JP5011076B2

JP5011076B2 - Laser microscope

Info

Publication number: JP5011076B2
Application number: JP2007304914A
Authority: JP
Inventors: 伸吾鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2027-11-26
Also published as: JP2009128719A

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a laser microscope.

従来、蛍光試薬の励起（吸収）、蛍光（放射）の分光特性、レーザ光の分光特性および光学系の透過率の分光特性をバイナリデータとして予めデータファイルに記憶しておき、全ての分光特性の重複の大小を判断して、使用に適した光学系の選択を可能にするレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。 Conventionally, excitation (absorption) of fluorescent reagent, spectral characteristics of fluorescence (radiation), spectral characteristics of laser light, and spectral characteristics of optical system transmittance are stored in advance in a data file as binary data, and all spectral characteristics of A laser microscope that makes it possible to select an optical system suitable for use by determining the size of overlap is known (see, for example, Patent Document 1).

特開２０００−３９５６３号公報JP 2000-39563 A

しかしながら、複数の波長域の蛍光を同時に観察したい場合には、蛍光のクロストーク（例えば、２種類の蛍光物質の蛍光を同時観察したい場合に、一方の蛍光物質の蛍光が、他方の蛍光物質の蛍光を検出する検出器側にも漏れ込む現象）を考慮することができず、必ずしも最適な光学系を選択することができないという不都合がある。
すなわち、最も大きな蛍光光量を受光可能な光学系を選択することはできるが、クロストークを除去することができないという不都合がある。 However, when it is desired to observe fluorescence in a plurality of wavelength ranges simultaneously, fluorescence crosstalk (for example, when the fluorescence of two types of fluorescent substances is desired to be observed simultaneously, the fluorescence of one fluorescent substance is different from that of the other fluorescent substance). The phenomenon of leaking to the detector side that detects fluorescence) cannot be taken into consideration, and there is a disadvantage that the optimum optical system cannot always be selected.
That is, an optical system capable of receiving the largest amount of fluorescent light can be selected, but there is a disadvantage that crosstalk cannot be removed.

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、実際に観察を行うことなく、検出器に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、光源や検出器、光学部品の設定の最適化を容易にすることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and simulates the intensity of fluorescence incident on the detector and the degree of crosstalk without actually observing, whereby a light source, a detector, An object of the present invention is to provide a laser microscope capable of facilitating optimization of setting of optical components.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起光を出射する光源と、該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度を対比可能に表示する表示部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention provides a light source that emits excitation light, a detector that detects fluorescence generated in a fluorescent material in a sample by being irradiated with the excitation light from the light source, and fluorescence from the sample to the detector. A setting variable detection optical system that guides, a spectral characteristic for each setting of the detection optical system, a fluorescent spectral characteristic for each fluorescent substance, and an excitation efficiency for each fluorescent substance, and a plurality of fluorescent substances A calculation unit that calculates the fluorescence intensity of each fluorescent substance in the detector based on data stored in the characteristic storage unit when performing fluorescence observation of the sample, and a fluorescent substance at a specific wavelength calculated by the calculation unit Provided is a laser microscope provided with a display unit that displays the fluorescence intensities for each of them in a comparable manner.

本発明によれば、特性記憶部に記憶されている検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の蛍光効率に基づいて、演算部により検出器における蛍光物質毎の蛍光強度が検出光学系の設定毎に算出され、特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度が表示部に対比可能に表示される。これにより、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、所望の蛍光物質の蛍光強度に対して、それ以外の蛍光物質の蛍光強度がどの程度同時に検出されるのかを簡易に判断することができ、クロストークの度合の少ない検出光学系の設定を選択する際の判断材料を提供することができる。 According to the present invention, based on the spectral characteristics for each setting of the detection optical system stored in the characteristic storage unit, the fluorescent spectral characteristics for each fluorescent material, and the fluorescent efficiency for each fluorescent material, the calculation unit causes the fluorescent material in the detector to be The fluorescence intensity for each is calculated for each setting of the detection optical system, and the fluorescence intensity for each fluorescent substance at the specific wavelength is displayed on the display unit so as to be comparable. This makes it easy to determine how much the fluorescence intensity of other fluorescent substances is detected simultaneously with the fluorescence intensity of the desired fluorescent substance when observing a sample containing multiple fluorescent substances. Therefore, it is possible to provide a judgment material when selecting a setting of a detection optical system with a low degree of crosstalk.

また、本発明は、励起光を出射する光源と、該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合を判定するクロストーク判定部とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。 The present invention also provides a light source that emits excitation light, a detector that detects fluorescence generated in a fluorescent substance in the sample by being irradiated with the excitation light from the light source, and the detection of fluorescence from the sample. A variable detection optical system that leads to a detector, a spectral storage characteristic for each setting of the detection optical system, a fluorescent spectral characteristic for each fluorescent substance, and an excitation efficiency for each fluorescent substance, and a plurality of fluorescent substances A fluorescence intensity of each fluorescent substance in the detector based on data stored in the characteristic storage unit, and a specific wavelength calculated by the calculation unit Provided is a laser microscope including a crosstalk determination unit that determines the degree of crosstalk based on a ratio of fluorescence intensity for each fluorescent substance.

本発明によれば、特性記憶部に記憶されている検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の蛍光効率に基づいて、演算部により検出器における蛍光物質毎の蛍光強度が検出光学系の設定毎に算出され、クロストーク判定部により特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合が判定される。これにより、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、クロストークの度合の少ない検出光学系の設定を選択する際の判断材料を提供することができる。 According to the present invention, based on the spectral characteristics for each setting of the detection optical system stored in the characteristic storage unit, the fluorescent spectral characteristics for each fluorescent material, and the fluorescent efficiency for each fluorescent material, the calculation unit causes the fluorescent material in the detector to be The fluorescence intensity for each is calculated for each setting of the detection optical system, and the degree of crosstalk is determined by the crosstalk determination unit based on the ratio of the fluorescence intensity for each fluorescent substance at the specific wavelength. Thereby, when performing fluorescence observation of a sample containing a plurality of fluorescent substances, it is possible to provide a judgment material when selecting a setting of a detection optical system with a low degree of crosstalk.

上記発明においては、前記演算部により算出された蛍光強度および前記クロストーク判定部により判定されたクロストークの度合に基づいて、検出光学系の設定を評価する設定評価部を備えていてもよい。
このようにすることで、複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、設定評価部によって検出光学系の設定の優劣が評価され、設定作業に要していた時間を大幅に短縮することができる。 In the above-described invention, a setting evaluation unit that evaluates the setting of the detection optical system may be provided based on the fluorescence intensity calculated by the calculation unit and the degree of crosstalk determined by the crosstalk determination unit.
In this way, when performing fluorescence observation of a sample containing multiple fluorescent substances, the setting evaluation unit evaluates the superiority or inferiority of the setting of the detection optical system, and greatly reduces the time required for the setting work. Can do.

また、上記発明においては、前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性および蛍光物質毎の蛍光分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、検出器の光電変換効率の分光特性をデータとして記憶し、前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを算出することとしてもよい。 Further, in the above invention, the calculation unit multiplies the spectral characteristic for each setting of the detection optical system and the characteristic value for each wavelength of the fluorescent spectral characteristic for each fluorescent substance, to the excitation efficiency for each fluorescent substance. It is good also as multiplying.
In the above invention, the characteristic storage unit further stores the spectral characteristics of the photoelectric conversion efficiency of the detector as data, and the calculation unit replaces the fluorescence intensity with the spectral for each setting of the detection optical system. The signal level after photoelectric conversion is calculated by multiplying the sum of the characteristics, the fluorescence spectral characteristics for each fluorescent substance, and the characteristic values for each wavelength of the photoelectric conversion efficiency of the detector, by the excitation efficiency for each fluorescent substance. It is good.

また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の分光特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。 In the above invention, the characteristic storage unit further stores the output value of the light source, the excitation efficiency of each fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system from the light source to the sample as data for each wavelength of the excitation light, The calculation unit multiplies the spectral characteristics for each setting of the detection optical system, the fluorescent spectral characteristics for each fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system for each wavelength. It is good also as multiplying the excitation efficiency for every fluorescent substance.

また、上記発明においては、前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを演算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 In the above invention, the characteristic storage unit further stores the output value of the light source, the excitation efficiency of each fluorescent substance, and the characteristics of the illumination optical system from the light source to the sample as data for each wavelength of the excitation light, The arithmetic unit, instead of the fluorescence intensity, the sum of the spectral characteristics for each setting of the detection optical system, the fluorescence spectral characteristics for each fluorescent substance, and the characteristic values for each wavelength of the photoelectric conversion efficiency of the detector, 4. The laser microscope according to claim 1, wherein the signal level after photoelectric conversion is calculated by multiplying the output value of the light source and the excitation efficiency for each fluorescent substance.

また、上記発明においては、前記光源がレーザダイオードであり、前記特性記憶部が、光源への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、前記演算部が、光源の分光特性、前記検出光学系の分光特性、蛍光物質の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算することとしてもよい。 In the above invention, the light source is a laser diode, and the characteristic storage unit includes a spectral characteristic for each voltage applied to the light source or an ambient temperature, excitation efficiency of each fluorescent substance, and an illumination optical system from the light source to the sample. The characteristics are stored as data for each wavelength of the excitation light, and the calculation unit has characteristic values for each wavelength of the spectral characteristics of the light source, the spectral characteristics of the detection optical system, the fluorescent spectral characteristics of the fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system The sum of the multiplications may be multiplied by the excitation efficiency for each fluorescent substance.

また、上記発明においては、前記照明光学系が、音響光学素子を含み、前記照明光学系の分光特性が、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性を含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記設定可変の検出光学系が、挿脱可能なバリアフィルタを含むこととしてもよい。 In the above invention, the illumination optical system may include an acoustooptic element, and the spectral characteristic of the illumination optical system may include a transmittance characteristic for each control wavelength of the acoustooptic element.
Moreover, in the said invention, the said setting variable detection optical system is good also as including the barrier filter which can be inserted or removed.

本発明によれば、実際に観察を行うことなく、検出器に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、光源や検出器、光学部品の設定の最適化を容易にすることができるという効果を奏する。 According to the present invention, the fluorescence intensity incident on the detector and the degree of crosstalk are simulated without actually observing, thereby facilitating optimization of the settings of the light source, detector, and optical components. There is an effect that can be.

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１〜図１８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示すように、レーザ光（励起光）を出射するレーザ光源２と、該レーザ光源２から発せられたレーザ光を試料Ａに照射し、試料Ａにおいて発生する蛍光を検出する顕微鏡本体３と、各種データを記憶するメモリ（特性記憶部）４と、該メモリ４に記憶されているデータに基づいて、蛍光物質毎の強度を算出する演算部（ＰＣ）５と、算出された蛍光物質毎の強度を対比可能に表示する表示部６とを備えている。演算部５には種々の撮影条件を入力する入力部７が備えられている。 A laser microscope 1 according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
As shown in FIG. 1, the laser microscope 1 according to the present embodiment irradiates a sample A with a laser light source 2 that emits laser light (excitation light) and a laser light emitted from the laser light source 2. The microscope main body 3 that detects the fluorescence generated in the above, a memory (characteristic storage unit) 4 that stores various data, and a calculation unit (calculation unit) that calculates the intensity of each fluorescent substance based on the data stored in the memory 4 PC) 5 and a display unit 6 for displaying the calculated intensities of the respective fluorescent substances so that they can be compared. The computing unit 5 is provided with an input unit 7 for inputting various photographing conditions.

レーザ光源２は、発振波長の異なるものが複数種備えられ、それぞれの発振波長のレーザ光を照射制御可能なＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ：図示略）を備えている。
顕微鏡本体３は、図２に示されるように、レーザ光源２からのレーザ光を試料Ａに導く照明光学系８と、試料Ａからの蛍光を検出する検出器９，１０と、試料Ａからの蛍光を検出器９，１０まで導く検出光学系１１とを備えている。
照明光学系８は、レーザ光源２からのレーザ光を導光する光ファイバ１２と、コリメートレンズ１３とを備えている。 The laser light source 2 includes a plurality of types having different oscillation wavelengths, and includes an AOTF (acousto-optic tunable filter: not shown) capable of controlling the irradiation of the laser beams having the respective oscillation wavelengths.
As shown in FIG. 2, the microscope body 3 includes an illumination optical system 8 that guides the laser light from the laser light source 2 to the sample A, detectors 9 and 10 that detect fluorescence from the sample A, and And a detection optical system 11 that guides the fluorescence to the detectors 9 and 10.
The illumination optical system 8 includes an optical fiber 12 that guides the laser light from the laser light source 2 and a collimating lens 13.

検出器９，１０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、異なる波長の蛍光を同時に検出するために２つ備えられている。
検出光学系１１は、試料Ａからの蛍光を集光する対物レンズ１４と、対物レンズ１４により集光された蛍光を結像させる結像レンズ１５と、スキャナ１６と、結像レンズ１５により結像された蛍光を略平行光にする瞳投影レンズ１７と、略平行光にされた蛍光をレーザ光の光路から分岐する励起ダイクロイックミラー１８と、分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ１９と、集光された蛍光のうち、対物レンズ１４の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させる共焦点ピンホール２０と、共焦点ピンホール２０を通過した蛍光を波長毎に分光する分光ダイクロイックミラー２１と、分光された蛍光に含まれるレーザ光を除去するバリアフィルタ２２，２３とを備えている。図中符号２４はミラーである。 The detectors 9 and 10 are, for example, photomultiplier tubes (PMT), and two detectors 9 and 10 are provided for simultaneously detecting fluorescence of different wavelengths.
The detection optical system 11 includes an objective lens 14 that collects the fluorescence from the sample A, an imaging lens 15 that forms an image of the fluorescence collected by the objective lens 14, a scanner 16, and an imaging lens 15. A pupil projection lens 17 for converting the fluorescent light into substantially parallel light, an excitation dichroic mirror 18 for branching the fluorescent light converted into substantially parallel light from the optical path of the laser light, a confocal lens 19 for condensing the branched fluorescence, Of the collected fluorescence, the confocal pinhole 20 that allows only the fluorescence generated from the focal position of the objective lens 14 to pass through, the spectroscopic dichroic mirror 21 that separates the fluorescence that has passed through the confocal pinhole 20 for each wavelength, Barrier filters 22 and 23 for removing laser light contained in the dispersed fluorescence are provided. Reference numeral 24 in the figure denotes a mirror.

励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３は、それぞれ回転可能なターレット２５〜２８に分光特性の異なるものが複数固定されている。
メモリ４には、全ての励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性のデータおよび蛍光試薬毎の励起効率分光特性、蛍光出力分光特性のデータが、観察を行う波長範囲にわたって、例えば、所定の波長刻みで記憶されている。 A plurality of excitation dichroic mirror 18, spectral dichroic mirror 21, and barrier filters 22 and 23 are fixed to a plurality of rotatable turrets 25 to 28 with different spectral characteristics.
In the memory 4, data of transmittance spectral characteristics of all the excitation dichroic mirrors 18, spectral dichroic mirrors 21 and barrier filters 22 and 23, excitation efficiency spectral characteristics for each fluorescent reagent, and fluorescence output spectral characteristics data are observed. For example, it is stored in predetermined wavelength increments over the wavelength range.

演算部５は、観察を行う複数の蛍光試薬が設定されたときには、想定される励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性のデータおよび蛍光試薬毎の励起効率分光特性、蛍光出力分光特性のデータを用いて、各蛍光試薬について、検出器９に入射する蛍光強度の分光特性を算出するようになっている。
表示部６は、算出された複数の蛍光試薬における蛍光強度の分光特性を表示し、選択される光学素子毎に切り替えて表示することができるようになっている。 When a plurality of fluorescent reagents to be observed are set, the calculation unit 5 transmits data of transmittance spectral characteristics of the expected excitation dichroic mirror 18, spectral dichroic mirror 21, and barrier filters 22, 23, and excitation efficiency for each fluorescent reagent. Using the spectral characteristic and fluorescence output spectral characteristic data, the spectral characteristic of the fluorescence intensity incident on the detector 9 is calculated for each fluorescent reagent.
The display unit 6 displays the calculated spectral characteristics of the fluorescence intensity of the plurality of fluorescent reagents, and can switch and display the selected optical elements.

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて試料Ａの蛍光観察を行う場合に、観察に先立って、図３に示されるように、ユーザが入力部７から複数の蛍光試薬の種類を入力する（ステップＳ１）。演算部５は、メモリ４に記憶されているデータの中から入力された蛍光試薬の種類に従う出力波長特性を読み出す（ステップＳ２）。 When performing fluorescence observation of the sample A using the laser microscope 1 according to this embodiment configured as described above, prior to observation, as shown in FIG. 3, the user can input a plurality of fluorescent reagents from the input unit 7. Is input (step S1). The calculation unit 5 reads out the output wavelength characteristic according to the type of the fluorescent reagent input from the data stored in the memory 4 (step S2).

次いで、ユーザが入力部７から光学素子の設定を入力する（ステップＳ３）。演算部５はメモリ４に記憶されているデータの中から入力された光学素子に対応する分光特性を読み出す（ステップＳ４）。 Next, the user inputs the setting of the optical element from the input unit 7 (step S3). The calculation unit 5 reads the spectral characteristics corresponding to the input optical element from the data stored in the memory 4 (step S4).

そして、演算部５は、読み出された分光特性および出力波長特性を用いて検出器９における蛍光の受光強度の分光特性を蛍光試薬毎に算出し（ステップＳ５）、表示部６に同時に表示する（ステップＳ６）。これにより、各蛍光試薬に対する受光強度の分光特性が対比可能に表示されるので、ユーザは、表示部６に表示されている複数の蛍光試薬毎の受光強度の分光特性を観察することにより、各蛍光試薬に対する受光強度の大きさから、実際の観察により取得される蛍光画像の明るさを推定することができる。また、分光特性の重複する波長範囲の広さ、重複部分における蛍光強度の大きさ等を考慮して、クロストークの度合を確認することができる。 Then, the calculation unit 5 calculates the spectral characteristic of the fluorescence received light intensity in the detector 9 for each fluorescent reagent using the read spectral characteristic and output wavelength characteristic (step S5), and simultaneously displays them on the display unit 6. (Step S6). Thereby, since the spectral characteristics of the received light intensity for each fluorescent reagent are displayed in a comparable manner, the user can observe each of the spectral characteristics of the received light intensity for each of the plurality of fluorescent reagents displayed on the display unit 6. From the magnitude of the received light intensity with respect to the fluorescent reagent, the brightness of the fluorescent image acquired by actual observation can be estimated. In addition, the degree of crosstalk can be confirmed in consideration of the width of the wavelength range where the spectral characteristics overlap, the magnitude of the fluorescence intensity in the overlapping portion, and the like.

そして、この設定で満足できる場合には、設定を終了し、試料Ａの観察を行う（ステップＳ７）。満足できない場合には、別の光学素子の設定を入力部７から入力するステップＳ３〜受光強度を表示するステップＳ６を繰り返し、最適な光学素子を選択することができる。 If this setting is satisfactory, the setting is terminated and the sample A is observed (step S7). If it is not satisfactory, step S3 for inputting another optical element setting from the input unit 7 to step S6 for displaying the received light intensity can be repeated to select an optimum optical element.

このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、実際に観察を行うことなく、検出器９に入射する蛍光強度とクロストークの度合をシミュレートし、それによって、レーザ光源２や検出器９、ダイクロイックミラー１８，２１やバリアフィルタ２２，２３の設定の最適化を容易にすることができるという利点がある。 Thus, according to the laser microscope 1 according to the present embodiment, the intensity of the fluorescence incident on the detector 9 and the degree of crosstalk are simulated without actually observing, whereby the laser light source 2 and the detection are performed. There is an advantage that the setting of the device 9, the dichroic mirrors 18 and 21 and the barrier filters 22 and 23 can be easily optimized.

ここで、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第１の実施例について説明する。
レーザ光源２として、発振波長４８８ｎｍのアルゴンレーザと、発振波長５４３ｎｍのヘリウムイオンレーザとを備えたものを採用する。
蛍光試薬として、４８８ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＦＩＴＣ（Fluoresceinisothiocyanate）および５４３ｎｍで励起可能な蛍光色素Ｃｙ３を採用する。 Here, a first example of the laser microscope 1 according to the present embodiment will be described.
As the laser light source 2, a laser light source having an argon laser with an oscillation wavelength of 488 nm and a helium ion laser with an oscillation wavelength of 543 nm is employed.
As the fluorescent reagent, a fluorescent reagent FITC (Fluoresceinisothiocyanate) that can be excited at 488 nm and a fluorescent dye Cy3 that can be excited at 543 nm are adopted.

励起ダイクロイックミラー１８として、図４および図５に示されるようなダイクロイックミラー１８の透過率分光特性、バリアフィルタ２２として、図６〜図９に示されるようなバリアフィルタ２２の透過率分光特性が、観察に使用する４００〜８００ｎｍの波長範囲にわたって１ｎｍ刻みでメモリ４に記憶されている。 As the excitation dichroic mirror 18, the transmittance spectral characteristics of the dichroic mirror 18 as shown in FIGS. 4 and 5, and as the barrier filter 22, the transmittance spectral characteristics of the barrier filter 22 as shown in FIGS. It is stored in the memory 4 in 1 nm increments over the wavelength range of 400 to 800 nm used for observation.

また、メモリ４には、図１０および図１１に示されるように、上記ＦＩＴＣおよびＣｙ３の他、５４３ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）についても、蛍光試薬毎の励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータが、観察に使用する４００〜８００ｎｍの波長範囲にわたって１ｎｍ刻みで記憶されている。 In addition, as shown in FIGS. 10 and 11, in addition to the above-described FITC and Cy3, the memory 4 also has a fluorescence reagent Texas Red (trademark) that can be excited at 543 nm. Output spectral characteristic data is stored in increments of 1 nm over a wavelength range of 400 to 800 nm used for observation.

ユーザが入力部７から観察対象の試料Ａを染色している蛍光試薬の種類（ＦＩＴＣ，Ｃｙ３）を入力する。演算部５は、メモリ４から、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＣｙ３の励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータを読み出す。 The user inputs the type (FITC, Cy3) of the fluorescent reagent staining the sample A to be observed from the input unit 7. The calculation unit 5 reads out the data of the excitation efficiency spectral characteristics and the fluorescence output spectral characteristics of the fluorescent reagents FITC and Cy3 from the memory 4.

また、ユーザが、入力部７から光路中に挿入する励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の種類、使用するレーザ波長を入力する。演算部５は、メモリ４から光路内に挿入する励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率分光特性を読み出す。 Further, the user inputs the types of the excitation dichroic mirror 18 and the barrier filter 22 to be inserted into the optical path and the laser wavelength to be used from the input unit 7. The calculation unit 5 reads the transmittance spectral characteristics of the excitation dichroic mirror 18 and the barrier filter 22 inserted into the optical path from the memory 4.

例えば、蛍光試薬ＦＩＴＣだけを観察する場合には、４８８ｎｍのレーザ光のみを出射し、励起ダイクロイックミラー１８として図４のような透過率分光特性を有するもの、バリアフィルタ２２として図６のような透過率分光特性を有するものをそれぞれ光路内に挿入することになる。ここでは、分光ダイクロイックミラー２１としては、波長全域で反射率がほぼ１００％である全反射ミラーが挿入されるものとする。このようにすると、検出器９のみを使用する１チャネル検出となる。 For example, when only the fluorescent reagent FITC is observed, only the laser beam of 488 nm is emitted and the excitation dichroic mirror 18 has transmittance spectral characteristics as shown in FIG. 4, and the barrier filter 22 is transmitted as shown in FIG. Those having the spectral rate characteristic are inserted into the optical path. Here, as the spectroscopic dichroic mirror 21, a total reflection mirror having a reflectance of almost 100% in the entire wavelength range is inserted. If it does in this way, it will become 1 channel detection which uses only the detector 9. FIG.

このとき、試料Ａから検出器９に至る検出光学系１１全体の透過率は、蛍光が通過する光学素子の透過率および反射率の分光特性によって決定される。レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０は固定されて切り替えられないものであるうえに、透過率または反射率が波長によらずほぼ一定であるとすることができ、この実施例では考慮しないこととする。 At this time, the transmittance of the entire detection optical system 11 from the sample A to the detector 9 is determined by the spectral characteristics of the transmittance and reflectance of the optical element through which the fluorescence passes. The lenses 13, 14, 15, 19, the scanner 16, and the confocal pinhole 20 are fixed and cannot be switched, and the transmittance or reflectance can be substantially constant regardless of the wavelength. In this embodiment, it is not considered.

これにより、試料Ａから検出器９へ至る検出光学系１１全体の透過率は、励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率によって決定される。すなわち、波長λにおける励起ダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２の透過率をＴ_ＤＭａ（λ）、Ｔ_ＢＦａ（λ）とすると、試料Ａから検出器９へ至る検出光学系１１全体の透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）は、以下の計算式により求められる。
Ｔ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・Ｔ_ＢＦａ（λ） Thereby, the transmittance of the entire detection optical system 11 from the sample A to the detector 9 is determined by the transmittance of the excitation dichroic mirror 18 and the barrier filter 22. That is, _assuming that the transmittances of the excitation dichroic mirror 18 and the barrier filter 22 at the wavelength λ are T _DMa (λ) and T _BFa (λ), the transmittance T _{PMTa of the} entire detection optical system 11 from the sample A to the detector 9 ( λ) is obtained by the following calculation formula.
T _PMTa (λ) = T _DMa (λ) · T _BFa (λ)

この計算式により得られた透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）に蛍光試薬毎の蛍光出力分光特性Ｆ（λ）を乗じることにより、蛍光試薬ＦＩＴＣ、Ｃｙ３が発する蛍光の、検出器９における受光効率の分光特性が求められる。さらに、使用レーザ波長４８８ｎｍでの励起効率Ｘ_４８８を乗ずることによって、検出器９に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ）を求めることができる。
Ｐ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＰＭＴａ（λ）・Ｆ（λ）・Ｘ_４８８ By _multiplying the transmittance T _PMTa (λ) obtained by this calculation formula by the fluorescence output spectral characteristic F (λ) for each fluorescent reagent, the spectrum of the light receiving efficiency in the detector 9 of the fluorescence emitted by the fluorescent reagents FITC and Cy3 is obtained. Characteristics are required. Furthermore, the spectral characteristic P _PMTa (λ) of the fluorescence intensity incident on the detector 9 can be obtained by multiplying the excitation efficiency X ₄₈₈ at the used laser wavelength 488 nm.
P _PMTa (λ) = T _PMTa (λ) · F (λ) · X ₄₈₈

このようにして算出された検出器９に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ）は、図１２に示されるように、表示部６にグラフ表示される。したがって、ユーザは表示部６に表示されているグラフを見ることにより、異なる蛍光試薬についての蛍光強度の分光特性の重なりを確認し、クロストークの度合を判断することができる。 The spectral characteristic P _PMTa (λ) of the fluorescence intensity incident on the detector 9 calculated in this way is displayed in a graph on the display unit 6 as shown in FIG. Therefore, the user can confirm the overlap of the spectral characteristics of the fluorescence intensities of different fluorescent reagents by looking at the graph displayed on the display unit 6 and determine the degree of crosstalk.

さらに、正確にクロストークの度合を判断するには、蛍光出力分光特性の積分値と蛍光強度分光特性の積分値とを比較することによって波長全域での受光効率を求める。具体的には、検出器９における受光効率Ｄ_ＰＭＴａ（λ）、すなわち、励起効率１００％で励起した蛍光を全て検出器９に入射させた場合を１００％としたときの受光効率を、以下の計算式により求める。ただし、蛍光出力分光特性のデータを規格化するとき、最大値を１とせず、蛍光主力分光特性の波長全域での積分値を１として規格化する場合には、蛍光出力分光特性Ｆ（λ）の積分値で除算する必要はない。
Ｄ_ＰＭＴａ（λ）＝∫Ｐ_ＰＭＴａ（λ）／∫Ｆ（λ） Further, in order to accurately determine the degree of crosstalk, the light receiving efficiency in the entire wavelength range is obtained by comparing the integrated value of the fluorescence output spectral characteristic and the integrated value of the fluorescent intensity spectral characteristic. Specifically, the light reception efficiency D _PMTa (λ) in the detector 9, that is, the light reception efficiency when the fluorescence excited at 100% is incident on the detector 9 as 100% is _expressed as follows: Obtained by calculation formula. However, when normalizing the fluorescence output spectral characteristic data, the maximum value is not set to 1, and when the integral value in the entire wavelength range of the fluorescent main spectral characteristic is normalized to 1, the fluorescent output spectral characteristic F (λ) There is no need to divide by the integral value of.
D _PMTa (λ) = ∫P _PMTa (λ) / ∫F (λ)

ユーザはこの計算結果を参照することにより、その設定で観察に移行するか、再度別の光学素子の設定を行うかを判断し、選択することができる。
具体的には、ユーザがバリアフィルタ２２として、図７のような透過率分光特性を有する別のバリアフィルタ２２に切り替える場合には、演算部５はメモリ４から切り替えたバリアフィルタ２２の透過率分光特性のデータを読み出し、再計算を行う。その結果、図１３に示されるような蛍光強度分光特性のデータを得る。これについても波長全域での受光効率の計算を行う。 By referring to this calculation result, the user can determine and select whether to shift to observation with the setting or to set another optical element again.
Specifically, when the user switches to another barrier filter 22 having transmittance spectral characteristics as shown in FIG. 7 as the barrier filter 22, the calculation unit 5 transmits the transmittance spectrum of the barrier filter 22 switched from the memory 4. Read the characteristic data and recalculate. As a result, data of fluorescence intensity spectral characteristics as shown in FIG. 13 is obtained. Also for this, the light reception efficiency is calculated over the entire wavelength range.

図６のバリアフィルタ２２を用いた場合の検出器９での蛍光の受光効率は、ＦＩＴＣが６０．４％、Ｃｙ３が１９％であった。一方、図７のバリアフィルタ２２のときの検出器９での蛍光の受光効率はＦＩＴＣが２６．８％、Ｃｙ３がほぼ０％であった。 When the barrier filter 22 of FIG. 6 is used, the fluorescence light receiving efficiency of the detector 9 is 60.4% for FITC and 19% for Cy3. On the other hand, the fluorescence light receiving efficiency of the detector 9 in the case of the barrier filter 22 of FIG. 7 was 26.8% for FITC and almost 0% for Cy3.

この結果から、観察対象外の蛍光の受光効率を観察対象および観察対象外の蛍光の受光効率の和で除算することによりクロストーク率を求める。例えば、図７のバリアフィルタ２２のときの検出器９でのクロストーク率は０／（２６．８＋０）＝０％である。図６のバリアフィルタ２２のときの検出器９でのクロストーク率は、１９．０／（１９．０＋６０．４）＝２３．９％である。 From this result, the crosstalk rate is obtained by dividing the light reception efficiency of the fluorescence outside the observation target by the sum of the light reception efficiencies of the observation target and the non-observation fluorescence. For example, the crosstalk rate at the detector 9 for the barrier filter 22 of FIG. 7 is 0 / (26.8 + 0) = 0%. The crosstalk rate at the detector 9 in the case of the barrier filter 22 of FIG. 6 is 19.0 / (19.0 + 60.4) = 23.9%.

ユーザはこの受光効率およびクロストーク率に基づいて、どちらのバリアフィルタ２２を用いた方がよいかを決定することができる。通常は、受光効率が高い方が明るい画像を取得できるので、図６のバリアフィルタ２２を選択するが、クロストーク率として１０％以上のものをＮＧとする場合には、クロストーク率が低い図７のバリアフィルタ２２を採用することができる。 The user can determine which barrier filter 22 should be used based on the light receiving efficiency and the crosstalk rate. Normally, a brighter image can be obtained when the light receiving efficiency is higher, so the barrier filter 22 in FIG. 6 is selected. However, when the crosstalk ratio is 10% or more and NG, the crosstalk ratio is low. 7 barrier filter 22 can be employed.

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の第２の実施例について、以下に説明する。
本実施例においては、蛍光試薬として、４８８ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＦＩＴＣおよび５４３ｎｍで励起可能な蛍光試薬ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）を採用する。 Next, a second example of the laser microscope 1 according to this embodiment will be described below.
In this example, a fluorescent reagent FITC that can be excited at 488 nm and a fluorescent reagent Texas Red (trademark) that can be excited at 543 nm are employed as the fluorescent reagent.

ユーザが入力部７から観察対象の試料Ａを染色している蛍光試薬の種類（ＦＩＴＣ，ＴｅｘａｓＲｅｄ）を入力する。演算部５は、メモリ４から、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓＲｅｄの励起効率分光特性および蛍光出力分光特性のデータを読み出す。 The user inputs the type (FITC, Texas Red) of the fluorescent reagent that stains the sample A to be observed from the input unit 7. The calculation unit 5 reads the data of the excitation efficiency spectral characteristics and the fluorescence output spectral characteristics of the fluorescent reagents FITC and Texas Red from the memory 4.

また、ユーザが、入力部７から光路中に挿入する励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の種類、使用するレーザ波長を入力する。演算部５は、メモリ４から光路内に挿入する励起ダイクロイックミラー１８、分光ダイクロイックミラー２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性を読み出す。 Further, the user inputs the types of the excitation dichroic mirror 18, the spectroscopic dichroic mirror 21 and the barrier filters 22 and 23 to be inserted into the optical path, and the laser wavelength to be used from the input unit 7. The computing unit 5 reads the transmittance spectral characteristics of the excitation dichroic mirror 18, the spectral dichroic mirror 21, and the barrier filters 22 and 23 that are inserted into the optical path from the memory 4.

例えば、蛍光試薬ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓＲｅｄを同時観察する場合には、４８８ｎｍおよび５４３ｎｍのレーザ光を同時出射し、励起ダイクロイックミラー１８として図４のような透過率分光特性を有するもの、分光ダイクロイックミラー２１として図５のような透過率分光特性を有するものおよびバリアフィルタ２２，２３として図７および図８のような透過率分光特性を有するものをそれぞれ光路内に挿入することになる。 For example, in the case of simultaneously observing the fluorescent reagents FITC and Texas Red, laser beams having a wavelength of 488 nm and 543 nm are emitted simultaneously, and the excitation dichroic mirror 18 has transmittance spectral characteristics as shown in FIG. 5 having transmittance spectral characteristics as shown in FIG. 5 and barrier filters 22 and 23 having transmittance spectral characteristics as shown in FIGS. 7 and 8 are respectively inserted in the optical paths.

このとき、試料Ａから検出器９，１０に至る検出光学系１１全体の透過率は、蛍光が通過する光学素子の透過率および反射率の分光特性によって決定される。レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０およびミラーは固定されて切り替えられないものであるうえに、透過率または反射率が波長によらずほぼ一定であるとすることができ、この実施例においても考慮しないこととする。 At this time, the transmittance of the entire detection optical system 11 from the sample A to the detectors 9 and 10 is determined by the spectral characteristics of the transmittance and reflectance of the optical element through which the fluorescence passes. The lenses 13, 14, 15, 19, the scanner 16, the confocal pinhole 20, and the mirror are fixed and cannot be switched, and the transmittance or reflectance may be substantially constant regardless of the wavelength. This is not considered in this embodiment.

これにより、試料Ａから検出器９，１０へ至る検出光学系１１全体の透過率は、励起ダイクロイックミラー１８の透過率、分光ダイクロイックミラー２１の反射率およびバリアフィルタ２２，２３の透過率によって決定される。分光ダイクロイックミラー２１の反射率としては、メモリ４に記憶されている分光ダイクロイックミラー２１の透過率の分光特性を透過率１から減算したものを使用する。 Thereby, the transmittance of the entire detection optical system 11 from the sample A to the detectors 9 and 10 is determined by the transmittance of the excitation dichroic mirror 18, the reflectance of the spectral dichroic mirror 21, and the transmittance of the barrier filters 22 and 23. The As the reflectance of the spectral dichroic mirror 21, a value obtained by subtracting the spectral characteristic of the transmittance of the spectral dichroic mirror 21 stored in the memory 4 from the transmittance 1 is used.

すなわち、波長λにおけるダイクロイックミラー１８，２１およびバリアフィルタ２２，２３の透過率をＴ_ＤＭａ（λ）、Ｔ_ＤＭｂ（λ）、Ｔ_ＢＦｂ（λ）、Ｔ_ＢＦｃ（λ）とすると、試料Ａから検出器９，１０へ至る検出光学系１１全体の透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ），Ｔ_ＰＭＴｂ（λ）は、それぞれ以下の計算式により求められる。
Ｔ_ＰＭＴａ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・｛１−Ｔ_ＤＭｂ（λ）｝・Ｔ_ＢＦｂ（λ）
Ｔ_ＰＭＴｂ（λ）＝Ｔ_ＤＭａ（λ）・Ｔ_ＤＭｂ（λ）・Ｔ_ＢＦｃ（λ） That is, the transmittance of the dichroic mirrors 18, 21 and the barrier filters 22 and 23 at the wavelength _{_{λ T DMa (λ), T}} DMb (λ), T BFb (λ), when the _{T BFc} (lambda), detected from the sample A The transmittances T _PMTa (λ) and T _PMTb (λ) of the entire detection optical system 11 reaching the devices 9 and 10 are obtained by the following calculation formulas, respectively.
T _PMTa (λ) = T _DMa (λ) · {1−T _DMb (λ)} · T _BFb (λ)
T _PMTb (λ) = T _DMa (λ) · T _DMb (λ) · T _BFc (λ)

この計算式により得られた透過率Ｔ_ＰＭＴａ（λ）に蛍光試薬毎の蛍光出力分光特性Ｆ（λ）を乗じることにより、蛍光試薬ＦＩＴＣ，ＴｅｘａｓＲｅｄが発する蛍光の、検出器９，１０における受光効率の分光特性が求められる。さらに、本実施例では波長４８８ｎｍと波長５４３ｎｍのレーザ光を同時出射するので、使用レーザ波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍでの励起効率Ｘ_４８８，Ｘ_５４３の合計がレーザ光源２全体の励起効率となる。これを受光効率の分光特性に乗ずることによって、検出器９，１０に入射する蛍光強度の分光特性Ｐ_ＰＭＴａ（λ），Ｐ_ＰＭＴｂ（λ）を求めることができる。 By _multiplying the transmittance T _PMTa (λ) obtained by this calculation formula by the fluorescence output spectral characteristic F (λ) for each fluorescent reagent, the light received by the detectors 9 and 10 is received by the fluorescent reagents FITC and Texas Red. Spectral characteristics of efficiency are required. Furthermore, in the present embodiment, laser beams having a wavelength of 488 nm and a wavelength of 543 nm are emitted simultaneously, so that the sum of the excitation efficiencies X ₄₈₈ and X ₅₄₃ at the used laser wavelengths 488 nm and 543 nm is the excitation efficiency of the entire laser light source 2. By multiplying this by the spectral characteristic of the light receiving efficiency, the spectral characteristics P _PMTa (λ) and P _PMTb (λ) of the fluorescence intensity incident on the detectors 9 and 10 can be obtained.

具体的には、波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍのレーザ出力をそれぞれＬ_４８８、Ｌ_５４３とすると、
Ｐ_ＰＭＴａ(λ)
＝Ｔ_ＰＭＴａ(λ)・Ｆ(λ)・{Ｘ_４８８・(１−Ｔ_ＤＭａ(４８８))・Ｌ_４８８
＋Ｘ_５４３・(１−Ｔ_ＤＭａ(５４３))・Ｌ_５４３}
Ｐ_ＰＭＴｂ(λ)
＝Ｔ_ＰＭＴｂ(λ)・Ｆ(λ)・{Ｘ_４８８・(１−Ｔ_ＤＭａ(４８８))・Ｌ_４８８
＋Ｘ_５４３・(１−Ｔ_ＤＭｂ(５４３))・Ｌ_５４３} Specifically, when laser outputs of wavelengths 488 nm and 543 nm are L ₄₈₈ and L ₅₄₃ , respectively,
P _PMTa (λ)
= T _PMTa (λ) · F (λ) · {X ₄₈₈ · (1-T _DMa (488)) · L ₄₈₈
+ X ₅₄₃ · (1-T _DMa (543)) · L ₅₄₃ }
P _PMTb (λ)
= T _PMTb (λ) · F (λ) · {X ₄₈₈ · (1-T _DMa (488)) · L ₄₈₈
+ X ₅₄₃ · (1-T _DMb (543)) · L ₅₄₃ }

波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍのレーザ出力Ｌ_４８８、Ｌ_５４３を１とすると、図１４および図１５に示される蛍光の受光効率の分光特性が得られる。
また、バリアフィルタ２３を図９に示される透過率分光特性を有するものに切り替えた場合には図１６に示されるような蛍光強度の分光特性が得られる。 When the laser outputs L ₄₈₈ and L ₅₄₃ of wavelengths 488 nm and 543 nm are set to 1, the spectral characteristics of the fluorescence light receiving efficiency shown in FIGS. 14 and 15 are obtained.
Further, when the barrier filter 23 is switched to the one having the transmittance spectral characteristic shown in FIG. 9, the spectral characteristic of fluorescence intensity as shown in FIG. 16 is obtained.

このようにして得られた分光特性に基づいて、第１の実施例と同様に蛍光強度およびクロストークの度合を比較することにより、最適なバリアフィルタ２３を選択することができる。また、複数の波長のレーザ光を使用しているので、レーザ波長毎に出力の比率を変えることによって、クロストークの度合を変更することもできる。 Based on the spectral characteristics thus obtained, the optimum barrier filter 23 can be selected by comparing the fluorescence intensity and the degree of crosstalk as in the first embodiment. In addition, since laser beams having a plurality of wavelengths are used, the degree of crosstalk can be changed by changing the output ratio for each laser wavelength.

例えば、波長４８８ｎｍよりも波長５４３ｎｍのレーザ光の出力を上げることによって、検出器１０におけるＴｅｘａｓＲｅｄの蛍光強度を相対的に高めることができる。これをシミュレートすることにより、特定の光学系においてクロストークを許容範囲内に納めるためのレーザ光の出力の比率を求めることができる。 For example, the fluorescence intensity of Texas Red in the detector 10 can be relatively increased by increasing the output of laser light having a wavelength of 543 nm rather than the wavelength of 488 nm. By simulating this, it is possible to obtain the ratio of the laser light output for keeping the crosstalk within an allowable range in a specific optical system.

なお、最適なレーザ光源２および光学素子を選択するために、受光効率およびクロストークの度合だけで判断するのではなく、レーザ光の遮断の程度を考慮するとさらに効果的である。具体的には、光路内に挿入しているバリアフィルタ２２，２３のレーザ波長での透過率を参照し、それが予め設定された透過率よりも低ければレーザ光遮断が可能であると判断する。 Note that, in order to select the optimum laser light source 2 and optical element, it is more effective when considering the degree of blocking of the laser light rather than judging only by the light receiving efficiency and the degree of crosstalk. Specifically, the transmittance at the laser wavelength of the barrier filters 22 and 23 inserted in the optical path is referred to, and if it is lower than the preset transmittance, it is determined that the laser beam can be blocked. .

例えば、レーザ波長４８８ｎｍで、図６のような透過率の分光特性を有するバリアフィルタ２２，２３を用いた場合には、そのバリアフィルタ２２，２３の波長４８８ｎｍでの透過率が予め設定されている閾値（例えば、０．０１％）より低いので、レーザ光遮断が可能であり、このバリアフィルタ２２，２３が選択可能であると判断できる。このような場合には、予め保存しておく透過率の分光特性のデータの小数点以下の有効桁数を閾値と同等もしくは多くしておく必要がある。 For example, when the barrier filters 22 and 23 having the spectral characteristics of transmittance as shown in FIG. 6 are used at a laser wavelength of 488 nm, the transmittance at the wavelength 488 nm of the barrier filters 22 and 23 is set in advance. Since it is lower than the threshold value (for example, 0.01%), it can be determined that the laser light can be blocked and the barrier filters 22 and 23 can be selected. In such a case, it is necessary to make the number of significant digits after the decimal point of the spectral characteristic data of transmittance stored in advance equal to or larger than the threshold value.

また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１においては、ユーザが表示部６に表示された蛍光試薬毎の蛍光強度の分光特性あるいはクロストーク率に基づいて、クロストークの度合を判定することとしたが、これに代えて、クロストーク率に基づいてレーザ顕微鏡１が光学素子の設定を評価し、最適な光学素子を自動的に選定することにしてもよい。 In the laser microscope 1 according to the present embodiment, the user determines the degree of crosstalk based on the spectral characteristics or the crosstalk rate of the fluorescence intensity for each fluorescent reagent displayed on the display unit 6. Instead of this, the laser microscope 1 may evaluate the setting of the optical element based on the crosstalk rate and automatically select the optimum optical element.

この場合の処理の流れを図１７に示されるフローチャートに従って説明する。
まず、ユーザが蛍光試薬の種類および使用するレーザ光の波長を入力部７から入力する（ステップＳ１１）。
演算部５は、入力された蛍光試薬を観察可能な光学素子のうち、いずれかの組合せを設定するとともに（ステップＳ１２）、蛍光試薬毎の励起効率の分光特性および蛍光出力の分光特性および設定された光学素子の分光特性をメモリ４から読み出す（ステップＳ１３）。 The processing flow in this case will be described with reference to the flowchart shown in FIG.
First, the user inputs the type of fluorescent reagent and the wavelength of the laser beam to be used from the input unit 7 (step S11).
The calculation unit 5 sets any combination of optical elements that can observe the input fluorescent reagent (step S12), and sets and sets the spectral characteristics of excitation efficiency and fluorescent output of each fluorescent reagent. The spectral characteristics of the optical element are read out from the memory 4 (step S13).

次いで、上述したレーザ光の遮断可否を判定し（ステップＳ１４）、遮断可能である場合には、蛍光色素毎の蛍光強度を算出する（ステップＳ１５）。また、単一染色か否かを判定し（ステップＳ１６）、単一染色ではない場合には、およびクロストーク率を算出し（ステップＳ１７）、クロストーク率が許容範囲か否かを判定する（ステップＳ１８）。 Next, it is determined whether or not the laser beam can be blocked (step S14). If the laser beam can be blocked, the fluorescence intensity for each fluorescent dye is calculated (step S15). In addition, it is determined whether or not it is single staining (step S16). If it is not single staining, a crosstalk rate is calculated (step S17), and it is determined whether or not the crosstalk rate is within an allowable range (step S17). Step S18).

クロストーク率が許容範囲内である場合には、蛍光強度が最も高いか否かを判定し（ステップＳ１９）、最も高い場合にはこれを最適な光学素子の組合せとして登録する（ステップＳ２０）。単一染色の場合には、クロストークの判定を行うことなく蛍光強度の判定を行う。 If the crosstalk rate is within the allowable range, it is determined whether or not the fluorescence intensity is the highest (step S19), and if it is the highest, this is registered as the optimum combination of optical elements (step S20). In the case of single staining, the fluorescence intensity is determined without determining crosstalk.

レーザ光が遮断できない場合、クロストーク率が許容範囲を超えている場合および蛍光強度が最も高い組合せではない場合には、全ての光学素子の組合せについて判定されたか否かを判断し（ステップＳ２１）、まだ判定していないものが残っている場合には、光学素子の組合せを変更して（ステップＳ２２）、ステップＳ１３〜Ｓ２１を繰り返す。 When the laser beam cannot be blocked, when the crosstalk rate exceeds the allowable range, and when the fluorescence intensity is not the highest combination, it is determined whether or not the combination of all the optical elements has been determined (step S21). If there are still undecided ones, the combination of optical elements is changed (step S22), and steps S13 to S21 are repeated.

全ての光学素子の組合せについて判定が行われたときには、登録されている最適な光学素子の組合せが存在するか否かを判定し（ステップＳ２３）、存在する場合には、登録されている光学素子を光路内に挿入して観察準備を終了し（ステップＳ２４）、登録されていない場合には観察不可能である旨のメッセージを報知して終了する（ステップＳ２５）。 When all the optical element combinations are determined, it is determined whether or not there is an optimum registered optical element combination (step S23). Is inserted into the optical path to complete the observation preparation (step S24), and if it is not registered, a message indicating that the observation is impossible is informed and the process ends (step S25).

なお、上記各実施例においては、レンズ１３，１４，１５，１９、スキャナ１６、共焦点ピンホール２０およびミラーの透過率や反射率の分光特性を考慮していないが、厳密にはこれらの光学素子も透過率および反射率の分光特性を有するので、これらの分光特性をメモリ４に記憶しておき、より正確な受光効率を算出する際に使用することにしてもよい。 In each of the above embodiments, the spectral characteristics of the transmittance and reflectance of the lenses 13, 14, 15, 19, the scanner 16, the confocal pinhole 20, and the mirror are not considered. Since the element also has spectral characteristics of transmittance and reflectance, these spectral characteristics may be stored in the memory 4 and used when calculating more accurate light receiving efficiency.

また、図１８に示されるように、バリアフィルタ２２，２３に代えて、ミラー２９，３０、グレーティング３１，３２およびスリット３３，３４を用いたレーザ顕微鏡の場合には、バリアフィルタ２２，２３の透過率分光特性の代わりに、グレーティング３１，３２の角度とスリット３３，３４の幅とによって決定される透過波長範囲の透過率を１００％、それ以外の波長範囲の透過率を０％として計算に使用することとしてもよい。 As shown in FIG. 18, in the case of a laser microscope using mirrors 29 and 30, gratings 31 and 32 and slits 33 and 34 instead of the barrier filters 22 and 23, transmission through the barrier filters 22 and 23. Instead of the rate spectral characteristics, the transmittance in the transmission wavelength range determined by the angle of the gratings 31 and 32 and the width of the slits 33 and 34 is set to 100%, and the transmittance in the other wavelength ranges is set to 0%. It is good to do.

また、メモリ４に記憶する特性として、レーザ光源２がレーザダイオードの場合に、レーザ光源２への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率およびレーザ光源２から試料Ａに至る光学系の特性をレーザ光の波長毎にデータとして記憶しておいてもよい。
また、照明光学系８が、音響光学素子を含む場合には、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性をメモリ４に記憶しておいてもよい。 Further, as characteristics to be stored in the memory 4, when the laser light source 2 is a laser diode, spectral characteristics for each applied voltage or ambient temperature to the laser light source 2, excitation efficiency of each fluorescent material, and the laser light source 2 to the sample A. The characteristics of the optical system may be stored as data for each wavelength of the laser beam.
When the illumination optical system 8 includes an acoustooptic element, the transmittance characteristic for each control wavelength of the acoustooptic element may be stored in the memory 4.

また、光学系の設定について、ユーザが入力部７から入力することとしたが、各光学素子に識別符号を備えておき、装着された光学素子の識別符号を読み取ることにより直接取得することとしてもよい。 In addition, the user inputs the optical system settings from the input unit 7, but each optical element may be provided with an identification code and directly acquired by reading the identification code of the mounted optical element. Good.

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す全体構成図である。It is a whole lineblock diagram showing the laser microscope concerning one embodiment of the present invention. 図１のレーザ顕微鏡の顕微鏡本体の構成要素を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the component of the microscope main body of the laser microscope of FIG. 図１のレーザ顕微鏡による光学素子の設定手順を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the setting procedure of the optical element by the laser microscope of FIG. 第１のダイクロイックミラーの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 1st dichroic mirror. 第２のダイクロイックミラーの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 2nd dichroic mirror. 第１のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 1st barrier filter. 第２のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 2nd barrier filter. 第３のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 3rd barrier filter. 第４のバリアフィルタの透過率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the transmittance | permeability spectral characteristic of a 4th barrier filter. 蛍光色素毎の励起効率分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the excitation efficiency spectral characteristic for every fluorescent dye. 蛍光色素毎の蛍光出力分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence output spectral characteristic for every fluorescent dye. 第１の実施例において、第１のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence intensity spectral characteristic in the detector at the time of using a 1st barrier filter in a 1st Example. 第１の実施例において、第２のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence intensity spectral characteristic in the detector at the time of using a 2nd barrier filter in a 1st Example. 第２の実施例において、第２のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence intensity spectral characteristic in the detector at the time of using a 2nd barrier filter in a 2nd Example. 第２の実施例において、第３のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence intensity spectral characteristic in the detector at the time of using a 3rd barrier filter in a 2nd Example. 第２の実施例において、第４のバリアフィルタを使用した場合の検出器における蛍光強度分光特性を示すグラフである。It is a graph which shows the fluorescence intensity spectral characteristic in the detector at the time of using a 4th barrier filter in a 2nd Example. 図１のレーザ顕微鏡による光学素子の自動設定手順を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the automatic setting procedure of the optical element by the laser microscope of FIG. 図１のレーザ顕微鏡の変形例を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the modification of the laser microscope of FIG.

符号の説明Explanation of symbols

Ａ試料
１レーザ顕微鏡
２レーザ光源（光源）
４メモリ（特性記憶部）
５演算部（クロストーク判定部、設定評価部）
６表示部
９，１０検出器
１１検出光学系
２２，２３バリアフィルタ A Sample 1 Laser microscope 2 Laser light source (light source)
4 Memory (characteristic storage unit)
5 Calculation unit (crosstalk determination unit, setting evaluation unit)
6 Display unit 9, 10 Detector 11 Detection optical system 22, 23 Barrier filter

Claims

励起光を出射する光源と、
該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、
前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、
該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、
複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、
該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度を対比可能に表示する表示部とを備えるレーザ顕微鏡。 A light source that emits excitation light;
A detector that detects fluorescence generated in the fluorescent material in the sample by being irradiated with excitation light from the light source;
A setting variable detection optical system for guiding fluorescence from the sample to the detector;
A characteristic storage unit for storing, as data, spectral characteristics for each setting of the detection optical system, fluorescent spectral characteristics for each fluorescent substance, and excitation efficiency for each fluorescent substance;
When performing fluorescence observation of a sample containing a plurality of fluorescent substances, a calculation unit that calculates the fluorescence intensity for each fluorescent substance in the detector based on the data stored in the characteristic storage unit;
A laser microscope comprising: a display unit that displays the fluorescence intensity of each fluorescent substance at a specific wavelength calculated by the calculation unit in a comparable manner.

励起光を出射する光源と、
該光源からの励起光が照射されることにより試料内の蛍光物質において発生した蛍光を検出する検出器と、
前記試料からの蛍光を前記検出器に導く設定可変の検出光学系と、
該検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および蛍光物質毎の励起効率をデータとして記憶する特性記憶部と、
複数の蛍光物質を含む試料を蛍光観察する際に、前記特性記憶部に記憶されているデータに基づいて前記検出器における蛍光物質毎の蛍光強度を算出する演算部と、
該演算部により算出された特定波長における蛍光物質毎の蛍光強度の比率に基づいてクロストークの度合を判定するクロストーク判定部とを備えるレーザ顕微鏡。 A light source that emits excitation light;
A detector that detects fluorescence generated in the fluorescent material in the sample by being irradiated with excitation light from the light source;
A setting variable detection optical system for guiding fluorescence from the sample to the detector;
A characteristic storage unit for storing, as data, spectral characteristics for each setting of the detection optical system, fluorescent spectral characteristics for each fluorescent substance, and excitation efficiency for each fluorescent substance;
When performing fluorescence observation of a sample containing a plurality of fluorescent substances, a calculation unit that calculates the fluorescence intensity for each fluorescent substance in the detector based on the data stored in the characteristic storage unit;
A laser microscope comprising: a crosstalk determination unit that determines a degree of crosstalk based on a ratio of fluorescence intensity for each fluorescent substance at a specific wavelength calculated by the calculation unit.

前記演算部により算出された蛍光強度および前記クロストーク判定部により判定されたクロストークの度合に基づいて、検出光学系の設定を評価する設定評価部を備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡。 The laser microscope according to claim 2, further comprising: a setting evaluation unit that evaluates a setting of the detection optical system based on the fluorescence intensity calculated by the calculation unit and the degree of crosstalk determined by the crosstalk determination unit.

前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性および蛍光物質毎の蛍光分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The calculation unit multiplies the sum of the spectral characteristic for each setting of the detection optical system and the characteristic value for each wavelength of the fluorescent spectral characteristic for each fluorescent substance by the excitation efficiency for each fluorescent substance. The laser microscope according to claim 3.

前記特性記憶部が、さらに、検出器の光電変換効率の分光特性をデータとして記憶し、
前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The characteristic storage unit further stores the spectral characteristics of the photoelectric conversion efficiency of the detector as data,
Instead of the fluorescence intensity, the arithmetic unit is multiplied by the sum of spectral characteristics for each setting of the detection optical system, fluorescence spectral characteristics for each fluorescent substance, and characteristic values for each wavelength of photoelectric conversion efficiency of the detector, The laser microscope according to any one of claims 1 to 3, wherein a signal level after photoelectric conversion is calculated by multiplying excitation efficiency for each fluorescent substance.

前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の分光特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The characteristic storage unit further stores the output value of the light source, the excitation efficiency of each fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system from the light source to the sample as data for each wavelength of the excitation light,
The calculation unit multiplies the spectral characteristics for each setting of the detection optical system, the fluorescent spectral characteristics for each fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system for each wavelength. The laser microscope according to claim 1, wherein the excitation efficiency for each fluorescent substance is multiplied.

前記特性記憶部が、さらに、光源の出力値、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、蛍光強度に代えて、前記検出光学系の設定毎の分光特性、蛍光物質毎の蛍光分光特性および検出器の光電変換効率の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、前記光源の出力値および蛍光物質毎の励起効率を乗算して光電変換後の信号レベルを演算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The characteristic storage unit further stores the output value of the light source, the excitation efficiency of each fluorescent substance, and the characteristics of the illumination optical system from the light source to the sample as data for each wavelength of the excitation light,
Instead of the fluorescence intensity, the arithmetic unit is multiplied by the sum of spectral characteristics for each setting of the detection optical system, fluorescence spectral characteristics for each fluorescent substance, and characteristic values for each wavelength of photoelectric conversion efficiency of the detector, The laser microscope according to any one of claims 1 to 3, wherein a signal level after photoelectric conversion is calculated by multiplying an output value of the light source and an excitation efficiency for each fluorescent substance.

前記光源がレーザダイオードであり、
前記特性記憶部が、光源への印加電圧または環境温度毎の分光特性、各蛍光物質の励起効率および光源から試料に至る照明光学系の特性を励起光の波長毎にデータとして記憶し、
前記演算部が、光源の分光特性、前記検出光学系の分光特性、蛍光物質の蛍光分光特性および照明光学系の分光特性の波長毎の特性値どうしを乗算したものの総和に、蛍光物質毎の励起効率を乗算する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The light source is a laser diode;
The characteristic storage unit stores the spectral characteristics for each voltage applied to the light source or the ambient temperature, the excitation efficiency of each fluorescent material, and the characteristics of the illumination optical system from the light source to the sample as data for each wavelength of the excitation light,
The calculation unit multiplies the spectral characteristics of the light source, the spectral characteristics of the detection optical system, the fluorescent spectral characteristics of the fluorescent substance, and the spectral characteristics of the illumination optical system for each wavelength. The laser microscope according to claim 1, which multiplies efficiency.

前記照明光学系が、音響光学素子を含み、
前記照明光学系の分光特性が、音響光学素子の制御波長毎の透過率特性を含む請求項６から請求項８のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The illumination optical system includes an acousto-optic element,
The laser microscope according to any one of claims 6 to 8, wherein the spectral characteristic of the illumination optical system includes a transmittance characteristic for each control wavelength of the acousto-optic element.

前記設定可変の検出光学系が、挿脱可能なバリアフィルタを含む請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。 The laser microscope according to claim 1, wherein the setting variable detection optical system includes a removable barrier filter.