JP5036761B2 - 神経疾患の治療及び/又は予防のためのオステオポンチンの使用 - Google Patents
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Description
本発明は概して、神経疾患及び障害の分野である。これは、神経保護、神経の髄鞘形成及びミエリン産生細胞の形成又は再生に関する。特に、これは、脱髄疾患及び神経変性疾患、ニューロパシー、外傷性神経損傷、脳卒中及び先天性代謝障害に起因した神経疾患に関する。より詳細に述べると、本発明は、神経疾患の治療及び/又は予防用の医薬品製造のための、オステオポンチン、又はオステオポンチン活性アゴニストの使用に関する。
神経の髄鞘形成は、中枢神経系(CNS)及び末梢神経系(PNS)の区画の形成及び機能において本質的過程である。軸索の周りのミエリン鞘は、神経に沿った電気インパルスの適切な伝導に必要である。ミエリン喪失は、多くの疾患を引き起こし、とりわけCNSに影響する多発性硬化症(MS)、ギラン・バレー症候群、CIDPなどがある(Abramsky及びOvadia、1997;Trojaborg、1998;Hartungら、1998参照)。様々な病因論の一方で、例えば感染性病原体又は自己免疫攻撃などの、脱髄疾患が全て、神経機能の喪失を引き起こし、かつ麻痺及び死亡につながることがある。本治療的物質は、MSにおける炎症攻撃を軽減しかつ疾患進行を遅らせるが、髄鞘再形成及び神経機能の回復につながる療法を開発する必要がある(Abramsky及びOvadia、1997;Pohlauら、1998)。
HTLV-随伴ミエロパシーは、ヒトT細胞白血病ウイルスによる感染に随伴した進行が遅い脊髄疾患であり、これは、両足の痙性の衰弱を特徴としている。
ミトコンドリア:MNGIE症候群、ミオパシー及び外眼筋麻痺、ニューロパシー、胃腸の脳障害、NARP症候群、ニューロパシー、運動失調、網膜炎、色素変性症。
感染症:クロイツフェルト・ヤコブ病、ジフテリア、HIV:随伴したCIDP、ライ:らい腫;軸索-脱髄混合;コロニー化したシュワン細胞、変種クロイツフェルト・ヤコブ病。
更なる詳細は、下記のインターネット上のサイトにおいて観ることができる:http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html。
脱髄は、活性化されたマクロファージ及び小グリア細胞によるミエリンへの攻撃に加え、Fas-リガンドシグナル伝達及び補体-又は抗体-媒介した細胞傷害性から始まる髄鞘形成している細胞への障害により引き起こされる。従って脱髄は、ミエリン鞘への直接攻撃に加え、ミエリンを産生しかつ維持する細胞の除去の両方を通じて生じる。
各クラスのIFNは、いくつかの異なる種類を含む。IFN-β及びIFN-γは各々、単独の遺伝子産物である。個々の種類の間の差異は、主にグリコシル化の変動に起因するように見える。
・活性化、増殖及び抑制の細胞機能のような、T-細胞機能の調節;
・サイトカイン産生の変調:前炎症サイトカインのダウンレギュレーション及び阻害性の抗-炎症サイトカインのアップレギュレーション;
・BBB(血液-脳関門)を介したCNSへのT-細胞の移動及び浸潤の調節。
本発明は、オステオポンチンが、希突起膠細胞分化時及び小脳発生時に、ディファレンシャルに発現されるという知見を基にしている。更に、in vitroにおける希突起膠細胞におけるオステオポンチンcDNAの発現は、これらの細胞の分化型の表現型につながることがわかっている。オステオポンチンの発現時に、希突起膠細胞は、分化し髄鞘形成している細胞の表現型に似た表現型を示す。これらのin vitro知見に加え、オステオポンチン、及び特にオステオポンチン及びインターフェロンの組合せは、多発性硬化症の確立されたモデルにおいて有益な作用を有することが示されている。末梢ニューロパシーの実験モデルにおいて、オステオポンチンは、神経活性に対する突出した有益な作用を有し、かつ再生の割合を有意に低下し、かつ脱髄の程度を増大した。
外傷性神経損傷は、PNS又はCNSに関連することができ、先の「発明の背景」に説明されたような対麻痺を含む、脳又は脊髄の外傷であることができる。
パーキンソン病は、振戦並びに歩行、運動及び共調の困難を含む、脳の障害である。本疾患は、筋肉運動を制御する脳の一部に対する障害に関連しており、これは振戦麻痺(paralysis agitans又はshaking palsy)とも称される。
ハンチントン病は、遺伝性の常染色体優性の神経疾患である。
(a)配列番号:1を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号:1のアミノ酸1から168又は170を含んで成るポリペプチド;
(c)配列番号:1のアミノ酸1から16及び170から314を含んで成るポリペプチド;
(d)配列番号:1のアミノ酸170から314を含んで成るポリペプチド;
(e)配列番号:2のポリペプチド;
(f)配列番号:3のポリペプチド;
(g)アミノ酸配列が、(a)から(f)の配列の少なくともひとつと、少なくとも40%又は50%又は60%又は70%又は80%又は90%の同一性を有する、(a)から(f)のムテイン;
(h)(a)から(f)のいずれかをコードしている天然のDNA配列の相補体に、中等度にストリンジェントな条件又は高度にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするDNA配列によりコードされた、(a)から(f)のいずれかのムテイン;
(i)アミノ酸配列の何らかの変化が、(a)から(f)のアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、(a)から(f)のいずれかのムテイン;
(j)(a)から(f)のいずれかの塩又はアイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分又は循環式に順番を入れ替えた誘導体。
用語「誘導体」は、ひとつのアミノ酸を、20種の通常生じる天然のアミノ酸の別のものと交換しないそれらの誘導体のみを含むことが意図されている。
(a)配列番号:1を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号:1のアミノ酸1から168又は170を含んで成るポリペプチド;
(c)配列番号:1のアミノ酸1から16及び170から314を含んで成るポリペプチド;
(d)配列番号:1のアミノ酸170から314を含んで成るポリペプチド;
(e)配列番号:2を含んで成るポリペプチド;
(f)配列番号:3を含んで成るポリペプチド;
(g)アミノ酸配列が、(a)から(f)の配列の少なくともひとつと、少なくとも40%又は50%又は60%又は70%又は80%又は90%の同一性を有する、(a)から(f)のいずれかのムテイン;
(h)(a)から(f)のいずれかをコードしている天然のDNA配列の相補体に、中等度にストリンジェントな条件又は高度にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするDNA配列によりコードされた、(a)から(f)のいずれかのムテイン;
(i)アミノ酸配列の何らかの変化が、(a)から(f)のアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、(a)から(f)のいずれかのムテイン;
(j)(a)から(f)のいずれかのアイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分又は循環式に順番を入れ替えた誘導体。
「治療的有効量」は、投与される場合に、オステオポンチンが、神経疾患に対し有益な作用を発揮するようなものである。個体へ単回又は反復用量として投与される用量は、オステオポンチンの薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴(性別、年齢、体重、健康状態、大きさ)、症状の程度、併用療法、治療頻度及び望ましい作用を含む、様々な要因に応じて変動するであろう。
本発明に従い好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、更に本発明にとって好ましい。
毎日の用量は、通常望ましい結果を得るのに有効な分割量又は徐放型で与えられる。2回目又は引き続きの投与は、個体に投与された初回又は前回用量と同じ、より少ない又はより多い用量で行うことができる。2回目又は引き続きの投与は、疾患の途中又は発症前に投与することができる。
公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法又は従来の方法に関する参考文献は、本発明の局面、説明又は態様は、関連する技術分野において明らかにされ、示されるか又は示唆されていることをいかなる方法においても承認するものではない。
方法
In vitroモデルシステム
Oli-neu細胞株は、t-neu癌遺伝子、構成的活性チロシンキナーゼをコードしている複製-欠損レトロウイルスによる、希突起グリア細胞前駆体の不死化により確立されており;この細胞株は、培養培地において1mMジブチリル-cAMPの存在下で分化が誘導されることが示された(Jungら、1995)。これは、単離された細胞型としての希突起膠細胞の研究の可能性を提供した。
多発性硬化症のin vivo及びin vitroモデルの広範な実験が存在する。In vivoモデルのほとんどは、MS、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の古典的動物モデルに関連している。このモデルには多くの変種が存在し、これは、マウス、ラット及び霊長類システムを含む、広範な哺乳類生物において使用するために適合されている(Petryらにより検証、2000)。加えて、MSの脳炎誘発性Theilerマウスウイルスモデルのような、動物モデルにおけるMSの提唱されたウイルス成分を「模倣する」ための方法が作成されている(Dal Cantoら、1995)。
最も周知でありかつ広範に使用されている髄鞘再形成モデルのひとつは、マウスにおける髄鞘再形成のためのキュプリゾンモデルである。これは、希突起膠細胞に対し選択的に毒性があることが示されている銅キレート剤である有機化合物キュプリゾンの経口投与に関連している(Morellら、1998)。
脱髄及び髄鞘再形成は、キュプリゾン処理したマウスの脳梁において生じる。これらの病態は、抗-CNPase抗体又はMBP抗体による染色により可視化することができる。ミエリンは、ルクソールファストブルー-過ヨウ素酸シッフ(LFB-PAS)により染色される。髄鞘再形成している希突起膠細胞前駆体は、PDGFα受容体又はNG2に対する抗体を使用し、可視化することができる。
その後のキュプリゾン投与計画の中止は、回復を誘導する環境を生じ、その結果キュプリゾン摂餌中止後6週間で、このマウスは脳梁に広範囲の髄鞘再形成を示す。従って、キュプリゾンモデルは、脱髄及び髄鞘再形成の局面を研究するための完全なin vivoパラダイムを提供する。その利点は、CNS組織へのT-細胞浸潤が存在しないこと、髄鞘形成過程のより専門的研究が可能であること、更には結果の再現性があることを含む(Hiremathら、1998)。
第1群:通常の粉末固形餌を摂取させた対照群;
第2群:0.2%キュプリゾンを含有する粉末餌を3週間摂取(Cup3w);
第3群:0.2%キュプリゾンを含有する粉末餌を5週間摂取(Cup5w);
第4群:0.2%キュプリゾンを含有する粉末餌を5週間摂取後、通常の粉末餌で1週間の回復期間(1wR);
第5群:0.2%キュプリゾンを含有する粉末餌を5週間摂取後、通常の粉末餌で3週間の回復期間(3wR);
第6群:0.2%キュプリゾンを含有する粉末餌を5週間摂取後、通常の粉末餌で6週間の回復期間(6wR)。
ホルマリンを、ホルムアルデヒド1容量(Fluka社、36% p.a.)、及び滅菌PBSの1容量を滅菌水8容量で希釈することにより調製した。蠕動ポンプに装填し、及び20G、1-1/5針を装着したシリコンチューブを、PBS 10mlで満たした。次にこのチューブを、気泡形成を防ぐように注意しながら、ホルマリン40mlを連続充填した。
50%エタノール中30分
70%エタノール中60分
70%エタノール中60分
80%エタノール中60分
80%エタノール中90分
96%エタノール中30分
96%エタノール中90分
96%エタノール中120分
100%キシレン中30分
100%キシレン中60分
パラフィン(Histosec、Merck 11609)中60分間のインキュベーションを4回;最終工程で包埋。
Oli-neu:マウスの希突起膠細胞の細胞株(Oii-neu)細胞を、遠心により濃縮し、かつSato培地中に再浮遊した(Trotterら、1989)。細胞を、75mLフラスコ中で37℃及び5%CO2の管理条件下で培養した。細胞培養培地に直接添加した1mM dbcAMPにより、分化を行なわせた。Trizol法を用いてRNAを抽出した(下記参照)。
総RNAを、Tri-ZOL(登録商標)抽出プロトコール(Life Technologies AG社、Basel、スイス)を用い、Oli-neu細胞、キュプリゾン-処理したマウス脳切片及び異なる発育段階の出生後マウスの全脳から単離した。ポリ(A)+ RNAを、Qiagen OLIGOTEX(商標)カラム(QIAGEN社、28159 Stanford Avenue, Valencia, CA 91355、米国)を用い、総RNA試料から調製した。
マイクロアレイ実験は、Incyte Genomics (Incyte Genomics社、3160 Porter Drive, Palo Alto, CA 94304, 米国)において行った。DGE分析は、Incyte社のMouse GEM(商標)1遺伝子発現マイクロアレイを用いて行った(http:/www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml)。
2種の蛍光強度からコンピュータ処理した比は、分析した2個の細胞試料中の相対遺伝子発現レベルの定量的測定値を提供した。各遺伝子に割当てられた比は、標準化された発現レベルを基にコンピュータ処理した。標準化因子は、第二の試料の総発現(P2)を、第一の試料の総発現(P1)で除算することにより、コンピュータ処理した。次にこの因子を、P2の各遺伝子の発現レベルに当てはめた。一旦この標準化工程が適用されたならば、これらの遺伝子比は、下記規則に従いコンピュータ処理した:
ディファレンシャルなオステオポンチン発現の分析に使用したモデル
表IVは、前述の、mRNAの抽出、及びチップハイブリダイゼーション(DGE分析)に使用したモデルを示す。
陽性対照として、最初に、ミエリン-特異的遺伝子のディファレンシャルな調節をDGEを用いて示すことができるかどうかを試験した。
チップ上において、オステオポンチンは、3w (+2.2)及び5w (+2.8)キュプリゾンでアップレギュレーションされた。
方法
cDNA鋳型作成
TaqMan(登録商標)分析のためのcDNA鋳型は、総RNA試料から、TaqMan(登録商標)逆転写試薬(P/N N808-0234)を使用する逆-転写(RT)により作成した。全てのRT反応は、以下を含有する100-μl容量で行った:RNase-非含有H2O中に、TaqMan RT緩衝液10μl、25mM MgCl2溶液(5.5mM)22μl、デオキシNTP混合物(500μMの各dNTP)20μl、ランダムヘキサマー(2.5μM)5μl、RNaseインヒビター(0.4U/μl)2μl、MultiScribe転写酵素(1.25U/μl)2.5μl、及びRNA試料(合計1μg)38.5μl。反応は、Eppendorf MasterCycler中で、25℃で10分間(インキュベーション工程)、48℃で30分間(逆転写)、及び95℃で5分間(失活工程)行った。全ての合成されたcDNAは、20μl容量において-20℃で貯蔵した。
全ての確認された遺伝子及びGAPDH(ハウスキーピング対照)のためのSYBR GreenリアルタイムPCR用フォワード及びリバースプライマーは、公開された配列に従い、PE BiosystemのPrimer Express(商標)ソフトウェアを用いてデザインし、かつInteractivaから0.02μM濃度で並べた(Interactiva:The Virtual Laboratory、Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm)。この特異性及び最適なプライマー濃度は、各プライマーセットについて試験した。可能性のあるゲノムDNA夾雑は、RT酵素非存在下で逆転写反応が施された陰性対照cDNA試料についてPCR反応を行うことによりモニタリングした。非-特異的増幅が存在しない場合は、3.5%MetaPhorゲル又はプレキャストNuSieve(登録商標)4%ゲル上の、アガロースゲル電気泳動により、PCR産物を分析することにより確認した。
SYBR GreenリアルタイムPCRは、5μl/ウェルのRT-産物(0.5ng総RNA)、25μl/ウェルのSYBR Green PCRマスターミックス(Applied Biosystems社、CA、米国)で、AmpEraseウラシルN-グリコシラーゼ(UNG)(0.5U/ウェル)及び20μlのプライマー(300nM)で行った。PCRは、50℃で2分間(先のTaqMan試行で作成されたPCR産物へ組込まれたウラシルを除去することにより、可能性のあるキャリーオーバーを除去するために、AmpErase UNGインキュベーション)、95℃で10分間(AmpliTaq Gold活性化)で行った。次に試料を、95℃で15秒、60℃で1分間、ABI PRISM(登録商標)7700配列決定システム上で40サイクル試行した。その結果逆転写されたcDNA試料が増幅され、かつそれらのCT(閾値サイクル)値を決定した。全てのCT値を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して標準化した。可能である場合は、試料を2つ組又は3つ組で試行し、結果の再現性を判断した。全ての確認された遺伝子及びGAPDHについての単独の特異的DNAバンドが、電気泳動分析により観察された。
SYBR Green PCRマスターミックスを使用するリアルタイム検出の原理は、SYBR Green色素が二本鎖DNAに結合することにより発生した蛍光の増強を測定することによる、PCR産物の直接的検出を基礎としている。これは、PCR増殖曲線を基にした遺伝子-特異的増幅産物の相対的に増加した定量をもたらす。
SYBR Green-dsDNA複合体蛍光シグナルは、鋳型DNAを含まない受動的参照又は陰性対照反応に対して標準化する。標準化は、受動的参照の放出強度による、実験的反応におけるSYBR Green-dsDNA複合体の放出強度の除算により行った。これは、この反応に対するRn(標準化したレポーター)比を生じる:
・Rn +=鋳型DNAを含む全ての成分を含む反応のRn値
・Rn -=未反応の試料(鋳型DNAなし)のRn値
・ΔRn=(Rn +)-(Rn -)
ここで、Rn +=(SYBR Green-dsDNA複合体の放出強度)/鋳型を伴うPCR(受動的参照の放出強度)
Rn -=(SYBR Green-dsDNA複合体の放出強度)/鋳型なし(受動的参照の放出強度)
ΔRnは、特異的反応のためのPCR条件の所定のセットにより発生したシグナルの大きさを表わしている。サイクル閾値パラメータは、遺伝子-特異的産物の増幅の相対増加の測定値を構成しており、これは実験的cDNA集団における特異的転写産物の相対的豊富さを示している。これは、ΔRnの統計学的有意性の増加が最初に検出されるサイクル点として固定される。この閾値は、調節可能な因子により積算された、初期サイクルのためのRnの平均標準偏差として定義した。このサイクル閾値パラメータは、ディファレンシャルな遺伝子発現の定量のために使用した。特異値は、バックグラウンド蛍光強度を上回る増加が検出された点又はサイクルを基にした各遺伝子-特異的増殖曲線について計算した。
リアルタイム定量逆転写酵素(RT)-PCR(TaqMan)は、遺伝子発現の変化を確認しかつ推定するための感度のよいかつ信頼できる方法を提供する。TaqMan配列検出装置(ABI PRISM(登録商標)7700配列決定システム(Applied Biosystems社、Foster City、CA))は、核酸配列のハイスループット定量のシステムを提供するために、PCR-ベースのアッセイを、ハードウェア/ソフトウェア計測器と統合していた。これは、特異的PCR産物の増加量のサイクル毎の検出を可能にするために、サーマルサイクリング、蛍光検出、及びアプリケーションに特有のソフトウェアを組合せている。
方法
ブロット調製
特異的遺伝子のために、発現の組織特異性を、マウスの多組織ノーザンブロットを用いてアッセイした(Clontech Labs.、1020 East Meadow Circle. Palo Alto, CA)。これらは、成体マウスの異なる組織に由来した、1レーン当り2μgのポリ(A)+ RNAを含んだ。個別のブロットは、in vitro及びin vivoの両状況におけるディファレンシャルな遺伝子発現の分析のために調製した。3週間、5週間のキュプリゾン処理並びに回復過程の1、3及び6-週間の時点(最大6週間)のマウス脳から単離したRNAを、ブロットの1セットで用いた。異なる出生後日数段階からの全脳RNAを、第二のセットに用いた。最後に、一連のRNAの時間経過を、培養物中で増殖しかつ異なる時間ジブチリル-cAMP処理したOli-neu細胞から調製した。このRNAを用い、第三のブロットセットを調製した。最大検出効率を確認しかつハイブリダイゼーション後の均等でないストリッピングに起因した結果の変動を最小化するために、新規ブロットを、各遺伝子-特異的プローブで使用した。全てのブロットは2回ハイブリダイズし、最初には関心のある遺伝子に対するプローブにより、その後RNA負荷の変動を制御するために、ストリッピング後に、マウスのグリセルアルデヒド-3-リン酸(mGAPDH)に対するプローブでハイブリダイズした。
放射性32P-標識したプローブを、関心のある遺伝子に対応するcDNAクローン(長さ〜500>800bp)のゲル-精製した制限断片を用いて調製した。DNA断片は、HighPrime(商標)標識システム(Roche Diagnostics AG社、Industriestrase7, 6343 Rotkreuz, スイス)を用い、32P-dCTPで、比放射能>109cpm/mlに無作為に標識した。取込まれなかった32P-dCTPは、プローブ混合物の、Sephadex(登録商標)G-25媒体(DNA等級の0.15%Kathon(登録商標)CG/ICP Biocide(登録商標)を含有する蒸留水)を含有するPharmacia NAP(商標)-5カラムを通る重力ベースの溶離により除去した。
プローブハイブリダイゼーションを、ExpressHyb(商標)(Clontech Labs社、1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA)を製造業者の規格に従い用いて行った。ブロットは、ハイブリダイゼーション後、オートラジオグラフィーカセット内、-80℃で、Hyperfilm(商標)MP(Amersham Pharmacia Biotech, 英国)に曝した。曝露後のプローブのストリッピングは、ブロットを、滅菌H2O/O.5%SDS溶液中、90〜100℃で10分間インキュベーションし、その後ブロットを10分間冷却することにより行った。ストリップした膜を、プラスチック中に密封し、かつ再プロービングに必要となるまで-20℃で貯蔵した。
ノーザンブロット分析は、大規模でディファレンシャルな遺伝子発現試験において、二次的確認技術としてこれまで使用されてきた(Changら、2000)。その感度及び精度は、関心のある所定の遺伝子の発現の組織特異性のみではなく、実験条件と対照条件の間のディファレンシャルな調節の大きさの分析も可能にしている。このことは、それを、マイクロアレイ分析により得られたDGE結果を確認する信頼できる方法にしている。同じくノーザンブロットは、転写産物のサイズ及び関心のある遺伝子に相当する交互スプライシングアイソフォームの可能性に関する情報を提供する。
cAMP処理した希突起膠細胞(oli-neu)におけるオステオポンチン発現を、TaqMan分析により測定した。結果は、図4に示している。カラム1から4は、希突起膠細胞において得られた結果を示した。対照(値=1)と比べ、cAMP処理の6時間(1列)は、オステオポンチンmRNAのアップレギュレーションをもたらした。2日間のcAMP処理後(2列)、12倍のアップレギュレーションが測定された。6から10日間の延長された処理(3列、4列)は、より低レベルのオステオポンチンmRNAにつながった。キュプリゾンモデル(5列、6列)におけるオステオポンチンmRNAの調節の比較は、前脳のキュプリゾン処理3及び5週間のオステオポンチンアップレギュレーションは、cAMP処理の2日後の希突起膠細胞のアップレギュレーションと同等であることを示している。
方法
Oli-neu細胞を、リン酸カルシウム沈降法に従い、一過性にトランスフェクションした。簡単に述べると、トランスフェクションを行う前日に、指数増殖相のoli-neu細胞を、6-ウェルプレートへ播種(105/ml)した。250mM CaCl2溶液100μlを、5μgのプラスミドDNAと混合した。300mM Na2HPO4及びNaH2PO4(pH7.05)ストック溶液からリン酸を補充した、等量(100μl)の2x HEPES溶液(140mM NaCl、50mM HEPES、pH7.05)を、Ca/DNA溶液に添加した。正確に1分後、この混合物を、培養プレートにゆっくりと添加し、CO2培養器中、37℃で4時間インキュベーションした。この時点以後、培地を、新鮮な培地と交換し、かつ次に細胞を24〜72時間インキュベーションし、その後収集し、及びウェスタンブロット分析した。
pDEST12.2ベクター中の異なるマウスのオステオポンチン構築体(pDEST12.2オステオポンチン-EGFP、pDEST12.2-オステオポンチン-His6、pDEST1 2.2-オステオポンチン、図4から7参照、及び対照プラスミドとしてpCIE-EGFP)を、oli-neu細胞においてトランスフェクションした。このタンパク質を生成し、特異的な市販の抗体(R&D Systems社、AFBO8)により検出されるように、これらの細胞により分泌した。EGFPタグ付けした構築体は、より容易なトランスフェクションのモニタリングをもたらし、及びトランスフェクションの24時間後、細胞形態の特異的変化(希突起膠細胞の突起の増加)を、pCIEGFP対照と比較し検出し(示さず)、これはオステオポンチンは、マウス希突起膠細胞の細胞株oli-neuをより成熟した形態表現型へと駆動することを示している。オステオポンチンでトランスフェクションしたoli-neu細胞により示された形態は、髄鞘形成している希突起膠細胞の形態に非常に類似していた。
オステオポンチン免疫組織化学的試験を、キュプリゾンモデルにおいて脱髄及び髄鞘再形成期間の異なる時点で行った。強力なシグナルが、キュプリゾン処理の5週目に、脱髄された脳梁及び線条束において認められ、この時点は、脱髄部位への著しい小グリア細胞の動員に関連していた。活性化された小グリア細胞を可視化するために、連続切片のCD68染色を実行し、かつその同様の発現パターンは、オステオポンチンの小グリア細胞における発現を示唆している。
この実験では、t-neu癌遺伝子により不死化されたマウス初代希突起膠細胞(希突起グリア細胞)細胞株(「oli-neu」細胞株)を用いた。oli-neu細胞株の確立及び特性に加え培養条件は、Jungらの論文(1995)に記されている。
装置及びソフトウェア
Wallac Victor 2マルチラベルカウンター(励起530-560nm、放出590nm)
Graph Pad Prismソフトウェア
oli-neu細胞株(Eur J Neuro、7:125-1265 (1995))
Alamarブルー(BioSourceinti社、Camarillo, CA, 93012)
Sato培地の成分を下記に示す:
In vitroバイオアッセイにおける細胞培養法
Oli-neu細胞は、ポリ-L-リシン基質上で増殖している接着細胞である。細胞を、BioCoat(商標)ポリ-リシンでプレコートした96ウェルプレート上に播種した。これらの細胞を、2〜3x/週でスプリットした。スプリットするために、これらを最初にPBSで洗浄し、その後PBS+1mM EDTAで剥がした。細胞を、加湿した10%CO2培養器中で増殖した。
CO2培養器中で48時間経過後、Alamarブルーストック液10μlをウェルに添加し、更に2.5時間インキュベーションした。蛍光を、530〜560nmの励起波長及び590nmの放出波長でモニタリングした。プレートは、最大4時間及び相対蛍光単位1,000,000まで読みとった。
対照として、100ng/ml R3-IGF-1(陽性対照)、又は1mM dbcAMP(陰性対照)、又はインスリンを伴わない培地、又は100nM煮沸したOPNを用いた。実験試料は、組換えオステオポンチン1nM、10pM、0.1pM、0.01pM又は100nMであった。対照及び被験試料を、インスリンを除いたSato培地中最終容量50μlとなるよう、望ましい濃度に希釈し、かつウェルに添加した。Oli-neu細胞は、インスリン-非含有培地において24時間増殖し、その後対照又は被験試料で48時間処理した。インスリンを除いた培地において新たに24時間飢餓状態とし、剥離したoli-neu細胞は、PBS+1mM EDTAで増殖フラスコから収集した。これらの細胞を、300,000細胞/mlで調製し、かつ50μl/ウェルとなるよう添加した。その後、これらの細胞を、加湿したCO2培養器において37℃で48時間インキュベーションした。Alamarブルー10μlを添加し、かつこれらの細胞を培養器に2.5時間戻した。その後、各ウェルから70μlを、黒色の96ウェルプレートに移し、かつ直ぐに蛍光を測定した。
結果は図8から10に示した。
用量反応を、バキュロウイルス及びHEK細胞の両方で発現した、組換えオステオポンチンにより観察した。予想通り、煮沸によるこのタンパク質の変性は、生物学的活性を破壊した。バキュロウイルスで発現したオステオポンチン(BacOPN)及びHEK細胞で発現したOPN(HEK OPN)の添加は、細胞増殖の用量-依存型の増加(図8)を示し、そのIC50は、BacOPnについて3.7nM及びHekOPNについて0.05nMであった(図9)。加えて、OPNアイソフォームaのアミノ酸1から168に対応するN-末端OPN構築体(図2、N-term. OPN-a参照)は、昆虫細胞において発現した。精製したタンパク質は、完全長タンパク質との比較において、増殖アッセイで試験した。短縮型タンパク質は、活性があった(10nM, 100nM)。図10参照のこと。
カバースリップ上で増殖した混合皮質培養物を、DIV(in vitroの日数)5日目〜17日目の間の12日間、BacOPN(100nM)で処理した。In vitroの17日目に、培養物を固定し、かつ抗-MBP抗体で染色した。結果は、BacOPNカバースリップは、対照よりも、より高度に分枝したMBP陽性希突起膠細胞を有したことを示している(図11)。加えて、対照培養物(図11A)において、髄鞘形成している希突起膠細胞は認められなかったにもかかわらず、OPN処理した培養物(図B、C及びD)は、希突起膠細胞が豊富であり、これは軸索の周りを覆い、かつミエリンセグメント及び結節間部を形成していた(図11BからD)。セグメントクラスターの計数は、セグメントは対照においては認められないが、3種の異なるOPN処理した試料は、16、22及び18のセグメントクラスターを示したことを明らかにした。これらの結果は、オステオポンチンによる皮質混合細胞の処理は、希突起膠細胞の分化された表現型につながり、これは髄鞘形成している希突起膠細胞の特徴であることを示している。
MBPタンパク質増加、従ってOPN及びLIFで処理した混合皮質培養物における髄鞘形成をモニタリングするために、MBP ELISAを用いた。
材料の給源は、妊娠したNMR1雌マウスから、交尾後16日目に摘出した胚由来の胚性マウス脳組織であった。胚を、Lubetzkiらのプロトコールに従い切断し、皮質をトリプシン消化により溶解し、かつ切断した細胞(ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、小グリア細胞、及びニューロン前駆体を含む)を、各ウェルについて、ポリ-L-リシンでプレコートした96-ウェル培養プレートに、1x105細胞/ウェルで播種した(最初の容量50μl)。
処理は、組換えタンパク質(陽性対照、AMRAD Laboratories社から購入した組換えマウス白血病阻害因子(LIF)、濃度1μg/ml、100ng/ml、及び10ng/ml;マウスバキュロウイルス-作出した完全長オステオポンチン、濃度100nM、10nM、及び10pM)を用いて行った。全てのタンパク質を、in vitroにおいて細胞に添加する前に、ストック材料から、適当な濃度へと、培養培地に希釈した。培養物を、in vitroにおいて5日間増殖させ、その後引き続き17日間処理した。培地は3日毎に交換した。
In vitroにおいて17日目(DIV17)に、細胞を溶解し、かつ試料を収集した。細胞溶解は、3種界面活性剤緩衝液を用いて行った。
50mM Tris pH8.0 1M 50ml
150mM NaCl 8.77g
0.02%NaN3 (10%) 2ml
0.1%SDS 2O% 5ml
1%NP40 10ml
0.5%デオキシコレートナトリウム 5g
Pierce社のBCAタンパク質アッセイは、比色検出のためのビシコニン酸(BCA)及び総タンパク質定量をベースにした界面活性剤-適合処方である。この方法は、アルカリ培地におけるタンパク質によるCu2+からCu1+への周知の還元と組合せた、ビシコニン酸(BCA)を含有する独自の試薬を用いる、第一銅カチオン(Cu1+)の高感度及び選択的な比色検出である。
各標準25μl(BSA濃度:2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml)及び試料を、適当なマイクロウェルプレートのウェルに添加した。希釈剤(3種界面活性剤緩衝液)25μlを、ブランクウェルに用いた(作業範囲20〜2000μg/ml)。
96-ウェル平底滅菌マイクロプレート(Costar社)を、1X PBS中に1:5000に希釈した抗-MBP抗体(Chemicon社、MAB5274)と共に、+4℃で一晩インキュベーションした。この希釈した抗体溶液50μlを、各ウェルに添加した。
100μg;50μg;25μg;12.5μg;6.2μg;3.1μg。
MBP標準及びタンパク質試料とのインキュベーション後、プレートを1% BSA/PBSで更に3回洗浄した。
図12に示したように、MBPタンパク質レベルは、DIV17で、bacOPN(10nM)処理した培養物において、対照培養物と比べ3倍増加した。この観察は、バキュロウイルスで発現されたOPNの希突起膠細胞前駆体の増殖及び髄鞘形成に対する正の作用を示す先の結果を裏付けている。
CG4細胞株は、初代A2B5希突起膠細胞前駆体から自然発生的に得たラットの不死化した希突起膠細胞の細胞株である。CG4細胞は、希突起膠細胞の分化又は生存の試験のために通常使用される細胞株である。CG4細胞株は、下記の利点を有する:
・希突起膠細胞始原細胞と同様(02A-様)の高い増殖率(GD3, A2B5-陽性細胞);
・ATCCから入手したB104ラット神経芽細胞腫の細胞株から得た馴化培地(有効な増殖因子濃度を伴う)における低い維持経費(Louis J.C.ら、1992);
・短期間、増殖のためのB104馴化培地の代わりに、限定培地(FBS含まず)を用いることができる(FGP2+PDGFを補充);
・希突起膠細胞への分化(O4、GalC-陽性)は、限定培地において誘発することができる;
・星状細胞への分化(GFAP-陽性)は、FBSの存在下で誘発することができる。
キナーゼ緩衝液6x: 試料緩衝液2xpH6
Hepes 50mM Tris-Cl 0.125
MgCl2 10mM グリセロール20%
DTT 1mM DTT 0.2M
バナジン酸ナトリウム0.2mM ブロモフェノールブルー0.02%
β-グリセロリン酸25mM
ATP混合物(60μM)
60OμM ATP、30μl
32PATPを5μl
H2O2を265μl
0.05μg/μlカゼインキナーゼ10μl、
0.5μg/μl E.coli OPN、10μl
50mM Tris-HCl pH8を20μl
キナーゼ緩衝液 6xを10μl
ATP混合物10μl
Bac OPN及びin vitroリン酸化されたOPNタンパク質は、濃度10pM、10nM及び100nMでCG4細胞の増殖に対し試験した。測定値として、Avellanaらの論文(1996)に記されたようなBrdU(Amersham社)を使用した。これらの細胞は、70%N1限定培地(4.5g'lグルコース、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び1mMピルビン酸ナトリウムを含有し、かつ5μg/mlトランスフェリン、100mMプトレスシン、30nMセレン酸ナトリウム及び10ng/mlビオチンを補充したDMEM )及び30%B104馴化培地(ビオチンを除いたN1)において培養した(Louis J. C.ら、1992)。このアッセイは、3x104細胞/ウェルで播種した、ポリ-オルニチン(100μg/ml)処理した24ウェルプレートにおいて行った。10nM BrdUを同時に添加し、かつ細胞を18時間インキュベーションした。固定後、免疫細胞化学試験を、抗-BrdU抗体により行い、細胞***を検出した。全細胞数を計数するために、細胞は更にHoechst 44432染色液(Sigma社)で染色した。画像を得、かつLeica QWin画像分析システムを用いて解析した。
結果は、図13に示した。
試験の目的
オステオポンチン(OPN;AS900011)は、様々な細胞種の接着、移動、分化、生存及びサイトカイン分泌を含む、多形質発現性機能を有するサイトカインである。OPNは、髄鞘再形成及び希突起膠細胞機能を調節することができる遺伝子を検出すること(実施例1参照)を目的とした、ディファレンシャルな遺伝子発現(DGE)法において同定した。組換えバキュロウイルスが発現したOPN(AS900011)による希突起膠細胞前駆体の処理は、用量依存型に増殖を増加した(IC50:3.7pM、実施例7参照)。加えて、AS900011は、CG4細胞株及び原発性神経半球(primary neurosphere)の分化に対する作用を示した(実施例8参照)。OPNは、キュプリゾン処理されたマウス脳領域の脱髄された脳梁に発現し、ここで発現は、小グリア細胞において最強であった(実施例1参照)。加えてOPN発現は、脳室下帯(SVZ)において認められ、このことは髄鞘再形成に参画する希突起膠細胞前駆体の生成を示唆している(実施例4参照)。様々な免疫-調節特性を伴うサイトカインであるOPNは、ニューロン機能及びグリア機能のモジュレーターとしての役割も果たし得ると仮定されている。
本試験に使用したEAE誘発法は、Sahrbacherら(1998)により発表されたプロトコールを改変した。実験に使用した動物の保護は、1992年1月27日のItalian DL. No. 116で強化された指令(Directive)86/609/EECに従った。動物の飼育及び世話のための生理的施設及び装置は、EEC委員会指令86/609の規定に従った。この機関は、Competent Veterinary Health Authoritiesにより完全に認可されている。動物に関するこのプロトコールの全ての部分は、公的獣医により承認されている。このプロトコールは、イタリア厚生省(Italian Ministry of Health)により認可されている(法令No. 51/99-B)。
種、系統、亜系統、及び性別:IFFA CREDO (Saint Gemiain sur I'Arbresle、仏国)から入手した、C57 BL/6JICO雌マウスのコロニーは、Charles River Italia (Calco. Lecco、イタリア)により供給された。
免疫処置法:マウスを、Mycobacterium tuberctdosisを0.5mg含有する完全フロインドアジュバント(CFA, Difco社、Detroit、米国)中の200μg MOG35-55ペプチド(Neosystem社、Strasbourg、仏国)で構成された乳剤0.2mlを、左側腹部に皮下注射することにより、免疫処置した(0日目)。その直後、これらに、緩衝液(0.5M NaCl、0.017% Triton X-100、0.015M Tris、pH7.5)400μlに溶解した500ngの百日咳毒(List Biological Lab.社、Campbell, CA, 米国)を腹腔内注射した。2日目に、これらの動物に、2回目の百日咳毒500ngを腹腔内注射した。7日目に、これらのマウスに、CFA中の200μg MOG35-55ペプチドを、皮下注射により右側腹部に2回用量を投与した。この手法は、8〜10日目位から始まる、尾部から生じかつ前肢へと上行していく、徐々に進行性の麻痺を生じた。
第1群:OPN媒体単独(PBS + 0.1%BSA)をs.c.経路で投与した陽性対照群
第2群:mIFNβ媒体単独(PBS)をs.c.経路で投与した陽性対照群
第3群:オステオポンチン(AS900011)1μg/kgのs.c.投与
第4群:オステオポンチン(AS900011)10μg/kgのs.c.投与
第5群:オステオポンチン(AS900011)100μg/kgのs.c.投与
第6群:オステオポンチン(AS900011)100μg/kgのs.c.投与+mIFNβの20,000U/マウスのs.c投与
第7群:mIFNβの20,000U/マウスのs.c投与
0=疾患徴候なし
0.5=部分的尾麻痺
1=尾麻痺
1.5=尾麻痺 + 部分的一側性後肢麻痺
2=尾麻痺 + 後肢衰弱又は部分的後肢麻痺
2.5=尾麻痺 + 部分的後肢麻痺(骨盤下方)
3=尾麻痺 + 完全な後肢麻痺
3.5=尾麻痺 + 完全な後肢麻痺 + 失禁
4=尾麻痺 + 後肢麻痺 +前肢の衰弱又は部分麻痺
5=瀕死又は死亡
動物の観察は、静かな部屋で行った、臨床徴候は、各処置群について、処置を知らされていない技術者により盲検化様式で、毎日モニタリングした。
動物の体重は毎日測定した。
疼痛による苦痛及び瀕死の状態にあるとみなされた動物は、スタッフの獣医又は権限のある者が試験し、かつ必要ならば疼痛又は罹患を最小とするために人道的に屠殺した。
組織病理学的試験:処置の最後に、ペントバルビタール麻酔下の動物を、左心室を通し4%ホルムアルデヒドで灌流固定した。次にそれらの脊髄を、慎重に剥離し、かつホルマリン中に固定した。脊髄切片を、パラフィンブロック中に包埋した。切片化、並びに炎症に関するヘマトキシリン・エオシンによる染色、及び脱髄検出のためのKiuver-PAS (Luxolファストブルー+過ヨウ素酸Schiff染色)を行った。
本試験の結果は、図14から16に示している。
浸潤された血管周囲炎症の組織学的分析から、OPN処理した動物において、特に1μg/kgの最低投与量で、より少ない量の血管周囲浸潤に向かう傾向があることが明らかになった。OPN、及び多発性硬化症の治療において有効であることが分かっている化合物であるIFNβとの組合せは、各々、OPN又はIFN単独の投与よりもより効果的であった(図14)。
単独で試験したオステオポンチン(AS900011)は、投与量1、10及び100 mg/kgのs.c.で、血管周囲の浸潤及び脱髄の統計学的に有意な低下を示さなかった。mIFNβ(20,000U/マウス、s.c.)による処理は、血管周囲浸潤(55%)及び脱髄(53%)の低下を誘導した。AS900011の投与量100mg/kgのs.c.と同じ投与量のmIFNβを組合せた場合、浸潤(71%)及び脱髄(81%)の有意かつ顕著な低下が認められた。
略号
CMAP:複合筋肉活動電位
EMG:筋電図
IGF-1:インスリン-様増殖因子
SC:皮下注射
s.e.m.:平均の標準誤差
vs:対
ニューロパシーは、罹患したPNSニューロンの種類(例えば、感覚神経、対、自律神経)として、及び実際ニューロン亜型(小、対、大)として、通常選択される。末梢神経の軸索切断術は、神経栄養性因子の神経保護作用を評価するために、最も一般的に使用される動物モデルである。外傷性神経損傷、叢病変及び根病変は、事故の深刻な合併症である。加えて、ミエリン障害を引き起こすことができる末梢神経への圧迫は、手根管症候群のような障害において頻繁に認められるか、もしくは脊柱の整形外科的合併症に随伴する。軸索切断術は、細胞死のような現象を生じ、軸索伝導速度を低下し、かつ障害を受けたニューロンにおける神経伝導物質レベルを変更する。圧挫病変は、ニューロパシー状態に関連した関心のある追加的過程である、再生を可能にする(McMahon S.及びPriestley J.V.、1995)。
動物
84匹の8週齢の雌C57bl/6 RJマウス(Elevage Janvier、Le Genest-St-lsle.、仏国)を用いた。これらは7群に分けた(n=12):(a)媒体で偽手術した群;(b)媒体で神経圧挫手術した群;(c)神経圧挫/オステオポンチン(1μg/kg);(d)神経圧挫/オステオポンチン(10μg/kg);(e)神経圧挫/オステオポンチン(100μg/kg);(f)神経圧挫/4-メチルカテコール(10μg/kg);(g)神経圧挫/変性したオステオポンチン(100μg/kg)。
これらは、群飼いし(5匹の動物/檻)、管理された温度(21〜22℃)及び逆転した昼夜サイクル(12時間/12時間)で、餌及び水は自在摂取するようにして維持した。全ての実験は、施設の指針に従い行った。
これらの動物を、60mg/kgのケタミン塩酸塩(Imalgene 500、Rhone Merieux. Lyon、仏国)のIP注射により麻酔した。右側坐骨神経を、中大腿レベルで手術により露出し、かつ坐骨神経の三分枝へ5mmと近接した部位で圧挫した。神経は、止血用鉗子(幅1.5mm;Koenig; Strasbourg;仏国)で、30秒間2回圧挫し、各圧挫の間に90度回転させた。
筋電図(EMG)試験を、手術日の前に1回(ベースライン)、及び術後3週間の間は毎週行った。
体重及び生存率は、毎日記録した。
第4週目に、各群4匹の動物を屠殺し、坐骨神経を切断し、形態学的分析を行った。
電気生理学的記録を、Neuromatic 2000M筋電図測定装置(EMG)(Dantec, Les Ulis、仏国)を用いて行った。マウスは、ケタミン塩酸塩(Imalgene 500(登録商標)、Rhone Merieux. Lyon、仏国)100mg/kgの腹腔内注射により麻酔した。加温ランプにより、30℃で、正常体温を維持し、かつ尾の上に配置した接触式体温計(Quick, Bioblock Scientific, Illkirch. 仏国)により管理した。
形態計測解析は、神経圧挫後3週間で行った。1群につき4匹の無作為に選択した動物を、この解析に使用した。これらは、Imalgene 500の100 mg/kg、IP注射により麻酔した。坐骨神経の5mmセグメントを、組織学的検査のために切り出した。組織を、リン酸緩衝液(pH7.4)中のグルタルアルデヒドの4%水溶液(Sigma社, L'lsle dAbeau-Chesnes, 仏国)で一晩固定し、かつ使用時まで、30%ショ糖中で+4℃で維持した。この神経は、リン酸緩衝液中の2%四酸化オスミウム(Sigma社, L'lsle d'Abeau-Chesnes, 仏国)で、2時間固定し、かつ連続アルコール溶液で脱水し、かつEpon中に包埋した。その後包埋した組織を、+70℃で、3日間重合させた。1.5μmの横断切片を、ミクロトームで作成し、1%トルイジンブルー(Sigma社、LIsle d'Abeau-Chesnes, 仏国)で2分間染色し、脱水し、かつEukittに搭載した。1試料につき20切片を、光学顕微鏡(Nikon社、東京、日本)を用いて観察し、かつ1個の神経試料につき6個の無作為化した切片について形態計測解析を、半自動式デジタル画像解析ソフトウェア(Biocom社、仏国)を用い行った。1切片につき2視野を試験した。以下のパラメータを試験した:変性線維の割合(1視野につき)及び線維の総数。
このデータの全般的解析は、ひとつの因子又は繰返しのあるANOVA及び一元配置ANOVA、並びにノンパラメトリックな検定(Mann Whitney検定)を用いて行った。更に適当な場合は、Dunnett検定を用いた。有意性レベルは、p<0.05と設定した。これらの結果は、平均±平均の標準誤差(s.e.m.)で表わした。
全ての動物が、神経圧挫手技後に生存していた。EMG評価時の麻酔のために、1匹のマウス(神経圧挫/媒体n°2)が7日目に、並びに2匹(媒体偽手術したn°3及びn°6)が14日目に死亡した。
図17に示したように、本試験を通じて体重評価における群間の有意性が認められた[F(6, 132)=1.93及びp<0.001;繰返しのあるANOVA]。
全ての異なる群が本試験を通じての体重の増加を示した。
複合筋活動電位の振幅(図18):
本試験を通じCMAPの振幅には、群間の有意差があった[F(6, 18)=49.185及びp<0.001;繰返しのあるANOVA](図19)。
本試験を通じCMAP持続期間において群間有意差が存在した[F(6, 18)=25.15及びp<0.001;繰返しのあるANOVA](図20)。
更に、神経圧挫/媒体群及び神経圧挫/D-オステオポンチン100μg/kg群においては、有意差は認められなかった。
変性繊維の割合(図21):
統計解析は、1視野当りの変性線維の割合の群間有意差を明らかにした(p<0.001;一元配置ANOVA)(図22)。全ての神経圧挫群が、変性線維の有意に増加した割合を示した(p<0.001、Dunnett検定)。更に、神経圧挫/処理マウスは、神経圧挫/媒体群よりも、有意に低い割合を示した(p<0.001;Dunnett検定)。更に、D-オステオポンチン(100μg/kg)処理群は、オステオポンチン-処理群よりもより高い変性線維の割合を示した(p<0.001;Dunnett検定)。
切片は、光学顕微鏡を用いて観察し、かつ形態計測解析は、Visiolab 2000ソフトウェア(Biocom社、Paris、仏国)の助けを借りて行った。1匹の動物につき5切片、1切片につき2視野を解析した。機能的に有髄線維のみを、コンピュータにより記録した(全ての変性線維は、変性を伴うことを意味し、ミエリン鞘は記録しなかった)。
神経圧挫モデルは、末梢ニューロパシーの非常に劇的なモデルである。神経圧挫直後に、機械的損傷のために、大きい直径の線維の大半が失われ、このことは、CMAP振幅の強力な減少につながる。CMAP潜伏時間は、すぐには影響を受けないが、続発する免疫が媒介した変性(マクロファージ、顆粒球)による、小さい直径の線維の更なる変性のために、21日目に増加を示す。CMAP持続期間は、7日目に増大し、14日目にピークに達し、かつ21日目に、7日目の時点と同等のレベルに戻った。これは、21日目に、圧挫病変は、再生のために、ニューロパシー状態に関連した関心のある追加の突起が可能になるという事実によるものである。この軸索の出芽/再生は、3週目の時点で、対照群においても明かであった。
−続発する免疫が媒介した変性からの線維の直接の保護;
−促進された髄鞘再形成及び軸索保護;
−障害を受けた軸索の促進された再生/出芽;
−マクロファージにより清掃された増大したミエリン破片。
Claims (9)
- 神経疾患の治療のための医薬組成物であって、
前記神経疾患が
a) 外傷性神経損傷、
b) 中枢神経系及び末梢神経系の脱髄疾患、
c) 異常な髄鞘形成を伴うニューロパシー、及び
d) 先天性代謝障害によって生じる、ミエリン鞘の発達に影響を及ぼす神経疾患、
から成る群から選択され、
(i) 配列番号:1のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(ii) 配列番号:1のアミノ酸1から168又は170を含んで成るポリペプチド;
(iii) 配列番号:1のアミノ酸1から16及び170から314を含んで成るポリペプチド;
(iv) 配列番号:1のアミノ酸170から314を含んで成るポリペプチド;
(v) 配列番号:2のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(vi) 配列番号:3のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(vii) αv-インテグリン及び/又はCD44変異体アイソフォームv6-v10と相互作用する能力を保持し、アミノ酸配列が、(i)から(vi)の配列の少なくともひとつと、少なくとも70%又は80%又は90%の同一性を有する、(i)から(vi)のいずれかのムテイン;
(viii) αv-インテグリン及び/又はCD44変異体アイソフォームv6-v10と相互作用する能力を保持し、アミノ酸配列の何らかの変化が、(i)から(vi)のアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、(i)から(vi)のいずれかのムテイン;
(ix) αv-インテグリン及び/又はCD44変異体アイソフォームv6-v10と相互作用する能力を保持している、(i)から(vi)のいずれかの塩、又はPEG化誘導体;
(x) αv-インテグリン及び/又はCD44変異体アイソフォームv6-v10と相互作用する能力を保持し、血液-脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチド又はタンパク質と融合されている、(i)から(vi)のいずれか;及び
(xi)αv-インテグリン及び/又はCD44変異体アイソフォームv6-v10と相互作用する能力を保持し、免疫グロブリン又はその断片と融合されている、(i)から(vi)のいずれか、
から成る群から選択される、オステオポンチンを含んで成る医薬組成物、
但し、外傷性神経損傷又は末梢ニューロパシーの治療のための前記(i)のポリペプチド又はそのムテインを含んで成る組成物を除く。 - 神経疾患が末梢ニューロパシーである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 神経疾患が糖尿病性ニューロパシーである、請求項2に記載の医薬組成物。
- 神経疾患が化学療法に関連するニューロパシーである、請求項2に記載の医薬組成物。
- 脱髄疾患が多発性硬化症(MS)である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 同時、逐次又は個別使用のために、更にインターフェロンを含んで成る、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- インターフェロンがインターフェロン−βである、請求項6に記載の医薬組成物。
- オステオポンチンが、0.001〜100mg/kg体重、又は1〜10mg/kg体重、又は5mg/kg体重の量で使用される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 更にインターフェロン−βを含んで成り、前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項1に記載の医薬組成物。
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