JP5009460B2 - 転写に基づく二本鎖dna標的の増幅 - Google Patents
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Description
本発明は、DNA標的を増幅するための転写に基づく増幅方法に関する。
【0002】
核酸増幅法は、分子生物学および組換えDNA技術の分野で使用されている。このような方法は、存在量が少なく、そして多くの場合には、広範囲の様々な他の核酸(RNAおよびDNAの両方)もまた存在する環境に存在する特定の核酸配列のコピー数を増やすために使用されている。特に、核酸増幅法は、核酸の検出または定量を容易にするために使用されており、例えば、感染性疾患、遺伝病および様々なタイプのガンを診断するために重要である。核酸増幅法はまた、核酸が微量で存在し得るサンプルが調べられる他の分野、例えば、法廷科学、考古学または父親鑑定などの分野において用途が見出されている。
【0003】
いくつかの核酸増幅技術が、異なる作用機構に基づいて知られている。核酸増幅に関する1つの方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)として知られている。これは、欧州特許出願EP200362および同EP201148に記載されている。PCRは、二本鎖DNAが標的として使用される周期的なプロセスである。PCRプロセスの各サイクルは、二本鎖DNAの標的をその2つの相補的な鎖に分けることによって開始される。それぞれの鎖に対して、プライマーがアニーリングし、そして存在するDNAポリメラーゼは、プライマーがアニーリングしたDNA鎖に沿ってプライマーを伸長させ、その結果、2つの新しいDNA二重鎖が形成される。反応混合物を加熱すると、このDNA二重鎖の鎖は再び分離し、そして新しいPCRサイクルが開始できる。従って、PCRプロセスによって、DNA標的の多数のDNAコピーが得られる。一本鎖RNAがPCRの所望する標的である場合、RNAは、最初に逆転写酵素によって二本鎖DNAに変換されなければならない。
【0004】
本発明は、異なる種類の核酸増幅法、すなわち、「転写に基づく増幅技術」に関連する。この技術は、多数のRNAコピーを、RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含むテンプレートから転写することを含む。この方法によって、多数のRNAコピーが、RNAポリメラーゼによって認識される機能的なプロモーターを含むDNAテンプレートから転写される。このコピーは再び標的として使用され、そのようなコピーから大量のDNAテンプレートが新しく得られる。そのような方法は、Gingeras他による国際特許公開WO88/10315に、そしてBurg他による国際特許公開WO89/1050に記載されている。等温での転写に基づく増幅技術が、Davey他による欧州特許EP323822(NASBA法に関する)に、Gingeras他による欧州特許EP373960に、そしてKacian他による欧州特許EP408295に記載されている。転写に基づく増幅反応はまた、熱に安定性な酵素を用いて行うことができる。転写に基づく増幅は、通常、41℃付近の温度で行われる。このような熱に安定な酵素は、反応をより高い温度で行うことを可能にする。そのような熱に安定な方法は、東洋紡績(株)の名で出願された欧州特許EP682121に記載されている。
【0005】
欧州特許EP323822、同EP373960および同EP408295に記載されているような方法は、等温の連続的な方法である。これらの方法の場合、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNアーゼ(H)活性およびRNAポリメラーゼ活性の4つの酵素活性が、増幅を達成するために必要である。これらの活性のいくつかは1つの酵素において一緒にすることができ、従って、通常は、2つまたは3つの酵素が必要とされるだけである。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素は、DNAをRNAテンプレートから合成する酵素である。従って、DNA依存性DNAポリメラーゼは、DNAをDNAテンプレートから合成する。転写に基づく増幅反応において、AMV(ニワトリ骨髄芽球症ウイルス)逆転写酵素またはMMLV(モロニーマウス白血病ウイルス)逆転写酵素などの逆転写酵素を使用することができる。そのような酵素は、RNAおよびDNAの両方に依存性するDNAポリメラーゼ活性を有するが、固有的なRNアーゼ活性もまた有する。さらに、大腸菌のRNアーゼHなどのRNアーゼは、転写に基づく増幅反応の反応混合物に加えることができる。
【0006】
DNA依存性RNAポリメラーゼは、多数のRNAコピーを、RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含むDNAテンプレートから合成する。RNAポリメラーゼの例は、大腸菌ならびにバクテリオファージT7、T3およびSP6から得られるポリメラーゼである。転写に基づく増幅法により広く使用されているRNAポリメラーゼの例は、T7ポリメラーゼである。従って、多数コピーのRNAを転写するために使用されるテンプレートに組み込まれるプロモーターは、T7プロモーターである。通常、プロモーターを含むテンプレートは、標的配列を含む核酸から出発して作製しなければならない。そのような核酸は、増幅反応の試験材料として使用される出発材料に存在し得る。出発材料に存在する核酸は、通常、標的配列を、さらにより長い配列の一部として含有する。さらなる核酸配列が、標的配列の3’末端および5’末端の両方に存在していてもよい。増幅反応は、出発材料から得られたこのような核酸、上記の活性を一緒に提供する適切な酵素類、および少なくとも1つのオリゴヌクレオチド(しかし、通常は2つのオリゴヌクレオチド)を一緒にすることによって開始させることができる。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、プロモーターの配列を含まなければならない。
【0007】
転写に基づく増幅法は、試験材料が一本鎖RNAである場合には特に有用であるが、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを試験材料として同様に使用することができる。転写に基づく増幅法が、標的配列の3’末端および5’末端の両方にさらなる配列を有する(「プラス」センスの)一本鎖RNAを含むサンプルで行われる場合、先行技術において記載されているような方法により都合よく使用されている1対のオリゴヌクレオチドは下記のものからなる。
【0008】
− 標的配列の3’末端にハイブリダイゼーションし得る第1のオリゴヌクレオチド(通常は、「プロモーターオリゴヌクレオチド」と呼ばれる)であって、その5’末端に結合したプロモーター(好ましくは、T7プロモーター)の配列を有するオリゴヌクレオチド(このオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部分は、試験材料として使用されたプラスRNAと逆の極性を有する)
− 標的配列の3末端を含む第2のオリゴヌクレオチド(「プライマー」)(このオリゴヌクレオチドはプラスRNAと同じ極性を有する)。
【0009】
そのような1対のオリゴヌクレオチドは、適切な活性を有するすべての酵素ならびに十分な量の必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドと一緒に、1つの反応混合物に一緒に入れられ、そして適切な条件(すなわち、適切な緩衝液条件および適切な温度)のもとで十分な時間保たれるときに、等温の連続的な増幅反応が始まる。図1には、この分野で知られている転写に基づく増幅反応の一部について提案されている機構が示されている。この等温の連続的な増幅プロセスは、周期的なプロセスとして図1に描かれている。しかし、実際には、このプロセスのすべての工程は、すべての成分が反応容器中に存在しているので同じ温度で起こる。従って、事象の個々の順序は増幅プロセスの基礎となる考えられる機構をより良く理解するために有益であるようにプロセスが描かれているので、増幅中の反応混合物において実際に起こっていることを実際に反映しているとは考えられない。図1に示されているサイクルは、最初の量の一本鎖RNAで始まると見なすことができる。サイクルに示されているRNAはマイナスセンスRNAである。従って、RNAは、上記オリゴヌクレオチド対の第2のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができる。このマイナスRNAは、通常、増幅反応の出発材料においてはそのようなものとして存在しないが、例えば、反応混合物のすべての成分が一緒にされている場合、そのようなオリゴヌクレオチドおよび酵素との反応によって出発材料に存在するプラスRNAから得られる。
【0010】
上記方法の多くの変化体が先行技術に記載されている。図1に示されている反応図式から、(上記の)第2のオリゴヌクレオチドは、マイナスRNAに相補的なDNA鎖の合成を開始させるプライマーとして作用していることが理解され得る。プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドは、第2のオリゴヌクレオチドの伸長生成物の3’末端にアニーリングすることができる。このオリゴヌクレオチドのプロモーター部分は、第2のオリゴヌクレオチドの伸長生成物を伸長させて二本鎖プロモーターを得るためのテンプレートとして作用する。プロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端は、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素(逆転写酵素)によって伸長し得るが、この酵素は必ずしも必要ではない。プロモーター配列を含有するオリゴヌクレオチドのテンプレートとしての機能を示すために、このテンプレートは、転写に基づく増幅に関連する先行技術のいくつか(例えば、Genprobe Inc.の欧州特許EP408295)では「スプライステンプレート」と呼ばれている。そのような「スプライステンプレート」の3’末端はブロックすることさえできる。その場合、「スプライステンプレート」がプライマーとして作用する能力は完全に除かれている。
【0011】
図1は、転写に基づく増幅に関して提案される図式を示す。この図式は、一本鎖RNA転写物の合成を含む。上記のように、増幅され得る核酸を含有する出発材料は、この特定の形態の核酸を含有し得ない。出発材料は、特定の長さのマイナスRNAを含有しない。その理由は、図1に示されているような事象からなる提案されたこのサイクルは、おそらくは、出発材料における核酸から最初のRNA転写工程に至る一連の事象によって進むためである。上記に説明されているように、転写に基づく増幅法は、一本鎖RNAから始まる増幅に特に有用である。オリゴヌクレオチドの1つ、すなわち、プロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドは、次いで、この一本鎖RNAにアニーリングすることが考えられ、そしてRNA依存性DNAポリメラーゼを有する酵素(逆転写酵素など)によって伸長される。DNA−RNA二重鎖がこのようにして得られ、そのRNA鎖はRNアーゼHによって消化することができる。もう一方のオリゴヌクレオチドは、残ったDNA鎖にアニリーングし、そしてこの鎖をテンプレートして伸長する。従って、RNAポリメラーゼに対する機能的な二本鎖プロモーターを含む二本鎖DNAテンプレートを作製することができ、そしてこの二本鎖DNAテンプレートから最初の転写工程を行うことができる。このようにして得られた転写物は、図1に示される提案された反応図式に入れることができる。実際には、サンプル中の一本鎖RNAから始まるこの一連のすべての事象は、すべての成分を一緒にし、そしてこの混合物を、酵素が十分に活性である適切な温度にすると直ちに起こる。この方法の実施者は、これらの工程のいずれかを達成するために介入する必要はない。
【0012】
しかし、転写に基づく増幅法を、標的配列が二本鎖DNA(環状または線状のいずれか)としてのみ含まれる出発材料について行わなければならない場合、当業者は、出発材料に最初に存在する二本鎖DNAから一本鎖の核酸を得るための方法を最初に行わなければ、何も増幅され得ないと予想しよう。当業者は、DNAは二本鎖形態であるので、当業者のオリゴヌクレオチドはどれもDNAにアニーリングし得ないと予想している。転写に基づく増幅法に関する当業者の知識に基づいて、この場合に行われる最も妥当なことは、DNAを分離するために(100℃までの)高い温度を加えることによって二本鎖のDNA鎖を分離し、そしてオリゴヌクレオチドの一方をこの一本鎖の1つにアニーリングさせることである。現在の転写に基づく増幅法により使用されている酵素は、そのような高い温度に耐えることができず、そしてそのような場合、DNA鎖が分離された後で加えることできるだけである。オリゴヌクレオチドの1つが一本鎖DNAにアニリーングして伸長する場合、二本鎖のDNAが再び作製され、そして反応混合物は、二本鎖DNAをその分離した鎖に再び融解するのに十分に高い高温に供しなければならない。再度ではあるが、このような高温は、存在する酵素を失活させ、そして新しい酵素を、加熱工程が行われた後で再度加えなければならない。第2のオリゴヌクレオチドを次に加えることができ、そして第1の工程で伸長した(プロモーター)オリゴヌクレオチドから作製された鎖にアニーリングさせることができ、従って、二本鎖の機能的なプロモーターを含む二本鎖DNAテンプレートが得られ、このテンプレートからRNA転写の第1工程を行うことができる。得られたRNA転写物は図1に示されているようなサイクルに入れることができ、そしてプロセスはさらに等温的であり得る。
【0013】
上記から、転写に基づく増幅法を二本鎖DNAから始めることは冗長なプロセスであり得ることが明らかである。転写に基づく増幅法は、実施者が行わなければならないいくつかの特定の作業を必要とする;サンプルは加熱および冷却を繰り返し行わなければならず、そして酵素は各加熱工程の後で補給しなければならない。
【0014】
あるいは、出発材料中の二本鎖DNAは、増幅を開始する前にRNAに転写することができる。そのようなさらなる工程は、ポリメラーゼ結合部位とも呼ばれているプロモーター配列の非存在下で二本鎖DNAをRNAに転写する酵素(例えば、大腸菌のRNAポリメラーゼ)に基づくことができる。転写に基づく増幅法によって二本鎖DNAの増幅を容易にするさらなる工程のそのようなプロセスは、PCT特許出願公開WO9602668に記載されている。この手順に記載されているさらなる工程は、さらなる取り扱い工程を含むだけでなく、さらなる成分、すなわち、大腸菌のRNAポリメラーゼを使用することもまた含む。
【0015】
今回、サンプルが二本鎖DNAを含む場合に、転写に基づく増幅プロセスが適用できることが見出された。このプロセスは本質的に等温的であり、そしてこのプロセスによってDNAの配列を含む大量のRNA転写物が得られる。
【0016】
本発明の方法により、等温の転写に基づく増幅法が、二本鎖DNAを増幅するために提供される。二本鎖DNAを増幅するための本発明の方法は、前記二本鎖DNAを、
− 前記二本鎖DNAに含まれる2つのDNA鎖の第1鎖の一部に相補的な配列を含み、そしてRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターの配列をさらに含む、少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
− 前記二本鎖DNAに含まれる第2鎖の一部に相補的な配列を含む、さらなるオリゴヌクレオチド、
− RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
− DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
− RNアーゼH活性を有する酵素、
− RNAポリメラーゼ活性を有する酵素
と接触させる工程、およびこのようにして得られた反応混合物を、増幅が起こるのに十分な時間、適切な条件のもとで維持する工程を含む。
【0017】
本発明による方法は、小さなDNA分子(例えば、プラスミドDNA)を増幅するのに特に有用である。
【0018】
本発明の方法は、病原性微生物の小さなDNA分子を検出するのに特に有用であり、そのような検出により診断が可能になる。特に、HIV−1ウイルスの複製途中で形成されるHIV−1の環状DNA分子は、本発明の方法によって検出することができる。そのようなHIV−1の環状DNA分子の検出はウイルスの活性な複製を示しており、これは疾患の進行(すなわち、AIDSの発症)と相関し得る。別の適用において、本発明は、クラミジア種に天然に存在するプラスミドDNA分子を検出するために使用することができる。クラミジアのプラスミドはいくつかのビルレンス因子をコードし得る。このことは、プラスミドの検出は、クラミジア感染の存在を示すだけでなく、感染を引き起こすクラミジア細胞がいくつかのビルレンス因子を保有することを示すこともまた意味する。
【0019】
他のさらなる適用において、本発明の方法は、DNAの(部分的な)分解および単離を行った後のゲノム配列を増幅するために使用することができる。これは広範囲に適用され、そのような適用の多くは、ゲノムDNAにおける変異の検出および同定と関連し得る。このような変異は、ガンの診断、遺伝性疾患の診断、または疾患に対する素因の診断と関連し得る。
【0020】
驚くべきことに、転写に基づく増幅は、制限酵素でDNAを処理する必要がなく、あるいはさらに重要なことに、加熱することによって取り扱う前に鎖を分離する必要がなく、二本鎖DNAから始めることができる。等温の転写に基づく増幅反応により従来から使用されている試薬はすべて、二本鎖DNAを含有する出発材料について、それが一本鎖RNAであるかのように、単に使用することができる。
【0021】
本発明による方法により使用される酵素は、転写に基づく増幅法に好適であるとしてこの分野で知られている任意の酵素であり得る。反応条件は、一本鎖RNAを増幅するために広く使用されている先行技術の転写に基づく増幅法と本質的には同じである。本発明の場合、転写に基づく増幅反応がそれに従って機能すると考えられる機構の知識に基づいて、本発明の方法が機能し得ないことを当業者が予想したとしても、本質的には同じプロトコルを二本鎖DNAの等温的な転写に基づく増幅に使用できることが今回見出された。
【0022】
好ましい実施形態において、DNAは、増幅用オリゴヌクレオチドの存在下で、しかし増幅用酵素の非存在下で65℃に加熱される。酵素は、反応混合物が増幅反応のインキュベーション温度(すなわち、41℃)に冷却された後で反応物に加えられるだけである。本発明の方法の別の実施形態において、DNAは、2つの増幅用オリゴヌクレオチドが存在するもとで100℃に加熱することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび伸長を行った後、新しく生成したDNA鎖は、第2のオリゴヌクレオチドがアニーリングして伸長し得る前に最初のDNAテンプレートから分離しなければならないという事実のために、本発明の方法が機能することを依然として予想していない。ただ1つの加熱工程を有するこの第2の好ましい実施形態において、酵素は、反応混合物が増幅インキュベーション温度(すなわち、41℃)に冷却された後で加えられるだけである。
【0023】
好ましくは、下記の2つのオリゴヌクレオチドが本発明による方法において使用される。
【0024】
− 二本鎖DNAの第1鎖において特定の配列にハイブリダイゼーションし得る第1のオリゴヌクレオチド(通常は、「プロモータープライマー」と呼ばれる)であって、その5’末端に結合したプロモーター(例えば、T7プロモーター)の配列を有するオリゴヌクレオチド、および
− 二本鎖DNAの第2鎖における特定の配列に対して十分に相補的な配列を含む第2のオリゴヌクレオチド(「プライマー」)。
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それらが互いにハイブリダイゼーションできないように選ばなければならない。
【0025】
二本鎖DNAを上記の2つのオリゴヌクレオチドおよび適切な酵素と接触させることによって、二本鎖DNAを構成する2つの鎖を分離するためのいくつかの鎖分離工程を全く必要としない転写に基づく増幅プロセスを行うことができることは驚くべきことである。本発明の方法によって、二本鎖DNAの配列の一部である標的配列を含む多数の線状RNAコピーが得られる。
【0026】
実施例
緒言
下記の実施例は、本発明の機構および有用性を明らかにする。実施例は限定的ではなく、そしてそのように見なすべきではない。下記の実施例において使用されている酵素は、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、T7RNAポリメラーゼおよび大腸菌RNアーゼHである。類似する活性を有する他の酵素および他の起源から得られる酵素を使用することができる。異なるプロモーター特異性を有する他のRNAポリメラーゼもまた使用するのに好適であり得る。
【0027】
下記の実施例において使用されたNASBA反応条件は、20μlの容量において、40mMのtris(pH8.5)、42mMのKCl(または、後の実験では70mMのKCl)、12mMのMgCl2、5mMのDTT、1mMの各dNTP、2mMのrATP、2mMのrCTP、2mMのrUTP、1.5mMのrGTP、0.5mMのITP、0.2μMの各オリゴヌクレオチド、375mMのソルビトール、0.105g/lのBSA、6.4ユニットのAMV−RT、32ユニットのT7RNAポリメラーゼ、0.08ユニットの大腸菌RNアーゼH、および指定量のテンプレートであった。使用したオリゴヌクレオチド配列は例示であり、そして他の配列がこれらの標的配列および他の標的配列に対して使用されるので限定的ではない。
【0028】
実施例1
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
HIV−1gag1 P1:
【0029】
【化1】
【0030】
HIV−1gag1 P2:
【0031】
【化2】
【0032】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、HIV−1ゲノムのgag領域の一部を標的とする。増幅用試験物として、HIV−1ゲノムのgag領域を含むプラスミドDNAのpUCp24を種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したHIV−1gagプローブの5’GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT G3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、105分子の添加プラスミドDNAの感度で得ることができる。同じ結果を、65℃のインキュベーションを用いることなく同じプロセスで得ることができる。
【0033】
実施例2
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
HPV16 P1:
【0034】
【化3】
【0035】
HPV16 P2:
【0036】
【化4】
【0037】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、HPV16ゲノムの一部を標的とする。増幅用試験物として、HPV16ゲノムの全長を含有するプラスミドDNAのpHPV16を種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したHPV16プローブの5’AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GC3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、1pgの添加プラスミドDNAの感度で得ることができる。
【0038】
実施例3
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
トラコーマクラミジア天然プラスミド P1:
【0039】
【化5】
【0040】
トラコーマクラミジア天然プラスミド P2:
【0041】
【化6】
【0042】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)の天然プラスミドの一部を標的とする。増幅用試験物として、トラコーマクラミジアのプラスミド調製物を、トラコーマクラミジアの封入形成単位(IFU)の量に関して種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したトラコーマクラミジア天然プラスミドのプローブの5’CGT GCG GGG TTA TCT TAA AAG GGA T3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、0.01IFUに対応するプラスミドDNAの量で得ることができる。
【0043】
実施例4
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
組織因子 P1:
【0044】
【化7】
【0045】
組織因子 P2:
【0046】
【化8】
【0047】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ヒト組織因子遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、組織因子遺伝子の一部を含有するプラスミドDNAのpUC13−TFを種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識した組織因子プローブの5’GTT CAG GAA AGA AAA CAG CCA3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、103分子の添加プラスミドDNAの感度で得ることができる。
【0048】
実施例5
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
CD14 P1:
【0049】
【化9】
【0050】
CD14 P2:
【0051】
【化10】
【0052】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、ヒトCD14遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、CD14遺伝子の一部を含有するプラスミドDNAのpπH3Mを種々の添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したCD14プローブの5’CCA TGG AGC GCG CGT CCT3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果を、増幅において、103分子の添加プラスミドDNAの感度で得ることができる。
【0053】
実施例6
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
アクチン P1:
【0054】
【化11】
【0055】
アクチン P2:
【0056】
【化12】
【0057】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。括弧内のヌクレオチドは「縮重した」位置を示し、括弧内のヌクレオチドのいずれかが存在し得る。これらのプライマーは、増幅のために、ヒトアクチン遺伝子の一部を標的とする。増幅用試験物として、RNアーゼAで処理した全ヒトゲノムDNA(市販のヒト胎盤DNA)を400ngの添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したアクチンプローブの5’CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG A3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果は、増幅用試験物としてヒトゲノムDNAを使用して示され得る。
【0058】
実施例7
高温での変性工程を用いることなくNASBAによるDNA標的の増幅の可能性を明らかにするために、下記の2つのオリゴヌクレオチドを、上記のNASBA反応成分と組み合わせて使用した。
CMVエキソン4 P1:
【0059】
【化13】
【0060】
CMVエキソン4 P2:
【0061】
【化14】
【0062】
P1のT7プロモーター部分を斜体字で示す。これらのプライマーは、増幅のために、CMVゲノムの一部を標的とする。増幅用試験物として、CMV感染HEL細胞の全DNAをRNアーゼAで処理して、このDNAを、0.1細胞と等価な添加量で使用した。使用したプロトコルは、標的プラスミドDNAを緒言に記載されている酵素以外の上記成分と混合すること、65℃への加熱、41℃への冷却、酵素の添加、および41℃で90分間のインキュベーションからなった。増幅物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にブロットして、32Pで標識したCMVプローブの5’CTG CTA TGT CTT AGA GGA GA3’とハイブリダイゼーションした。陽性の結果は、増幅用試験物として、0.1細胞当量のDNAを使用して示される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、転写に基づく増幅の反応図式である。
Claims (9)
- 転写に基づく増幅方法により二本鎖DNAを増幅するための方法であって、前記二本鎖DNAに、
− 前記二本鎖DNAに含まれる2つのDNA鎖の第1鎖の一部に相補的な配列を含む少なくとも1つの第1のオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドはRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターの配列をさらに含み、及び
− 前記二本鎖DNAに含まれる第2鎖の一部に相補的な配列を含む第2のオリゴヌクレオチドの存在下で加熱及び冷却することで、前記第1の鎖の一部に相補的な配列を含む少なくとも1つの第1のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、
− RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
− DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
− RNアーゼH活性を有する酵素、
− RNAポリメラーゼ活性を有する酵素
と接触させる工程、および
このようにして得られた反応混合物を、酵素添加後は加熱処理することなく、転写に基づく増幅反応が起こるのに十分な時間、適切な等温条件のもとで維持する工程
を含む方法。 - 前記DNAが、前記オリゴヌクレオチドの存在下で一回加熱され、その後に増幅用酵素が加えられる請求項1に記載の方法。
- 逆転写酵素が使用される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項3に記載の方法。
- 前記プロモーター配列がT7プロモーター配列であり、そして使用されるRNAポリメラーゼがT7RNAポリメラーゼである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- さらにRNアーゼH酵素が使用される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNアーゼHが大腸菌のRNアーゼHである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAが、前記オリゴヌクレオチドの存在下で65℃に加熱され、その後に増幅用酵素が加えられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAが、前記の2つの増幅用オリゴヌクレオチドの存在下、100℃に一回加熱される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
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