．３２−３．３６（ｑ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−）；３．５４−３．６５（ｍ，２４Ｈ，ＰＯＥ）。
２．蛋白質担持リポソームの調製
ＤＰＰＣ（１．０ｇ，１．３６ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．４２ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）、ＤＰＥＡ（０．１９ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）の混合脂質に、膜貫通型脂質（１１）（８．５ｍｇ，８．１６μｍｏｌ）を０．３ｍｏｌ％混合して５ｍＬベンゼンに溶解後、凍結乾燥を行った。ベンゼンを除去した後、脂質濃度が約２ｗｔ％になるようリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に水和した（ｒ．ｔ．、終夜）。その後、凍結融解処理を行い、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法にて最終孔径５０ｎｍまで透過させた。超遠心分離にて外水相を洗浄した後、リン脂質定量で濃度を調整して、粒径が約１４０ｎｍの１枚膜リポソームを調製した。
３．膜貫通型脂質の導入量測定
導入量は、膜貫通型脂質の両末端アミノ基にフルオレスカミンにて蛍光標識して、蛍光測定により定量した。膜貫通を証明する為に、（ａ）リポソーム表面アミノ基のみ、及び（ｂ）リポソーム中の全アミノ基の２通りの測定を行い、両者を比較した。
Ｇｌｕ２Ｃ１６（３０ｍｇ，５０μｍｏｌ）にＴＨＦ、フルオレスカミン（４２ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて１５分攪拌て希釈後、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）により検量線を作成した（Ｒ２＝０．９９９４）。
（ａ）：リポソーム分散液（［ＤＰＰＣ］＝１ｗｔ％，１ｍＬ）に１００μＬフルオレスカミン（１０ｍｇ／５００μＬアセトン）を加えて１５分間攪拌後、超遠心分離で未反応のフルオレスカミンを除去した。ＴＨＦに再溶解し、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）を行った。
（ｂ）：リポソーム分散液（［ＤＰＰＣ］＝１ｗｔ％，１ｍＬ）をＴＨＦに溶解し、１００μＬフルオレスカミン（１０ｍｇ／５００μＬアセトン）を加えて１５分間攪拌後、蛍光測定（μｅｘ＝３９０ｎｍ，μｅｍ＝４７５ｎｍ）を行った。
［結果］
蛍光測定の結果、リポソーム表面アミノ基は全アミノ基の約５０％であった（表１）。以上の結果、及び長鎖アルキルがメチレン同士の立体障害を最小にする為に真っ直ぐなコンホメーションをとり易い事を考慮すると、今回導入した合成脂質はリポソーム二分子膜を貫通して膜内に固定化され、末端アミノ基がリポソーム表面から充分に露出していると結論できる。
４．リポソーム表面への蛋白質の導入
調製したリポソームの表面アミノ基に、架橋剤Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）及びＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＭＤＰ）を用いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識したモデル蛋白質（□−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（分子量：１４ｋＤａ）、ｒＨＳＡ（６６．５ｋＤａ）、ＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（４６０ｋＤａ）、Ｔｈｙｒｏｇｒｏｂｕｌｉｎ（６７０ｋＤａ））を結合させた。蛋白質は電気泳動マーカーの中から、分子量依存性を解析するために等電点の近いものを選択した（表２）。
［蛋白質の調製］
蛋白質２．０ｇ／ｄＬ（１ｍＬ、ＰＢＳ）にＳＰＤＰ（３．８ｍｇ／Ｅｔｈａｎｏｌ ２ｍＬ）を８μＬ（１．５ｅｑ）添加、室温にて３０分攪拌した。その後、ＦＩＴＣ（６ｍｇ／１Ｎ ＮａＯＨ ２５０μＬ，ＰＢＳ ７５０μＬ）を２００μＬ（５ｅｑ）添加、室温にてさらに３０分攪拌した。ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にて未反応のＳＰＤＰ、ＦＩＴＣを除去した。ＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ １ｍＬ）を４０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３０分攪拌後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にて未反応のＤＴＴを除去した。
［ＳＭＤＰ結合リポソーム調製］
膜貫通型脂質導入リポソーム分散液（ＰＢＳ ５ｍＬ，［ＤＰＰＣ］＝２．８ｇ／ｄＬ）にＳＭＤＰ（３０ｍｇ／５００μＬ ＤＭＦ）を３８μＬ添加し、室温にて１時間撹拌した。超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ×２）より未反応のＳＭＤＰを除去した。
［蛋白質結合リポソーム調製］
ＳＭＤＰ導入リポソーム分散液（ＰＢＳ ４ｍＬ（［Ｌｉｐｉｄ］＝０．６ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ導入蛋白質溶液（０．４ｇ／ｄＬ）を１ｍＬ添加し、４℃にて１２時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応の蛋白質を除去し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた。
［蛋白質結合量の定量］
調製した蛋白質結合リポソーム分散液をエタノール溶液に溶解し、溶液の蛍光強度（λｅｘ＝４９０ｎｍ，λｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定して導入された蛋白質の結合数及びリポソーム表面アミノ基に対する結合率を算出した（表３）。
５．蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離速度測定
調製した５種の蛋白質（ＦＩＴＣ標識）結合リポソームをｐＨ７．４、３７℃にて振とうし、蛋白質の脱離挙動を蛍光測定した。
［実験方法］ 蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ １０ｍＬ、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定を行い（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図３に示した。図３中の記号はそれぞれ、（●）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ、（■）ｒＨＳＡ、（□）ＩｇＧ、（▲）Ｆｅｒｒｉｔｉｎ、（△）Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎを表す。
蛋白質分子量の増加に伴いリポソーム表面からの脱離が促進されたが、分子量が６６．５ｋＤａのｒＨＳＡまでは約９０％が安定に保持された。
６．膜透過性還元剤添加による脱離効果
前述の脱離評価より、最も脱離が少なかったα−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ結合リポソームについて、膜透過性の還元剤であるＬ−システイン（Ｃｙｓ）を外水相に共存させて脱離評価を行った。
［実験方法］
α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ結合リポソーム分散液（ＰＢＳ １ｍＬ×８サンプル、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を窒素雰囲気下で撹拌（３０ｍｉｎ、４℃）後、２０ｍＭ Ｃｙｓ溶液を添加し、ｐＨ７．４、３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定を行って（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図４に示した。図４中の記号はそれぞれ、（●）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（Ｃｙｓ無添加系）、（○）α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ＋Ｃｙｓ溶液（Ｃｙｓ添加系）を表す。
Ｃｙｓ無添加系では２４時間後でも９０％以上がリポソーム表面に保持されていたが、Ｃｙｓ添加系では徐々に蛋白質の脱離が促進され、２４時間後には９５％が脱離した。Ｃｙｓがリポソーム二分子膜を透過し、二分子膜内に導入した膜貫通脂質のジスルフィド結合を還元することによる脱離効果であると考えられる。1. Synthesis of Novel Transmembrane Lipid Starting from diaminoPEG (Mw = 220) as a starting material, one end was first protected with a t-butoxy (Boc) group. When the benzyloxycarbonyl (Z) group is used, the final deprotection operation (catalytic reduction or strong acid) may cleave the hydrophobic disulfide. Therefore, a Boc group that can be deprotected even with a weak acid was selected. Further, in order to prevent cleavage of the Boc group, mixing of acid and heating were avoided as much as possible.
4,7,10-Trioxa-1,13-tridecaneamine (6.6 g, 30 mmol) and triethylamine (TEA, 1.5 g, 15 mmol) were dissolved in 20 mL distilled chloroform, and anhydrous t-butoxycarbonyl ((Boc) 2 O A distilled chloroform solution (100 mL) of 3.3 g, 15 mmol) was gradually added dropwise to react. After stirring at 4 ° C. for 6 hours, the solvent was removed under reduced pressure, redissolved in benzene, and insoluble salt components were filtered off. Silica gel column (neutral, solvent: chloroform / methanol (4/1) (volume / volume) purification yielded PEG lipid derivative (7) (compound 7) with only one end protected with Boc group as a pale yellow viscous liquid (2.4 g, yield 50%).
Analysis results of PEG lipid derivative 7:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.27 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3363 (ν N—H ); 1709 (ν C═O ); 1520 (ν N—H ); 1271 (ν C—O ).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 1.43 (s, 9H, t-butyl); 1.71-1.78 (m, 4H, —CH 2 —C—N—) ; 2.75-2.81 (t, 2H, -CH 2 -N); 3.20-3.39 (br, 2H, -CH 2 -N -); 3.49-3.65 (m, 12H, POE).
2,2′-dipyridine disulphide (2-PD, 4.3 g, 19.2 mmol) was stirred in 20 mL distilled THF for 1 hour under a nitrogen atmosphere, deoxygenated, and then 1,10-decandithiol (1.0 g, 4 g .8 mmol) in THF (10 mL) was gradually added dropwise, and PD groups were introduced at both ends of 1,10-decandithiol by thiol-disulfide exchange reaction at 37 ° C. for 10 hours (0.82 g, yield 40%). ). The solvent was removed under reduced pressure, and purification was performed with a flash column (silica gel, solvent: chloroform / ethyl acetate (10/1) (volume / volume)). Although 2-PD was charged in 4 equivalents with respect to 1,10-decandithiol, a by-product having a several times longer alkyl chain was obtained and the yield was considered to be reduced. The structure of Compound 8 was confirmed by 1 H-NMR and ESI-MS. Again, Compound 8 (0.77 g, 1.8 mmol) was deoxygenated by stirring in 20 mL distilled THF for 1 hour under a nitrogen atmosphere, and 10-carbo-1-decanethiol (0.79 g, 3.6 mmol) in THF. The solution (20 mL) was gradually added dropwise to react for 10 hours. Reprecipitation purification was performed twice with diethyl ether, and recrystallization from chloroform gave dicarboxylic acid derivative 9 (compound 9) having 30 carbon chains as a white solid (1.1 g, yield 93%).
Analysis results for compounds 8 and 9:
(Compound 8): Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / ethyl acetate (10/1) (volume / volume): R f : 0.7 (monospot)).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 1.23-1.38 (m, 12 H, —CH 2 —); 1.65-1.71 (m, 4 H, —S—C) -CH 2 -); 2.79 (t , 4H, -S-CH 2 -); 7.05-8.46 (m, 8H, -C 5 NH 4).
(Compound 9): Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / acetone (4/1) (volume / volume): R f : 0.23 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3038 (ν O—H ): 1694 (ν C═O ); 1229 (ν C—O ).
1 H-NMR (CDCl 3, 500MHz, δ (ppm)): 1.29-1.39 (m, 36H, -CH 2 -); 1.61-1.70 (m, 12H, -CH 2 - C—CO—, —CH 2 —C—S—); 2.35 (t, 4H, —CH 2 —CO—); 2.68 (t, 8H, —CH 2 —S—).
Dicarboxylic acid derivative (compound 9) (0.20 g, 0.31 mmol), BOP reagent (0.30 g, 0.69 mmol), TEA (0.22 g, 2.2 mmol) and one-terminal amino PEG (compound 7) (0 .74 g, 2.3 mmol) was reacted in 20 mL distilled chloroform for 12 hours to form an amide bond. Liquid separation with 4% citric acid aqueous solution and water (chloroform phase collection) was performed, and the solvent was removed under reduced pressure, followed by purification with a flash column (silica gel, solvent: chloroform / acetone (2/1) (volume / volume)). Compound 10 was obtained as a white solid (0.35 g, yield 91%).
Analysis result of compound 10:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / acetone (2/1) (volume / volume): R f : 0.44 (monospot)).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 1.28-1.37 (m, 36H, —CH 2 —); 1.44 (s, 18H, t-butyl); 1.56 -1.70 (m, 12H, -CH 2 -C-CO - / - CH 2 -C-S -); 1.73-1.80 (m, 8H, -CH 2 -C-N-); 2.13-2.16 (t, 4H, —CH 2 —CO—); 2.66-2.69 (t, 8H, —CH 2 —S—); 3.31-3.22 (m, 4H, -CH 2 -NH-COO - ); 3.33-3.37 (q, 4H, -CH 2 -NH -); 3.53-3.66 (m, 24H, POE).
Compound 10 (0.156 g, 0.125 mmol) is dissolved in 5 mL of dichloromethane, 2,6-Lutidine (0.82 mL, 1.5 M) and Trimethylsilyl Triflate (0.89 mL, 1 M) are added, and the mixture is stirred at room temperature for 1 hour. did. After confirming the appearance of amino groups with ninhydrin spray, the solvent was removed under reduced pressure at 60-70 ° C. with an acid-resistant pump, washed with water twice, purified by reprecipitation with diethyl ether, and transmembrane lipid ( 11) (Compound 11) was obtained as a pale yellow solid (0.12 g, 93% yield).
Analysis results of transmembrane lipid 11:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.19 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 3326 (ν N—H ); 1637 (ν C═O ); 1540 (ν N—H ); 1252 (ν C—O ); 1114 (ν C—O—C) ); 1314 (ν C-S ).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 1.28 to 1.43 (m, 36 H, —CH 2 —); 1.59-1.80 (m, 20 H, —CH 2 —) C—CO — / — CH 2 —C—S — / — CH 2 —C—N); 2.13-2.16 (t, 4H, —CH 2 —CO—); 2.66-2.69 (T, 8H, —CH 2 —S—); 2.87-2.89 (t, 4H, —CH 2 —NH—C—O—); 3.32-3.36 (q, 4H, − CH 2 -NH -); 3.54-3.65 ( m, 24H, POE).
2. Preparation of protein-supported liposomes To a mixed lipid of DPPC (1.0 g, 1.36 mmol), cholesterol (0.42 g, 1.09 mmol), DPEA (0.19 g, 0.27 mmol), a transmembrane lipid (11) ( 8.5 mg, 8.16 μmol) was mixed at 0.3 mol% and dissolved in 5 mL benzene, and then lyophilized. After removing benzene, it was hydrated in phosphate buffered saline (PBS) to a lipid concentration of about 2 wt% (rt, overnight). Thereafter, freeze-thawing treatment was performed, and the resultant was allowed to permeate to a final pore diameter of 50 nm by the extrusion method. After washing the outer aqueous phase by ultracentrifugation, the concentration was adjusted by phospholipid quantification to prepare a single membrane liposome having a particle size of about 140 nm.
3. Measurement of the amount of transmembrane lipid introduced The amount introduced was fluorescently labeled with fluorescamine on both terminal amino groups of the transmembrane lipid and quantified by fluorescence measurement. In order to prove transmembrane, two types of measurements were performed: (a) only liposome surface amino groups and (b) total amino groups in liposomes, and compared them.
After adding THF and fluorescamine (42 mg, 0.15 mmol) to Glu2C16 (30 mg, 50 μmol) and stirring for 15 minutes to dilute, a calibration curve was prepared by fluorescence measurement (λ ex = 390 nm, λ em = 475 nm) (R 2 = 0.9994).
(A): 100 μL fluorescamine (10 mg / 500 μL acetone) was added to the liposome dispersion ([DPPC] = 1 wt%, 1 mL) and stirred for 15 minutes, and then unreacted fluorescamine was removed by ultracentrifugation. The sample was redissolved in THF, and fluorescence measurement (λ ex = 390 nm, λ em = 475 nm) was performed.
(B): Liposome dispersion ([DPPC] = 1 wt%, 1 mL) was dissolved in THF, 100 μL fluorescamine (10 mg / 500 μL acetone) was added and stirred for 15 minutes, and then fluorescence measurement (μ ex = 390 nm, μ em = 475 nm).
[result]
As a result of the fluorescence measurement, the liposome surface amino groups were about 50% of the total amino groups (Table 1). Considering the above results and the fact that long-chain alkyls tend to take a straight conformation to minimize steric hindrance between methylenes, the synthetic lipid introduced this time penetrates the liposome bilayer membrane and enters the membrane. It can be concluded that it is immobilized and the terminal amino groups are well exposed from the liposome surface.
4). Introduction of protein to liposome surface The surface amino groups of the prepared liposomes were subjected to fluorescein isothiocyanate (SMDP) using the cross-linking agents N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) and N-Succinimidyl 3-Maleimidopropionate (SMDP). FITC) labeled model proteins (□ -Lactalbumin (molecular weight: 14 kDa), rHSA (66.5 kDa), IgG (150 kDa), Ferritin (460 kDa), Thyroglobulin (670 kDa)) were bound. Proteins with close isoelectric points were selected from electrophoresis markers in order to analyze the molecular weight dependency (Table 2).
[Preparation of protein]
8 μL (1.5 eq) of SPDP (3.8 mg / Ethanol 2 mL) was added to 2.0 g / dL (1 mL, PBS) of protein, and stirred at room temperature for 30 minutes. Then, 200 μL (5 eq) of FITC (6 mg / 1N NaOH 250 μL, PBS 750 μL) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 30 minutes. Unreacted SPDP and FITC were removed by gel column chromatography (Sephadex G25). 40 μL (20 mM) of DTT (15.4 mg / PBS 1 mL) was added, and after stirring for 30 minutes, unreacted DTT was removed by gel column chromatography (Sephadex G25).
[Preparation of SMDP-bound liposome]
38 μL of SMDP (30 mg / 500 μL DMF) was added to a transmembrane lipid-introduced liposome dispersion (PBS 5 mL, [DPPC] = 2.8 g / dL), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Unreacted SMDP was removed by ultracentrifugation (33,000 rpm, 60 min × 2).
[Protein-bound liposome preparation]
1 mL of the SPDP-introduced protein solution (0.4 g / dL) was added to the SMDP-introduced liposome dispersion (PBS 4 mL ([Lipid] = 0.6 g / dL)) and stirred for 12 hours at 4 ° C. Centrifugation (10, Unreacted proteins were removed at 000 rpm, 5 min × 3), and 5 types of proteins were bound to the liposome surface.
[Quantification of protein binding amount]
Dissolve the prepared protein-bound liposome dispersion in an ethanol solution, measure the fluorescence intensity (λ ex = 490 nm, λ em = 520 nm) of the solution, and calculate the number of bound proteins and the rate of binding to the liposome surface amino groups. (Table 3).
5. Measurement of Desorption Rate of Protein-bound Transmembrane Lipid Five prepared protein (FITC-labeled) -bound liposomes were shaken at pH 7.4 and 37 ° C., and the desorption behavior of the protein was measured by fluorescence.
[Experiment Method] A protein-bound liposome dispersion (PBS 10 mL, [Lipid] = 0.8 g / dL, stored at 4 ° C.) was shaken at 37 ° C. Five minutes after the start, 1 mL of control (0 min) was collected, centrifuged (10,000 rpm, 5 min), and then the supernatant (700 μL) was measured for fluorescence (FITC, λex = 490 nm, λem = 520 nm), and desorbed from the calibration curve. The protein was quantified. The change over time in the amount of desorbed protein was measured after 2, 4, 8, 12, and 24 hours by the same operation. The results are shown in FIG. The symbols in FIG. 3 represent (●) α-Lactalbumin, (■) rHSA, (□) IgG, (▲) Ferritin, (Δ) Thyroglobulin, respectively.
Desorption from the liposome surface was promoted as the protein molecular weight increased, but about 90% was stably maintained up to rHSA having a molecular weight of 66.5 kDa.
6). Desorption effect due to addition of membrane-permeable reducing agent From α-Lactalbumin-bound liposomes, which were the least desorbed from the aforementioned desorption evaluation, L-cysteine (Cys), which is a membrane-permeable reducing agent, coexists in the outer aqueous phase. The desorption was evaluated.
[experimental method]
α-Lactalbumin-conjugated liposome dispersion (PBS 1 mL × 8 sample, [Lipid] = 0.8 g / dL, stored at 4 ° C.) was stirred in a nitrogen atmosphere (30 min, 4 ° C.), then 20 mM Cys solution was added, pH 7 4. Shake at 37 ° C. Five minutes after the start, 1 mL of control (0 min) was collected, centrifuged (10,000 rpm, 5 min), and then the supernatant (700 μL) was subjected to fluorescence measurement (FITC, λex = 490 nm, λem = 520 nm), and removed from the calibration curve. The released protein was quantified. The change over time in the amount of desorbed protein was measured after 2, 4, 8, 12, and 24 hours by the same operation. The results are shown in FIG. The symbols in FIG. 4 represent (●) α-Lactalbumin (Cys-free system) and (◯) α-Lactalbumin + Cys solution (Cys-added system), respectively.
In the Cys-free system, 90% or more was retained on the liposome surface even after 24 hours, whereas in the Cys-added system, protein detachment was gradually promoted, and 95% detached after 24 hours. It is considered that Cys permeates the liposome bilayer membrane and is a desorption effect by reducing the disulfide bond of the transmembrane lipid introduced into the bilayer membrane.

１．多アルキル鎖型糖脂質の合成
ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１００ｍＬ）を８５℃にて沸点還流し、ジンスタークを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）とヘキサデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）、またはオクタデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、１０時間生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し黄色透明に変化した。反応終了後、溶媒を減去し、炭酸ナトリウム飽和水溶液／クロロホルムにて３回分液操作を行った後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行い、ジアシルグルタミン酸誘導体１２（化合物１２）（８３％）および１３（化合物１３）（８５％）を得た。
ジアシルグルタミン酸誘導体１２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．８４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．０８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．４５（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；３．４５（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６，４．１０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：５９５．９；Ｆｏｕｎｄ：５９７．３（ＭＨ）＋．
両末端アミンＰＥＧ（９．０１ｇ、４１ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１０ｍＬ）にトリエチルアミン（５．７１ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて攪拌した。Ｚクロライド（６．９８ｇ、４１ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を滴下漏斗にてゆっくりと（２秒に１滴程度）滴下した。反応は滴下に伴って速やかに進行し、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝４／１，シリカゲルプレート）にて片末端保護の目的物が出現（Ｒｆ＝０．４２）するが、この他に両末端保護の副生成物（Ｒｆ＝０．８１）も生成した。反応終了後、溶媒を減去、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール＝４／１）により両末端保護の副生成物とＴＥＡ塩酸塩を除去そ、目的の化合物１４を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。また、ＴＥＡ塩はベンゼン、酢酸エチルに不溶であり、これを用いて除去も可能である。
化合物１４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．４２（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７１３（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６２３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）；１５２８（δＮ−Ｈ，ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：１．２５（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２−Ｃ−）；１．８０（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２−Ｃ−ＣＨ２−）；１．９４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；３．１１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２−ＣＨ２−）；３．３０（ｑ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．５８（ｔ，１２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−）；５．０８（ｓ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３４（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．５７（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：３５４．４；Ｆｏｕｎｄ：３５５．４（ＭＨ）＋．
化合物１４（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）にトリエチルアミン（１９６μＬ、１．４ｍｍｏｌ）、マルトース（５０７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加して７０℃、１２時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４，シリカゲルプレート）にて目的物のスポットが出現（Ｒｆ＝０．０９）した。反応終了後、溶媒を減去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４）により、目的の化合物１５を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。
化合物１５の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１８（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７２０（νＣ＝Ｏ、ｅｓｔｅｒ）；１６５４（νＣ＝Ｏ、ａｍｉｄｅ）；１５４０（δＮ−Ｈ、ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：１．７１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；３．０７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．２１（ｔ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−４）；３．３１（ｔ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−４）；３．５７（ｔ，１２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−）；３．４９−３．９６（ｍ，１０Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，５，６）；４．５９（ｄ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；５．０５（ｂｒ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＮＨ−Ｃ−Ｃ−）；５．１６（ｄ，１Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１，ａｎｏｍｅｒｉｃＨ）；５．３３（ｄ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３７（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；８．３９（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）．
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：６７８．７；Ｆｏｕｎｄ：６７９．４（ＭＨ）＋．
化合物１５（１．００ｇ、１．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）にトリエチルアミン（６９８μＬ、５．０ｍｍｏｌ）、エピクロロヒドリン（２２８μＬ、２．８ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃にて２時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４，シリカゲルプレート）にてエポキシ基の導入による新たなスポットが出現（Ｒｆ＝０．１９，０．２７）したが、化合物１６の単離は行わず、続く反応により１２（Ｇｌｕ２Ｃ１６、２．３３ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃にて１８時間攪拌し、エポキシ基に結合させた。反応終了後、ＤＭＦを減去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール＝１０／１）により２本鎖糖脂質１７（Ｒｆ＝０．３８，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、４本鎖糖脂質１９（Ｒｆ＝０．５０）を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。炭素数１８の糖脂質、２本鎖１８（Ｒｆ＝０．４０，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、４本鎖２０（Ｒｆ＝０．５１）も同様に合成した。
本反応は水酸基の反応性の差異を利用して６位の一級水酸基にアルキル鎖を導入するものである。アルキル鎖４本の導入では、エステル結合を用いて導入を試みたがアルキルグルタメート同士の立体障害により収率が低く単離が困難であった。より活性の高いエポキシ基を用いることでアルキル鎖４本の導入および単離が可能となり、糖脂質１７〜２０（化合物１７〜２０）の合成が可能であった。
糖脂質１９（４Ｃ１６）の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３１（νＣ＝Ｏ、ｅｓｔｅｒ）；１６７２（νＣ＝Ｏ、ａｍｉｄｅ）；１５２１（δＮ−Ｈ、ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，１２Ｈ，−ＣＨ３）；１．２８（ｓ，１０４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６４（ｍ，８Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．７４（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．１４（ｍ，２Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．２９−２．３５（ｍ，８Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−，ＮＨ−Ｃ−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−）；２．４５（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；２．５５（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−）；３．１１（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１８（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．４９−３．７４（ｍ，１２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，４，５，６）；３．５１（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６（ｔ，２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；４．１５（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．２７（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；５．０５（ｍ，２Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；７．３３（ｔ，５Ｈ，Ｃ６Ｈ５−ＣＨ２−）；８．０１（ｂｒ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−）．
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：１９８１．４；Ｆｏｕｎｄ：１９８１．４（ＭＨ）＋．
化合物１７（２０ｍｇ、１０ｎｍｏｌ）のエタノール溶液（３ｍＬ）にＰｄブラック粉末（２０ｍｇ）（またはＰｄ／Ｃ粉末）を添加し、Ｈ２ガス（Ｚｎ／Ｈ２ＳＯ４にて発生）通気下、室温にて４時間攪拌した。反応の進行に伴い、ＴＬＣにて、ニンヒドリン陽性のスポット、２１（Ｒｆ＝０．０９，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）が出現した。反応終了後、Ｐｄ粉末を濾別し、溶媒を減去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，クロロホルム／メタノール／水＝５／１）により目的の化合物２１を精製した。化合物の同定はＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳにより行った。化合物２１（Ｒｆ＝０．１２，クロロホルム／メタノール＝１０／１，シリカゲルプレート）、化合物２２（Ｒｆ＝０．０３）、化合物２４（Ｒｆ＝０．０３）も同様に合成した。
化合物２３（４Ｃ１６）の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（１０／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０９（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３８（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，１２Ｈ，−ＣＨ３）；１．２８（ｓ，１０４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６１（ｍ，８Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．７７（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．９２（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．１４（ｍ，２Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２）；２．２４−２．４１（ｍ，８Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−，ＮＨ−Ｃ−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−）；２．４４（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２）；２．６８（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ−Ｏ−）；３．０９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−）；３．４９−３．７９（ｍ，１２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−２，３，４，５，６）；３．６３（ｍ，１４Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−，ｇｌｕα−ＣＨ）；４．０６（ｔ，２Ｈ，ｍａｌｔｏｓｅＣ−１）；４．１５（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．２８（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）．
２．多アルキル鎖型糖脂質の臨界ミセル濃度測定
［方法］
糖脂質（化合物２１〜２４）分散液（純水２ｍＬ，１，５，１０，２０，３０，５０，１００μＭ）にＤＰＨ溶液（３０μＭ，ＴＨＦ）を２μＬ添加し、３７℃にて２時間で振とうした。３７℃にて、蛍光測定（ＤＰＨ、λｅｘ＝３５７ｎｍ、λｅｍ＝４３０ｎｍ）により、蛍光強度が急激に上昇する糖脂質濃度を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とした。
［結果］
化合物２１のＣＭＣは２０μＭであるのに対し、化合物２２では１８μＭとなり、アルキル鎖長をＣ１６からＣ１８にすることでＣＭＣは若干低下した。他方、化合物２３のＣＭＣは８．０μＭ、化合物２４では７．０μＭであり、アルキル鎖数を２本から４本に増加させることで大幅なＣＭＣの低下が認められた。このことから、アルキル鎖数を増加させることが疎水性相互作用の増大に有効であることを確認した。結果を図５に示した。図５中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。
３．糖脂質導入リポソームの調製
ＤＰＰＣ（６００ｍｇ）、コレステロール（３１６ｍｇ）あるいは糖脂質（化合物２１（３．９ｍｇ）、化合物２２（４．１ｍｇ）、化合物２３（６．０ｍｇ）、化合物２４（６．４ｍｇ））（ＤＰＰＣ／コレステロール＝１／１（モル比）、糖脂質＝０．２０ｍｏｌ％）をクロロホルム３０ｍＬに溶解して混合した。クロロホルムをエバポレーターにて除去し、真空乾燥後、ＰＢＳ５０ｍＬ中にて１２時間水和攪拌した（［Ｌｉｐｉｄ］＝２．０ｇ／ｄＬ）。水和後、４５℃にて４時間アニーリング処理し、エクストリューダーにて造粒（３０００→８００→６５０→４５０→３００→２２０ｎｍ×２）し、粒径制御した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）により外水相を除去、ＰＢＳ中に再分散して糖脂質含有リポソーム分散液を調製した。
４．リポソーム表面の糖脂質定量
リポソーム分散液（ＰＢＳ １ｍＬ，［Ｌｉｐｉｄ］＝０．１５ｇ／ｄＬ）中にフルオレスカミン（３０ｍｇ／Ａｃｅｔｏｎｅ ４５０μＬ）を１００μＬ添加して、室温にて３０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）にて、未反応のフルオレスカミンを除去し、クロロホルム／メタノール＝２／１に溶解（総量２ｍＬ）して、蛍光測定（λｅｘ＝３９０ｎｍ，λｅｍ＝４７５ｎｍ）よりリポソーム表面のアミノ基を定量した（表４）。
５．リポソーム表面への蛋白質の導入
架橋剤ＳＰＤＰを用いてリポソーム表面に導入したＮＨ２基、および蛋白質表面のＮＨ２基をジスルフィド結合にて架橋し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた（表５）。
［蛋白質の調製］
蛋白質２．０ｇ／ｄＬ（１ｍＬ、ＰＢＳ）にＳＰＤＰ（３．８ｍｇ／Ｍｅｔｈａｎｏｌ ２ｍＬ）を８μＬ（１．５ｅｑ）添加し、室温にて３０分攪拌した。その後、ＦＩＴＣ（６ｍｇ／１Ｎ ＮａＯＨ ２５０μＬ，ＰＢＳ ７５０μＬ）を２００μＬ（５ｅｑ）添加し、室温にてさらに３０分攪拌した。ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にて未反応のＳＰＤＰ、ＦＩＴＣを除去した。ＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ １ｍＬ）を４０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３０分攪拌後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にて未反応のＤＴＴを除去した。
［ＳＰＤＰ結合リポソーム調製］
糖脂質導入リポソーム分散液（ＰＢＳ １０ｍＬ［Ｌｉｐｉｄ］＝２．０ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ（８ｍｇ／Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を４５０μＬ添加し、室温にて３０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応のＳＰＤＰを除去した。
［蛋白質結合リポソーム調製］
ＳＰＤＰ導入リポソーム分散液（ＰＢＳ ４ｍＬ（［Ｌｉｐｉｄ］＝０．６ｇ／ｄＬ）にＳＰＤＰ導入蛋白質溶液（０．４ｇ／ｄＬ）を１ｍＬ添加、４℃にて１２時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ×３）より未反応の蛋白質を除去し、リポソーム表面にそれぞれ５種類の蛋白質を結合させた。
［蛋白質結合量の定量］
蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ １ｍＬ［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ）にＤＴＴ（１５．４ｍｇ／ＰＢＳ１ｍＬ）を２０μＬ（２０ｍＭ）添加し、３７℃にて４時間攪拌した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）を蛍光測定（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線から結合蛋白質量を定量した（表６）。
６．蛋白質結合糖脂質の脱離速度測定
調製した５種の蛋白質（ＦＩＴＣ標識）結合リポソームをｐＨ７．４、３７℃にて振とうし、蛋白質結合糖脂質の脱離挙動を蛍光測定した。
［実験方法］
蛋白質結合リポソーム分散液（ＰＢＳ１０ｍＬ、［Ｌｉｐｉｄ］＝０．８ｇ／ｄＬ、４℃保存）を３７℃にて振とうした。開始５分後にｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍｉｎ）１ｍＬを採取、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、上澄み（７００μＬ）の蛍光測定（ＦＩＴＣ、λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）、検量線より脱離した蛋白質結合糖脂質を定量した。２、４、８、１２、２４時間後も同様の操作により、脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。結果を図６に示した。図６中、（ａ）はα−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（Ｍｗ：１４．０ｋＤ）、（ｂ）はｒ−ＨＳＡ（Ｍｗ：６６．５ｋＤ）、（ｃ）はＣａｔａｌａｓｅ（Ｍｗ：２３２ｋＤ）、（ｄ）はＦｅｒｒｉｔｉｎ（Ｍｗ：４４０ｋＤ）、（ｅ）はＴｈｙｒｏｇｒｏｂｕｒｉｎ（Ｍｗ：６６９ｋＤ）の測定結果であり、図６中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。
Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｍｗ：４４０ｋＤａ）の測定結果では、化合物２１の脱離速度は１２％／ｈｒであるのに対し、化合物２２では１１％／ｈｒとなり、アルキル鎖長をＣ１８にすることで脱離速度は若干抑制された。他方、化合物２３の脱離速度は４．４％／ｈｒ、化合物２４では３．５％／ｈｒであり、２Ｃ（２本鎖）群と比較してそれぞれ０．３６倍、０．３２倍となり、アルキル鎖数を２本から４本に増加させることで脱離速度は大幅に抑制され、２４時間後に２．３倍の蛋白質の保持に成功した。また、これらの脱離速度の差異は糖脂質のＣＭＣと一致しており、さらに脱離速度を抑制するには糖鎖の水酸基をアセチル基に変換して疎水部とし、ＣＭＣを小さくする方法が考えられる。
次に、蛋白質分子量と脱離速度との関係を図７に示した。図７中の記号はそれぞれ、（□）２１（２Ｃ１６）、（■）２２（２Ｃ１８）、（○）２３（４Ｃ１６）、（●）２４（４Ｃ１８）を表す。２本鎖では、蛋白質分子量３１倍（１４ｋＤａ〜４４０ｋＤａ）の増加に対して脱離速度は１０．７倍（１．０％／ｈｒ〜１０．７％／ｈｒ）に促進された。他方、４本鎖では脱離速度は５．０倍（０．７％／ｈｒ〜３．９％／ｈｒ）であり、蛋白質分子量４４０ｋＤａまでは分子量が増大しても脱離速度はほとんど促進されなかった。これは、４本鎖では４４０ｋＤａまでは分子量の増大に伴い脱離速度の抑制効果が大きくなることを示している。しかし、４４０ｋＤａ以上では４本鎖でも脱離し易くなり、アルキル鎖数の違いによる影響は分子量の増大と共に小さくなるものと考察される。1. Synthesis of polyalkyl chain type glycolipid p-Toluenesulfonic acid monohydrate (4.56 g, 24 mmol) in benzene solution (100 mL) is refluxed at 85 ° C., and water is removed before the reaction using ginstark. did. Glutamic acid (2.96 g, 20 mmol) and hexadecyl alcohol (10.7 g, 44 mmol) or octadecyl alcohol (10.7 g, 44 mmol) were added to the reaction solution, and the mixture was refluxed at boiling point for 10 hours while removing generated water. As the reaction progressed, the suspension gradually dissolved and turned yellow and transparent. After completion of the reaction, the solvent was removed, and liquid separation was performed three times with a saturated aqueous solution of sodium carbonate / chloroform, followed by dehydration with magnesium sulfate and recrystallization at 4 ° C. to give diacylglutamic acid derivative 12 (compound 12 ) (83%) and 13 (Compound 13) (85%).
Analysis result of diacyl glutamic acid derivative 12:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.83 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 1737 (ν C═O , ester).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ ppm): 0.89 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (s, 52H, —CH 2 —CH 2 —); 1.62 (m, 4H) , —CO—O—C—CH 2 ); 1.84 (m, 1H, gluβ-CH 2 ); 2.08 (m, 1H, gluβ-CH 2 ); 2.45 (t, 2H, gluγ- CH 2); 3.45 (t, 1H, gluα-CH); 4.06,4.10 (t, 4H, -CO-O-CH 2)
MS (ESI) Calcd: 595.9; Found: 597.3 (MH) <+> .
Triethylamine (5.71 mL, 41 mmol) was added to a chloroform solution (10 mL) of both-end amine PEG (9.01 g, 41 mmol) and stirred at room temperature. A chloroform solution of Z chloride (6.98 g, 41 mmol) was slowly added dropwise (about 1 drop every 2 seconds) using a dropping funnel. The reaction proceeds rapidly with the dropwise addition, and the target of one-end protection appears in TLC (chloroform / methanol = 4/1, silica gel plate) (Rf = 0.42). As a by-product (Rf = 0.81). After completion of the reaction, the solvent was removed, and the by-product protected at both ends and TEA hydrochloride were removed by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol = 4/1), and the target compound 14 was purified. The compound was identified by IR, 1 H-NMR, and ESI-MS. The TEA salt is insoluble in benzene and ethyl acetate, and can be removed using this.
Analysis result of Compound 14:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.42 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 1713 (ν C═O , ester); 1623 (ν C═O , amide); 1528 (δ N—H , amide).
1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ ppm): 1.25 (br, 2H, NH 2 —C—); 1.80 (m, 2H, NH 2 —C—CH 2 —); 1.94 ( m, 2H, CONH-C- CH 2 -); 3.11 (m, 2H, NH 2 -CH 2 -); 3.30 (q, 2H, CONH-CH 2 -); 3.58 (t, 12H, —O—CH 2 —); 5.08 (s, 2H, C 6 H 5 —CH 2 —); 7.34 (t, 5H, C 6 H 5 —CH 2 —); 7.57 ( br, 1H, -CONH-)
MS (ESI) Calcd: 354.4; Found: 355.4 (MH) <+> .
Triethylamine (196 μL, 1.4 mmol) and maltose (507 mg, 1.4 mmol) were added to a DMF solution (5 mL) of compound 14 (500 mg, 1.4 mmol), and the mixture was stirred at 70 ° C. for 12 hours. As the reaction progressed, a target spot appeared (Rf = 0.09) by TLC (chloroform / methanol / water = 65/25/4, silica gel plate). After completion of the reaction, the solvent was removed, and the target compound 15 was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol / water = 65/25/4). The compound was identified by IR, 1 H-NMR, and ESI-MS.
Analysis result of compound 15:
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol / water (65/25/4) (volume / volume): R f : 0.18 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 1720 (ν C═O , ester); 1654 (ν C═O , amide); 1540 (δ N—H , amide).
1 H-NMR (D 2 O, 500 MHz, δ ppm): 1.71 (m, 2H, NH—C—CH 2 —); 1.84 (m, 2H, CONH—C—CH 2 —); 07 (m, 2 H, NH—CH 2 —); 3.15 (m, 2 H, CONH—CH 2 —); 3.21 (t, 1 H, maltose C-4); 3.31 (t, 1 H, maltose C) -4); 3.57 (t, 12H , -O-CH 2 -); 3.49-3.96 (m, 10H, maltoseC-2,3,5,6); 4.59 (d, 1H , maltoseC-1); 5.05 ( br, 1H, maltoseNH-C-C -); 5.16 (d, 1H, maltoseC-1, anomericH); 5.33 (d, 2H, C 6 H 5 - CH 2 -); 7.37 (t , 5H, C 6 H 5 -CH -); 8.39 (br, 1H , -CONH-).
MS (ESI) Calcd: 678.7; Found: 679.4 (MH) <+> .
Triethylamine (698 μL, 5.0 mmol) and epichlorohydrin (228 μL, 2.8 mmol) were added to a DMF solution (10 mL) of compound 15 (1.00 g, 1.4 mmol), and the mixture was stirred at 40 ° C. for 2 hours. . As the reaction progressed, a new spot (Rf = 0.19, 0.27) due to the introduction of an epoxy group appeared on TLC (chloroform / methanol / water = 65/25/4, silica gel plate). 16 was not isolated, and 12 (Glu2C16, 2.33 g, 3.9 mmol) was added by the subsequent reaction, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 18 hours to be bonded to an epoxy group. After completion of the reaction, DMF was removed and double-chain glycolipid 17 (Rf = 0.38, chloroform / methanol = 10/1, silica gel plate) by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol = 10/1), Four-chain glycolipid 19 (Rf = 0.50) was purified. The compound was identified by IR, 1 H-NMR, and ESI-MS. A glycolipid having 18 carbon atoms, double strand 18 (Rf = 0.40, chloroform / methanol = 10/1, silica gel plate), and four strands 20 (Rf = 0.51) were synthesized in the same manner.
In this reaction, an alkyl chain is introduced into the primary hydroxyl group at the 6-position utilizing the difference in the reactivity of the hydroxyl group. In the introduction of four alkyl chains, introduction was attempted using an ester bond, but the yield was low due to steric hindrance between alkyl glutamates, making isolation difficult. By using a more active epoxy group, it was possible to introduce and isolate four alkyl chains and to synthesize glycolipids 17 to 20 (compounds 17 to 20).
Analysis results of glycolipid 19 (4C16):
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (10/1) (volume / volume): R f : 0.50 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 1731 (ν C═O , ester); 1672 (ν C═O , amide); 1521 (δ N—H , amide).
1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz, δ ppm): 0.89 (t, 12 H, —CH 3 ); 1.28 (s, 104 H, —CH 2 —CH 2 —); 1.64 (m, 8H, —CO—O—C—CH 2 ); 1.74 (m, 4H, gluβ-CH 2 , NH—C—CH 2 —); 2.01 (m, 2H, CONH—C—CH 2 —) 2.14 (m, 2H, gluβ-CH 2 ); 2.29-2.35 (m, 8H, NH—CH 2 —C (OH) —C—O—, NH—C—C (OH ) —CH 2 —O—); 2.45 (m, 4H, gluγ-CH 2 ); 2.55 (m, 2H, NH—C—CH (OH) —C—O—); 3.11 ( m, 2H, NH—CH 2 —); 3.18 (m, 2H, CONH—CH 2 —); 3.49-3.74 (m, 12H, maltose) C-2,3,4,5,6); 3.51 (m , 14H, -O-CH 2 -, gluα-CH); 4.06 (t, 2H, maltoseC-1); 4.15 ( t, 4H, -CO-O- CH 2); 4.27 (t, 4H, -CO-O-CH 2); 5.05 (m, 2H, C 6 H 5 -CH 2 -); 7. 33 (t, 5H, C 6 H 5 -CH 2 -); 8.01 (br, 1H, -CONH-).
MS (ESI) Calcd: 1981.4; Found: 1981.4 (MH) + .
Pd black powder (20 mg) (or Pd / C powder) was added to an ethanol solution (3 mL) of compound 17 (20 mg, 10 nmol), and brought to room temperature under H 2 gas (generated by Zn / H 2 SO 4 ) ventilation. And stirred for 4 hours. As the reaction progressed, a ninhydrin positive spot, 21 (Rf = 0.09, chloroform / methanol = 10/1, silica gel plate) appeared on TLC. After completion of the reaction, the Pd powder was filtered off, the solvent was removed, and the target compound 21 was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol / water = 5/1). The compound was identified by IR, 1 H-NMR, and ESI-MS. Compound 21 (Rf = 0.12, chloroform / methanol = 10/1, silica gel plate), compound 22 (Rf = 0.03), and compound 24 (Rf = 0.03) were synthesized in the same manner.
Analysis result of Compound 23 (4C16):
Thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (10/1) (volume / volume): R f : 0.09 (monospot)).
Infrared absorption spectrum (cm −1 ): 1738 (ν C═O , ester).
1 H-NMR (CD 3 OD, 500 MHz, δ ppm): 0.89 (t, 12 H, —CH 3 ); 1.28 (s, 104 H, —CH 2 —CH 2 —); 1.61 (m, 8H, —CO—O—C—CH 2 ); 1.77 (m, 4H, gluβ-CH 2 , NH—C—CH 2 —); 1.92 (m, 2H, CONH—C—CH 2 —) 2.14 (m, 2H, gluβ-CH 2 ); 2.24-2.41 (m, 8H, NH—CH 2 —C (OH) —C—O—, NH—C—C (OH ) —CH 2 —O—); 2.44 (m, 4H, gluγ-CH 2 ); 2.68 (m, 2H, NH—C—CH (OH) —C—O—); 3.09 ( m, 2H, NH—CH 2 —); 3.15 (m, 2H, CONH—CH 2 —); 3.49-3.79 (m, 12H, maltose) C-2,3,4,5,6); 3.63 (m , 14H, -O-CH 2 -, gluα-CH); 4.06 (t, 2H, maltoseC-1); 4.15 ( t, 4H, -CO-O- CH 2); 4.28 (t, 4H, -CO-O-CH 2).
2. Determination of critical micelle concentration of multi-alkyl chain type glycolipid [Method]
Add 2 μL of DPH solution (30 μM, THF) to a dispersion of glycolipid (compounds 21-24) (pure water 2 mL, 1, 5, 10, 20, 30, 50, 100 μM) and shake at 37 ° C. for 2 hours. That ’s it. The glycolipid concentration at which the fluorescence intensity rapidly increased was determined as the critical micelle concentration (CMC) by fluorescence measurement (DPH, λex = 357 nm, λem = 430 nm) at 37 ° C.
[result]
The CMC of compound 21 was 20 μM, while that of compound 22 was 18 μM. By changing the alkyl chain length from C16 to C18, the CMC slightly decreased. On the other hand, the CMC of Compound 23 was 8.0 μM, and that of Compound 24 was 7.0 μM. A significant decrease in CMC was observed by increasing the number of alkyl chains from 2 to 4. From this, it was confirmed that increasing the number of alkyl chains is effective in increasing the hydrophobic interaction. The results are shown in FIG. The symbols in FIG. 5 represent (□) 21 (2C16), (■) 22 (2C18), (◯) 23 (4C16), (●) 24 (4C18), respectively.
3. Preparation of glycolipid-introduced liposome DPPC (600 mg), cholesterol (316 mg) or glycolipid (compound 21 (3.9 mg), compound 22 (4.1 mg), compound 23 (6.0 mg), compound 24 (6.4 mg) ) (DPPC / cholesterol = 1/1 (molar ratio), glycolipid = 0.20 mol%) was dissolved in 30 mL of chloroform and mixed. Chloroform was removed with an evaporator, vacuum-dried, and then hydrated and stirred in 50 mL of PBS for 12 hours ([Lipid] = 2.0 g / dL). After hydration, it was annealed at 45 ° C. for 4 hours, granulated with an extruder (3000 → 800 → 650 → 450 → 300 → 220 nm × 2), and the particle size was controlled. The outer aqueous phase was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 min × 3) and redispersed in PBS to prepare a glycolipid-containing liposome dispersion.
4). Quantitative determination of glycolipid on liposome surface 100 μL of fluorescamine (30 mg / acetone 450 μL) was added to a liposome dispersion (PBS 1 mL, [Lipid] = 0.15 g / dL) and stirred at room temperature for 30 minutes. Unreacted fluorescamine was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 min × 3), dissolved in chloroform / methanol = 2/1 (total amount 2 mL), and fluorescence measurement (λex = 390 nm, λem = 475 nm). ) To determine the amino group on the liposome surface (Table 4).
5. NH 2 group introduced to the liposome surface with the introduction crosslinker SPDP the protein to the liposome surface, and the NH 2 groups of the protein surface crosslinked by disulfide bonds, was coupled respectively five proteins to the liposome surface ( Table 5).
[Preparation of protein]
8 μL (1.5 eq) of SPDP (3.8 mg / Methanol 2 mL) was added to 2.0 g / dL (1 mL, PBS) of protein, and stirred at room temperature for 30 minutes. Then, 200 μL (5 eq) of FITC (6 mg / 1N NaOH 250 μL, PBS 750 μL) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 30 minutes. Unreacted SPDP and FITC were removed by gel column chromatography (Sephadex G25). 40 μL (20 mM) of DTT (15.4 mg / PBS 1 mL) was added, and after stirring for 30 minutes, unreacted DTT was removed by gel column chromatography (Sephadex G25).
[SPDP-binding liposome preparation]
450 μL of SPDP (8 mg / Methanol) was added to a glycolipid-introduced liposome dispersion (PBS 10 mL [Lipid] = 2.0 g / dL) and stirred at room temperature for 30 minutes. Unreacted SPDP was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 min × 3).
[Protein-bound liposome preparation]
1 mL of SPDP-introduced protein solution (0.4 g / dL) was added to SPDP-introduced liposome dispersion (PBS 4 mL ([Lipid] = 0.6 g / dL)) and stirred for 12 hours at 4 ° C. Centrifugation (10,000 rpm Unreacted proteins were removed from 5 min × 3), and 5 types of proteins were bound to the liposome surface.
[Quantification of protein binding amount]
20 μL (20 mM) of DTT (15.4 mg / PBS 1 mL) was added to the protein-bound liposome dispersion (PBS 1 mL [Lipid] = 0.8 g / dL), and the mixture was stirred at 37 ° C. for 4 hours. After centrifugation (10,000 rpm, 5 min), the supernatant (700 μL) was measured by fluorescence (FITC, λex = 490 nm, λem = 520 nm), and the amount of bound protein was determined from the calibration curve (Table 6).
6). Measurement of protein-binding glycolipid desorption rate Five prepared protein (FITC-labeled) -binding liposomes were shaken at pH 7.4 and 37 ° C., and the desorption behavior of protein-binding glycolipid was measured by fluorescence.
[experimental method]
A protein-bound liposome dispersion (PBS 10 mL, [Lipid] = 0.8 g / dL, stored at 4 ° C.) was shaken at 37 ° C. 5 minutes after the start, 1 mL of control (0 min) was collected, centrifuged (10,000 rpm, 5 min), and the supernatant (700 μL) fluorescence measurement (FITC, λex = 490 nm, λem = 520 nm), protein binding desorbed from the calibration curve Glycolipids were quantified. The change over time in the amount of desorbed protein was measured after 2, 4, 8, 12, and 24 hours by the same operation. The results are shown in FIG. In FIG. 6, (a) is α-Lactalbumin (Mw: 14.0 kD), (b) is r-HSA (Mw: 66.5 kD), (c) is Catalase (Mw: 232 kD), (d) is Ferritin. (Mw: 440 kD), (e) are the measurement results of Thyrogroburin (Mw: 669 kD), and the symbols in FIG. 6 are (□) 21 (2C16), (■) 22 (2C18), (◯) 23, respectively. (4C16), (●) 24 (4C18).
In the measurement result of Ferritin (Mw: 440 kDa), the desorption rate of compound 21 is 12% / hr, whereas in compound 22, the desorption rate is 11% / hr, and the desorption rate is changed to C18 by changing the alkyl chain length to C18. Slightly suppressed. On the other hand, the desorption rate of Compound 23 is 4.4% / hr, and that of Compound 24 is 3.5% / hr, which is 0.36 times and 0.32 times as compared with the 2C (double-stranded) group, respectively. The elimination rate was greatly suppressed by increasing the number of alkyl chains from 2 to 4, and the protein was successfully retained 2.3 times after 24 hours. Moreover, the difference in these desorption rates is consistent with the CMC of glycolipids, and in order to further suppress the desorption rate, there is a method in which the hydroxyl group of the sugar chain is converted to an acetyl group to form a hydrophobic part and the CMC is reduced. Conceivable.
Next, the relationship between the protein molecular weight and the desorption rate is shown in FIG. The symbols in FIG. 7 represent (□) 21 (2C16), (■) 22 (2C18), (◯) 23 (4C16), (●) 24 (4C18), respectively. In the double strand, the desorption rate was promoted to 10.7 times (1.0% / hr to 10.7% / hr) with respect to an increase in protein molecular weight of 31 times (14 kDa to 440 kDa). On the other hand, with four strands, the desorption rate is 5.0 times (0.7% / hr to 3.9% / hr), and the desorption rate is almost accelerated even when the molecular weight increases up to a protein molecular weight of 440 kDa. There wasn't. This indicates that the effect of suppressing the desorption rate increases with increasing molecular weight up to 440 kDa in the case of four strands. However, at 440 kDa or more, even four strands are easily detached, and the influence of the difference in the number of alkyl chains is considered to decrease with increasing molecular weight.

ｐＨ応答性脂質の合成
Ｚ−Ｌｙｓ（Ｈ）−ＯＢｚｌ・ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（１．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ（３８０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．３４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を３０ｍＬ蒸留ジクロロメタン中で４℃、６時間反応させ、アミノ結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム、および水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、淡黄色粘稠液体を得た（２．０１ｇ、収率９１％）。その後接触還元法にて脱保護し、カラム（シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝（８／１）（容量／容量））による精製を行って２５を淡黄色粘稠液体で得た（５９６ｍｇ、収率５０％）。２５（５９６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２５９ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ｎ−テトラデカノール（３００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）をベンゼン１００ｍＬ中で１０５℃、１２時間沸点還流しエステル結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム水溶液、および水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、メタノール再結晶による精製を行い白色固体２６（５５０ｍｇ、収率５８％）を得た。
化合物２６の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．５０（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；１．６（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−，−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ−ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．６（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；４．９（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）。
化合物２６（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（２０２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（４８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１３９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ蒸留クロロホルム中で１２時間反応させ、アミド結合を形成させた。飽和炭酸ナトリウム、及び水で分液を行い（クロロホルム相採取）、溶媒を減圧除去後、凍結乾燥し２７（８０ｍｇ、３０％）を得た。
化合物２７の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．２（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；５．１（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）；７．３（ｓ，１Ｈ，−Ｇｌｕ−ＣＯ−ＮＨ−）。
また、次のようにして、化合物２８及び２９を合成した。
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｇ−ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ（７６４ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（５１３ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、４℃で３０分間撹拌した後、Ｇｌｕ２Ｃ１６（１ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン溶液に滴下した。反応溶液を室温で５時間撹拌した後、反応液を濾過し、溶媒を減圧除去した。メタノールから４℃で再結晶して濾過後、乾燥してＧｌｕ２Ｃ１６に親水部としてアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン酸を結合させた化合物を白色固体として得た（１．１５ｇ）。この化合物をＴＦＡ １０ｍＬに溶解し、４℃で２時間撹拌した後、クロロホルムを加え、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、純水で２回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧除去した。ベンゼンに溶解後、凍結乾燥し化合物２８（０．８９ｇ）を白色粉末で得た。
化合物２９は、化合物２７の合成法と同様にし、ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄの代わりにｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄを用いた。
化合物２８の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．２４（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２６（ｍ，４６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−）２．２（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕβ−ＣＨ２−）；２．３２、２．４１（ｍ，４Ｈ，ｇｌｕγ−ＣＨ２−）；３．４（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−ＣＯＮ−）；４．０７、４．１２（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−）；４．５１（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−ＣＯ−Ｏ−）
化合物２９の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．７１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｍ，３８Ｈ，−ＣＨ２−，−Ｌｙｓ−β−γ−，ＣＨ２−）；２．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ−ＣＯ−）；３．２（ｔ，１Ｈ，−Ｌｙｓ−）；４．０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−，−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）；５．１（ｂ，１Ｈ，−Ｎ−Ｈ−Ｃ−Ｏ−）；７．３（ｓ，１Ｈ，−Ｇｌｕ−ＣＯ−ＮＨ−）
２．リポソームの調製
１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ、２９ｍｇ、３６ｍｍｏｌ）、コレステロール（１８ｍｇ、４８ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（２．１ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の混合脂質と、化合物２８（２６ｍｇ、３６ｍｍｏｌ）を５ｍＬ ｔ−ブチルアルコールに溶解させて混合した後、凍結乾燥を行った。乾燥後、脂質濃度が２ｗｔ％になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に室温で１２時間水和後、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法にて最終孔径０．２２μｍまで透過させた。超遠心分離にて外水相を洗浄後、リン脂質定量値から濃度を調整し、粒径が２５０ｎｍ程度のリポソームを調製した。
３．リポソームの分散安定度測定
調製したリポソームの安定度を、光散乱を用いた粒径測定より行った。その結果、化合物２８の膜含有量によってリポソームの粒径は変化しなかった（表７）。
４．リポソーム中での化合物２８の低ｐＨによる加水分解
調製したリポソーム（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝３／４／３／０．０３、モル比）を３７℃、ｐＨ４．５のＰＢＳに分散させ、２４時間後に分散液を凍結乾燥した。乾燥させた混合脂質粉末をクロロホルムに溶解し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）、検出：ヨウ素）にて検出した。検出結果は、図８に示した通りである。
化合物２８のＲｆ＝０．２１のスポットが消失し、新たにＲｆ＝０．０５付近にスポットが見られた。これは化合物２８がｐＨ４．５で加水分解してリゾ体を生成したことによるものと思われる。
５．リポソームの低ｐＨにおける内包分子の放出促進
調製したリポソーム（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝３／４／３／０．０３）のｐＨ応答性を検証するために、内包分子にカチオン性蛍光ＨＰＴＳ（ｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｅｎｅ−３，６，８−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を内包させた小胞体を調製し、蛍光色素の漏出を測定した。測定は、調製したリポソームをそれぞれのｐＨで３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝液に添加し、１０分後にｐＨ７．４に戻してから行った（λｅｘ：４１３ｎｍ，λｅｍ：５１２ｎｍ）。ＨＰＴＳは高濃度では消光しており、小胞体から漏出したＨＰＴＳが希釈によって蛍光を発する原理を利用して、膜の透過率（放出率）を以下の式１．１から算出した。
ｒｅｌｅａｓｅｄ％＝（Ｉｘ−Ｉ０）／（ＩＴ×１．１−Ｉ０） （１．１）
Ｉ０：ｔ＝０（ｈｒ）における蛍光強度
Ｉｘ：ｔ＝ｘ（ｈｒ）における蛍光強度
ＩＴ：１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００μＬ加えたときの蛍光強度
各ｐＨにおける１０分後の放出率を図９に示した。また、各ｐＨにおける経時的な内包分子の放出を測定した結果を図１０に示した。図１０中の記号はそれぞれ、（■）ｐＨ３．５、（△）ｐＨ４．５、（○）ｐＨ５．５、（◇）ｐＨ６．５、（□）ｐＨ７．３、（▲）ｐＨ１１における測定結果を表す。ｐＨ３．５で約２０％の内包蛍光分子が放出したが、ｐＨ６以上ではほとんど放出がされなかった。よって化合物２８を膜成分としたリポソームは、低ｐＨによって化合物２８が加水分解し、加水分解した化合物２８のリゾ体はより親水性が高いために小胞体から遊離することに伴って、二分子膜の分子充填状態が乱れて内包蛍光分子の放出速度が高まったものと考察される。
さらに、化合物２８および２９のそれぞれ１０ｍｏｌ％を膜成分としたリポソームを調製し、そのｐＨ応答性についても検証した。
リポソームの調製は、前記「２．リポソーム調製」と同様にして行い、（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／（２８または２９）／ＰＥＧ−ＤＰＥ＝５／５／１／０．０３、モル比）を得た。その特性は表７に示したとおりである。
内包分子の放出は、前記と同様の方法で蛍光強度を測定し、その測定結果をもとに上記式１．１から算出した。各ｐＨにおける１０分後の放出率を図１１に示した。
化合物２８または２９を膜成分（１０ｍｏｌ％）としたリポソームは、ｐＨ４において内包分子が急激に放出された。低ｐＨにより放出率が増加することから、分解性脂質（化合物２８または２９）の加水分解により、生じたリゾ体が遊離し、その際リポソーム二分子膜の分子充填状態が乱れ、内包分子の放出が促進されたと考えられる。Synthesis of pH-responsive lipids Z-Lys (H) -OBzlbenzoenesulfonate (1.5 g, 2.8 mmol), BOP reagent (1.5 g, 3.4 mmol), lauric acid (380 mg, 3.4 mmol), TEA ( 0.34 g, 3.4 mmol) was reacted in 30 mL distilled dichloromethane at 4 ° C. for 6 hours to form an amino bond. Liquid separation was carried out with saturated sodium carbonate and water (chloroform phase collection), and after removing the solvent under reduced pressure, a pale yellow viscous liquid was obtained (2.01 g, yield 91%). Thereafter, it was deprotected by a catalytic reduction method and purified by a column (silica gel, chloroform / methanol = (8/1) (volume / volume)) to obtain 25 as a pale yellow viscous liquid (596 mg, yield 50). %). 25 (596 mg, 1.1 mmol), p-toluenesulfonic acid monohydrate (259 mg, 1.4 mmol) and n-tetradecanol (300 mg, 1.4 mmol) in 100 mL of benzene at 105 ° C. for 12 hours at boiling point An ester bond was formed. Liquid separation was performed with a saturated aqueous sodium carbonate solution and water (collecting chloroform phase), and the solvent was removed under reduced pressure, followed by purification by methanol recrystallization to obtain white solid 26 (550 mg, yield 58%).
Analysis results of Compound 26:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (8/1) (volume / volume): R f : 0.50 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (m, 38H, —CH 2 —, —Lys-β-γ-, CH 2 -); 1.6 (m, 4H, -CO-O-CH 2 -, - NH-CO-C-CH 2 -); 2.2 (m, 2H, -CH 2 -N-CO-) ; 3.6 (t, 1H, -Lys -); 4.0 (t, 4H, -COO-CH 2 -, - N-CO-CH 2 -); 4.9 (b, 1H, -N- H-C-O-).
Compound 26 (200 mg, 0.38 mmol), BOP reagent (202 mg, 0.48 mmol), TEA (48 mg, 0.48 mmol) and Boc-Glu-O t Bu (139 mg, 0.46 mmol) in 12 mL of 20 mL distilled chloroform. The reaction was performed for a time to form an amide bond. Liquid separation was performed with saturated sodium carbonate and water (chloroform phase collection), and the solvent was removed under reduced pressure, followed by lyophilization to obtain 27 (80 mg, 30%).
Analysis result of compound 27:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (8/1) (volume / volume): R f : 0.71 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (m, 38H, —CH 2 —, —Lys-β-γ-, CH 2— ); 2.2 (m, 2H, —CH 2 —N—CO—); 3.2 (t, 1H, —Lys—); 4.0 (t, 4H, —COO—CH 2 —, -N-CO-CH 2 -) ; 5.1 (b, 1H, -N-H-CO -); 7.3 (s, 1H, -Glu-CO-NH-).
Compounds 28 and 29 were synthesized as follows.
Nt-Boc-L-glutamic acid-g-butyester (764 mg, 2.52 mmol) and DCC (513 mg, 2.52 mmol) were dissolved in dichloromethane and stirred at 4 ° C. for 30 minutes, and then Glu2C16 (1 g, 1.68 mmol) was added dropwise to the dissolved dichloromethane solution. After stirring the reaction solution at room temperature for 5 hours, the reaction solution was filtered and the solvent was removed under reduced pressure. After recrystallization from methanol at 4 ° C., filtration, and drying, a compound in which amino group and carboxyl group-protected glutamic acid was bound as a hydrophilic part to Glu2C16 was obtained as a white solid (1.15 g). This compound was dissolved in 10 mL of TFA, stirred at 4 ° C. for 2 hours, chloroform was added, and the mixture was washed twice with a saturated aqueous sodium carbonate solution and twice with pure water. The chloroform layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. After dissolving in benzene, lyophilization was performed to obtain Compound 28 (0.89 g) as a white powder.
For compound 29, myristic acid was used instead of lauric acid in the same manner as in the synthesis method of compound 27.
Analysis results of compound 28:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.24 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.26 (m, 46H, —CH 2 —CH 2 —); 1.61 (m , 4H, —CO—O—CH 2 —) 2.2 (m, 4H, gluβ-CH 2 —); 2.32, 2.41 (m, 4H, gluγ-CH 2 —); 3.4 ( m, 1H, —CH—CON—); 4.07, 4.12 (t, 4H, —CO—O—CH 2 —); 4.51 (m, 1H, —CH—CO—O—)
Analysis results of compound 29:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (8/1) (volume / volume): R f : 0.71 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ); 1.25 (m, 38H, —CH 2 —, —Lys-β-γ-, CH 2— ); 2.2 (m, 2H, —CH 2 —N—CO—); 3.2 (t, 1H, —Lys—); 4.0 (t, 4H, —COO—CH 2 —, -N-CO-CH 2 -) ; 5.1 (b, 1H, -N-H-CO -); 7.3 (s, 1H, -Glu-CO-NH-)
2. Preparation of liposomes Mixed lipid of 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 29 mg, 36 mmol), cholesterol (18 mg, 48 mmol), PEG-DSPE (2.1 mg, 0.036 mmol), and compound 28 (26 mg, 36 mmol) was dissolved in 5 mL t-butyl alcohol and mixed, and then lyophilized. After drying, the mixture was hydrated in phosphate buffered saline (PBS) at room temperature for 12 hours so that the lipid concentration was 2 wt%, and then permeated to a final pore size of 0.22 μm by the extrusion method. After washing the outer aqueous phase by ultracentrifugation, the concentration was adjusted from the phospholipid quantitative value to prepare liposomes having a particle size of about 250 nm.
3. Measurement of Liposome Dispersion Stability The stability of the prepared liposomes was measured by particle size measurement using light scattering. As a result, the particle size of the liposome did not change depending on the membrane content of compound 28 (Table 7).
4). Hydrolysis of Compound 28 at Low pH in Liposomes Prepared liposomes (DOPC / chol / ( 28 ) /PEG-DPE=3/4/3/0.03, molar ratio) at 37 ° C., pH 4.5 PBS After 24 hours, the dispersion was freeze-dried. The dried mixed lipid powder was dissolved in chloroform and detected by thin layer chromatography (silica gel plate, chloroform / methanol (8/1) (volume / volume), detection: iodine). The detection result is as shown in FIG.
The spot of Compound 28 with Rf = 0.21 disappeared, and a new spot was observed near Rf = 0.05. This is probably because Compound 28 was hydrolyzed at pH 4.5 to produce a lyso form.
5. In order to verify the pH responsiveness of the prepared liposome (DOPC / chol / ( 28 ) /PEG-DPE=3/4/3/0.03), the release of the encapsulated molecule at low pH of the liposome Endoplasmic reticulum encapsulating fluorescent fluorescent HPTS (l-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid) was prepared, and leakage of the fluorescent dye was measured. The measurement was performed after adding the prepared liposomes to a HEPES buffer solution at 37 ° C. at each pH and returning to pH 7.4 after 10 minutes (λ ex : 413 nm, λ em : 512 nm). HPTS is quenched at a high concentration, and the transmittance (release rate) of the membrane was calculated from the following formula 1.1 using the principle that HPTS leaked from the endoplasmic reticulum emits fluorescence by dilution.
released% = (I x -I 0 ) / (I T × 1.1-I 0) (1.1)
I 0 : fluorescence intensity at t = 0 (hr)
I x : fluorescence intensity at t = x (hr)
I T: the release rate after 10 minutes in the fluorescence intensity at each pH when adding 10% Triton-X300μL shown in FIG. Further, the results of measuring the release of the encapsulated molecules over time at each pH are shown in FIG. The symbols in FIG. 10 are the measurement results at (■) pH 3.5, (Δ) pH 4.5, (◯) pH 5.5, (◇) pH 6.5, (□) pH 7.3, (▲) pH 11, respectively. Represents. Approximately 20% of the encapsulated fluorescent molecules were released at pH 3.5, but were hardly released at pH 6 or higher. Therefore, the liposome using the compound 28 as a membrane component is hydrolyzed by a low pH, and the lyso form of the hydrolyzed compound 28 is more hydrophilic and thus released from the endoplasmic reticulum. It is thought that the release rate of the encapsulated fluorescent molecules was increased by disturbing the molecular packing state.
Furthermore, liposomes having 10 mol% each of compounds 28 and 29 as membrane components were prepared, and their pH responsiveness was also verified.
The liposome was prepared in the same manner as in “2. Liposome preparation” to obtain (DOPC / chol / (28 or 29) /PEG-DPE=5/5/1/0.03, molar ratio). The characteristics are as shown in Table 7.
The release of the encapsulated molecule was calculated from the above formula 1.1 based on the measurement result by measuring the fluorescence intensity by the same method as described above. The release rate after 10 minutes at each pH is shown in FIG.
In liposomes using Compound 28 or 29 as a membrane component (10 mol%), the encapsulated molecules were rapidly released at pH 4. Since the release rate increases at low pH, the resulting lyso form is liberated by hydrolysis of the degradable lipid (compound 28 or 29). At that time, the molecular packing state of the liposome bilayer is disturbed, and the inclusion molecules are released. Seems to have been promoted.

１．ジスルフィド脂質の合成
下記のスキームに従い、疎水部にジスルフィド基を有するジスルフィド脂質を合成した。
（Ａ）Ｎα，Ｎα’−ｄｉ−Ｂｏｃ−Ｌ−ｃｙｓｔｉｎｅ（（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ）２）（２．６４ｇ，６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４０ｍＬに溶解させ、ＴＥＡ（７ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）に溶解させたｈｅｘａｄｅｃｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ（１．５５ｇ，６ｍｍｏｌ）を滴下した。４０℃にて２時間反応させ、ジスルフィド結合を形成させた。溶媒除去後、ジエチルエーテルに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムにて分液を行い（ジエチルエーテル層回収）、溶媒を減圧除去後、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝９／１（容量／容量））による精製を行い、化合物３０を白色固体として得た（４３７ｍｇ，収率１６％）。
化合物３０の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１７（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，３Ｈ，−ＣＨ３），１．２３（ｂｒ，２６Ｈ，−ＣＨ２−），１．３８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１．５８（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．６９（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），２．９３，３．０６（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），４．１６（ｔ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｂ）化合物３０（３７２ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに溶解させ、ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ（１８８ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３３ｍＬ，０．８５ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬（４４２ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間反応させ、アミド結合を形成させた。反応終了後、クロロホルムに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムにより分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後、６０℃メタノールから再結晶を行い、化合物３１を白色粉末として得た（４２０ｍｇ，収率７７％）。
化合物３１の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．９０（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１．５９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６５（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．７１（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），３．０２−３．０４（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），３．２４（ｔ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−），４．３６（ｔ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｃ）化合物３１（４１５ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）をＴＦＡ２０ｍＬに溶解させ、４℃、１時間にてＢｏｃ基の脱保護を行った。反応終了後、炭酸水素飽和ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝３０／１（容量／容量））による精製を行い、化合物３２を白色粉末として得た（２５２ｍｇ，７１％）。
化合物３２の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６８（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．５０（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６７（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．７０（ｔ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−），３．２３（ｔ，２Ｈ−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），３．２９，３．３１（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−），３．６８（ｔ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｄ）化合物３２（２５０ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１５ｍｌに溶解させＤＩＥＡ（０．４５ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１４０ｍｇ，０，４６ｍｏｌ）、ＢＯＰ試薬をジクロロメタンと共に室温で１０時間反応させ、アミド結合を形成した。反応終了後、クロロホルムに溶解させ、飽和硫酸水素カリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、溶媒を減圧除去後６０℃メタノールから再結晶を行い、化合物３３を白色粉末として得た（３１７ｍｇ，収率８５％）。
化合物３３の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（９／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８４（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４４，１．４６（ｓ，１８Ｈ，Ｂｏｃ），１．５２（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．６６（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．８５，２．１７（ｄｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．３３（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ），２．７１（ｔ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−），３．０７（ｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−），３．２４（ｔ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），４．２５（ｔ，１Ｈ，Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−），４．６７（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
（Ｅ）化合物３３（１１７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）にＴＦＡ１０ｍＬを加え、４℃にて２．５時間、Ｂｏｃ基、ＯｔＢｕ基の脱保護を行った。反応終了後、飽和炭酸ナトリウム、水にて分液を行い（クロロホルム層回収）、カラム（中性シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝９／１（容量／容量））により精製を行い化合物３４（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６）を白色粉末として得た（６５ｍｇ収率６９％）。
化合物３４の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１１（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：
０．８０（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．１８（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−），１．４２（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．５８（ｍ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．０２，２．０９（ｄｄ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．４０（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ），２．６２（ｔ，２Ｈ，−Ｓ−ＣＨ２−），２．８５，３．１５（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｓ−），３．０１（ｔ，２Ｈ，ＣＯＮＨ−ＣＨ２−），３．５２（ｔ，１Ｈ，ＮＨ２−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−），４．５０（ｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−）
２．リポソームの調製
ＤＰＰＣ、コレステロール、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１６をモル比３／４／３／０．０３にて混合させ、クロロホルムに若干のメタノールを添加して、最終濃度５ｗｔ％となるように溶解させた。溶解後、溶媒の除去、真空乾燥を経て混合脂質粉末を得た。カルセイン内包リポソームを得るため、混合脂質を１００ｍＭカルセイン水溶液（２ｗｔ％）にて水和（ｒ．ｔ．，６ｈｒ）後、高圧押出し法（フィルター孔径；５０００ｎｍ，６５０ｎｍ，４５０ｎｍ，２２０ｎｍ×２回）にて粒径制御（φ＝２６８±１０３ｎｍ）した。未内包カルセインはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラムにて除去した。
濃度を変化（終濃度１０，５，１．０，０．５，０．１ｍＭ）させた還元剤（システインまたはグルタチオン）水溶液に、調製したカルセイン内包リポソーム（総脂質濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１時間振とう後、ｐＨ７．４にて蛍光測定（λｅｘ：４８８ｎｍ，λｅｍ：５１７ｎｍ）を行い、カルセイン放出率を以下の式から算出した。
カルセイン放出率「％」＝（Ｆｘ−Ｆ０）／（Ｆ１００−Ｆ０）×１００
Ｆｘ＝還元後における蛍光強度
Ｆ１００＝リポソームの完全可溶化後の蛍光強度
Ｆ０＝ＰＢＳにて３７℃１ｈｒ静置後の蛍光強度
結果を図１２に示す。図１２中、−○−はシステイン添加系を示し、−□−はグルタチオン添加系を示す。図１２に示されるとおり、膜成分としてＧｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６を混合したリポソームは還元剤の存在によりカルセインの放出が促進された。特にシステイン添加系では各濃度にて高い放出率を示したのに対し、グルタチオン添加系では濃度依存的に放出率は増大した。これは、システインの方が小胞体膜に対して高い膜透過性と還元速度定数を持つため、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６のリゾ化がより早く進行し、リゾ体のリポソーム膜からの脱離に伴って内包カルセインが放出されたものと考えられる。またカルセインの放出率が７０％に留まったのは、すべてのＧｌｕ−Ｃｙｓ−ＳＣ１６がリゾ体となって脱離した後安定な小胞体としてカルセインを保持したためと思われる。1. Synthesis of Disulfide Lipid According to the following scheme, a disulfide lipid having a disulfide group in the hydrophobic part was synthesized.
(A) Nα, Nα′-di-Boc-L-cystein ((Boc-Cys-OH) 2 ) (2.64 g, 6 mmol) was dissolved in 40 mL of DMF and hexadecymercaptan (7 mL, 50 mmol) was dissolved in TEA (7 mL, 50 mmol). 1.55 g, 6 mmol) was added dropwise. The mixture was reacted at 40 ° C. for 2 hours to form a disulfide bond. After removal of the solvent, the residue is dissolved in diethyl ether and separated with saturated potassium hydrogen sulfate, saturated sodium hydrogen carbonate, and sodium chloride (diethyl ether layer recovery). After removing the solvent under reduced pressure, the column (neutral silica gel, chloroform / methanol) = 9/1 (volume / volume)) to obtain compound 30 as a white solid (437 mg, yield 16%).
Analysis result of compound 30:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (9/1) (volume / volume): R f : 0.17 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.85 (t, 3H, —CH 3 ), 1.23 (br, 26H, —CH 2 —), 1.38 (s, 9H, Boc), 1.58 (m, 2H, S—CH 2 —CH 2 —), 2.69 (t, 2H, S—CH 2 —), 2.93, 3.06 (dd, 1H, NH— CH (COOH) -CH 2 -) , 4.16 (t, 1H, NH-CH (COOH) -)
(B) Compound 30 (372 mg, 0.78 mmol) was dissolved in 20 mL of dichloromethane, hexadecylamine (188 mg, 0.78 mmol), DIEA (0.33 mL, 0.85 mmol), and BOP reagent (442 mg, 1 mmol) were added at room temperature. For 2 hours to form an amide bond. After completion of the reaction, the product was dissolved in chloroform and separated with saturated potassium hydrogen sulfate, saturated sodium hydrogen carbonate, and sodium chloride (chloroform layer recovery). After removing the solvent under reduced pressure, recrystallization from 60 ° C. methanol gave Compound 31. Obtained as a white powder (420 mg, 77% yield).
Analysis result of compound 31:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (9/1) (volume / volume): R f : 0.90 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ), 1.25 (br, 52H, —CH 2 —), 1.45 (s, 9H, boc), 1.59 (m, 2H , NH-CH 2 -CH 2 -), 1.65 (m, 2H, S-CH 2 -CH 2 -), 2.71 (t, 2H, S-CH 2 -), 3.02-3.04 (dd, 1H, NH-CH (COOH) -CH 2 -), 3.24 (t, 2H, NH-CH 2 -), 4.36 (t, 1H , NH-CH (COOH)-)
(C) Compound 31 (415 mg, 0.59 mmol) was dissolved in 20 mL of TFA, and the Boc group was deprotected at 4 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, liquid separation was performed with saturated sodium bicarbonate and water (chloroform layer recovery), and the solvent was removed under reduced pressure, followed by purification with a column (neutral silica gel, chloroform / methanol = 30/1 (volume / volume)). As a result, compound 32 was obtained as a white powder (252 mg, 71%).
Analysis results for Compound 32:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (9/1) (volume / volume): R f : 0.68 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.88 (t, 6H, —CH 3 ), 1.25 (br, 52H, —CH 2 —), 1.50 (m, 2H, NH-CH 2 -CH 2 -) , 1.67 (m, 2H, S-CH 2 -CH 2 -), 2.70 (t, 2H, S-CH 2 -), 3.23 (t, 2H -CONH-CH 2 -), 3.29,3.31 (dd, 1H, NH-CH (COOH) -CH 2 -), 3.68 (t, 2H, NH-CH (COOH) -)
(D) Compound 32 (250 mg, 0.42 mmol) was dissolved in 15 ml of dichloromethane, DIEA (0.45 mL, 1.2 mmol), Boc-Glu (OtBu) -OH (140 mg, 0, 46 mol), and BOP reagent together with dichloromethane The reaction was carried out at room temperature for 10 hours to form an amide bond. After completion of the reaction, the product was dissolved in chloroform and separated with saturated potassium hydrogen sulfate, saturated sodium hydrogen carbonate, and water (chloroform layer recovery). After removing the solvent under reduced pressure, recrystallization from methanol at 60 ° C. gave compound 33 as white Obtained as a powder (317 mg, 85% yield).
Analysis result of Compound 33:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (9/1) (volume / volume): R f : 0.84 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.87 (t, 6H, —CH 3 ), 1.25 (br, 52H, —CH 2 —), 1.44, 1.46 ( s, 18H, Boc), 1.52 (m, 2H, NH-CH 2 -CH 2 -), 1.66 (m, 2H, S-CH 2 -CH 2 -), 1.85,2.17 (Dd, 1H, —NH—CH (COOH) —CH 2 —CH 2 —), 2.33 (t, 2H, —CH 2 —COO), 2.71 (t, 2H, —S—CH 2 — ), 3.07 (d, 2H, -CH 2 -S -), 3.24 (t, 2H, CONH-CH 2 -), 4.25 (t, 1H, Boc-NH-CH (COOH) - ), 4.67 (t, 1H, -NH-CH (COOH)-)
(E) 10 mL of TFA was added to compound 33 (117 mg, 0.13 mmol), and the Boc group and the O t Bu group were deprotected at 4 ° C. for 2.5 hours. After completion of the reaction, the mixture was separated with saturated sodium carbonate and water (chloroform layer recovery), and purified with a column (neutral silica gel, chloroform / methanol = 9/1 (volume / volume)) to obtain compound 34 (Glu-Cys). -SC 16) as a white powder (69% 65 mg yield).
Analysis results for Compound 34:
Thin layer chromatography (silica gel, chloroform / methanol (4/1) (volume / volume): R f : 0.11 (monospot))
1H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz, δ (ppm)):
0.80 (t, 6H, -CH 3 ), 1.18 (br, 52H, -CH 2 -), 1.42 (m, 2H, NH-CH 2 -CH 2 -), 1.58 (m , 2H, S-CH 2 -CH 2 -), 2.02,2.09 (dd, 1H, -NH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -), 2.40 (t, 2H, - CH 2 -COO), 2.62 (t , 2H, -S-CH 2 -), 2.85,3.15 (dd, 2H, -CH 2 -S -), 3.01 (t, 2H, CONH—CH 2 —), 3.52 (t, 1H, NH 2 —CH (COOH) —), 4.50 (t, 1H, —NH—CH (COOH) —)
2. Preparation of Liposomes DPPC, cholesterol, by mixing Glu-Cys-SC 16, PEG -Glu2C16 a molar ratio of 3/4/3 / 0.03, with the addition of some methanol in chloroform, to a final concentration of 5 wt% So that it was dissolved. After dissolution, the mixed lipid powder was obtained through solvent removal and vacuum drying. In order to obtain calcein-encapsulating liposomes, the mixed lipid was hydrated (r.t., 6 hr) with a 100 mM aqueous solution of calcein (2 wt%) and then subjected to high-pressure extrusion (filter pore size: 5000 nm, 650 nm, 450 nm, 220 nm × 2 times). The particle size was controlled (φ = 268 ± 103 nm). Unencapsulated calcein was removed with a Sephadex G-75 column.
Add the prepared calcein-encapsulated liposomes (total lipid concentration: 1 mg / ml) to a reducing agent (cysteine or glutathione) aqueous solution whose concentration is changed (final concentration: 10, 5, 1.0, 0.5, 0.1 mM) Then, after shaking for 1 hour, fluorescence measurement (λ ex : 488 nm, λ em : 517 nm) was performed at pH 7.4, and calcein release rate was calculated from the following equation.
Calcein release rate “%” = (F x −F 0 ) / (F 100 −F 0 ) × 100
F x = fluorescence intensity after reduction
F 100 = fluorescence intensity after complete solubilization of liposomes
The fluorescence intensity after standing at 37 ° C. for 1 hr in F 0 = PBS is shown in FIG. In FIG. 12, -o- indicates a cysteine addition system, and-□-indicates a glutathione addition system. As shown in FIG. 12, in the liposome mixed with Glu-Cys-SC 16 as a membrane component, the release of calcein was promoted by the presence of the reducing agent. In particular, the cysteine addition system showed a high release rate at each concentration, whereas the glutathione addition system increased the release rate in a concentration-dependent manner. This is because cysteine has a higher membrane permeability and a reduction rate constant for the endoplasmic reticulum membrane, so that the lysolysis of Glu-Cys-SC 16 proceeds faster and the lyso body is detached from the liposome membrane. Along with this, it is considered that the encapsulated calcein was released. The reason why the release rate of calcein stayed at 70% seems to be that calcein was retained as a stable vesicle after all the Glu-Cys-SC 16 had been released as a lyso form.

１．マルトペンタオーゼ（ＭＰ）結合脂質の合成
下記のスキームに従い、マルトペンタオーゼ結合脂質を合成した。
ＭＰ（０．２５ｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）、Ｇｌｕ２Ｃ１８（０．０９８ｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、７０℃で１２時間攪拌した。ニンヒドリンによりＧｌｕ２Ｃ１８のアミンのスポットが消失したことを確認し、反応溶液をアセトンでの再沈殿と水洗いにより精製し、ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を白色粉末で得た（０．１４５ｇ、収率６６％）。
ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の分析結果：
ＴＬＣ（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール／水（３／４／１）（ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ：０．８５（モノスポット）．ＩＲ（ｃｍ−１）：１７３６［νＣ＝Ｏ（ａｍｉｄｅ）］；１６７６［νＣ＝Ｏ（ａｍｉｄｅ）］；１５５３［δＮ−Ｈ（ａｍｉｄｅ）］．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８（６Ｈ）；１．２（６０Ｈ）；１．５（４Ｈ）；２．０（２Ｈ）；２．３（２Ｈ）；２．８〜５．６（５６Ｈ）；７．９（１Ｈ）．
２．ＭＰ担持リポソームとコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との複合体形成現象
ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８をＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｃｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ＝５／５／１（モル比）に対し、０，０．３，１，２，１０ｍｏｌ％導入し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１ｍＭ Ｃａ２＋，ｐＨ７．４）にて調製したリポソーム溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、Ｄ−グルコースやＤ−マンノースの認識部位を４つ持つレクチンＣｏｎＡ水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、水溶液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を測定した。図１３は、種々のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率のリポソーム分散液に対してＣｏｎＡ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。図１３中、○はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率０モル％、●はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率０．３モル％、△はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率１モル％、▲はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率２モル％、□はＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率１０モル％における経時変化を示す。ＣｏｎＡ水溶液の添加直後から溶液濁度の上昇が観察された。これは添加したＣｏｎＡがリポソーム表面の糖鎖末端Ｄ−グルコースを認識し、リポソー厶間を架橋したためと考えられる。また、図１４は、図１３の０．５分後、５分後の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）変化をＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入率に対してプロットしたグラフである。図１４中、○は０．５分後の濁度変化を示し、●は５分後の濁度変化を示す。リポソーム表面のＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入量に依存して濁度の上昇が観察され、導入量２ｍｏｌ％以上で急激な濁度上昇が見られた。
３．ＭＰ担持リポソームとコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との複合体解離現象
図１５は、２ｍｏｌ％ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８導入リポソームに１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）を導入した系を、希釈倍率を変化させて希釈し、この系にＣｏｎＡ溶液を添加した際の分散液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）の経時変化を示したグラフである。ＭＰ−Ｇｌｕ２Ｃ１８をＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ＝５／５／１（モル比）に対し２ｍｏｌ％導入し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（１ｍＭ Ｃａ２＋，ｐＨ７．４）にて調製したリポソーム分散液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、ＣｏｎＡ水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加すると、図１５中の○で示すように、水溶液の濁度（Ｏ．Ｐ．値、λ＝６００ｎｍ）が増加した。ここに５ｍＭのＥＤＴＡを添加すると、図１５中の●で示したとおり、濁度上昇が完全に抑制されることがわかった。このことから、ＣｏｎＡの糖認識にＣａ２＋が必須であることが示唆された。
次に、１ｍｏｌ％ＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）溶液をリポソーム分散液の外水相に添加してリポソーム表面をＰＥＧ鎖にて修飾すると、図１５中の△に示したとおり、濁度上昇が抑制されたことから、ＰＥＧ鎖の排除体積効果によりリポソーム表面ＭＰの認識障害が起き、機能が阻害された。この系を希釈率２０倍（図１５中の▲）、１００倍（図１５中の□）、２００倍（図１５中の▽）に希釈してから超遠心分離にてリポソームを分離し、再分散した溶液にＣｏｎＡを同様に添加したところ、希釈倍率の上昇に伴う濁度の上昇が観察された。これはマスキングしたリポソーム表面からのＰＥＧ脂質の脱離により、ＭＰに対するＣｏｎＡの認識能が発現したためと考えられる。1. Synthesis of Maltopentaose (MP) Binding Lipid Maltopentaose binding lipid was synthesized according to the following scheme.
MP (0.25 g, 0.302 mmol) and Glu2C18 (0.098 g, 0.151 mmol) were dissolved in DMF (2 mL) and stirred at 70 ° C. for 12 hours. After confirming that the amine spot of Glu2C18 had disappeared by ninhydrin, the reaction solution was purified by reprecipitation with acetone and washing with water to obtain MP-Glu2C18 as a white powder (0.145 g, yield 66%).
Analysis results of MP-Glu2C18:
TLC (silica gel plate, chloroform / methanol / water (3/4/1) (v / v / v): Rf: 0.85 (monospot). IR (cm −1 ): 1736 [ν C═O (amide) )]; 1676 [ν C═O (amide)]; 1553 [δ N—H (amide)].
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz, δ (ppm)): 0.8 (6H); 1.2 (60H); 1.5 (4H); 2.0 (2H); 2.3 ( 2H); 2.8-5.6 (56H); 7.9 (1H).
2. Complex formation phenomenon of MP-supporting liposome and concanavalin A (ConA) MP-Glu2C18 was introduced at 0, 0.3, 1, 2, 10 mol% with respect to DPPC / cholsterol / DHSG = 5/5/1 (molar ratio). A lectin ConA aqueous solution (0.5 mg / ml) having four recognition sites for D-glucose and D-mannose in a liposome solution (0.5 mg / ml) prepared with 10 mM HEPES buffer (1 mM Ca 2+ , pH 7.4). / Ml), and the change with time of the turbidity (OP value, λ = 600 nm) of the aqueous solution was measured. FIG. 13 is a graph showing changes over time in the turbidity (OP value, λ = 600 nm) of a dispersion when a ConA solution is added to liposome dispersions having various MP-Glu2C18 introduction rates. . In FIG. 13, ◯ is MP-Glu2C18 introduction rate 0 mol%, ● is MP-Glu2C18 introduction rate 0.3 mol%, Δ is MP-Glu2C18 introduction rate 1 mol%, and ▲ is MP-Glu2C18 introduction rate 2 mol%, □ shows the change over time at an introduction rate of 10 mol% of MP-Glu2C18. An increase in solution turbidity was observed immediately after the addition of the ConA aqueous solution. This is presumably because the added ConA recognized the sugar chain terminal D-glucose on the liposome surface and cross-linked between the liposomes. FIG. 14 is a graph in which the change in turbidity (OP value, λ = 600 nm) after 0.5 minutes and 5 minutes in FIG. 13 is plotted against the MP-Glu2C18 introduction rate. In FIG. 14, ◯ indicates turbidity change after 0.5 minutes, and ● indicates turbidity change after 5 minutes. An increase in turbidity was observed depending on the amount of MP-Glu2C18 introduced on the liposome surface, and a rapid increase in turbidity was observed at an introduction amount of 2 mol% or more.
3. Complex dissociation phenomenon between MP-supported liposome and concanavalin A (ConA) FIG. 15 shows the dilution of a system in which 1 mol% PEG lipid (P125-2C14) is introduced into 2 mol% MP-Glu2C18-introduced liposome by changing the dilution ratio. FIG. 5 is a graph showing a change with time of turbidity (OP value, λ = 600 nm) of a dispersion when a ConA solution is added to the system. 2 mol% of MP-Glu2C18 was introduced with respect to DPPC / cholesterol / DHSG = 5/5/1 (molar ratio), and a liposome dispersion (0.5 mg / mL) prepared with 10 mM HEPES buffer (1 mM Ca 2+ , pH 7.4). When ConA aqueous solution (0.5 mg / ml) was added to (ml), the turbidity (OP value, λ = 600 nm) of the aqueous solution increased as indicated by the circles in FIG. It was found that when 5 mM EDTA was added thereto, the increase in turbidity was completely suppressed as indicated by ● in FIG. This suggests that Ca 2+ is essential for ConA sugar recognition.
Next, when a 1 mol% PEG lipid (P125-2C14) solution was added to the outer aqueous phase of the liposome dispersion and the liposome surface was modified with PEG chains, the increase in turbidity was suppressed as indicated by Δ in FIG. Therefore, the recognition effect of the liposome surface MP occurred due to the excluded volume effect of the PEG chain, and the function was inhibited. This system was diluted to a dilution ratio of 20 times (▲ in Fig. 15), 100 times (□ in Fig. 15), 200 times (倍 in Fig. 15), and then the liposomes were separated by ultracentrifugation. When Con A was added to the dispersed solution in the same manner, an increase in turbidity with an increase in dilution rate was observed. This is presumably because ConA recognition ability for MP was expressed by detachment of PEG lipid from the masked liposome surface.

１．Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅの調製
１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ，５ｍｇ，６．９μｍｏｌ）をクロロホルム／メタノール混合溶媒（８／１（ｖ／ｖ））に溶解後、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（１０．４μｍｏｌ）添加し攪拌させた（ｒ．ｔ．，１０ｍｉｎ）。さらに、Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ（ＥＭＣＳ，２１．３ｍｇ，６９μｍｏｌ）を添加し攪拌させた（ｒ．ｔ．，１時間）。１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ，２５３．２ｍｇ，３５０μｍｏｌ）、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１０６．５ｍｇ，２８０μｍｏｌ）、ＤＨＳＧ（４８ｍｇ，６９μｍｏｌ）を溶解させ、薄膜乾燥を経て、真空乾燥にて溶媒を除去した。純水１５ｍＬで水和・攪拌後、押出法にて粒径制御し（φ．０．８，０．６，０．４５，０．２２μｍ）、遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて未反応ＥＭＣＳや副生成物を除去、マレイミド基導入リン脂質小胞体（ＭＡＬ−ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た（４ｗｔ％，６ｍＬ）。Ｎ末端にあらかじめシステインを導入したドデカペプチド（Ｈ１２，１００ｍＭ，１００μＬ）をＭＡＬ−ｖｅｓｉｃｌｃに添加し、振とうさせた（ｒ．ｔ．，１２時間）。遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて未結合Ｈ１２を除去し、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅを得た。
小胞体表面のＨ１２結合量は，未結合Ｈ１２をＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＰＷＸＬｃｏｌｕｍｎ，７．８ｍｍ ｏ．ｄ．ｘ ３００ｍｍ ｈ，１ｍＬ／ｍｉｎ，３６％（ｖ／ｖ）アセトニトリル，０．１％（ｖ／ｖ）トリフフルオロ酢酸）にて定量し、逆算した。
２．ＰＥＧ導入Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ（ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ）の調製
Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ分散液（１７ｍＭ，５ｍＬ）にＰＥＧ脂質（Ｐ１２５−２Ｃ１４）水溶液（１７．０μＭ，１５．８ｍＬ）を混合後３７℃にて２時間撹拌した。さらに超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）にて未導入ＰＥＧ脂質を除去後、ＰＥＧ脂質導入小胞体（ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た。
３．Ｈ１２−Ｖの活性化血小板への特異的結合並びにＰＥＧ鎖修飾による結合抑制（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
［方法］
洗浄ヒト血小板（１．０×１０５／μＬ，５０μＬ）にＤｉＯＣ１８標識した検体（ｖｅｓｉｃｌｅ、ＰＥＧ−ｖｅｓｉｃｌｅ、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ、ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ、ｆ．ｃ．［ｌｉｐｉｄ］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、トロンビン（ｆ．ｃ．３Ｕ／ｍＬ）にて血小板を活性化させ，３７℃にて１０分間振とうし、ホルムアルデヒド（ｆ．ｃ．１％（ｖ／ｖ））にて固定した。血小板分画の蛍光陽性率から、血小板へのＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅの結合率を観察した。
［結果］
結果を図１６に示した。ＤｉＯＣ１８標識Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ存在下、トロンビン刺激させた活性化血小板の蛍光陽性率をフローサイトメトリーにて測定したところ、８５．６％であり、Ｈ１２−Ｖは活性化血小板へ結合することを確認した。また、トロンビン未刺激時（２．１％）、ＰＡＣ−１（活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するＨ１２の結合を阻害する抗体）存在下（３．１％）では結合は抑制され、ｖｅｓｉｃｌｅ存在下（２．３％）も同様であった。従って、Ｈ１２−ｖｅｓｉｃｌｅは活性化血小板と特異的に結合することが明らかとなった。
ＰＥＧを後導入させたＰＥＧ（Ｈ１２）−Ｖで同様の実験を行ったところ、活性化血小板への結合率は、３．４％へ減少した。これは、ＰＥＧの排除体積効果により、Ｈ１２の機能が阻害されたためと考えられる。
４．ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅのＰＥＧ脂質の脱離に伴う活性化血小板への結合（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
［方法］
ＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ分散液をＰＢＳにて０、６、３００倍に希釈し、振とうさせた（ｒ．ｔ．，１時間）。遠心分離（１００，０００ｇ，３０ｍｉｎ）にて濃縮し、希釈倍率を変えた３種類のＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ（［ｌｉｐｉｄ］＝３ｍｇ／ｍＬ）を得た。
洗浄血小板（１．０×１０５／μＬ，５０μＬ）にＤｉＯＣ１８標識したそれぞれのＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅ（ｆ．ｃ．［ｌｉｐｉｄ］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、トロンビン（ｆ．ｃ．３Ｕ／ｍＬ）にて血小板を活性化させ，３７℃にて１０分間振とう、ホルムアルデヒド（ｆ．ｃ．１％（ｖ／ｖ））にて固定した。ポジティブコントロール群はＰＥＧ未導入のＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅ添加時とし、ネガティブコントロール群はｖｅｓｉｃｌｅとした。血小板分画の蛍光陽性率から、血小板へのＰＥＧ（Ｈ１２）ｖｅｓｉｃｌｅの結合率を観察した。結果を図１７に示した。
［結果］
ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ（図１７ではＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅ）の活性化血小板への結合率は１１．０％であった。ＰＥＧ（Ｈ１２）−ｖｅｓｉｃｌｅの希釈倍率の増大に伴い結合率は増大し、３００倍希釈後にはＨ１２−ｖｅｓｉｃｌｅのそれとほぼ同等であった。このことから、希釈によるＰＥＧ脂質の脱離が促進され、Ｈ１２の機能が発現したと考えられる。1. Preparation of H12-vesicle After dissolving 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DSPE, 5 mg, 6.9 μmol) in a chloroform / methanol mixed solvent (8/1 (v / v)), triethylamine (10 .4 μmol) was added and stirred (rt, 10 min). Further, N- (ε-maleimidocaproyl) succinimide ester (EMCS, 21.3 mg, 69 μmol) was added and stirred (rt, 1 hour). 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC, 253.2 mg, 350 μmol), cholesterol (106.5 mg, 280 μmol), DHSG (48 mg, 69 μmol) are dissolved and dried in a vacuum. The solvent was removed. After hydration and stirring with 15 mL of pure water, the particle size is controlled by extrusion (φ. 0.8, 0.6, 0.45, 0.22 μm), and not centrifuged by centrifugation (100,000 g, 30 min). Reaction EMCS and by-products were removed, and maleimide group-introduced phospholipid vesicles (MAL-vesicle) were obtained (4 wt%, 6 mL). A dodecapeptide (H12, 100 mM, 100 μL) into which cysteine had been introduced in advance at the N-terminus was added to MAL-vesiclc and shaken (rt, 12 hours). Unbound H12 was removed by centrifugation (100,000 g, 30 min) to obtain H12-vesicle.
The amount of H12 binding on the surface of the endoplasmic reticulum was determined by HPLC using unbound H12 (TSK-GEL G3000PW XL column, 7.8 mm odx 300 mm h, 1 mL / min, 36% (v / v) acetonitrile, 0.1% (V / v) trifluoroacetic acid) and back-calculated.
2. Preparation of PEG-introduced H12-vesicle (PEG (H12) vesicle) An aqueous solution of PEG lipid (P125-2C14) (17.0 μM, 15.8 mL) was mixed with H12-vesicle dispersion (17 mM, 5 mL), and then at 37 ° C. Stir for hours. Furthermore, after removing unintroduced PEG lipids by ultracentrifugation (33,000 rpm, 30 min), PEG lipid-introduced vesicles (PEG (H12) vesicle) were obtained.
3. Specific binding of H12-V to activated platelets and binding inhibition by PEG chain modification (flow cytometry)
[Method]
DiOC 18- labeled specimen (vesicle, PEG-vesicle, H12-vesicle, PEG (H12) -vesicle, fc [lipid] = 0.5 mg on washed human platelets (1.0 × 10 5 / μL, 50 μL) / ML), thrombin (fc 3 U / mL) to activate platelets, shake at 37 ° C. for 10 minutes, and formaldehyde (fc 1% (v / v)) Fixed. From the fluorescence positive rate of the platelet fraction, the binding rate of H12-vesicle to platelets was observed.
[result]
The results are shown in FIG. When the fluorescence positive rate of thrombin-stimulated activated platelets was measured by flow cytometry in the presence of DiOC 18- labeled H12-vesicle, it was found to be 85.6%, confirming that H12-V bound to activated platelets. did. When thrombin is not stimulated (2.1%), binding is suppressed in the presence of PAC-1 (an antibody that inhibits H12 binding to GPIIb / IIIa on activated platelets) (3.1%), and vesicles are present. The same was true for the bottom (2.3%). Therefore, it was revealed that H12-vesicle specifically binds to activated platelets.
When a similar experiment was performed with PEG (H12) -V into which PEG was introduced afterwards, the binding rate to activated platelets decreased to 3.4%. This is considered because the function of H12 was inhibited by the excluded volume effect of PEG.
4). Binding of PEG (H12) vesicles to activated platelets upon detachment of PEG lipids (flow cytometry)
[Method]
The PEG (H12) vesicle dispersion was diluted 0, 6, and 300 times with PBS and shaken (rt, 1 hour). Concentration was performed by centrifugation (100,000 g, 30 min) to obtain three types of PEG (H12) vesicles ([lipid] = 3 mg / mL) with different dilution ratios.
Washed platelets (1.0 × 10 5 / μL, 50 μL) were mixed with DiOC 18- labeled PEG (H12) vesicle (fc [lipid] = 0.5 mg / mL) and thrombin (fc). (3 U / mL), platelets were activated, shaken at 37 ° C. for 10 minutes, and fixed with formaldehyde (fc 1% (v / v)). The positive control group was set at the time of addition of H12-vesicle without PEG introduction, and the negative control group was set at vesicle. From the fluorescence positive rate of the platelet fraction, the binding rate of PEG (H12) vesicle to platelets was observed. The results are shown in FIG.
[result]
The binding rate of PEG (H12) -vesicle (PEG (H12) -vesicle in FIG. 17) to activated platelets was 11.0%. The binding rate increased with an increase in the dilution ratio of PEG (H12) -vesicle, and was almost equivalent to that of H12-vesicle after 300-fold dilution. From this, it is considered that the detachment of PEG lipid by dilution was promoted and the function of H12 was expressed.

本発明の薬物運搬体は、外部環境の変化によって薬物動態を制御することができるので、各種疾患の予防・治療用の製剤として極めて有用である。   Since the drug carrier of the present invention can control the pharmacokinetics according to changes in the external environment, it is extremely useful as a preparation for the prevention and treatment of various diseases.

Claims (10)

薬物が担持されている分子集合体を含み、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体であって、遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）
で表わされ、
式中、結合部位Ａは親水部と薬物とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部を結合する部位であり、親水部は、ポリエチレングリコールであり、−（結合部位Ｂ）−（疎水部）で表わされる部分は、下記式［I］、［II］又は［III］：
で表されるものである、薬物運搬体。In vivo pharmacokinetics are controlled by the release of some amphiphilic molecules that comprise the drug-supported molecular assembly from the molecular assembly due to changes in the external environment. A drug carrier that releases amphiphilic molecules,
(Drug)-(Binding site A)-(Hydrophilic portion)-(Binding site B)-(Hydrophobic portion)
Represented by
Wherein the binding site A is a portion for coupling the hydrophilic moiety and a drug binding site B is a site which binds a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, the hydrophilic portion is a polyethylene glycol, - (binding site B )-(Hydrophobic part) is represented by the following formula [I], [II] or [III]:
A drug carrier which is represented by 薬物が担持されている分子集合体を含み、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体であって、遊離する両親媒性分子が、
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）
または
（薬物）−（結合部位Ａ）−（親水部）−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−（親水部）−（結合部位Ａ）−（薬物）
で表わされ、
式中、結合部位Ａは薬物と親水部とを結合する部位であり、結合部位Ｂは親水部と疎水部を結合する部位であり、親水部は、ポリエチレングリコールであり、−（結合部位Ｂ）−（疎水部）−（結合部位Ｂ）−で表わされる部分は、下記式［IV］：
で表わされるものである、薬物運搬体。In vivo pharmacokinetics are controlled by the release of some amphiphilic molecules that comprise the drug-supported molecular assembly from the molecular assembly due to changes in the external environment. A drug carrier that releases amphiphilic molecules,
(Drug)-(binding site A)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion)
Or (drug)-(binding site A)-(hydrophilic portion)-(binding site B)-(hydrophobic portion)-(binding site B)-(hydrophilic portion)-(binding site A)-(drug)
Represented by
Wherein the binding site A is a site which binds the drug and a hydrophilic portion, the binding site B is a site which binds a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, the hydrophilic portion is a polyethylene glycol, - (binding site B )-(Hydrophobic part)-(binding site B)-represents a moiety represented by the following formula [IV]:
A drug carrier which is represented by 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、この分子集合体の分散液の希釈によるものである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The drug carrier according to any one of claims 1 and 2, wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to dilution of a dispersion of the molecular assembly. 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、温度変化によるものである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The drug carrier according to any one of claims 1 to 3, wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to a temperature change. 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、プロトン、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも１種の濃度変化によるものである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The release of amphiphilic molecules from the molecular assembly is due to a change in concentration of at least one selected from the group consisting of protons, alkali metal ions and alkaline earth metal ions. The drug carrier according to claim 1. 分子集合体からの両親媒性分子の遊離がアミド結合の加水分解によるものである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The drug carrier according to any one of claims 1 to 5, wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is caused by hydrolysis of an amide bond. 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、ジスルフィド結合の還元によるものである、請求項２に記載の薬物運搬体。The drug carrier according to claim 2 , wherein the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to reduction of a disulfide bond. 両親媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によって、分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The drug retained in the molecular assembly is released by partial or total destruction of the molecular assembly structure accompanying the release of the amphiphilic molecule, according to any one of claims 1 to 7. The drug carrier described. 分子集合体が小胞体構造を有するものである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の薬物運搬体。  The drug carrier according to any one of claims 1 to 8, wherein the molecular assembly has an endoplasmic reticulum structure. 両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部または全体的な破壊によって、小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである、請求項９に記載の薬物運搬体。  The drug carrier according to claim 9, wherein the drug retained in the aqueous phase of the endoplasmic reticulum is released by partial or total destruction of the endoplasmic reticulum structure accompanying the release of the amphiphilic molecule.
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