JP5001240B2

JP5001240B2 - Biosensor, its manufacturing method, and its use

Info

Publication number: JP5001240B2
Application number: JP2008220418A
Authority: JP
Inventors: 成史伊藤; 純木村; 哲小出; 憲二横山
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tanita Corp
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tanita Corp
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2028-08-28
Also published as: JP2010054379A

Description

本発明は、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサ、その製造方法、その使用方法に関する。 The present invention relates to a biosensor that electrochemically detects a reaction between a substrate in a sample and an oxidoreductase to measure the substrate concentration, a method for producing the biosensor, and a method for using the biosensor.

従来のバイオセンサとしては、例えば特許文献１〜４に記載されたものがある。 Examples of conventional biosensors include those described in Patent Documents 1 to 4.

特許文献１では、グルコースを含有する試料をグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウムと接触させる電流滴定バイオセンサーシステムを開示している。 Patent Document 1 discloses an amperometric biosensor system in which a glucose-containing sample is brought into contact with glucose oxidase (GOD) and hexacyanoiron (III) potassium.

特許文献２には、電極上にフェロセン化合物を含有する光硬化性樹脂膜と順次作用する作用極を備えたグルコースセンサが開示されている。 Patent Document 2 discloses a glucose sensor having a working electrode that sequentially acts on a photocurable resin film containing a ferrocene compound on an electrode.

特許文献３には、電極上にフェロセン化合物を蒸着させた層と、蒸着層上にＧＯＤを固定化した層とを有する作用極を備えたグルコースセンサが開示されている。 Patent Document 3 discloses a glucose sensor including a working electrode having a layer in which a ferrocene compound is vapor-deposited on an electrode and a layer in which GOD is immobilized on the vapor-deposited layer.

特許文献４には、作用極上にＧＯＤとフェロセン化合物とを担持した識別層と作用極付近の温度を所定温度に維持する温度維持手段とを備えたグルコースセンサが開示されている。 Patent Document 4 discloses a glucose sensor including an identification layer carrying GOD and a ferrocene compound on a working electrode, and temperature maintaining means for maintaining the temperature near the working electrode at a predetermined temperature.

特許文献１乃至４に記載のグルコースセンサによってグルコースを測定するメカニズムは以下のとおりである。 The mechanism for measuring glucose by the glucose sensors described in Patent Documents 1 to 4 is as follows.

すなわち、グルコース１分子がＧＯＤによって酸化されるのに、２電子の作用極への移動がおこなわれる。そこで、これを電流値として検出する。この際、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウムやフェロセン化合物が電子受容体として機能する。
国際公開第８６／０７６３２号パンフレット特開平０２−２４０５５５号公報特開平０２−９９８５１号公報特開平０５−２５６８１２号公報特開平０９−２１０９４８号公報特開平０９−１５９６４５号公報 That is, although one molecule of glucose is oxidized by GOD, two electrons move to the working electrode. Therefore, this is detected as a current value. At this time, potassium hexacyanoiron (III) or a ferrocene compound functions as an electron acceptor.
International Publication No. 86/07632 Pamphlet Japanese Patent Laid-Open No. 02-240555 Japanese Patent Laid-Open No. 02-99851 JP 05-256812 A JP 09-210948 A JP 09-159645 A

しかしながら、上記文献記載の従来技術は、広範囲の基質濃度を精度よく測定することが難しかった。 However, the conventional techniques described in the above-mentioned documents have difficulty in accurately measuring a wide range of substrate concentrations.

たとえば、酸化還元酵素としてＧＯＤを用いるグルコースセンサの場合、特許文献５に開示されているように、グルコースがＧＯＤの作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生する過酸化水素を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定する。こうすることにより、グルコース濃度を間接的に求めることができる。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速される。そのため、グルコース濃度が約１００ｍｇ／ｄｌ程度迄しか直線検量範囲を示さないという問題があった。 For example, in the case of a glucose sensor using GOD as an oxidoreductase, as disclosed in Patent Document 5, glucose is oxidized in the presence of the enzyme by the action of GOD to produce gluconolactone, which is then generated. Hydrogen peroxide is oxidized on the working electrode, and the oxidation current value at that time is measured. By doing so, the glucose concentration can be obtained indirectly. However, when the measurement solution is a stock solution sample that is not diluted with water, the oxidation reaction is limited by the dissolved oxygen concentration. Therefore, there is a problem that the linear calibration range is shown only until the glucose concentration is about 100 mg / dl.

そこで、特許文献５では、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、フェロシアン化カリウムやパラベンゾキノン等の電子受容体をＧＯＤ等と共に用いることで、検量範囲を１０００ｍｇ／ｄＬまで拡大させている。しかしながら、電子受容体の測定電位が＋０．６Ｖと高いため、干渉物質の影響を受けやすいという問題がある。 Therefore, in Patent Document 5, the calibration range is expanded to 1000 mg / dL by using an electron acceptor such as potassium ferrocyanide or parabenzoquinone together with GOD or the like instead of oxygen having a finite concentration in the solution. However, since the measurement potential of the electron acceptor is as high as +0.6 V, there is a problem that it is easily affected by an interference substance.

また、特許文献６では、ＧＯＤを光架橋樹脂膜に包括固定化させるという構成をとることによって、検量範囲を２０００ｍｇ／ｄＬまで拡大させている。しかしながら、特許文献６では、電子受容体を用いていないため、上記説明したように、溶存酸素量に依存してしまうという問題がある。 In Patent Document 6, the calibration range is expanded to 2000 mg / dL by adopting a configuration in which GOD is comprehensively immobilized on a photocrosslinked resin film. However, since Patent Document 6 does not use an electron acceptor, there is a problem that it depends on the amount of dissolved oxygen as described above.

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料中に含まれる基質濃度の検量範囲を広範囲に設計することができ、かつ、精度よく基質濃度を測定することを可能とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and allows the calibration range of the substrate concentration contained in the sample to be designed over a wide range, and allows the substrate concentration to be measured with high accuracy.

本発明によれば、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサであって、
基板と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系と、
前記基板に設けられ、前記試料が導入される濃度測定領域と、
を有し、
前記濃度測定領域は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層が前記第一作用極に接するように設けられており、
前記第二測定領域には、第二反応層が前記第二作用極と接するように設けられており、
前記第一反応層は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含み、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含むことを特徴とするバイオセンサ
が提供される。 According to the present invention, a biosensor for electrochemically detecting a reaction between a substrate in a sample and an oxidoreductase to measure a substrate concentration,
A substrate,
An electrode system including a first working electrode and a second working electrode different from the first working electrode;
A concentration measurement region provided on the substrate and into which the sample is introduced;
Have
The concentration measurement region is
A first measurement region for measuring a relatively low substrate concentration;
A second measurement region for measuring a relatively high substrate concentration;
Including
In the first measurement region, a first reaction layer is provided in contact with the first working electrode,
In the second measurement region, a second reaction layer is provided in contact with the second working electrode,
The first reaction layer includes a first electron acceptor and an oxidoreductase,
The second reaction layer includes a second electron acceptor different from the first electron acceptor, and the same oxidoreductase as the oxidoreductase contained in the first reaction layer. A biosensor is provided.

また、本発明によれば、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサの製造方法であって、
基板を用意する工程と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系を形成する工程と、
前記基板に、前記試料が導入される濃度測定領域を設ける工程と、
を有し、
前記濃度測定領域を設ける工程は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域を形成する工程と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域を形成する工程と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層を前記第一作用極に接するように形成し、
前記第二測定領域には、第二反応層を前記第二作用極と接するように形成し、
前記第一反応層に、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含ませ、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含ませることを特徴とするバイオセンサの製造方法
が提供される。 Moreover, according to the present invention, there is provided a biosensor manufacturing method for electrochemically detecting a reaction between a substrate in a sample and an oxidoreductase to measure a substrate concentration,
Preparing a substrate;
Forming an electrode system including a first working electrode and a second working electrode different from the first working electrode;
Providing a concentration measurement region into which the sample is introduced on the substrate;
Have
The step of providing the concentration measurement region includes:
Forming a first measurement region for measuring a relatively low substrate concentration;
Forming a second measurement region for measuring a relatively high substrate concentration;
Including
Forming a first reaction layer in contact with the first working electrode in the first measurement region;
In the second measurement region, a second reaction layer is formed in contact with the second working electrode,
In the first reaction layer, a first electron acceptor and an oxidoreductase are included,
The second reaction layer includes a second electron acceptor different from the first electron acceptor, and the same oxidoreductase as the oxidoreductase contained in the first reaction layer. A method for manufacturing a biosensor is provided.

さらに本発明によれば、上記のバイオセンサの使用方法であって、
前記第一反応層および前記第二反応層にそれぞれ試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と酸化還元酵素とを反応させるステップと、
前記第二反応層で反応した前記酸化還元酵素と前記第二反応層の電子受容体とを反応させるステップと、
前記第一反応層が設けられた第一測定領域で発生する電流と前記第二反応層が設けられた第二測定領域で発生する電流とをそれぞれ測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法
が提供される。 Furthermore, according to the present invention, there is provided a method of using the above biosensor,
Adding a sample to each of the first reaction layer and the second reaction layer;
Reacting the added substrate with the oxidoreductase;
Reacting the redox enzyme reacted in the second reaction layer with the electron acceptor in the second reaction layer;
Measuring each of a current generated in the first measurement region provided with the first reaction layer and a current generated in the second measurement region provided with the second reaction layer;
A method of using a biosensor is provided.

この発明によれば、第一反応層と第二反応層とが互いに同一の酸化還元酵素を含み、互いに異なる電子受容体を含んでいる。これにより、試料中の同一の基質と反応した酸化還元酵素が特性の異なる電子受容体と反応することができる。したがって、酸化還元酵素に対する電子受容体の反応速度の違いによって、第一測定領域では相対的に低濃度範囲の基質濃度を定量し、第二測定領域では相対的に高濃度範囲の基質濃度を定量することができる。よって、所望の検量範囲を有する電子受容体を適宜選択することで、バイオセンサの検量範囲を使用目的に併せて任意に設計することができ、検量範囲を拡大して精度よく基質濃度を測定することができる。 According to this invention, the first reaction layer and the second reaction layer contain the same oxidoreductase and contain different electron acceptors. Thereby, the oxidoreductase reacted with the same substrate in the sample can react with the electron acceptor having different characteristics. Therefore, the substrate concentration in the relatively low concentration range is quantified in the first measurement region and the substrate concentration in the relatively high concentration range is quantified in the second measurement region due to the difference in the reaction rate of the electron acceptor to oxidoreductase. can do. Therefore, by appropriately selecting an electron acceptor having a desired calibration range, the calibration range of the biosensor can be arbitrarily designed according to the intended use, and the calibration range is expanded to accurately measure the substrate concentration. be able to.

本発明によれば、試料中に含まれる基質濃度の範囲によって所望の検量範囲を設計することができ、検量範囲を拡大して精度よく基質濃度を測定できる。 According to the present invention, a desired calibration range can be designed according to the range of the substrate concentration contained in the sample, and the calibration range can be expanded to accurately measure the substrate concentration.

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. In all the drawings, the same reference numerals are given to the same components, and the description will be omitted as appropriate.

図１は、本実施形態のバイオセンサ１を示す図である。図１（ａ）はバイオセンサ１の平面図である。図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図１（ｃ）は図１（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。バイオセンサ１は、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定する。 FIG. 1 is a diagram showing a biosensor 1 of the present embodiment. FIG. 1A is a plan view of the biosensor 1. FIG.1 (b) is AA 'sectional drawing of Fig.1 (a). FIG.1 (c) is BB 'sectional drawing of Fig.1 (a). The biosensor 1 electrochemically detects the reaction between the substrate in the sample and the oxidoreductase, and measures the substrate concentration.

図１で示すように、バイオセンサ１は、絶縁性基板１０と、作用極１０２（第二作用極）と、作用極１０２とは異なる作用極２０２（第一作用極）と、を含む電極系５０と、絶縁性基板１０に設けられ、試料が導入される濃度測定領域と、を有する。濃度測定領域は、相対的に低い基質濃度を測定する反応セル（第一測定領域）２１と、相対的に高い基質濃度を測定する反応セル（第二測定領域）１１と、からなる。反応セル２１には、反応層（第一反応層）２０３が作用極２０２に接するように設けられている。反応セル１１には、反応層１０３（第二反応層）が作用極１０２に接するように設けられている。反応層２０３は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含んでいる。反応層１０３は、第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、反応層２０３に含まれる酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含んでいる。 As shown in FIG. 1, the biosensor 1 is an electrode system including an insulating substrate 10, a working electrode 102 (second working electrode), and a working electrode 202 (first working electrode) different from the working electrode 102. 50 and a concentration measurement region provided on the insulating substrate 10 and into which the sample is introduced. The concentration measurement region includes a reaction cell (first measurement region) 21 that measures a relatively low substrate concentration and a reaction cell (second measurement region) 11 that measures a relatively high substrate concentration. The reaction cell 21 is provided with a reaction layer (first reaction layer) 203 in contact with the working electrode 202. The reaction cell 11 is provided with a reaction layer 103 (second reaction layer) in contact with the working electrode 102. The reaction layer 203 includes a first electron acceptor and an oxidoreductase. The reaction layer 103 includes a second electron acceptor different from the first electron acceptor, and the same oxidoreductase as the oxidoreductase contained in the reaction layer 203.

絶縁性基板１０には、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用することができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド及びポリカーボネードなどの合成樹脂板を用いることができる。 For the insulating substrate 10, ceramic, plastic, silicon, an alumina glass plate, or a polymer material can be used. Preferably, synthetic resin plates such as polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, and polycarbonate can be used.

絶縁性基板１０には対極３０１および参照極３０２が設けられている。このような三極式を採用することにより、安定した応答電流が得られ、測定精度を安定化させることができる。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、導電性材料を用いて形成させることができる。導電性材料とは、炭素、またはパラジウム、銀、白金、金、銅、ニッケル、これらの合金等の金属材料である。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、１種の導電性材料により形成させてもよいし、２種以上の導電性材料により形成させてもよい。これにより、安定した応答電流が得られ、精度がさらに安定化する。作用極１０２、２０２、対極３０１および参照極３０２は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法により絶縁性基板１０に塗布することにより形成させることができる。 The insulating substrate 10 is provided with a counter electrode 301 and a reference electrode 302. By adopting such a three-pole system, a stable response current can be obtained and the measurement accuracy can be stabilized. The working electrodes 102 and 202, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 can be formed using a conductive material. The conductive material is carbon or a metal material such as palladium, silver, platinum, gold, copper, nickel, or an alloy thereof. The working electrodes 102 and 202, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 may be formed of one type of conductive material, or may be formed of two or more types of conductive materials. As a result, a stable response current is obtained, and the accuracy is further stabilized. The working electrodes 102 and 202, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 can be formed by applying to the insulating substrate 10 by screen printing, sputtering, or vapor deposition.

反応セル２１において、反応層２０３は、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに接している。一方、反応セル１１において、反応層１０３は対極３０１および参照極３０２のそれぞれに接している。 In the reaction cell 21, the reaction layer 203 is in contact with each of the counter electrode 301 and the reference electrode 302. On the other hand, in the reaction cell 11, the reaction layer 103 is in contact with each of the counter electrode 301 and the reference electrode 302.

バイオセンサ１は、電極系５０を覆う絶縁膜３０と、反応層２０３が露出している第一開口部と、反応層１０３が露出している第二開口部と、をさらに有している。第一開口部は反応セル２１に設けられ、第二開口部は反応セル１１に設けられている。図１（ｂ）で示すように、反応層１０３は絶縁膜３０で覆われていない。また、図１（ｃ）で示すように、反応層２０３は絶縁膜３０に覆われていない。図１（ａ）で示すように、絶縁膜３０を介して第一開口部と第二開口部とが分離されている。 The biosensor 1 further includes an insulating film 30 that covers the electrode system 50, a first opening from which the reaction layer 203 is exposed, and a second opening from which the reaction layer 103 is exposed. The first opening is provided in the reaction cell 21, and the second opening is provided in the reaction cell 11. As shown in FIG. 1B, the reaction layer 103 is not covered with the insulating film 30. Further, as shown in FIG. 1C, the reaction layer 203 is not covered with the insulating film 30. As shown in FIG. 1A, the first opening and the second opening are separated through the insulating film 30.

反応層１０３、２０３は、少なくとも１種の酸化還元酵素を含有する。 The reaction layers 103 and 203 contain at least one oxidoreductase.

酸化還元酵素は、測定対象となる様々な基質と反応して酸化または還元される。酸化された酵素が再び還元され、または、還元された酵素が再び酸化されるとき、生じる電流の変化を検出することで基質濃度を測定することができる。 The oxidoreductase is oxidized or reduced by reacting with various substrates to be measured. When the oxidized enzyme is reduced again or the reduced enzyme is oxidized again, the substrate concentration can be measured by detecting the change in current that occurs.

たとえば、酸化還元酵素には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。また、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）、およびこれらの組合せを用いることができる。 For example, glucose oxidase (GOD) or glucose dehydrogenase can be used as the oxidoreductase. In addition, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, cholesterol oxidase (ChOD), and combinations thereof can be used.

バイオセンサ１をグルコースセンサとする場合、酸化還元酵素として、ＧＯＤまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。 When the biosensor 1 is a glucose sensor, GOD or glucose dehydrogenase can be used as the oxidoreductase.

（反応式１）
グルコース＋ＧＯＤ（酸化体） → グルコン酸＋ＧＯＤ（還元体） (Reaction Formula 1)
Glucose + GOD (oxidized substance) → Gluconic acid + GOD (reduced form)

反応式１で示すように、測定試料中のグルコースは、ＧＯＤの触媒反応によりＧＯＤを還元させることで、グルコースがグルコン酸に酸化される。そして反応セル２１では、作用極２０２に電圧が印加されることで、ＧＯＤ（還元体）からＧＯＤ（酸化体）に酸化させる。 As shown in Reaction Formula 1, glucose in the measurement sample is oxidized to gluconic acid by reducing GOD by the catalytic reaction of GOD. In the reaction cell 21, a voltage is applied to the working electrode 202 to oxidize GOD (reduced form) to GOD (oxidized form).

反応層１０３、２０３中の酸化還元酵素の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができる。たとえば、ＧＯＤを用いる場合、その含有量は、０．１〜４０ユニット／μＬが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させるために必要な、酸化還元酵素の量をいう。 The content of the oxidoreductase in the reaction layers 103 and 203 is not particularly limited, and an appropriate amount can be selected as necessary. For example, when GOD is used, the content is preferably 0.1 to 40 units / μL. Here, “1 unit” refers to the amount of oxidoreductase required to oxidize 1 μmol of substrate in 1 minute.

ところで、反応式１による電流の変化を検出することで試料中のグルコース量を測定することができる。また、試料中に溶存する酸素によって生成された過酸化水素を電極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することによりグルコース濃度を求めることもできる。しかしながら、酸化還元酵素の酸化還元反応による電流の変化を直接検出する方法では、溶存酸素に依存したり、干渉物質の影響を受けたりしてしまう。干渉物質はフィルター構造を設けることで除去できるが、バイオセンサの構造が複雑になる。そこで、電子受容体を添加することで、シンプルな構造で基質量を精度よく測定することができる。 By the way, the amount of glucose in the sample can be measured by detecting a change in current according to Reaction Formula 1. Alternatively, the glucose concentration can be determined by oxidizing hydrogen peroxide produced by oxygen dissolved in the sample on the electrode and measuring the oxidation current value at that time. However, in the method of directly detecting a change in current due to the oxidation-reduction reaction of the oxidoreductase, it depends on dissolved oxygen or is affected by interference substances. Interfering substances can be removed by providing a filter structure, but the structure of the biosensor is complicated. Therefore, by adding an electron acceptor, the base mass can be accurately measured with a simple structure.

反応層１０３は、少なくとも１種以上の電子受容体を含んでいる。反応層１０３に含ませる電子受容体は、酸化還元電位の低いものを選択する。具体的には、電子受容体として酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであるものを選択する。こうすることにで、反応層１０３における酵素と電子受容体との反応が試料中の干渉物質による影響を受けにくくなる。したがって、精度よく試料中の基質濃度を測定することができる。 The reaction layer 103 contains at least one kind of electron acceptor. As the electron acceptor included in the reaction layer 103, one having a low redox potential is selected. Specifically, an electron acceptor having a redox potential of −0.3 to +0.3 V is selected. By doing so, the reaction between the enzyme and the electron acceptor in the reaction layer 103 is less affected by the interference substance in the sample. Therefore, the substrate concentration in the sample can be accurately measured.

より具体的には、反応層１０３に含ませる電子受容体は、テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）化合物、フェロセニルトリメチルアンモニウム、テトラシアノキノジメタンからなる群から選択することができる。ＴＴＦ化合物として、テトラチアフルバレン、４−エトキシカルボニル−４，５，５'−トリメチルテトラチアフルバレン、８−メルカプトオクチルテトラチアフルバレンカルボキシレートなどを例示することができる。ＴＴＦ化合物は、酸化還元電位が０〜＋０．３Ｖであり、特に好ましい。 More specifically, the electron acceptor included in the reaction layer 103 can be selected from the group consisting of a tetrathiafulvalene (TTF) compound, ferrocenyltrimethylammonium, and tetracyanoquinodimethane. Examples of the TTF compound include tetrathiafulvalene, 4-ethoxycarbonyl-4,5,5′-trimethyltetrathiafulvalene, 8-mercaptooctyltetrathiafulvalenecarboxylate, and the like. The TTF compound has an oxidation-reduction potential of 0 to +0.3 V, and is particularly preferable.

反応層１０３中の電子受容体は作用極１０２に電位が印加されることで、酸化型へと変化する。そして、酸化型の電子受容体がＧＯＤと反応し、還元される。酸化還元酵素としてＧＯＤ、電子受容体としてＴＴＦを用いたときの反応層１０３における反応メカニズムを反応式２に示す。 The electron acceptor in the reaction layer 103 changes to an oxidized type when a potential is applied to the working electrode 102. The oxidized electron acceptor reacts with GOD and is reduced. The reaction mechanism in the reaction layer 103 when GOD is used as the oxidoreductase and TTF is used as the electron acceptor is shown in Reaction Formula 2.

（反応式２）
グルコース＋ＧＯＤ（酸化体） → グルコン酸＋ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体）＋酸化型ＴＴＦ → ＧＯＤ（酸化体）＋ＴＴＦ (Reaction Formula 2)
Glucose + GOD (oxidized substance) → Gluconic acid + GOD (reduced form)
GOD (reduced form) + oxidized TTF → GOD (oxidized form) + TTF

酵素反応により酸化型ＴＴＦから生成されたＴＴＦに電位を印加し、再酸化して酸化型ＴＴＦを生成する。この際の応答電流を検出することで、グルコース濃度を測定することができる。 A potential is applied to the TTF generated from the oxidized TTF by the enzyme reaction, and reoxidation is performed to generate an oxidized TTF. By detecting the response current at this time, the glucose concentration can be measured.

一方、反応層２０３は、反応層１０３の電子受容体とは異なる電子受容体を少なくとも１種以上含んでいる。反応層２０３の電子受容体として、酵素との反応効率が、反応層１０３の電子受容体よりも相対的に低いものを選択する。また、反応層２０３の電子受容体として、酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであるものを選択する。こうすることにで、反応層２０３における酵素と電子受容体との反応が試料中の干渉物質によって影響されにくくなる。したがって、精度よく試料中の基質濃度を測定することができる。 On the other hand, the reaction layer 203 contains at least one electron acceptor different from the electron acceptor of the reaction layer 103. As the electron acceptor of the reaction layer 203, an electron acceptor having a reaction efficiency relatively lower than that of the reaction layer 103 is selected. Further, an electron acceptor having a redox potential of −0.3 to +0.3 V is selected as the electron acceptor of the reaction layer 203. By doing so, the reaction between the enzyme and the electron acceptor in the reaction layer 203 is less affected by the interference substance in the sample. Therefore, the substrate concentration in the sample can be accurately measured.

具体的には、反応層２０３に含ませる電子受容体には、フェロセン誘導体、ヒドロキシエトキシテトラシアノキノジメタン、および、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）からなる群から選択することができる。フェロセン誘導体として、１，１'−ジメチルフェロセン（以下単にジメチルフェロセンという）、フェロセンの他にフェロセンカルボン酸、１，１'−フェロセンジカルボン酸、フェロセンメタノール、１，１'−フェロセンジメタノール、フェロセンエタノール、メチルフェロセン、フェロセン酢酸を例示することができる。 Specifically, the electron acceptor included in the reaction layer 203 includes a ferrocene derivative, hydroxyethoxytetracyanoquinodimethane, and 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy-PMS). Can be selected from the group consisting of As ferrocene derivatives, 1,1′-dimethylferrocene (hereinafter simply referred to as dimethylferrocene), ferrocene, ferrocenecarboxylic acid, 1,1′-ferrocenedicarboxylic acid, ferrocenemethanol, 1,1′-ferrocenedimethanol, ferroceneethanol , Methyl ferrocene, and ferrocene acetic acid.

反応層２０３の電子受容体もまた作用極２０２によって印加された電位により、酸化型へと変化する。酸化還元酵素としてＧＯＤ、電子受容体としてジメチルフェロセンを用いたときの反応層２０３における反応メカニズムを反応式３に示す。 The electron acceptor of the reaction layer 203 is also changed to an oxidized type by the potential applied by the working electrode 202. The reaction mechanism in the reaction layer 203 when GOD is used as the oxidoreductase and dimethylferrocene is used as the electron acceptor is shown in Reaction Formula 3.

（反応式３）
グルコース＋ＧＯＤ（酸化体） → グルコン酸＋ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体）＋酸化型ジメチルフェロセン → ＧＯＤ（酸化体）＋ジメチルフェロセン (Reaction Formula 3)
Glucose + GOD (oxidized substance) → Gluconic acid + GOD (reduced form)
GOD (reduced form) + oxidized dimethyl ferrocene → GOD (oxidized form) + dimethyl ferrocene

酵素反応により酸化型ジメチルフェロセンから生成されたジメチルフェロセンに電位を印加し、再酸化して酸化型ジメチルフェロセンを生成する。この際の応答電流を検出することで、グルコース濃度を測定することができる。 A potential is applied to dimethylferrocene generated from oxidized dimethylferrocene by an enzymatic reaction, and reoxidation is performed to generate oxidized dimethylferrocene. By detecting the response current at this time, the glucose concentration can be measured.

測定試料として、血液、尿、唾液、汗、涙等の体液等や、果汁等の食品を例示することができる。尿は、０〜５ｇ／ｄｌの広範囲のグルコースを含有し、かつ、干渉物質を多く含む。しかしながら、バイオセンサ１を用いることで尿糖を精度よく測定することができる。 Examples of the measurement sample include body fluids such as blood, urine, saliva, sweat, and tears, and foods such as fruit juice. Urine contains a wide range of glucose from 0 to 5 g / dl and is rich in interfering substances. However, urine sugar can be accurately measured by using the biosensor 1.

たとえば、電子受容体として、ＴＴＦ化合物やフェロセニルトリメチルアンモニウムを用いることで、０．２〜５ｇ／ｄＬの検量範囲でグルコース量を測定することができる。また、ジメチルフェロセンや１−メトキシ−ＰＭＳを用いることで０〜０．２ｇ／ｄＬの検量範囲でグルコース濃度を測定することができる。したがって、反応層１０３中の電子受容体をＴＴＦ化合物とし、反応層２０３中の電子受容体をジメチルフェロセンとすることで、生体試料中に含まれる０〜５ｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度を高い精度で測定することができる。 For example, the amount of glucose can be measured within a calibration range of 0.2 to 5 g / dL by using a TTF compound or ferrocenyltrimethylammonium as an electron acceptor. Further, by using dimethylferrocene or 1-methoxy-PMS, the glucose concentration can be measured within a calibration range of 0 to 0.2 g / dL. Therefore, by using the TTF compound as the electron acceptor in the reaction layer 103 and dimethylferrocene as the electron acceptor in the reaction layer 203, the glucose concentration in the range of 0 to 5 g / dl contained in the biological sample is highly accurate. Can be measured.

反応層１０３、２０３は、シクロデキストリンを含んでいてもよい。これにより親水性が向上するため、作用極１０２、２０２に塗布しやすくなる。 The reaction layers 103 and 203 may contain cyclodextrin. As a result, the hydrophilicity is improved, so that it can be easily applied to the working electrodes 102 and 202.

シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリン等を使用することができる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが好ましい。これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。 Although it does not restrict | limit especially as a cyclodextrin, For example, (alpha) -cyclodextrin, (beta) -cyclodextrin, (gamma) -cyclodextrin etc. can be used. Further, it may be a chemically modified cyclodextrin, such as hydroxycyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (hp-β-CD), dimethyl-β-cyclodextrin, carboxymethyl-β-cyclodextrin, etc. Of these, hydroxypropyl-β-cyclodextrin is preferred. One kind of these may be used, or two or more kinds may be used in combination.

電子受容体は１モルあたり、例えば、０〜４０重量％のシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは０．１〜２０重量％であり、特に好ましくは１〜１０重量％である。多すぎると粘性が高くなるという点で問題があり、少なすぎると可溶化が難しくなるという点で問題がある。 The electron acceptor is preferably included by 0 to 40% by weight of cyclodextrin per mole, more preferably 0.1 to 20% by weight, and particularly preferably 1 to 10% by weight. is there. If it is too much, there is a problem in that the viscosity becomes high, and if it is too small, there is a problem in that solubilization becomes difficult.

電子受容体は、シクロデキストリンを用いた公知の包接方法により包接することができる。例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、電子受容体を懸濁した懸濁液と、を準備し、両者を混合させることで当該電子受容体を包接させることができる。 The electron acceptor can be included by a known inclusion method using cyclodextrin. For example, a cyclodextrin solution in which cyclodextrin is dissolved in an aqueous solvent and a suspension in which an electron acceptor is suspended are prepared, and the electron acceptor can be included by mixing both.

シクロデキストリン溶液に対する電子受容体の割合は、電子受容体を溶解することができれば特に制限されないが、たとえば、０〜４０重量％のシクロデキストリンの溶液に当該電子受容体を５ｍＭとなるように溶解させることができる。シクロデキストリンの溶液は、１〜１０ｍＭであるとより好ましい。 The ratio of the electron acceptor to the cyclodextrin solution is not particularly limited as long as the electron acceptor can be dissolved. For example, the electron acceptor is dissolved in a solution of 0 to 40% by weight of cyclodextrin so as to be 5 mM. be able to. The solution of cyclodextrin is more preferably 1 to 10 mM.

水性溶媒としては、たとえば、水、緩衝液等が使用できる。緩衝液としては、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液などを用いることができる。緩衝液は、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。 As an aqueous solvent, water, a buffer solution, etc. can be used, for example. As the buffer solution, TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfide acid) buffer solution, HEPES (2- [4- (2-hydroxyethylyl) -1-piperazinyl] ethanesulfide acid) buffer solution, etc. may be used. it can. The buffer solution may contain sodium chloride.

溶媒のｐＨは４〜８とすると好ましい。ｐＨが大きすぎたり小さすぎたりすると酵素が失活してしまうため好ましくない。 The pH of the solvent is preferably 4-8. If the pH is too large or too small, the enzyme is deactivated, which is not preferable.

また、反応層１０３、２０３は、安定化剤を含んでいてもよい。安定化剤として、トレハロース、スクロース、ラフィノース、アルギニン、および、グルコサミンからなる群から選択することができる。 The reaction layers 103 and 203 may contain a stabilizer. The stabilizer can be selected from the group consisting of trehalose, sucrose, raffinose, arginine, and glucosamine.

また、反応層１０３、２０３は、界面活性剤を含むことができる。 In addition, the reaction layers 103 and 203 can include a surfactant.

電子受容体は、水に対する溶解度が低い。そのため、測定試料中に含まれる水によって電子受容体が反応層上に析出することがある。そこで、反応層に界面活性剤を含ませることにより、水に対する溶解性を向上させることができる。 The electron acceptor has low solubility in water. Therefore, the electron acceptor may be deposited on the reaction layer due to water contained in the measurement sample. Therefore, the solubility in water can be improved by including a surfactant in the reaction layer.

界面活性剤としては、たとえば、レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、トライトン−Ｘ１００（登録商標）、ＬｕｂｒｏｌＰＸ（登録商標）、ＤＫ−エステル（登録商標）、ＢＩＧＣＨＡＰ（登録商標）、ＤｅｏｘＣＨＡＰ（登録商標）、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアクリル酸およびＴｗｅｅｎ２０（登録商標、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を用いることができる。トライトン−Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎ２０を用いると特に好ましい。 Examples of the surfactant include lecithin, octylthioglucoside, sodium cholate, dodecyl-β-maltoside, sodium deoxycholate, sodium taurodeoxycholate, Triton-X100 (registered trademark), Lubrol PX (registered trademark), DK-ester (registered trademark), BIGCHAP (registered trademark), DeoxCHAP (registered trademark), sodium lauryl sulfate (SOD), sodium dodecylbenzenesulfonate, carboxymethylcellulose, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, polyvinylsulfonic acid, Uses polydiallyldimethylammonium salt, polyacrylic acid and Tween 20 (registered trademark, polyoxyethylene sorbitan monolaurate) Rukoto can. It is particularly preferred to use Triton-X®, SDS, and Tween 20.

つづいて、バイオセンサ１の製造方法の一例について説明する。 It continues and demonstrates an example of the manufacturing method of the biosensor 1. FIG.

まず、基板を準備し、試料がそれぞれ投入される反応セル２１および反応セル１１を設ける。反応セル２１には、作用極２０２を形成し、反応セル１１には、作用極１０２を形成する。また、作用極１０２、２０２に並列するように、対極３０１および参照極３０２を設ける。作用極１０２、２０２、対極３０１、および参照極３０２は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法等、公知の方法により形成させることができる。ついで、基板上に絶縁性ペーストをスクリーン印刷して絶縁膜３０を形成し、絶縁性基板１０を得る。絶縁膜３０は作用極１０２、２０２の外周を覆うように形成させる。ただし、反応セル１１、２１の各領域には絶縁膜３０は形成しない。これにより、反応セル１１には第二開口部が設けられ、反応セル２１には第一開口部が設けられる。 First, a substrate is prepared, and a reaction cell 21 and a reaction cell 11 into which samples are respectively placed are provided. A working electrode 202 is formed in the reaction cell 21, and a working electrode 102 is formed in the reaction cell 11. Further, a counter electrode 301 and a reference electrode 302 are provided in parallel with the working electrodes 102 and 202. The working electrodes 102 and 202, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 can be formed by a known method such as screen printing, sputtering, or vapor deposition. Next, an insulating paste 30 is formed on the substrate by screen printing an insulating paste to obtain the insulating substrate 10. The insulating film 30 is formed so as to cover the outer periphery of the working electrodes 102 and 202. However, the insulating film 30 is not formed in each region of the reaction cells 11 and 21. Thereby, the reaction cell 11 is provided with a second opening, and the reaction cell 21 is provided with a first opening.

その後、反応セル２１に反応層２０３を形成し、反応セル１１に反応層１０３を形成する。 Thereafter, the reaction layer 203 is formed in the reaction cell 21, and the reaction layer 103 is formed in the reaction cell 11.

具体的には、反応層１０３および反応層２０３は以下のように形成する。反応セル１１の作用極１０２、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに酸化還元酵素およびＴＴＦなどの電子受容体を含む溶液を塗布する。また、反応セル２１の作用極２０２、対極３０１および参照極３０２のそれぞれに酸化還元酵素およびジメチルフェロセンなどの電子受容体を含む溶液を塗布する。このとき、反応セル１１および反応セル２１において、それぞれ塗布した溶液がコンタミネーションしないように留意する。コンタミネーションすると、バイオセンサ１の測定精度が低下するため好ましくない。ピペッターやディスペンサーを用いることで反応セル１１および反応セル２１のそれぞれの電極系５０に選択的に溶液を塗布することができる。こうすることで、反応層１０３、２０３を形成する。 Specifically, the reaction layer 103 and the reaction layer 203 are formed as follows. A solution containing an oxidoreductase and an electron acceptor such as TTF is applied to each of the working electrode 102, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 of the reaction cell 11. In addition, a solution containing an electron acceptor such as oxidoreductase and dimethylferrocene is applied to the working electrode 202, the counter electrode 301, and the reference electrode 302 of the reaction cell 21. At this time, attention is paid so that the applied solution does not contaminate in the reaction cell 11 and the reaction cell 21, respectively. Contamination is not preferable because the measurement accuracy of the biosensor 1 decreases. By using a pipetter or a dispenser, the solution can be selectively applied to each electrode system 50 of the reaction cell 11 and the reaction cell 21. In this way, the reaction layers 103 and 203 are formed.

なお、電子受容体、シクロデキストリン、界面活性剤及び酸化還元酵素を水性溶媒に混合調整し、反応セル１１、２１の電極系５０のそれぞれの表面に塗布することで反応層１０３、２０３を形成させてもよい。 The reaction layers 103 and 203 are formed by mixing and adjusting the electron acceptor, cyclodextrin, surfactant and oxidoreductase in an aqueous solvent and applying the mixture to the respective surfaces of the electrode systems 50 of the reaction cells 11 and 21. May be.

以上のように、反応層１０３、２０３を形成した後、乾燥させてバイオセンサ１を完成させる。乾燥は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下で行うと好ましい。 As described above, after the reaction layers 103 and 203 are formed, the biosensor 1 is completed by drying. Drying is preferably performed at a temperature at which the oxidoreductase is not inactivated and at an optimum temperature or lower.

つづいて、バイオセンサ１を用いて試料中に含まれる基質濃度を測定する方法について説明する。 Next, a method for measuring the substrate concentration contained in the sample using the biosensor 1 will be described.

まず、反応層１０３および反応層２０３に試料をそれぞれ添加し、所定時間放置する。こうすることで、添加された試料中の基質と酸化還元酵素とが反応し、ついで、酸化還元酵素と反応層１０３、２０３中のそれぞれの電子受容体とが反応する。その後、電極系５０に電圧を印加し、反応セル１１および反応セル２１から発生する応答電流をそれぞれ公知の方法で測定する。そして、あらかじめ既知の濃度の基質を用いて作成した基質濃度と応答電流値との検量線を用いて、得られた応答電流値から基質濃度を求める。 First, samples are respectively added to the reaction layer 103 and the reaction layer 203, and left for a predetermined time. By doing so, the substrate in the added sample reacts with the oxidoreductase, and then the oxidoreductase reacts with the respective electron acceptors in the reaction layers 103 and 203. Thereafter, a voltage is applied to the electrode system 50, and the response currents generated from the reaction cell 11 and the reaction cell 21 are measured by known methods. Then, the substrate concentration is obtained from the obtained response current value by using a calibration curve of the substrate concentration and the response current value prepared in advance using a substrate having a known concentration.

なお、測定試料の添加により、反応層１０３、２０３は溶解する。しかしながら、反応層１０３と反応層２０３とが混合すると測定精度が低下するため好ましくない。これを避けるため、バイオセンサ１では、図１（ａ）で示すように、反応セル１１と反応セル２１とを並列させない構成となっている。 The reaction layers 103 and 203 are dissolved by adding the measurement sample. However, mixing the reaction layer 103 and the reaction layer 203 is not preferable because the measurement accuracy decreases. In order to avoid this, the biosensor 1 has a configuration in which the reaction cell 11 and the reaction cell 21 are not juxtaposed as shown in FIG.

また、反応層１０３と反応層２０３との混合をより確実に防止するため、取り外し可能な蓋部材を絶縁性基板１０に取り付けてもよい。 In addition, a removable lid member may be attached to the insulating substrate 10 in order to more reliably prevent the reaction layer 103 and the reaction layer 203 from mixing.

図２には、蓋部材６０とバイオセンサ１とを模式的に示している。図２（ａ）は、バイオセンサ１の斜視図である。図２（ｂ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１の平面図である。図２（ｃ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１のＣ−Ｃ'断面図である。図２（ｄ）は、蓋部材を取り付けたバイオセンサ１の側面図である。 FIG. 2 schematically shows the lid member 60 and the biosensor 1. FIG. 2A is a perspective view of the biosensor 1. FIG.2 (b) is a top view of the biosensor 1 which attached the cover member. FIG.2 (c) is CC 'sectional drawing of the biosensor 1 which attached the cover member. FIG.2 (d) is a side view of the biosensor 1 which attached the cover member.

図示するように、蓋部材６０は、反応セル１１、２１にわたって取り付けられる。蓋部材６０は、試料を導入する試料導入口６１と、導入された試料を反応セル１１および反応セル２１に導く流路６３と、流路６３に設けられる少なくとも二つの空気孔６４と、を形成する。空気孔６４は、反応セル２１側と反応セル１１側にそれぞれ形成されるが、図２（ｄ）では、反応セル１１側の空気孔６４を示している。 As illustrated, the lid member 60 is attached over the reaction cells 11 and 21. The lid member 60 forms a sample introduction port 61 for introducing a sample, a flow path 63 for guiding the introduced sample to the reaction cell 11 and the reaction cell 21, and at least two air holes 64 provided in the flow path 63. To do. The air holes 64 are respectively formed on the reaction cell 21 side and the reaction cell 11 side. FIG. 2D shows the air holes 64 on the reaction cell 11 side.

絶縁膜３０が流路６３の一部を構成することで試料導入口６１から導入された試料は二分割される。空気孔６４が反応セル２１側と反応セル１１側にそれぞれ形成されているため、毛細管現象によって反応セル２１および反応セル１１に分割された試料がそれぞれ導かれる。 Since the insulating film 30 constitutes a part of the flow path 63, the sample introduced from the sample introduction port 61 is divided into two. Since the air holes 64 are respectively formed on the reaction cell 21 side and the reaction cell 11 side, the samples divided into the reaction cell 21 and the reaction cell 11 by the capillary phenomenon are respectively guided.

なお、蓋部材６０は試料と接する面に親水性のコーティング膜を覆うことができる。コーティング膜は、コーティング剤の塗布、表面重合やプラズマ重合、プラズマ処理等で形成させることができる。蓋部材６０の表面をコーティング膜で覆うことで、各測定領域における気泡の付着を防止することができ、測定精度の低下を防止することが可能となる。 The lid member 60 can cover a hydrophilic coating film on the surface in contact with the sample. The coating film can be formed by applying a coating agent, surface polymerization, plasma polymerization, plasma treatment, or the like. By covering the surface of the lid member 60 with a coating film, it is possible to prevent bubbles from adhering to each measurement region and to prevent a reduction in measurement accuracy.

つづいて、バイオセンサ１の作用及び効果について図１を用いつつ説明する。 It continues and demonstrates the effect | action and effect of the biosensor 1 using FIG.

バイオセンサ１によれば、反応層２０３と反応層１０３とが互いに同一の酸化還元酵素を含み、互いに異なる電子受容体を含んでいる。これにより、試料中の同一の基質と反応した酸化還元酵素が特性の異なる電子受容体と反応することができる。したがって、酸化還元酵素に対する電子受容体の反応速度の違いによって、反応セル２１では相対的に低濃度範囲の基質濃度を定量し、反応セル１１では相対的に高濃度範囲の基質濃度を定量することができる。よって、所望の検量範囲を有する電子受容体を適宜選択することで、バイオセンサの検量範囲を使用目的に併せて任意に設計することができ、検量範囲を所望の範囲に拡大して精度よく基質濃度を測定することができる。 According to the biosensor 1, the reaction layer 203 and the reaction layer 103 include the same oxidoreductase, and include different electron acceptors. Thereby, the oxidoreductase reacted with the same substrate in the sample can react with the electron acceptor having different characteristics. Therefore, the reaction cell 21 quantifies the substrate concentration in a relatively low concentration range and the reaction cell 11 quantifies the substrate concentration in a relatively high concentration range depending on the reaction rate of the electron acceptor to the oxidoreductase. Can do. Therefore, by appropriately selecting an electron acceptor having a desired calibration range, the calibration range of the biosensor can be arbitrarily designed according to the purpose of use, and the calibration range can be expanded to the desired range and the substrate accurately. The concentration can be measured.

また、第一電子受容体および第二電子受容体はそれぞれ酸化還元電位が低いものを選択することができる。これにより、干渉物質の影響を受けにくくし、精度よく広範囲の基質濃度を測定することができる。 In addition, the first electron acceptor and the second electron acceptor can each be selected to have a low redox potential. As a result, it is possible to measure the substrate concentration over a wide range with high accuracy without being affected by the interference substance.

従来、０〜１０００ｍｇ／ｄｌ程度の広範囲のグルコース濃度を測定可能なバイオセンサは開発されていた（たとえば、特許文献５、６）。しかしながら、従来のバイオセンサでは、試料中の干渉物質の存在が考慮されていなかった。干渉物質はバイオセンサの測定精度に影響を与えるため、検量範囲を著しく低下させる要因ともなっていた。 Conventionally, biosensors capable of measuring a wide range of glucose concentrations of about 0 to 1000 mg / dl have been developed (for example, Patent Documents 5 and 6). However, conventional biosensors do not consider the presence of interfering substances in the sample. Interfering substances affect the measurement accuracy of biosensors, and have been a factor that significantly reduces the calibration range.

たとえば、生体試料には、尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、アセトアミノフェンなどの干渉物質が含まれる。特に尿はこれら干渉物質を多く含んでいる。そこで、干渉物質を取り除くためのフィルターを反応層に設ける構成を採用することも考えられる。 For example, the biological sample includes interfering substances such as uric acid, bilirubin, ascorbic acid, and acetaminophen. In particular, urine contains a large amount of these interfering substances. Therefore, it may be possible to adopt a configuration in which a filter for removing the interference substance is provided in the reaction layer.

しかしながら、反応層にフィルターを設ける構成は、バイオセンサの構造を複雑にする。そのため、ディスポーザブル式のバイオセンサにかかる構成を採用することはコストの面や携帯性の観点から好ましくない。 However, the structure in which the filter is provided in the reaction layer complicates the structure of the biosensor. Therefore, it is not preferable to adopt the configuration of the disposable biosensor from the viewpoint of cost and portability.

そこで、バイオセンサ１では、酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖの電子受容体を用いる構成を採用することができる。これにより、干渉物質の影響を受けにくくし、基質濃度を精度よく測定することができる。したがって、フィルターを不要とし、バイオセンサの構造をシンプルにすることができる。よって、バイオセンサ１をディスポーザブル式のバイオセンサとして好適に用いることができる。 Therefore, the biosensor 1 can employ a configuration using an electron acceptor having a redox potential of −0.3 to + 0.3V. Thereby, it becomes difficult to be influenced by the interference substance, and the substrate concentration can be accurately measured. Therefore, no filter is required and the structure of the biosensor can be simplified. Therefore, the biosensor 1 can be suitably used as a disposable biosensor.

また、高濃度の基質量を精度よく測定できる電子受容体を反応層１０３に担持し、低濃度の基質量を精度よく測定できる電子受容体を反応層２０３に担持することで、所望の検量範囲のバイオセンサ１を設計することができる。たとえば、酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼを採用し、反応層１０３にＴＴＦ化合物、反応層２０３にフェロセン化合物を採用することで、生体試料に含まれる０〜５ｇ／ｄＬのグルコース濃度を定量することができる。このバイオセンサは、干渉物質の影響も受けにくく、かつ、広範囲のグルコース濃度を測定でき、構造をシンプルにすることができる。そのため、ディスポーザブル式の尿糖バイオセンサとして好適に用いることができる。 In addition, an electron acceptor capable of measuring a high concentration base mass with high accuracy is carried on the reaction layer 103, and an electron acceptor capable of accurately measuring a low concentration base mass is carried on the reaction layer 203, whereby a desired calibration range is obtained. The biosensor 1 can be designed. For example, by using glucose oxidase as the oxidoreductase, using a TTF compound for the reaction layer 103 and a ferrocene compound for the reaction layer 203, the glucose concentration of 0 to 5 g / dL contained in the biological sample can be quantified. . This biosensor is not easily affected by interfering substances, can measure a wide range of glucose concentrations, and can simplify the structure. Therefore, it can be suitably used as a disposable urine sugar biosensor.

ところで、バイオセンサ１では、反応セル１１と反応セル２１とで異なる反応層が設けられている。そのため、両領域の反応層のコンタミネーションにより測定精度が低下してしまうという問題も考えられる。 By the way, in the biosensor 1, different reaction layers are provided in the reaction cell 11 and the reaction cell 21. For this reason, there may be a problem that the measurement accuracy is lowered due to contamination of the reaction layers in both regions.

そこで、バイオセンサ１では、反応セル１１と反応セル２１とを並列させない構成を採用する。また、反応セル１１と反応セル２１とを絶縁膜３０で分離する。これにより、反応層２０３および反応層１０３の混合を防止することができる。 Therefore, the biosensor 1 employs a configuration in which the reaction cell 11 and the reaction cell 21 are not arranged in parallel. Further, the reaction cell 11 and the reaction cell 21 are separated by the insulating film 30. Thereby, mixing of the reaction layer 203 and the reaction layer 103 can be prevented.

さらに、バイオセンサ１では、図２で示す蓋部材を基板に設ける構成を採用することができる。これにより、反応セル１１および反応セル２１にそれぞれ均等に試料を導くことができ、かつ、反応層２０３および反応層１０３の混合を確実に防止することができる。 Further, the biosensor 1 can employ a configuration in which the lid member shown in FIG. 2 is provided on the substrate. Thereby, a sample can be equally guided to the reaction cell 11 and the reaction cell 21, respectively, and mixing of the reaction layer 203 and the reaction layer 103 can be reliably prevented.

以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described with reference to drawings, these are the illustrations of this invention, Various structures other than the above are also employable.

たとえば、図３には、本実施の形態の第一の変形例であるバイオセンサ２を示している。図３（ａ）はバイオセンサ２の平面図である。図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図３（ｃ）は図３（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。 For example, FIG. 3 shows a biosensor 2 that is a first modification of the present embodiment. FIG. 3A is a plan view of the biosensor 2. FIG. 3B is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. FIG. 3C is a cross-sectional view taken along the line BB ′ of FIG.

バイオサンサ２は、電極系５０が、対極２０４（第一対極）と、対極２０４とは異なる対極１０４（第二対極）と、参照極３０２と、を有している。バイオセンサ２では、対極３０１のかわりに、対極が２つ（対極１０４、２０４）設けられている。また、反応セル２１において、反応層２０３が対極２０４および参照極３０２のそれぞれに接している。そして、反応セル１１において、反応層１０３が対極１０４および参照極３０２のそれぞれに接している。 In the biosensor 2, the electrode system 50 includes a counter electrode 204 (first counter electrode), a counter electrode 104 (second counter electrode) different from the counter electrode 204, and a reference electrode 302. In the biosensor 2, two counter electrodes (counter electrodes 104 and 204) are provided instead of the counter electrode 301. In the reaction cell 21, the reaction layer 203 is in contact with each of the counter electrode 204 and the reference electrode 302. In the reaction cell 11, the reaction layer 103 is in contact with each of the counter electrode 104 and the reference electrode 302.

このように、２つの電極系を採用し、参照極を共通にすることで、電流の出力を安定にすることができる。したがって、精度良く基質濃度を測定することができる。 In this way, by using two electrode systems and using a common reference electrode, the output of current can be stabilized. Therefore, the substrate concentration can be measured with high accuracy.

また、図４には、本実施の形態の第二の変形例であるバイオセンサ３を示している。図４（ａ）はバイオセンサ３の平面図である。図４（ｂ）は図４（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。 FIG. 4 shows a biosensor 3 that is a second modification of the present embodiment. FIG. 4A is a plan view of the biosensor 3. FIG. 4B is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG.

バイオセンサ３では、反応セル２１と反応セル１１とが並列している構成を採用している。バイオセンサ１とは異なり、対極３０１および参照極３０２はいずれも反応層２０３に接しておらず、かつ、反応層１０３にも接していない。この構成では、反応層２０３中に担持される第二電子受容体を作用極２０２に固定化し、反応層１０３中に担持される第一電子受容体を作用極１０２に固定化する。これにより、反応層１０３と反応層２０３とのコンタミネーションを防止できる。 The biosensor 3 employs a configuration in which the reaction cell 21 and the reaction cell 11 are arranged in parallel. Unlike the biosensor 1, the counter electrode 301 and the reference electrode 302 are not in contact with the reaction layer 203 and are not in contact with the reaction layer 103. In this configuration, the second electron acceptor supported in the reaction layer 203 is fixed to the working electrode 202, and the first electron acceptor supported in the reaction layer 103 is fixed to the working electrode 102. Thereby, contamination with the reaction layer 103 and the reaction layer 203 can be prevented.

具体的には、電子受容体を作用極１０２、２０２にそれぞれ固定化させることができる。固定化は、電子受容体を高分子化合物に混ぜ込んで作用極１０２、２０２に塗布することにより行うことができる。高分子化合物として、たとえばナフィオン（登録商標）、スルホイソフタル酸コポリエステル、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、シリコンオイルなどを例示することができる。スルホイソフタル酸コポリエステルは、たとえば、ＥａｓｔｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社から"ＥａｓｔｍａｎＡＱ−５５Ｄ"の名で市販されているものを用いることができる。また、電子受容体として機能する官能基を組み込んだポリマーを調製し、これをそれぞれの作用極に固定化させてもよい。 Specifically, the electron acceptor can be immobilized on the working electrodes 102 and 202, respectively. Immobilization can be performed by mixing an electron acceptor with a polymer compound and applying it to the working electrodes 102 and 202. Examples of the polymer compound include Nafion (registered trademark), sulfoisophthalic acid copolyester, polyethylene oxide (PEO), and silicone oil. As the sulfoisophthalic acid copolyester, for example, those commercially available from Eastman Chemical under the name of “Eastman AQ-55D” can be used. Alternatively, a polymer incorporating a functional group that functions as an electron acceptor may be prepared and immobilized on each working electrode.

なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本発明を満足する範囲で各種に変更することができる。 Needless to say, the above-described embodiment and a plurality of modifications can be combined within a range in which the contents do not conflict with each other. Further, in the above-described embodiments and modifications, the structure of each part has been specifically described, but the structure and the like can be changed in various ways within the scope of the present invention.

（バイオセンサの作製方法）
本実施例では、図１で示すバイオセンサ１の構成を有するグルコースセンサを用いた。以下、本実施例のグルコースセンサの作製方法について説明する。まず、ポリエチレンテレフタレート基板上に銀/塩化銀をスクリーン印刷し、参照極３０２を形成させた。その後、伝導性炭素ペーストを利用してスクリーン印刷して作用極１０２，２０２および対極３０１を形成後、絶縁高分子ペーストを使用して絶縁膜３０を形成した。ついで、４ｍＭＴＴＦ水溶液、５％ｈｐ−β−ＣＤ、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、１０Ｕ／μＬＧＯＤを１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に混合調製し、得られた溶液（５μＬ）を反応セル１１の作用極１０２、参照極３０２および対極３０１に塗布して反応層１０３を形成した。また、４ｍＭジメチルフェロセン、５％ｈｐ−β−ＣＤ、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、１０Ｕ／μＬＧＯＤを１５０ｍＭＮａＣｌを含む０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で混合調整し、反応セル２１の作用極２０２、参照極３０２および対極３０１に塗布して反応層２０３を形成した。その後、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。 (Production method of biosensor)
In this example, a glucose sensor having the configuration of the biosensor 1 shown in FIG. 1 was used. Hereinafter, a method for manufacturing the glucose sensor of this example will be described. First, silver / silver chloride was screen-printed on a polyethylene terephthalate substrate to form a reference electrode 302. Thereafter, the conductive electrodes 102 and 202 and the counter electrode 301 were formed by screen printing using a conductive carbon paste, and then the insulating film 30 was formed using an insulating polymer paste. Next, 4 mM TTF aqueous solution, 5% hp-β-CD, 1% triton X-100, 10 U / μLGOD were mixed and prepared in 0.1 M TES buffer (pH 7.5) containing 150 mM sodium chloride, and the resulting solution was obtained. (5 μL) was applied to the working electrode 102, the reference electrode 302, and the counter electrode 301 of the reaction cell 11 to form the reaction layer 103. Also, 4 mM dimethylferrocene, 5% hp-β-CD, 1% triton X-100, 10 U / μL GOD was mixed and adjusted with 0.1 M TES buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, and the action of the reaction cell 21 The reaction layer 203 was formed by coating the electrode 202, the reference electrode 302, and the counter electrode 301. Then, it was dried in a refrigerator for 24 hours or more.

（電気化学測定）
標準サンプルとして、１５０ｍＭＮａＣｌを含む０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したグルコース溶液を用意した。また、ボランティアによって採取されたヒト尿、およびこのヒト尿にグルコースを添加したものを尿サンプルとして用意した。サンプル５μＬを反応層１０３、２０３にそれぞれ添加し、サンプル添加後１０秒後に、対極３０１に対して作用極１０２、２０２にアノード方向に電圧（＋０．３Ｖ／ｖｓ）を印加し、応答電流の測定を開始した。開始後１分の電流値を測定値とした。測定に用いたグルコースセンサは測定ごとに交換した。 (Electrochemical measurement)
As a standard sample, a glucose solution prepared with 0.1 M TES buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl was prepared. In addition, human urine collected by volunteers, and human urine with glucose added thereto were prepared as urine samples. 5 μL of the sample was added to each of the reaction layers 103 and 203, and 10 seconds after the sample was added, a voltage (+0.3 V / vs) was applied to the working electrode 102 and 202 in the anode direction with respect to the counter electrode 301, and the response current was measured Started. The current value for 1 minute after the start was taken as the measured value. The glucose sensor used for the measurement was replaced for each measurement.

図５に結果を示す。図５（ａ）は標準サンプルの結果を示す図である。図５（ｂ）は図５（ａ）の拡大図である。図５（ｃ）は尿サンプルの結果を示す図である。図５（ｄ）は図５（ｃ）の拡大図である。図５（ａ）、（ｂ）で示すように、ジメチルフェロセンを備える反応セル２１では、検量範囲が０〜０．２ｇ／ｄＬであった。一方、ＴＴＦを備える反応セル１１では、検量範囲が０．２〜２ｇ／ｄＬであった。図５（ｃ）、（ｄ）で示すように、尿サンプルでは標準サンプルと比べて検量範囲が狭くなったが、反応セル１１の検量範囲は、０．２〜１ｇ／ｄＬであり、反応セル２１の検量範囲は０．０４〜０．１ｇ／ｄＬであるという結果が得られた。 The results are shown in FIG. FIG. 5A shows the results of the standard sample. FIG. 5B is an enlarged view of FIG. FIG.5 (c) is a figure which shows the result of a urine sample. FIG. 5D is an enlarged view of FIG. As shown in FIGS. 5A and 5B, in the reaction cell 21 provided with dimethylferrocene, the calibration range was 0 to 0.2 g / dL. On the other hand, in the reaction cell 11 provided with TTF, the calibration range was 0.2 to 2 g / dL. As shown in FIGS. 5C and 5D, the calibration range of the urine sample is narrower than that of the standard sample, but the calibration range of the reaction cell 11 is 0.2 to 1 g / dL. The result that the calibration range of 21 was 0.04 to 0.1 g / dL was obtained.

実施の形態に係るバイオセンサを示す図である。図１（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図１（ｃ）は、図１（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。It is a figure which shows the biosensor which concerns on embodiment. FIG. 1A is a plan view of the biosensor according to the embodiment. FIG.1 (b) is AA 'sectional drawing of Fig.1 (a). FIG.1 (c) is BB 'sectional drawing of Fig.1 (a). 蓋部材を取り付けたバイオセンサを模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the biosensor which attached the cover member. 実施の形態に係るバイオセンサの変形例を示す図である。図３（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図３（ｂ）は、図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）のＢ−Ｂ'断面図である。It is a figure which shows the modification of the biosensor which concerns on embodiment. FIG. 3A is a plan view of the biosensor according to the embodiment. FIG.3 (b) is AA 'sectional drawing of Fig.3 (a). FIG. 3C is a cross-sectional view taken along the line BB ′ of FIG. 実施の形態に係るバイオセンサの変形例を示す図である。図４（ａ）は、実施の形態に係るバイオセンサの平面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。It is a figure which shows the modification of the biosensor which concerns on embodiment. FIG. 4A is a plan view of the biosensor according to the embodiment. FIG. 4B is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. 実施例の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of an Example.

符号の説明Explanation of symbols

１バイオセンサ
２バイオセンサ
３バイオセンサ
１０絶縁性基板
１１反応セル
２１反応セル
３０絶縁膜
５０電極系
６０蓋部材
６１試料導入口
６３流路
６４空気孔
１０２作用極
１０３反応層
１０４対極
２０２作用極
２０３反応層
２０４対極
３０１対極
３０２参照極 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Biosensor 2 Biosensor 3 Biosensor 10 Insulating substrate 11 Reaction cell 21 Reaction cell 30 Insulating film 50 Electrode system 60 Lid member 61 Sample introduction port 63 Flow path 64 Air hole 102 Working electrode 103 Reaction layer 104 Counter electrode 202 Working electrode 203 Reaction layer 204 Counter electrode 301 Counter electrode 302 Reference electrode

Claims

試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサであって、
基板と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系と、
前記基板に設けられ、前記試料が導入される濃度測定領域と、
を有し、
前記濃度測定領域は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層が前記第一作用極に接するように設けられており、
前記第二測定領域には、第二反応層が前記第二作用極と接するように設けられており、
前記第一反応層は、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含み、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含むことを特徴とするバイオセンサ。 A biosensor for electrochemically detecting a reaction between a substrate and an oxidoreductase in a sample to measure a substrate concentration,
A substrate,
An electrode system including a first working electrode and a second working electrode different from the first working electrode;
A concentration measurement region provided on the substrate and into which the sample is introduced;
Have
The concentration measurement region is
A first measurement region for measuring a relatively low substrate concentration;
A second measurement region for measuring a relatively high substrate concentration;
Including
In the first measurement region, a first reaction layer is provided in contact with the first working electrode,
In the second measurement region, a second reaction layer is provided in contact with the second working electrode,
The first reaction layer includes a first electron acceptor and an oxidoreductase,
The second reaction layer includes a second electron acceptor different from the first electron acceptor, and the same oxidoreductase as the oxidoreductase contained in the first reaction layer. Biosensor.

前記第一または／および前記第二電子受容体の酸化還元電位が−０．３〜＋０．３Ｖであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 1, wherein the redox potential of the first or / and the second electron acceptor is -0.3 to + 0.3V.

前記第一電子受容体は、１，１'−ジメチルフェロセン、フェロセン酢酸、ヒドロキシエトキシテトラシアノキノジメタン、および、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。 The first electron acceptor is from 1,1′-dimethylferrocene, ferroceneacetic acid, hydroxyethoxytetracyanoquinodimethane, and 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy-PMS). The biosensor according to claim 1 or 2, wherein the biosensor is selected from the group consisting of:

前記第二電子受容体は、テトラチオフルバレン、フェロセニルトリメチルアンモニウム、および、テトラシアノキノジメタンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The second electron acceptor, tetrathiofulvalene, ferrocenyl trimethylammonium, and, according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is selected from the group consisting of tetracyanoquinodimethane Biosensor.

前記電極系は、対極と参照極とをさらに有し、
前記第一測定領域において、前記第一反応層が前記対極および前記参照極のそれぞれに接しており、
前記第二測定領域において、前記第二反応層が前記対極および前記参照極のそれぞれに接していることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The electrode system further includes a counter electrode and a reference electrode,
In the first measurement region, the first reaction layer is in contact with each of the counter electrode and the reference electrode,
The biosensor according to any one of claims 1 to 4, wherein in the second measurement region, the second reaction layer is in contact with each of the counter electrode and the reference electrode.

前記電極系は、
第一対極と、
前記第一対極とは異なる第二対極と、
参照極と、
をさらに有し、
前記第一測定領域において、前記第一反応層が前記第一対極および前記参照極のそれぞれに接しており、
前記第二測定領域において、前記第二反応層が前記第二対極および前記参照極のそれぞれに接していることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The electrode system
A first pair of poles;
A second counter electrode different from the first counter electrode;
A reference pole;
Further comprising
In the first measurement region, the first reaction layer is in contact with each of the first pair of electrodes and the reference electrode,
The biosensor according to any one of claims 1 to 4, wherein in the second measurement region, the second reaction layer is in contact with each of the second counter electrode and the reference electrode.

前記電極系は、対極と参照極とをさらに有し、
前記対極および前記参照極はいずれも前記第一反応層に接しておらず、かつ、前記対極および前記参照極はいずれも前記第二反応層に接していないことを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The electrode system further includes a counter electrode and a reference electrode,
The counter electrode and the reference electrode are not in contact with the first reaction layer, and the counter electrode and the reference electrode are not in contact with the second reaction layer. The biosensor according to any one of claims.

前記電極系を覆う絶縁膜と、
前記第一反応層が露出している第一開口部と、
前記第二反応層が露出している第二開口部と、
をさらに有し、
前記絶縁膜を介して前記第一開口部と前記第二開口部とが分離されていることを特徴とする請求項５または６に記載のバイオセンサ。 An insulating film covering the electrode system;
A first opening in which the first reaction layer is exposed;
A second opening through which the second reaction layer is exposed;
Further comprising
The biosensor according to claim 5 or 6, wherein the first opening and the second opening are separated through the insulating film.

前記第一測定領域および前記第二測定領域にわたって取り付けられている取り外し可能な蓋部材を前記基板にさらに有し、
前記蓋部材は、
前記試料を導入する試料導入口と、
前記第一測定領域および前記第二測定領域のそれぞれに前記試料を導く流路と、
前記流路に設けられる少なくとも二つの空気孔と、
を形成し、
前記空気孔は、前記第一測定領域側と前記第二測定領域側にそれぞれ形成されることを特徴とする請求項８に記載のバイオセンサ。 The substrate further comprises a removable lid member attached across the first measurement area and the second measurement area,
The lid member is
A sample inlet for introducing the sample;
A channel for guiding the sample to each of the first measurement region and the second measurement region;
At least two air holes provided in the flow path;
Form the
The biosensor according to claim 8, wherein the air holes are respectively formed on the first measurement region side and the second measurement region side.

前記第一電子受容体が前記第一作用極に固定化されており、前記第二電子受容体が前記第二作用極に固定化されていることを特徴する請求項７に記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 7, wherein the first electron acceptor is immobilized on the first working electrode, and the second electron acceptor is immobilized on the second working electrode .

前記第一および／または前記第二反応層が、シクロデキストリンを含むことを特徴とする請求項１乃至１０いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 1 to 10, wherein the first and / or the second reaction layer contains cyclodextrin.

前記第一および／または前記第二反応層が、トレハロース、スクロース、ラフィノース、アルギニン、および、グルコサミンからなる群から選択される安定化剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１１いずれか一項に記載のバイオセンサ。 Wherein the first and / or the second reaction layer, trehalose, sucrose, raffinose, arginine, and claims 1-11 any one characterized in that it comprises a stabilizer selected from the group consisting of glucosamine The biosensor described in 1.

前記第一および／または第二反応層に界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１２いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 1 to 12, wherein a surfactant is included in the first and / or second reaction layer.

前記界面活性剤は、トライトンＸ−１００（登録商標）、ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、および、ポリアクリル酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサ。 The surfactant is Triton X-100 (registered trademark), tween-20 (registered trademark), sodium dodecylbenzenesulfonate, carboxymethylcellulose, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, polyvinylsulfonic acid, polydiallyldimethylammonium salt, and The biosensor according to claim 13, wherein the biosensor is selected from the group consisting of polyacrylic acid.

前記酸化還元酵素は、グルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素であることを特徴とする請求項１乃至１４いずれか一項に記載のバイオセンサ。 Said oxidoreductase, biosensor according to any one of claims 1 to 14, characterized in that a glucose oxidase or glucose reductase.

前記試料が尿であることを特徴する請求項１乃至１５いずれか一項に記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 1 to 15, wherein the sample is urine.

試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサの製造方法であって、
基板を用意する工程と、
第一作用極と、前記第一作用極とは異なる第二作用極と、を含む電極系を形成する工程と、
前記基板に、前記試料が導入される濃度測定領域を設ける工程と、
を有し、
前記濃度測定領域を設ける工程は、
相対的に低い基質濃度を測定する第一測定領域を形成する工程と、
相対的に高い基質濃度を測定する第二測定領域を形成する工程と、
を含み、
前記第一測定領域には、第一反応層を前記第一作用極に接するように形成し、
前記第二測定領域には、第二反応層を前記第二作用極と接するように形成し、
前記第一反応層に、第一電子受容体と酸化還元酵素とを含ませ、
前記第二反応層は、前記第一電子受容体とは異なる第二電子受容体と、前記第一反応層に含まれる前記酸化還元酵素と同一の酸化還元酵素と、を含ませることを特徴とするバイオセンサの製造方法。 A method for producing a biosensor for electrochemically detecting a reaction between a substrate in a sample and an oxidoreductase to measure a substrate concentration,
Preparing a substrate;
Forming an electrode system including a first working electrode and a second working electrode different from the first working electrode;
Providing a concentration measurement region into which the sample is introduced on the substrate;
Have
The step of providing the concentration measurement region includes:
Forming a first measurement region for measuring a relatively low substrate concentration;
Forming a second measurement region for measuring a relatively high substrate concentration;
Including
Forming a first reaction layer in contact with the first working electrode in the first measurement region;
In the second measurement region, a second reaction layer is formed in contact with the second working electrode,
In the first reaction layer, a first electron acceptor and an oxidoreductase are included,
The second reaction layer includes a second electron acceptor different from the first electron acceptor, and the same oxidoreductase as the oxidoreductase contained in the first reaction layer. A method for manufacturing a biosensor.

請求項１乃至１６いずれかに記載のバイオセンサの使用方法であって、
前記第一反応層および前記第二反応層にそれぞれ試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と酸化還元酵素とを反応させるステップと、
前記第二反応層で反応した前記酸化還元酵素と前記第二反応層の電子受容体とを反応させるステップと、
前記第一反応層が設けられた第一測定領域で発生する電流と前記第二反応層が設けられた第二測定領域で発生する電流とをそれぞれ測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法。 A method of using the biosensor according to any one of claims 1 to 16,
Adding a sample to each of the first reaction layer and the second reaction layer;
Reacting the added substrate with the oxidoreductase;
Reacting the redox enzyme reacted in the second reaction layer with the electron acceptor in the second reaction layer;
Measuring each of a current generated in the first measurement region provided with the first reaction layer and a current generated in the second measurement region provided with the second reaction layer;
Of using a biosensor comprising:

０〜５ｇ／ｄｌの範囲の基質濃度を定量することを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサの使用方法。 The method for using a biosensor according to claim 18, wherein the substrate concentration in the range of 0 to 5 g / dl is quantified.

前記第二測定領域において、０．２〜５ｇ／ｄｌの基質濃度を定量することを特徴とする請求項１８または１９に記載のバイオセンサの使用方法。 The method of using a biosensor according to claim 18 or 19, wherein a substrate concentration of 0.2 to 5 g / dl is quantified in the second measurement region.