JP4999678B2 - アルカロイド化合物と抗マラリア剤としてのそれらの用途 - Google Patents
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Description
マラリアは、通常は、クロロキン、ピリメタミン、キニーネ、プログアニル、プリマキン、アルテミシニン化合物等、またその併用物を投与することにより治療されるが、ほとんどのマラリア寄生虫が最終的にはこれらの抗マラリア剤に対して耐性を持つようになったため、これらの一般的な抗マラリア剤を用いた効果的な治療は困難になった。通常の抗マラリア化合物のほとんどは、寄生虫の血液期には活性であるが、肝期(hepatic stage)では活性ではないことが知られている。
マラリアを治療するための既知の化合物のいくつかは、副作用がないわけではなく、ある状況でその長時間の使用を有害なものとし、これらの化合物の使用を制約する。
よって、それらの通常の欠点がなく、血液期ばかりでなく肝期においてもマラリアに対して有効であり、これにより化合物に予防効果をもたらす化合物が今でも必要とされている。さらに、製薬用組成物に処方するのが容易な抗マラリア剤が必要とされている。
日本国特開昭62−263158号には、抗腫瘍剤としてシノコクリン(sinoccoculine)が記載されており、日本国特開昭62−289565号には四環系アルカロイド類とそれらの抗腫瘍活性が記載されており、化合物はCocculus sarmentosus又はCocculus trilobusから抽出されている。
− R1は、H、又はiが0〜6であるOCiH2i+1であり;
− R2は、H、又はjが0〜6であるOCjH2j+1であり;
− R3は、H、又はkが0〜6であるOCkH2k+1であり;
− R4は、H又はOHであり;
− R5は、OH、又はmが1〜6であるOCmH2m+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R6は、OH、又はnが1〜6であるOCnH2n+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R7は、pが0〜6であるOCpH2p+1であり;
− R8及びR9は類似でも異なっていてもよく、H、又はqが0〜6のOCqH2q+1、又はHal(ここでHalはCl、Br、F又はIである)を表し、又は共に共有結合を形成し、ここで該結合は二重結合であるか、又は酸素原子と共にエーテル結合(エポキシ基)を形成し;
− R10は、H、又はrが1〜12であるCrH2r+1、又は不飽和のアルキル基又はシクロアルキル基で、(トリ-からヘキサ-)不飽和又はそうではなく、ヘテロ原子を有するか又は有さないもの;又はヘテロ原子を有するか又は有さない芳香族又は多環芳香族基;又はsが1〜12であるCsH2s-Aであり、ここでAは、ヘテロ原子を有するか又は有さない、飽和又は(トリ-からヘキサ-)不飽和のシクロアルキル基、又はヘテロ原子を有するか又は有さない芳香族又は多環芳香族基であり、又はAは、tが1〜5であるC6H5−t-(Hal)t、又はuが1〜5であり、vが0〜6であるC6H5−u-(O-CvH2v+1)u であり;又はR10は、窒素原子を第4級化にする類似の又は異なった2つの置換基、又は酸素原子(ニトロン基)を表し、この場合において、窒素原子とC9との間の結合は二重結合であり;又はR10は、wが0〜10であるCH2CH2[OCH2CH2]wOCH2CH2-Bを表し、ここでBはOH、O-D又はNH-Dであり、Dはイソチオシアナート等の求電子官能基を担持するC1-C12アルキル基であり;
− R11は、H、又はOH、又はxが1〜6であるOCxH2x+1、又はHal(ここでHalはCl、Br、F又はIである);又はアセトキシ基又はスルホナートエステル基、又はオキソ基であり;
又はR10及びR11はイソアルキリデン基を表してもよい]、又は
− R4は、H、又はOH、又はlが2〜6であるOClH2l+1であり;
− R10は、yが1〜12であるCyH2y、又はzが0〜10であるCH2CH2[OCH2CH2]zOCH2CH2であり;
− R11は、H、又はOH、又はxが1〜6であるOCxH2x+1、又はHal(ここでHalはCl、Br、F又はIである);又はアセトキシ基又はスルホナートエステル基、又はオキソ基である]
を有する化合物と、それらの全ての立体異性体及び光学異性体であり、
但し、式(I)において、(1)R3がOH又はアルコキシで、R4がH又はOHで、R5及びR6がOH又はアシルオキシで、R7がOCH3で、R8及びR9が二重結合を表し、R1がHである場合に、R2はH又はアルコキシではなく;また(2)R2がHで、R3及びR7がOCH3で、R4、R5及びR6がOHで、R8及びR9が二重結合を表し、R10がHである場合に、R1はHではなく;特に式(I)において、(1)R3がOH又はアルコキシで、R4がH又はOHで、R5及びR6がOH又はアシルオキシで、R7がOCH3で、R8及びR9が二重結合を表し、R1、R10及びR11がHである場合に、R2はH又はアルコキシではなく;また(2)R2がHで、R3及びR7がOCH3で、R4、R5及びR6がOHで、R8及びR9が二重結合を表し、R10及びR11がHである場合に、R1はHではなく、これらは日本国特開昭62−263158号及び日本国特開昭62−289565号から知られている。
本発明の一態様によれば、R10は、H、又はrが1〜12であり、AがHであるCrH2r-A、又はsが3〜6である環CsH2s−1、又は芳香環、又は多環芳香族、又はtが1〜5であり、HalがCl、Br、F又はIであるC6H5−t-(Hal)tとして、又はuが1〜5であり、vが0〜6であるC6H5−u-(O-CvH2v+1)uとして、又はwが1〜2であるC6H5−w-(NH2)wとして置換された芳香環を表すことができ;又はR10は、窒素原子を第4級化にする類似の又は異なった2つの置換基、又は酸素原子を表し;又はR10は、xが0〜10であり、BがH又はOH又はNH2又はN=C=Sである、CH2CH2-[O-CH2-CH2]xO-CH2-CH2-Bを表す。
好ましい化合物は以下、すなわち実施例及び詳細な説明に記載する。
また、本発明は、少なくとも一の第2の抗マラリア化合物及び製薬的に許容可能なビヒクルと共に、但し書きなしの上述した式I又は式IIの化合物を含有する製薬用組成物に関する。
また、本発明は、マラリアの治療に有用な製薬用組成物の製造のためのこれらの化合物の使用であって、該組成物が、但し書きなしでの式I又はIIの少なくとも一の化合物と他の抗マラリア化合物を含む使用に関する。
本発明は、さらに、マラリアの予防的又は治癒的処置に有用な製薬用組成物の製造のための、但し書きのない式I又はIIの化合物と、それらの全ての立体異性体及び光学異性体の使用に関する。
本発明は、また、Strychnopsis thouarsiiの単離抽出物と、式I又はIIの少なくとも一の化合物と、製薬的に許容可能なビヒクルを含有する製薬用組成物に関する。
本発明は、また、少なくとも前記Strychnopsis thouarsii抽出物及び製薬的に許容可能なビヒクルを含有する製薬用組成物の調製のための、Strychnopsis thouarsiiの単離抽出物の使用であって、該組成物がマラリアの予防的又は治癒的処置に有用である使用に関する。
しかしながら、プリマキンには非常に毒性があり、アトバコンは素早く耐性が生じるため、使用が制約されており、他の抗マラリア剤と組み合わせて使用されるのみである。
以下に記載する試験に従い、マウス及びヒト肝細胞におけるプラスモジウムの成長阻害によるインビトロでの抗マラリア活性について、植物の煎剤(滲出液)及びメタノール抽出物を評価した。
クロマトグラフィーによる分離技術にこのインビトロ試験を関連付ける植物抽出物のバイオアッセイ誘導分画を、以下に記載するようにして実施し、活性化合物の単離に至った。
本発明の製薬用組成物は、本発明の化合物(類)に加えて、製薬的に許容可能な担体を含む。製薬的に許容可能な担体は投薬形態に依存する。
本発明の化合物の利点の一つは、それらの生物学的利用能にある。水及び水性ビヒクル中でのそれらの溶解性は大きな利点である。
製薬的に許容可能なビヒクルの中でも、水性ビヒクルが好ましい。
本発明の製薬用組成物が注射可能な組成物である場合、適切な製薬的に許容可能な担体には、滅菌水、等張生理食塩水、及びpH緩衝液が含まれる。また、本発明の注射可能な組成物は、滅菌水に単に溶解させることで使用可能な、滅菌パウダー組成物又は凍結乾燥パウダー組成物であってもよい。本発明の注射可能な製薬用組成物は、糖類(グルコース、マンニトール及びデキストリン等)、多価アルコール(グリセロール等)、及び無機塩(ナトリウム塩及びマグネシウム塩等)を含んでいてもよい。
本発明の製薬用組成物が静脈内注射又は注入により投与される場合、それらは栄養素、例えばグルコース、ビタミン類、アミノ酸及び脂質を含んでいてもよい。
他の投与モデル、例えば経鼻投与、吸入及び経皮投与用の投与形態のものに添加される製薬用の担体もまた当業者にはよく知られている。
上述した投与形態及び製薬用の担体は、出典明示によりここに援用される、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, (1980), Mack Publishing Companyに記載されている。
これらの投与形式の中でも、経口投与が特に好ましく、また水性ビヒクルの使用が興味深い任意の形式も同様である。
本発明の化合物が、第2の抗マラリア化合物と組み合わせて、又は他の抗マラリア化合物の抗マラリア活性のエンハンサーとして存在する場合、本発明の化合物は製薬用組成物に0.0001〜20重量%の量で存在している。
本発明において、マラリアの処置に使用される本発明の化合物の有効量は、年齢、体重、患者の症状、及び投与形式に応じて、通常は毎日1−1000mg/kg体重、好ましくは毎日5−500mg/kg体重である。
さらに、酸化及び引き続いてのアルキル化は、通常の手順により実施することができ、必要ならば、予め置換基を保護することもできる。
図1は、感染後の日数に対する寄生虫血症のパーセンテージを示すグラフである。コントロールグループは●で示し、化合物(1)で処置したグループは◆で示す。
実施例1:抽出プロセス
以下の手順に従い、6日間、室温で、MeOH中に攪拌しつつ、500gのパウダー状のStrychnopsis thouarsiiの茎の樹皮を浸漬した。
24時間毎に溶質を濾過し、固形残留物を2リットルのMeOHで処理した。得られた6つの溶質をプールし、減圧下で蒸発乾固させたところ、22gのメタノール抽出物が得られた。
この抽出物を2リットルのH2Oに溶解させ、10000rpmで1時間、遠心分離した。10gの残留物を除去し、上清をH2OとCH2Cl2(500mL)の間で3回分配した。
画分をそれらのTLCプロファイルに従い、3つの画分F1〜F3にプールした。
画分F1(9.4g)をシリカゲルカラムでさらに分離させ、CH2Cl2-MeOH-NH4OH(85−15−0.5)で溶出させたところ、10の画分F1−1〜F1−10を得た。
以下に記載する方法に従い実施された生物活性の評価により、画分F1−6が、得られた画分の中で最も高い活性があることを決定した。
化合物(1)=4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシ-モルフィナンC18H23NO6
化合物(2)=4,6,7-トリヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシ-モルフィナン(シノコクリン又はFK1000)[CAS登録番号109351-36-2]C18H23NO5
画分F1−6(0.850g)のアリコートを、セファデックス(sephadex)ゲルカラム(LH-20)においてクロマトグラフィーにかけ、MeOHを用いて溶出させたところ、4つの画分F1−6−1〜F1−6−4を得た。
画分F1−6−3(0.368g)をシリカゲルカラムで精製し、CH2Cl2-MeOH-NH4OH(87-13-1)で溶出させたところ、6の画分F1−6−3−1〜F1−6−3−6を得た。
画分F1−6−3−4(0.122g)は2つの化合物(1)及び(2)の混合物であることが分かった。
さらに、F1−6−3−4(0.045g)のアリコートを調製シリカゲルTLCにかけ、CHCl3−NH(C2H5)2(70−30)にて移動させたところ、2つの画分F1−6−3−4−1(0.01g)とF1−6−3−4−2(0.028g)を得た。
第1の画分を、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(70−30−3)を用いたシリカゲルカラム濾過にかけたところ、純粋な化合物(2)(0.004g)が得られ、第2の画分からは、同じ条件下で純粋な化合物(1)(0.019g)が得られた。
画分F1−6(0.22g)のアリコートをそのまま調製シリカゲルTLCにかけ、CHCl3−MeOH−NH4OH(75−25−3.5)にて移動させたところ、化合物(1)(0.04g)が得られるが、極性の低い生成物に相当するバンドをプールし、第2の調製TLCにかけ、CHCl3−MeOH−CH3COOH−H2O(75−18−4−3)にて移動させたところ、3つの画分F1−6−1'〜F1−6−3'を得た。
画分F1−6−1'(0.012g)を、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(90−10−1)を用いたシリカゲルカラム濾過にかけたところ、純粋な化合物(2)(0.004g)が得られた。
1)化合物(1)
質量分析(ESI-TOF+):m/z 350.1[M+H]+
C18H24NO6に対する算出質量:350.1604
高分解能MS(DCI+):m/z 350.1604[M+H]+
UV(λmaxnm(ε)、MeOH):282(3318)、242sh(9926)、207(57483)
[α]20 D-46°(c0.5、MeOH)
円偏光二色性(λextnm、θ):(216、+66324)、(227、−15949)、(242、+16864)
(c=1.15x10−3M、MeOH)
1H-NMR(300MHz、CD3OD):δ6.85(d,1H,J=8.3Hz)、6.62(dd,1H,J=1.2,8.3Hz)、4.96(dd,1H,J=1.7,6.2Hz)、4.39(dd,1H,J=1.1,3.1Hz)、3.87(ddd,1H,J=3.1,3.9,13.5Hz)、3.84(s,3H)、3.78(s,3H)、3.31(ddd,3H,J=1.2,6.2,19.1Hz)、3.14(dd,1H,J=4.6,13.1Hz)、3.10(dd,1H,J=1.7,19.1Hz)、3.03(ddd,1H,J=1.1,3.9,13.5Hz)、2.84(ddd,1H,J=4.1,13.1,13.2Hz)、2.24(dd,1H,J=13.5,13.5Hz)、2.19(dd,1H,J=4.1,13.2Hz)、2.06(ddd,1H,J=4.6,13.2,13.2Hz)
13C-NMR(300MHz、CD3OD):δ33.53、34.08、36.0、38.46、40.67、47.96、56.22、56.67、65.38、68.11、111.30、113.92、119.48、127.90、128.56、145.79、148.09、150.66
(2)のNMRデータは、文献[1,2]に過去に記載されたものと同様であった。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 334.1[M+H]+
C18H24NO5に対する算出質量:334.1654
C18H23NO5に対して算出された高分解能MS:334.1655
UV(MeOH)λmaxnm(ε):282(2856)、242sh(6984)、207(59602)
[α]20 D-143°(c0.25、MeOH) 参照:[3] [α]20 D-137.4°(c0.12、MeOH)
円偏光二色性(λextnm、θ):(216、+63340)、(227、−15231)、(242、+16105)
(c=1.20x10−3M、MeOH)
参照:[1] CD(λextnm、θ):(238、+62100)(c=9.67x10−5M、MeOH)
化合物(2)及びシノコクリンの比旋光度値は酷似していた。
化合物(1)及び(2)は、シノコクリンと同じ核オーバーハウザー効果スペクトロスコピーY(Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY)(NOESY)相関関係(表1を参照)を示した。その結果、化合物(1)及び(2)にはシノコクリンと同じ相対配置(6S★、7S★、9R★、13S★)が付与されている。
さらに、化合物(1)及び(2)は、文献に記載されたシノコクリンと一致して、類似したCDスペクトル(216nm及び242nmで陽性極大、227nmで陰性極大)示し、化合物(1)及び化合物(2)の絶対(立体)配置が、それぞれ(6S、7S、9R、10R、13S)及び(6S、7S、9R、13S)であると結論付けることができた。
1)化合物(3)の調製
1mLのMeOHに(1)(10.9mg、0.031mmol)が入った溶液に、100μlのホルムアルデヒド溶液(水に37%)を添加した。室温で1時間攪拌した後、3mgのNaBH4を添加し、混合物をさらに3時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、さらにシリカゲルカラムにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(85−15−1)で溶出させたところ、収率71%で、白色固体として化合物(3)(8mg、0.022mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 364.1[M+H]+
C19H26NO6に対する算出質量:364.1760
高分解能MS(DCl+):m/z 364.1764[M+H]+
[α]20 D-41°(c0.5、MeOH)
1)化合物(4)の調製
300μlのMeOHに(1)(3.05mg、0.0087mmol)が入った溶液に、1μl、0.014mmolのプロピオンアルデヒド溶液と、0.6mg、0.0095mmolのシアノホウ化水素ナトリウムNaBH3CNを添加した。混合物を室温で4時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、調製TLCにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(90−10−1)で2回溶出させたところ、収率68%で、白色固体として(4)(2.3mg、0.059mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 392.2[M+H]+
C21H30NO6に対する算出質量:392.2073
高分解能MS(DCl+):m/z 392.2064[M+H]+
[α]20 D-18°(c0.1、MeOH)
1)化合物(5)の調製
500μlのMeOHに(1)(5.7mg、0.016mmol)が入った溶液に、200μl、1.6mmolのアニスアルデヒドを添加した。室温で1時間攪拌した後、3mgのNaBH4を添加し、混合物を室温でさらに3時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、調製TLCにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(90−10−1.5)で2回溶出させたところ、収率40%で、白色固体として(5)(3.0mg、0.0064mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 470.2[M+H]+
C26H32NO7に対する算出質量:470.2179
高分解能MS(DCl+):m/z 470.2170[M+H]+
[α]20 D-12°(c0.1、MeOH)
1)化合物(6)の調製
500μlのMeOHに(1)(4.85mg、0.014mmol)が入った溶液に、4-ヒドロキシ-ベンズアルデヒド(1.7mg、1当量)を添加した。室温で4時間攪拌した後、0.9mg、1当量のNaBH3CNを添加し、混合物を室温でさらに3時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、調製TLCにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(90−10−1)で2回溶出させたところ、収率55%で、白色固体として(6)(3.5mg、0.0077mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 456.2[M+H]+
C25H30NO7に対する算出質量:456.2022
高分解能MS(DCl+):m/z 456.2018[M+H]+
[α]20 D-10°(c0.03、MeOH)
1)化合物(7)の調製
300μlのMeOHに(1)(3.3mg、0.0095mmol)が入った溶液に、2mg、0.011mmolの4-ブロモ-ベンズアルデヒド、及び3mgのNaBH3CNを添加した。混合物を室温で20時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、調製TLCにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(95−5−0.5)で2回溶出させたところ、収率61%で、白色固体として(7)(3.0mg、0.0058mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 519.1及び521.1[M+H]+
C25H29NO6Brに対する算出質量:519.1035及び521.1055
高分解能MS(DCl+):m/z 519.1037及び521.1058[M+H]+
[α]20 D-0.5°(c0.5、MeOH)
1)化合物(8)の調製
300μlのMeOHに(1)(4.95mg、0.014mmol)が入った溶液に、2μl、0.023mmolのシクロペンタノン、及び3mgのNaBH3CNを添加した。混合物を室温で6時間攪拌した。
減圧下で溶媒を除去した後、残留物を1NのHClで酸性化し、ついで20%のNH4OH水で塩基性化し、調製TLCにかけ、CH2Cl2−MeOH−NH4OH(90−10−1)で2回溶出させたところ、収率81%で、白色固体として(8)(4.75mg、0.011mmol)が得られた。
質量分析(ESI-TOF+):m/z 418.2[M+H]+
C23H32NO6に対する算出質量:418.2230
高分解能MS(DCl+):m/z 418.2239[M+H]+
[α]20 D-30°(c0.03、MeOH)
・材料及び方法
・・植物抽出物及び純粋な化合物(1)−(8)の抗マラリア活性のインビトロでの評価
A−マウスモデル:Plasmodium yoelii yoelii 265BYの肝期
マウス肝細胞の初代培養物を、コラゲナーゼ(1g/L)を用いた灌流により、6〜8週齢のスイスマウスの肝臓から単離し、60%のパーコール勾配を通して精製した。
以下に記載するように、ウェル当たり0.3mLの次に記載する完全培養培地に90000細胞の割合で、肝細胞を滅菌チャンバー(Lab-Tek)にて培養し、4%のCO2雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。肝細胞の完全培養培地は、10%のdecomplementedウシ胎児血清、1%のグルタミン、1%のピルビン酸ナトリウム、1%のインシュリン、トランスフェリン及びセレンの混合物、1%の非必須アミノ酸、及びペニシリンとストレプトマイシンの1%溶液、1%のオウグメンチン、及び2.5pg/mlのフルシトシンを含有する抗生物質混合物が補足されたウィリアムズE培養培地であった。
肝細胞に感染している寄生虫;すなわちスポロゾイトは、感染したハマダラカ属の蚊の唾液腺を切開することにより回収した。
培養培地と共に、ポッター(Potter)グラインダーでそれらを挽いた後、懸濁液を40μmメッシュのフィルターで濾過し、4℃で2分間、遠心分離した(15000rpm)。ペレットを完全培養培地に再び導入した。ついで、「セルVu」カウンター(CML)でスポロゾイトを計測し、感染に必要な濃度である70μL当たり100000スポロゾイトに調節した。
感染した肝細胞を洗浄し、感染3時間及び24時間後に試験用生成物を含有する培養培地を与えた。
感染48時間後に、冷メタノール固定液で処理することにより、培養を停止した。
まず、シゾント期に得られた寄生虫を、プラスモジウム[4]のHSP70に対して反応した組換えタンパク質172のN末端からの組換え断片にて免疫されたBALB/cマウスから単離された血清を用い、第2に、FITCに結合させた抗体−マウス抗免疫グロブリン−を用いて、免疫標識付けをした。エバンス・ブルー及びDAPI、核酸マーカーを、同時に肝細胞に添加した。ついで、シゾントを蛍光顕微鏡で計測した。
マウス肝細胞でのP. yoelii yoelii 265BY成長に対して有意な阻害効果を示す抽出物及び精製された生成物を、P. falciparum NF54に感染したヒト肝細胞培養について試験した。
部分的肝切除を施したヒト成人の肝臓断片を酵素的に灌流することにより、ヒト肝細胞を得た。
P. falciparumに感染したハマダラカ属の蚊stephensiの唾液腺から得られたスポロゾイト(オランダのナイメーヘンのPr. W. Eling, Univの研究室)により、培養24時間後に、肝細胞を感染させた。
試験用生成物を含む培養培地を感染3時間後に交換し、ついで、実験中少なくとも24時間毎に新しいものにした。
感染5日後に、マウス肝細胞に対して記載されたもの[5]と同様の方法で、培養物を固定した。
CI50値(処置されないコントロールウェルと比較して、寄生虫の数が50%阻害される濃度)は、StatView SIグラフィックスによる3つの独立した評価の平均値である。
細胞傷害アッセイを、10%のウシ胎児血清、L-グルタミン(2mM)、ペニシリンG(100U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mM)及びゲンタマイシン(10μg/mL)が共に補填されたヒト癌腫KB株化細胞(ATCC CCL-17)(DMEM培地中104細胞/mL)及びヒト大腸腫瘍HT29株化細胞(ATCC HTB-38)(RPMI1640培地中105細胞/mL)に対し、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて3回実施した。
試験用化合物の原液をH2O/DMSO(9/1)に調製した。
5%のCO2の雰囲気下、72時間、37℃でのインキュベートの後、PBSに0.02%のニュートラルレッドを添加した。
24時間後、培養培地を除去し、水に1%のSDSを添加することにより、細胞膜を溶解させた。
ニュートラルレッドが導入されて染色された生存細胞を比色測定することにより、細胞増殖を評価した。光学密度をTitertek Multiskan光度計にて540nmで測定した。
コントロールの50%の細胞増殖を阻害するのに必要な化合物の濃度として、CI50値を定義した。
表2は、マウス肝細胞でのP. yoelii yoelii 265BYの成長阻害及びヒト腫瘍株化細胞に対するそれらの細胞傷害性についての、天然化合物(1)及び(2)、及び(1)のN置換誘導体の化合物(3)−(8)のインビトロ活性を表す。
表2では、Rは、式Iに記載の(1)の化学修飾により、窒素原子に導入される基を表す。
算出された選択指数(=細胞傷害性のCI50と抗マラリア活性のCI50との比)は、哺乳動物細胞に関し、プラスモジウム寄生虫に対する化合物の実際の効果であるべきである。
プリマキン及びアトバコンは、プラスモジウムの肝期に対するそれらの阻害活性の参照として試験する一方、5-フルオロウラシル及びビンブラスチンは、KB及びHT29細胞に対するそれらの細胞傷害活性の参照として試験した。
40匹のスイスマウス(6週齢)に対してインビボアッセイを実施した。それらを2つのグループに分けた:
− 20匹のマウスのグループには、100mg/kgの用量で滅菌水に希釈した化合物(1)を4回:感染24時間前及び1時間前、肝期中、感染24時間後及び40時間後に与えた;
− 20匹のマウスのコントロールグループには、同じ回数、滅菌水を与えた。
マウス当たり、100μlのリン酸緩衝生理食塩水に、4000のPlasmodium yoelii yoelii 265BYのスポロゾイトが入ったものを眼窩後注射により、感染を実施した。
寄生虫が肝臓から解放され、血液循環に入る感染後3日目D3から感染後23日目D23の間で毎日、寄生虫血症をモニターした。マウスの尾静脈から取り出された血液塗抹標本によって、モニタリングを実施した。塗抹標本をギームザで染色し、寄生された赤血球を顕微鏡で計測する。
寄生虫血症を以下の式に従い算出した:
寄生された赤血球数×100/全赤血球数
以下の表は得られた結果を表す。
処理グループでは、第1のマウスは感染後6日目に寄生があり、これはコントロールグループのマウスと比較して3日遅い。
アッセイの終わりである23日目には、処理されたマウスでは20匹のうち6匹のみが寄生されているが、コントロールマウスでは100%が寄生されていた。その結果を図1に示す。
第2の結論として、100mg/kgの化合物(1)を用いた処理により、コントロールグループ(75%)と比較して、処理グループ(90%)においてD23でのマウスの生存率を良好にすることができる。
さらに、寄生虫血症の平均パーセンテージは、コントロールグループにおいて寄生されたマウスと比較して、処理グループにおいて寄生されたマウスの方が低かった(図1)。
第3の結論として、100mg/kgの化合物(1)を用いた処理により、寄生された赤血球の数を有意に低減させることができる。
インビボでの結果は、Plasmodium yoelii 265BY及びPlasmodium falciparum NF54に対する保護についての、化合物(1)の効果に関し、インビトロでの結果を追認する。経口投与された化合物(1)は、P. yoelii 265BYによる感染からマウスを保護し(70%)、寄生虫血症を低減させ、寄生虫の出現を遅延化させ、マウスの生存率を改善する。
この予防的処置は、主として寄生虫の血液形態を標的とする通常の処置とは異なる。
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[5]Mazier D., Beaudoin R.L., Mellouk S., Druilhe P., Texier B., Trosper J., Miltgen F., Landau I., Paul C., Brandicourt O.ら.Complete development of hepatic stages of Plasmodium falciparum in vitro.Science, 1985, 227(4685), 440-2.
Claims (14)
- 次の式:
− R3は、H、又はkが0〜6であるOCkH2k+1であり;
− R4は、H又はOHであり;
− R5は、OH、又はmが1〜6であるOCmH2m+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R6は、OH、又はnが1〜6であるOCnH2n+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R7は、pが0〜6であるOCpH2p+1であり;
− R 10 は、H、又はrが1〜12であり、AがHであるC r H 2r -A、又はsが3〜6である環C s H 2s−1 、又は芳香環、又は多環芳香族、又はtが1〜5であり、HalがCl、Br、F又はIであるC 6 H 5−t -(Hal) t として、又はuが1〜5であり、vが0〜6であるC 6 H 5−u -(O-C v H 2v+1 ) u として、又はwが1〜2であるC 6 H 5−w -(NH 2 ) w として置換された芳香環であるか;又はR 10 は、窒素原子を第4級化にする類似の又は異なった2つの置換基、又は酸素原子を表し;又はR 10 は、xが0〜10であり、BがH又はOH又はNH 2 又はN=C=Sである、CH 2 CH 2 -[O-CH 2 -CH 2 ] x O-CH 2 -CH 2 -Bを表す]
を有する化合物と、それらの全ての立体異性体及び光学異性体。 - 4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシモルフィナン、及びN-メチル-、N-プロピル-、N-4-メトキシベンジル-、N-4-ヒドロキシベンジル-、N-4-ブロモベンジル-又はN-シクロペンチル-4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシ-モルフィナンを含む群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- 4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシモルフィナンである請求項1に記載の化合物。
- N-シクロペンチル-4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシ-モルフィナンである請求項1に記載の化合物。
- 光学的配置(6S、7S、9R、10R、13S)を有する、請求項2ないし4のいずれか一項に記載の化合物。
- 次の式:
− R3は、H、又はkが0〜6であるOCkH2k+1であり;
− R4は、H又はOHであり;
− R5は、OH、又はmが1〜6であるOCmH2m+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R6は、OH、又はnが1〜6であるOCnH2n+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R7は、pが0〜6であるOCpH2p+1であり;
− R 10 は、H、又はrが1〜12であり、AがHであるC r H 2r -A、又はsが3〜6である環C s H 2s−1 、又は芳香環、又は多環芳香族、又はtが1〜5であり、HalがCl、Br、F又はIであるC 6 H 5−t -(Hal) t として、又はuが1〜5であり、vが0〜6であるC 6 H 5−u -(O-C v H 2v+1 ) u として、又はwが1〜2であるC 6 H 5−w -(NH 2 ) w として置換された芳香環であるか;又はR 10 は、窒素原子を第4級化にする類似の又は異なった2つの置換基、又は酸素原子を表し;又はR 10 は、xが0〜10であり、BがH又はOH又はNH 2 又はN=C=Sである、CH 2 CH 2 -[O-CH 2 -CH 2 ] x O-CH 2 -CH 2 -Bを表す]
の化合物と、それらの全ての立体異性体及び光学異性体、又はそれらの製薬的に許容可能な塩を含んでなる抗マラリアの予防的又は治癒的処置のための医薬。 - 次の式:
− R3は、H、又はkが0〜6であるOCkH2k+1であり;
− R4は、H又はOHであり;
− R5は、OH、又はmが1〜6であるOCmH2m+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R6は、OH、又はnが1〜6であるOCnH2n+1、又はアセトキシ基又はオキソ基であり;
− R7は、pが0〜6であるOCpH2p+1であり;
− R 10 は、H、又はrが1〜12であり、AがHであるC r H 2r -A、又はsが3〜6である環C s H 2s−1 、又は芳香環、又は多環芳香族、又はtが1〜5であり、HalがCl、Br、F又はIであるC 6 H 5−t -(Hal) t として、又はuが1〜5であり、vが0〜6であるC 6 H 5−u -(O-C v H 2v+1 ) u として、又はwが1〜2であるC 6 H 5−w -(NH 2 ) w として置換された芳香環であるか;又はR 10 は、窒素原子を第4級化にする類似の又は異なった2つの置換基、又は酸素原子を表し;又はR 10 は、xが0〜10であり、BがH又はOH又はNH 2 又はN=C=Sである、CH 2 CH 2 -[O-CH 2 -CH 2 ] x O-CH 2 -CH 2 -Bを表す]
の化合物と、それらの全ての立体異性体及び光学異性体、又はそれらの製薬的に許容可能な塩を含んでなる肝期におけるマラリアの予防的又は治癒的処置のための医薬。 - 少なくとも一の第2の抗マラリア化合物、製薬的に許容可能なビヒクルと共に、請求項1に記載の少なくとも一の化合物又はそれらの製薬的に許容可能な塩を含有する抗マラリアの予防的又は治癒的処置のための製薬用組成物。
- 請求項1ないし5のいずれか一項に記載の少なくとも一の化合物、又はそれらの製薬的に許容可能な塩と、製薬的に許容可能なビヒクルを含有する抗マラリアの予防的又は治癒的処置のための製薬用組成物。
- 式Iの化合物が、組成物の重量に対して0.001〜50重量%の量で存在している、請求項8又は9に記載の製薬用組成物。
- ビヒクルが水性である、請求項8ないし10のいずれか一項に記載の製薬用組成物。
- 抗マラリア活性を有するStrychnopsis thouarsiiの単離抽出物を含む、請求項8ないし11のいずれか一項に記載の抗マラリアの予防的又は治癒的処置のための製薬用組成物。
- 請求項1ないし5のいずれか一項に記載の式Iの化合物の少なくとも一と製薬的に許容可能なビヒクルを含有する、Strychnopsis thouarsiiの単離抽出物を含む抗マラリアの予防的又は治癒的処置のための製薬用組成物。
- 4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシモルフィナン、又はN-シクロペンチル-4,6,7,10-テトラヒドロキシ-8,14-ジデヒドロ-3,8-ジメトキシ-モルフィナンを含有する請求項8ないし13のいずれか一項に記載の製薬用組成物。
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