JP4997500B2 - Animal viable agent, feed composition, and method of use - Google Patents

Description

本発明は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）を含有する動物用生菌剤、この菌株を含有する飼料組成物、及び、動物の体重増加量の向上、下痢又は軟便の治療又は予防のためにこれらの生菌剤又は飼料組成物を使用する方法に関する。 The present invention includes a live bacterial agent for animals containing Lactobacillus plantarum HOKKAIDO strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center accession number: FERM P-19645), and this strain. The present invention relates to a feed composition and a method of using these live fungal agents or feed compositions for improving the weight gain of animals, treating or preventing diarrhea or loose stool.

牛、豚、鶏等の家畜の飼養者にとって、家畜の健康維持促進を図って生産性を向上させることは重大な関心事である。例えば、体重が小さく疾病を発症しやすい幼動物では細菌感染や免疫力不足のために下痢が発生しやすく、特に子牛では斃死原因の６２．１％が下痢や消化不良であると報告されている（ＵＳＤＡ、２００２）。従って、下痢や消化不良の治療や予防は、家畜の生産性向上のため不可欠な事項である。   For livestock farmers such as cattle, pigs, and chickens, it is of great concern to improve productivity by promoting the maintenance of livestock health. For example, diarrhea is likely to occur due to bacterial infection and lack of immunity in young animals that are small in weight and prone to disease, and in calves, 62.1% of moribund causes are reported to be diarrhea and indigestion. (USDA, 2002). Therefore, the treatment and prevention of diarrhea and indigestion is indispensable for improving the productivity of livestock.

下痢や消化不良の治療や予防のために、飼料以外の様々な添加剤、例えば抗生物質が併給されてきた。しかし、近年抗生物質の多用により、多剤耐性菌の出現等の弊害が指摘され、消費者から健康的で安心安全な飼養技術が求められており、抗生物質の使用については世界的に規制が強化される傾向にある。一方、近年サルモネラ、ボツリヌス等、動物や畜産物から移行した有害微生物がヒトヘ重大な健康被害を引き起こす事例が増えている。従って、抗生物質に代わってこれら有害な微生物を抑制する作用を有する物質が飼料と共に動物に併給されるのが好ましい。   For the treatment and prevention of diarrhea and indigestion, various additives other than feed, such as antibiotics, have been co-supplied. However, due to the heavy use of antibiotics in recent years, adverse effects such as the emergence of multidrug-resistant bacteria have been pointed out, and consumers are demanding healthy, safe and safe breeding techniques. It tends to be strengthened. On the other hand, in recent years, there are an increasing number of cases where harmful microorganisms transferred from animals and livestock products such as Salmonella and Botulinum cause serious health damage to humans. Therefore, it is preferable that a substance having an action of suppressing these harmful microorganisms is supplied to the animal together with the feed instead of the antibiotic.

一方、乳酸菌、特にプロバイオテック機能を有する乳酸菌は、上述の抗生物質の有する問題点を有さず、大腸菌等の増殖を抑制する作用を有する乳酸を生成し、下痢や消化不良の治療や予防の効果が期待されるため、これまで広く検討されてきた。   On the other hand, lactic acid bacteria, particularly lactic acid bacteria having a probiotic function, do not have the problems of the above-mentioned antibiotics, produce lactic acid having an action of inhibiting the growth of Escherichia coli, etc., and treat or prevent diarrhea and indigestion Since the effect of is expected, it has been widely studied so far.

例えば、特表２００１−５１９１４４号公報（特許文献１）は、ウマ腸でコロニー形成する能力を有するラクトバチルス・プランタラムＪＩ：１ ＤＣＭ １１５２０株等を含むウマ飼料製品を開示しており、抗生物質による治療時の副作用である胃腸障害がこの飼料製品のウマへの給与により改善されたこと等が記載されている。しかしながら、ウマ以外の畜種に対する記述がなく、またウマの体重増加量の向上については明らではない。   For example, JP-T-2001-519144 (Patent Document 1) discloses a horse feed product containing Lactobacillus plantarum JI: 1 DCM 11520 strain and the like having the ability to colonize the horse intestine, and antibiotics. It is described that the gastrointestinal disorder, which is a side effect at the time of treatment by, was improved by feeding this feed product to horses. However, there is no description for non-horse breeds, and it is not clear about the improvement in weight gain of horses.

また、特開２００２−２３８４６５号公報（特許文献２）は、ソルビン酸とプロバイオテック活性を有する微生物の培養菌を含有する飼料用添加物を開示している。プロバイオテック活性を有する微生物自体については、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーサス等の極めて多くの乳酸菌や酵母が羅列されているだけで、それぞれの菌種については詳細な記載はない。   Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-238465 (Patent Document 2) discloses an additive for feed containing sorbic acid and a culture of a microorganism having probiotic activity. As for microorganisms having probiotic activity, only a large number of lactic acid bacteria and yeasts such as Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus are listed, and there is no detailed description of each bacterial species.

さらに、特開２００５−２２４１３３号公報（特許文献３）は、動物用乳酸発酵大豆タンパク質性飼料成分の調製方法を開示している。この方法では、大豆に含まれる鼓腸誘発性オリゴ糖をグルコシターゼで処理して発酵性糖類に加水分解して無害化する際に、乳酸生産性培養物で発酵性糖類を処理して加水分解速度を向上させている。しかしながら、乳酸生産性培養物についてはラクトバチルス・プランタラム、ストレプトコッカス・クレモリス等の非常に多くの一般的な乳酸菌が羅列されているだけで、乳酸菌株自体の動物に対する機能性については明らかにされていない。   Furthermore, JP-A-2005-224133 (Patent Document 3) discloses a method for preparing a lactic acid-fermented soy proteinaceous feed ingredient for animals. In this method, when flatulence-inducing oligosaccharides contained in soybeans are treated with glucosidase and hydrolyzed into fermentable saccharides to render them harmless, the fermentable saccharides are treated with a lactic acid-producing culture to increase the hydrolysis rate. It is improving. However, only a large number of common lactic acid bacteria such as Lactobacillus plantarum and Streptococcus cremoris are listed in the lactic acid-producing culture, and the functionality of the lactic acid strain itself for animals has not been clarified. Absent.

また、特開２００５−２２４２２４号公報（特許文献４）は、新規な乳酸菌株ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５。以下、「ＨＯＫＫＡＩＤＯ株」という）、及び、それを用いた発酵豆乳を開示している。特許文献４は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株が単一菌として優れた発酵力を有し、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株をスタータとして風味の優れた豆乳が得られることを開示している。また、“食品と開発，４（７），７０〜７１（２００６）”（非特許文献１）は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株のヒトへの摂取試験において、糞便中からＨＯＫＫＡＩＤＯ株が主要な乳酸菌として検出され、乳酸菌数及びビフィズス菌が増加したことを記載している。しかしながら、これらの先行技術文献では、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株がヒト以外の動物に対する機能性を有するかどうかについては明らかにされていない。   JP-A-2005-224224 (Patent Document 4) discloses a novel lactic acid strain Lactobacillus plantarum HOKKAIDO strain (FERM P-19645, hereinafter referred to as “HOKKAIDO strain”) and fermented soymilk using the same. Is disclosed. Patent Document 4 discloses that the HOKKAIDO strain has excellent fermentative power as a single bacterium, and soy milk with excellent flavor can be obtained using the HOKKAIDO strain as a starter. In addition, “Food and Development, 4 (7), 70-71 (2006)” (Non-Patent Document 1) shows that the HOKKAIDO strain was detected as the main lactic acid bacterium in feces in the human ingestion test of the HOKKAIDO strain, It describes that the number of lactic acid bacteria and bifidobacteria increased. However, these prior art documents do not disclose whether the HOKKAIDO strain has functionality for animals other than humans.

さらに、複数の種類の微生物を含有する複合生菌剤に関する情報や市販製品が流通しており、ラクトバチルス・プランタラムを含む複合生菌剤も存在する（例えば、「ボバクチン」（株式会社ミヤリサン製））。   In addition, information and commercial products related to complex live bacteria containing a plurality of types of microorganisms are distributed, and there are also complex live bacteria containing Lactobacillus plantarum (for example, “Bobactin” (manufactured by Miyarisan Co., Ltd.). )).

特表２００１−５１９１４４号公報Special table 2001-519144 gazette 特開２００２−２３８４６５号公報JP 2002-238465 A 特開２００５−２２４１３３号公報JP 2005-224133 A 特開２００５−２２４２２４号公報JP-A-2005-224224 食品と開発，４（７），７０〜７１（２００６）Food and Development, 4 (7), 70-71 (2006)

しかしながら、プロバイオテック活性を有する微生物による動物の下痢軟便抑制及び体重増加に対する効果、飼料効率に対する効果は一般には不明瞭であり、ラクトバチルス・プランタラムについても単独菌株で明瞭な動物の下痢軟便抑制効果と体重増量効果とを有するものは知られていない。従って、ラクトバチルス・プランタラムの単独菌株を用いて、動物の増体促進や下痢抑制により健康的に動物を飼育したり、家畜の生産性を良好に維持できる機能性飼料を提供することはできなかった。   However, the effects of microorganisms with probiotic activity on the suppression of animal diarrhea and stool, weight gain, and feed efficiency are generally unclear. Nothing has an effect and weight gain effect. Therefore, using a single strain of Lactobacillus plantarum, it is not possible to provide a functional feed that can keep animals healthy and maintain good livestock productivity by promoting animal gain and suppressing diarrhea. There wasn't.

また、複数の種類の微生物を含む複合生菌剤については、菌どうしの科学的な因果関係や生菌剤自体の作用メカニズムが必ずしも明確でない上に、複合生菌剤の製造には複数段の培養工程が含まれる等、製造工程、管理工程が複雑であり、経済的にも不利である。   In addition, regarding the complex viable agent containing multiple types of microorganisms, the scientific causal relationship between the bacteria and the mechanism of action of the viable agent itself are not necessarily clear, and the production of the complex viable agent is not possible in several stages. The manufacturing process and the management process are complicated, including a culture process, which is disadvantageous economically.

従って、本発明の目的は、単独の微生物であっても十分な動物の下痢軟便抑制効果及び体重増加効果を示し、動物に給与しても安全であり、家畜の生産性向上に寄与することができる生菌剤及び飼料組成物を提供することである。   Therefore, the object of the present invention is to exhibit sufficient diarrhea loose stool suppression effect and weight gain effect even with a single microorganism, it is safe even if fed to animals, and contributes to the improvement of livestock productivity. It is to provide a viable fungus and feed composition.

発明者らは上記の課題を解決するため、広範な有用微生物素材について鋭意研究を行なった結果、食味が非常に良好な古漬けから分離されたＨＯＫＫＡＩＤＯ株が、単独でも十分な動物の下痢軟便抑制効果及び体重増加効果を示し、この菌株を用いることで上記課題を解決できることを発見し、本発明に至った。   In order to solve the above-mentioned problems, the inventors have conducted extensive research on a wide range of useful microorganism materials. As a result, the HOKKAIDO strain isolated from old pickles with a very good taste is sufficient to suppress diarrhea and loose stool in animals alone. It was found that the above problems could be solved by using this strain, showing the effect of increasing body weight and reaching the present invention.

すなわち、本発明はまず、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含有する動物用生菌剤に関する。この生菌剤に使用するＨＯＫＫＡＩＤＯ株は、ＢＳＥ対策上、動物由来材料を含まない培地で培養されるのが好ましい。尚、本発明において、「動物」とは、ヒト以外の脊椎動物を意味し、牛、馬、豚、羊、鶏等の家畜、サル、犬、猫、ハムスター、小鳥等の愛玩動物の他、魚等も含まれる。   That is, the present invention first relates to a live bacterial agent for animals containing the HOKKAIDO strain. The HOKKAIDO strain used for this viable agent is preferably cultured in a medium that does not contain animal-derived materials for BSE countermeasures. In the present invention, “animal” means a vertebrate other than a human, domestic animals such as cows, horses, pigs, sheep, and chickens, pets such as monkeys, dogs, cats, hamsters, and small birds, Fish etc. are also included.

この生菌剤は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株以外の生菌を含むこともできるが、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株が単独でも十分な動物の下痢軟便抑制効果及び体重増加効果を示すため、生菌として実質的にＨＯＫＫＡＩＤＯ株のみを含有する動物用生菌剤とするのが好ましい。このことにより、生菌剤の製造が容易かつ安価になる。   Although this viable agent can also contain viable bacteria other than the HOKKAIDO strain, since the HOKKAIDO strain alone exhibits a sufficient animal diarrhea loose stool suppression effect and body weight gain effect, substantially only the HOKKAIDO strain is viable. It is preferable to make it contain the live bacteria agent for animals. This makes it easy and inexpensive to produce viable bacteria agents.

この生菌剤は、飲料と共に動物に給与することができ、又はサプリメントとして動物に給与することもできる。   This viable agent can be fed to the animal along with the beverage, or can be fed to the animal as a supplement.

本発明はまた、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含有する飼料組成物に関する。尚、本発明において、「飼料組成物」には、家畜に給与される飼料組成物の他、上述の動物に一般に供与される飼料組成物も含まれる。ＨＯＫＫＡＩＤＯ株が単独でも十分な動物の下痢軟便抑制効果及び体重増加効果を示すため、本発明の飼料組成物は、家畜や愛玩動物の健康維持促進のために効果的であり、家畜の生産性を向上させることができる。   The present invention also relates to a feed composition containing the HOKKAIDO strain. In the present invention, the “feed composition” includes, in addition to the feed composition fed to livestock, a feed composition generally provided to the above-mentioned animals. Since the HOKKAIDO strain exhibits sufficient diarrhea loose stool suppression effects and weight gain effects even when used alone, the feed composition of the present invention is effective for promoting the health maintenance of domestic animals and pet animals, and increases the productivity of domestic animals. Can be improved.

本発明の飼料組成物は、例えば動物への給与の直前に基礎飼料に上述の動物用生菌剤を添加することにより製造しても良く、また、基礎飼料に上述の動物用生菌剤を添加して発酵させることにより製造することもできる。尚、本発明において、「基礎飼料」とは、一般に食用として動物に給与される飼料（例えば穀類、野菜、牧草、食品加工副産物、農産加工副産物等）であって、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含まないものを意味する。   The feed composition of the present invention may be produced, for example, by adding the above-mentioned live bacteria agent for animals to the basic feed immediately before feeding to the animal. It can also be produced by adding and fermenting. In the present invention, the “basic feed” is a feed (eg, cereals, vegetables, pasture, food processing by-products, agricultural processing by-products, etc.) that is generally fed to animals as food, and does not include the HOKKAIDO strain. means.

本発明の飼料組成物は、安全であり、また、明確な動物の下痢軟便抑制効果及び体重増加効果を示すため、体重が小さく疾病を発症しやすい幼動物に対する代用乳の形態であるのが好ましく、また、動物一般に対して給与することができるが、好ましくは、牛、羊、豚、犬、猫、鶏に対して給与するのが好ましく、特に牛に対して、中でも下痢や消化不良のために斃死することが多い子牛に対して給与するのが好ましい。   The feed composition of the present invention is preferably in the form of milk substitute for a young animal having a small body weight and easily developing a disease, because it is safe and exhibits a clear diarrhea stool suppression effect and weight gain effect. It can be fed to animals in general, but it is preferred to feed cattle, sheep, pigs, dogs, cats and chickens, especially for cattle, especially for diarrhea and indigestion. It is preferable to feed calves that are often drowning.

本発明はまた、動物の下痢又は軟便の治療又は予防のために、上述の動物用生菌剤又は上述の飼料組成物を使用する方法、及び、動物の体重増加量の向上のために、上述の動物用生菌剤又は上述の飼料組成物を使用する方法を提供する。尚、「体重増加量の向上」とは、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含まない基礎飼料を動物に給与した場合と比較して体重増加量が増えることを意味する。   The present invention also provides a method of using the above-mentioned live bacteria agent for animals or the above-mentioned feed composition for the treatment or prevention of diarrhea or loose stool in animals, and for improving the weight gain of animals. A method for using the animal live fungus or the above-mentioned feed composition. “Improvement in weight gain” means that the weight gain increases as compared to the case where a basic feed not containing the HOKKAIDO strain is fed to an animal.

ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を使用することにより、安全で明瞭な下痢軟便抑制効果や体重増量効果を有する動物用生菌剤及び飼料組成物が得られる。従って、本発明により動物を健康的に飼育したり、安全かつ効率的に畜産物を生産することが可能となる。   By using the HOKKAIDO strain, a live animal agent for animal and a feed composition having a safe and clear diarrhea loose stool inhibitory effect and weight gain effect can be obtained. Therefore, according to the present invention, it becomes possible to breed animals healthily and produce livestock products safely and efficiently.

以下、本発明の実施の形態について、具体的かつ詳細に説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described specifically and in detail.

本発明において使用されるＨＯＫＫＡＩＤＯ株の培養には、一般的なＭＲＳ培地、ＧＹＰ培地、ＢＬＢ培地等の乳酸菌用培地の他、果汁、野菜等の搾り汁、乳製品、牧草や穀物等の熱水抽出液、加水して加熱殺菌した糟糠類分散物等、乳酸菌の増殖を抑制せず、安全な素材であれば基本的に使用することができる。家畜用には、ＢＳＥ対策上、動物由来材料を含有していない培地の使用が望ましい。また、培地は、接種前に滅菌することが望ましいが、物理的、化学的、生物学的な要因により、目的の菌株以外の微生物の生育を抑制できる場合には、必ずしも滅菌する必要はない。   For culturing the HOKKAIDO strain used in the present invention, in addition to a medium for lactic acid bacteria such as a general MRS medium, GYP medium and BLB medium, juices such as fruit juice and vegetables, hot water such as dairy products, grass and grains Basically, any extract can be used as long as it is a safe material that does not inhibit the growth of lactic acid bacteria, such as moss dispersions that have been sterilized by heating and heat. For livestock, it is desirable to use a medium that does not contain animal-derived materials for BSE countermeasures. The medium is preferably sterilized before inoculation, but is not necessarily sterilized if the growth of microorganisms other than the target strain can be suppressed due to physical, chemical, and biological factors.

培養条件は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の生残性が良好であれば特に限定されないが、一般に、温度は２５℃〜４２℃の範囲が好ましく、３０℃〜３７℃の範囲がより好ましい。培地のｐＨは、６〜８の範囲に制御されるのが好ましく、６〜７の範囲に制御されるのがより好ましい。菌株の接種量は、培地の重量又は体積に対して接種源が０．０１％〜１０％の濃度が好ましく、０．１〜５％の濃度がより好ましい。初発菌数は、１０⁴〜１０¹⁰ＣＦＵ／ｇの範囲が好ましく、１０⁶〜１０⁸ＣＦＵ／ｇの範囲がより好ましい。培養時間は、１０時間〜１０日の範囲が好ましく、１〜４日の範囲がより好ましい。これ以外の条件でも、培地等他の条件を組み合わせて実施することができる。 The culture conditions are not particularly limited as long as the survival of the HOKKAIDO strain is good, but in general, the temperature is preferably in the range of 25 ° C to 42 ° C, more preferably in the range of 30 ° C to 37 ° C. The pH of the medium is preferably controlled in the range of 6-8, and more preferably in the range of 6-7. The inoculation amount of the strain is preferably 0.01% to 10%, more preferably 0.1 to 5%, based on the weight or volume of the medium. The initial bacterial count is preferably in the range of 10 ⁴ to 10 ¹⁰ CFU / g, more preferably in the range of 10 ⁶ to 10 ⁸ CFU / g. The culture time is preferably in the range of 10 hours to 10 days, and more preferably in the range of 1 to 4 days. Even under other conditions, it can be carried out in combination with other conditions such as culture medium.

本発明では、上述の培養液そのものを懸濁液状の生菌剤とすることができる。また、培養液を濃縮することにより生菌剤とすることもできる。濃縮は、ろ過法や遠心分離法等の公知の方法で行うことができる。また、培養液を希釈することにより生菌剤とすることができる。希釈には、水、果汁、野菜等の搾り汁、乳製品、牧草や穀物等の熱水抽出液、加水して加熱殺菌した糟糠類分散物等を使用することができる。   In the present invention, the above-mentioned culture solution itself can be used as a suspension-like viable agent. Moreover, it can also be set as a living microbe agent by concentrating a culture solution. Concentration can be performed by a known method such as a filtration method or a centrifugal separation method. Moreover, it can be set as a living microbe agent by diluting a culture solution. For dilution, squeezed juices such as water, fruit juices and vegetables, dairy products, hot water extracts such as pastures and grains, moss dispersions sterilized by heating and sterilized, and the like can be used.

また、培養液を遠心分離して菌体を採集し、滅菌した生理食塩水等で洗浄した後、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥、真空凍結乾燥等の公知の方法により乾燥し、乾燥粉末の形態の生菌剤とすることもできる。乾燥に先立って、菌株を基材に固定することもできる。基材は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の生存に影響を与えない限り、有機物でも無機物でも良く、多糖類、澱粉、炭酸カルシウム、スキムミルク等の乳製品の他、市販の豆乳等も使用することができる。基材への固定は、培養液やその濃縮物又は希釈物を基材に混合、塗布、被覆、浸透、又は噴霧すること等により行うことができる。   In addition, after centrifuging the culture solution to collect the cells, washing them with sterilized physiological saline, etc., the cells are dried by a known method such as ventilation drying, hot air drying, spray drying, fluidized bed drying, vacuum freeze drying and the like. It can also be a viable agent in the form of a dry powder. Prior to drying, the strain can also be immobilized on a substrate. The base material may be organic or inorganic as long as it does not affect the survival of the HOKKAIDO strain, and commercially available soy milk can be used in addition to dairy products such as polysaccharides, starch, calcium carbonate and skim milk. Fixing to the substrate can be performed by mixing, applying, coating, penetrating, or spraying the culture solution or its concentrate or dilution to the substrate.

乾燥粉末は、公知の方法により、造粒しても良く、押出成形、打錠成形等によりペレット化しても良く、またマイクロカプセル化した生菌剤としても良い。カプセル化のためには、ゼラチン、レシチン、ステアレート類、アルギナート類、トラガカンス、アラビアゴム、変性澱粉、セルロース、パルミチン等を使用することができる。   The dry powder may be granulated by a known method, may be pelletized by extrusion molding, tableting molding or the like, or may be a microbacterial viable agent. For encapsulation, gelatin, lecithin, stearates, alginate, tragacanth, gum arabic, modified starch, cellulose, palmitic acid and the like can be used.

本発明の生菌剤には、他の有用な菌株が含まれていても良い。例えば、プロバイオテック機能を有する乳酸菌や酵母、例えば、バチルス・セレウス、バチルス・サブチリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ガゼイ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・インファンタリアス、サッカロミセス・セレビシエ、及びこれらの混合物等が含まれていても良い。この場合には、これらの菌株を別々に培養した後、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株と混合するか、又は、菌株どうしの相性の良い場合には最初から混合培養することもできる。しかしながら、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株は単独でも優れた動物への機能性を示すため、本発明の生菌剤には、生菌として実質的にＨＯＫＫＡＩＤＯ株のみが含まれているのが好ましく、この場合には製造が容易かつ安価になる。   Other useful strains may be contained in the viable agent of the present invention. For example, lactic acid bacteria and yeast having a probiotic function, such as Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gazei, Streptococcus thermophilus, Streptococcus infantaria, Saccharomyces cerevisiae, and mixtures thereof may be included. In this case, after culturing these strains separately, they can be mixed with the HOKKAIDO strain, or if the strains are compatible with each other, they can be mixed and cultured from the beginning. However, since the HOKKAIDO strain alone exhibits excellent animal functionality, it is preferable that the viable agent of the present invention substantially contains only the HOKKAIDO strain as a viable cell. Is easy and cheap.

また、本発明の生菌剤には、酵素を混合することもできる。使用可能な酵素としては、例えば、セルラーゼ、フィターゼ、β−グルコシターゼ、リパーゼ、アミラーゼ、β−グルカナーゼ、ペントサナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロテアーゼ、ペプチターゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。   Moreover, an enzyme can also be mixed with the living microbe agent of this invention. Examples of enzymes that can be used include cellulase, phytase, β-glucosidase, lipase, amylase, β-glucanase, pentosanase, trypsin, chymotrypsin, protease, peptidase, and mixtures thereof.

さらに、本発明の生菌剤には、酸化防止剤（クエン酸、アスコルビン酸、ビタミンＥ等）、乳化剤（ショ糖、脂肪酸エステル、レシチン等）、増粘剤（寒天、グルコマンナン、ゼラチン等）、ビタミン類（ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２等）、ミネラル類（カルシウム、マグネシウム、マンガン等）、糖類（キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等）、フレーバー（ハーブ、ベリー、オレンジ等）等の各種成分を混合することもできる。   Further, the viable agent of the present invention includes antioxidants (citric acid, ascorbic acid, vitamin E, etc.), emulsifiers (sucrose, fatty acid esters, lecithin, etc.), thickeners (agar, glucomannan, gelatin, etc.). , Various ingredients such as vitamins (vitamins A, B1, B2, etc.), minerals (calcium, magnesium, manganese, etc.), sugars (xylo-oligosaccharides, fructooligosaccharides, galactooligosaccharides, etc.), flavors (herbs, berries, oranges, etc.) Can also be mixed.

本発明の生菌剤は、水道水、ミネラル含有水等の飲料に分散させて動物に飲用として給与しても良く、またサプリメントとして飼料とは別に供与しても良い。   The viable agent of the present invention may be dispersed in beverages such as tap water and mineral-containing water and fed to animals for drinking, or may be provided separately from feed as a supplement.

本発明の生菌剤に含有されるＨＯＫＫＡＩＤＯ株は、飼料組成物として動物に給与されるのが好ましい。この飼料組成物は、例えば動物への給与の直前に基礎飼料に上述の動物用生菌剤を添加することにより製造しても良く、また、基礎飼料に上述の動物用生菌剤を添加して発酵させることにより製造することもできる。   The HOKKAIDO strain contained in the viable agent of the present invention is preferably fed to animals as a feed composition. This feed composition may be produced, for example, by adding the above-mentioned live bacteria agent for animals to the basic feed immediately before feeding to the animal. It can also be produced by fermentation.

基礎飼料は、清潔で品質の優れたものであれば、種類は特に限定されない。基礎飼料としては、青刈り牧草、貯蔵牧草、穀類、野菜類、根菜類、スキムミルク等の乳製品の他、澱粉粕、オカラ、カボチャワタ等の未利用、低利用の食品加工副産物、及び、リンゴ果汁絞り粕、ポテトパルプ、ビール酵母等の農産加工副産物も使用することができる。食品加工副産物及び農産加工副産物を使用することにより、飼料自給率を向上させることができる。また、幼動物には、それぞれの動物に応じて粗たんぱく質、粗脂肪、粗繊維、粗灰分、ミネラル等が調製された公知の代用乳を基礎飼料とすることができる。   The basic feed is not particularly limited as long as it is clean and excellent in quality. Basic feeds include dairy products such as green-cutting pastures, storage pastures, cereals, vegetables, root vegetables, skim milk, as well as unused and low-use food processing by-products such as starch cake, okara, pumpkin, and apple juice. Agricultural processing by-products such as squeezed lees, potato pulp and brewer's yeast can also be used. The feed self-sufficiency rate can be improved by using food processing by-products and agricultural processing by-products. In addition, for young animals, known milk substitutes prepared with crude proteins, crude fats, crude fibers, crude ash, minerals and the like can be used as the basic feed for each animal.

長期保存用の飼料組成物のためには水分含量が低い基礎飼料を使用するのが望ましいが、水分含量が高い基礎飼料を使用する場合には、給与直前に本発明の生菌剤を混合して使用するか、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株をスタータとしてサイレージや、リキッドフィード等の発酵飼料に加工・調製すれば問題ない。   It is desirable to use a basic feed with a low water content for a feed composition for long-term storage, but when using a basic feed with a high water content, mix the viable agent of the present invention immediately before feeding. There is no problem if it is used or processed and prepared into fermented feed such as silage or liquid feed using the HOKKAIDO strain as a starter.

これらの発酵飼料の調製条件は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の増殖と他の雑菌の抑制が可能な条件であれば、特に制限がない。例えば、オカラなどの基礎飼料に、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株を飼料１ｇあたり１０⁴〜１０¹⁰ＣＦＵ、好ましくは１０⁶〜１０⁸ＣＦＵの生菌量になるように添加し、発酵させることができる。基礎飼料への添加は、乾燥形態の生菌剤を混合することにより、又は懸濁液形態の生菌剤を混合、塗布、被覆、浸透、又は噴霧することにより行うことができる。 The conditions for preparing these fermented feeds are not particularly limited as long as the conditions allow the growth of the HOKKAIDO strain and the suppression of other germs. For example, the HOKKAIDO strain can be added to a basic feed such as okara so that the amount of viable bacteria is 10 ⁴ to 10 ¹⁰ CFU, preferably 10 ⁶ to 10 ⁸ CFU per gram of feed, and fermented. The addition to the basic feed can be carried out by mixing a live form of a dry form or by mixing, applying, coating, penetrating, or spraying a form of a live form of a suspension.

発酵の条件は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の生存に影響しない条件であれば、特に限定がない。一般に、発酵温度は１０℃〜３５℃の範囲が好ましく、発酵時間は１０時間〜３０日の範囲が好ましい。これ以外の条件でも、基礎飼料等他の条件を組み合わせて実施することができる。   The conditions for the fermentation are not particularly limited as long as they do not affect the survival of the HOKKAIDO strain. In general, the fermentation temperature is preferably in the range of 10 ° C to 35 ° C, and the fermentation time is preferably in the range of 10 hours to 30 days. Even other conditions can be implemented in combination with other conditions such as basic feed.

また、本発明の動物用飼料には、本発明の生菌剤に関して示したのと同様の、酵素、酸化防止剤、乳化剤、増粘剤、ビタミン類、ミネラル類、糖類、フレーバー等の各種成分を混合することもできる。   In addition, the animal feed of the present invention has various components such as enzymes, antioxidants, emulsifiers, thickeners, vitamins, minerals, saccharides, flavors and the like similar to those shown for the live fungus of the present invention. Can also be mixed.

本発明の生菌剤及び飼料組成物は、安全であり、動物、特に幼動物の下痢又は軟便の治療又は予防の効果に優れ、良好な体重増加、体重増加量の向上をもたらし、愛玩動物の健康維持促進の他、家畜の生産性向上に寄与することができる。下痢又は軟便の治療又は予防のためのＨＯＫＫＡＩＤＯ株の有効給与量、体重増加量の向上のためのＨＯＫＫＡＩＤＯ株の有効給与量は、動物の種類、動物の健康状態及び給与形態等に依存して変化するが、子牛への給与の場合には、一般に、１日あたり体重１ｋｇに対して１０⁷〜１０¹⁰ＣＦＵ程度である。 The viable agent and feed composition of the present invention are safe and excellent in the effect of treatment or prevention of diarrhea or loose stool of animals, particularly juveniles, and provide good weight gain and improved weight gain. In addition to promoting health maintenance, it can contribute to improving livestock productivity. Effective amount of HOKKAIDO strain for treatment or prevention of diarrhea or loose stool, and effective amount of HOKKAIDO strain for improvement of weight gain vary depending on animal type, animal health condition and salary form, etc. However, in the case of feeding calves, it is generally about 10 ⁷ to 10 ¹⁰ CFU per kg of body weight per day.

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.

１． 生菌剤の製造
実施例１：
容量３Ｌのジャーファーメンター（高杉製作所製ＴＳ−Ｍ−３）中で調整したＭＲＳブロース培地から肉エキスを除いた組成の培地に、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株のフルグロースの培養液を種菌として１％接種し、３７℃、ｐＨ６．５の条件下で２４時間中和培養し、計４Ｌの培養液を得た。この培養液を高速冷却遠心機で遠心（３０００Ｇ、５℃、１０分）し、得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、この１／４の量を、水に１０％のスキムミルクと１％のグルタミン酸ナトリウムを溶解させた溶液１００ｍＬに懸濁させ、懸濁液の形態の生菌剤を得た。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）により生菌数を測定したところ、総生菌数は、８．５×１０¹²ＣＦＵであった。 1. Production Example 1 of Live Bacteria
Inoculate 1% of the full growth medium of HOKKAIDO strain as the inoculum into the medium of the composition obtained by removing the meat extract from the MRS broth medium prepared in a 3L jar fermenter (TS-M-3 manufactured by Takasugi Seisakusho) Neutralization culture was performed under the conditions of 37 ° C. and pH 6.5 for 24 hours to obtain a total of 4 L of culture solution. This culture solution is centrifuged (3000 G, 5 ° C., 10 minutes) with a high-speed cooling centrifuge, and the obtained bacterial cells are washed with physiological saline, and this ¼ amount is mixed with 10% skimmed milk and 1 % Of a sodium glutamate solution was suspended in 100 mL of a solution to obtain a viable bacterial agent in the form of a suspension. When the viable cell count was measured by the plate dilution method (MRS agar medium), the total viable cell count was 8.5 × 10 ¹² CFU.

実施例２：
実施例１に示した生理食塩水で洗浄した後の菌体の１／４の量を、実施例１と同様に水に１０％のスキムミルクと１％のグルタミン酸ナトリウムを溶解させた溶液１００ｍＬに懸濁させ、アルミトレイに分注した。これを真空凍結乾燥機（協和真空技術製ＲＬＥＩＩ−１０３）により、−５０℃に予備凍結後、最終棚温度２５℃で計４８時間乾燥し、１０ｇ強の乾燥粉末の形態の生菌剤を得た。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）による総生菌数の測定結果及び乾燥前後での生残率を、以下の表１に示す。 Example 2:
The amount of the cells after washing with physiological saline shown in Example 1 was suspended in 100 mL of a solution of 10% skim milk and 1% sodium glutamate dissolved in water as in Example 1. Turbid and dispensed into aluminum tray. This was pre-frozen to -50 ° C with a vacuum freeze dryer (Kyowa Vacuum Technology RLEII-103) and then dried at a final shelf temperature of 25 ° C for a total of 48 hours. It was. The measurement results of the total viable count by the plate dilution method (MRS agar medium) and the survival rate before and after drying are shown in Table 1 below.

実施例３：
水に１０％のスキムミルクと１％のグルタミン酸ナトリウムを溶解させた溶液１００ｍＬの代わりに、市販の成分無調整豆乳（めいらく製）１００ｍＬを使用した点を除いて実施例２を繰り返し、１０ｇ強の乾燥粉末の形態の生菌剤を得た。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）による総生菌数の測定結果及び乾燥前後での生残率を、以下の表１に示す。 Example 3:
Example 2 was repeated except that 100 mL of a commercially available ingredient non-adjusted soymilk (made by Meiraku) was used instead of 100 mL of a solution of 10% skim milk and 1% sodium glutamate dissolved in water. A viable agent in the form of a powder was obtained. The measurement results of the total viable count by the plate dilution method (MRS agar medium) and the survival rate before and after drying are shown in Table 1 below.

２． 飼料組成物の製造
実施例４：
実施例２の乾燥粉末としての生菌剤を、ホエーパウダーで重量２０００倍に希釈し、乳酸菌としてＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含有する混合飼料（飼料組成物）を製造した。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）による生菌濃度（飼料１ｇあたりの生菌数）の測定結果を、以下の表２に示す。 2. Production Example 4 of Feed Composition :
The live bacteria agent as a dry powder of Example 2 was diluted 2000 times with whey powder to produce a mixed feed (hog composition) containing the HOKKAIDO strain as lactic acid bacteria. The measurement results of the viable cell concentration (number of viable cells per 1 g of feed) by the plate dilution method (MRS agar medium) are shown in Table 2 below.

実施例５：
実施例４の混合飼料を、子牛用配合飼料（組成：脱脂粉乳４２質量％、濃縮ホエー蛋白３０質量％、混合油脂２５質量％、ビタミン・ミネラル類のプレミックス３質量％）で重量２５倍に希釈し、乳酸菌としてＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含有する配合飼料（飼料組成物）を得た。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）による生菌濃度の測定結果を、以下の表２に示す。 Example 5:
25 times the weight of the mixed feed of Example 4 with a mixed feed for calf (composition: 42% by mass of skim milk powder, 30% by mass of concentrated whey protein, 25% by mass of mixed fat and oil, 3% by mass of premix of vitamins and minerals) To obtain a blended feed (feed composition) containing the HOKKAIDO strain as lactic acid bacteria. The measurement results of the viable cell concentration by the plate dilution method (MRS agar medium) are shown in Table 2 below.

比較例１：
ホエーパウダーを、子牛用配合飼料（組成：脱脂粉乳４２質量％、濃縮ホエー蛋白３０質量％、混合油脂２５質量％、ビタミン・ミネラル類のプレミックス３質量％）で重量２５倍に希釈し、乳酸菌を含有していない配合飼料（飼料組成物）を得た。平板希釈法（ＭＲＳ寒天培地）による生菌濃度の測定結果を、以下の表２に示す。 Comparative Example 1:
Dilute whey powder 25 times by weight with a mixed feed for calf (composition: skim milk powder 42 mass%, concentrated whey protein 30 mass%, mixed fats and oils 25 mass%, vitamins and minerals premix 3 mass%) A blended feed (feed composition) containing no lactic acid bacteria was obtained. The measurement results of the viable cell concentration by the plate dilution method (MRS agar medium) are shown in Table 2 below.

実施例４、５、及び比較例１の飼料組成物を子牛に給与したところ、いずれも良好な嗜好性を示した。   When the feed compositions of Examples 4 and 5 and Comparative Example 1 were fed to calves, all showed good palatability.

３． 子牛への飼料組成物の給与
飼養例１： ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の有無による比較
市場で購入したホルスタイン雄子牛３２頭を、外観、体重、体調等について統計学的に偏りの無い１６頭ずつの二群に分け、それぞれ、実施例５及び比較例１の配合飼料を給与し、４２日間飼育した。 3. Feed composition for calves
Feeding Example 1: 32 Holstein calves purchased in the comparative market with or without the HOKKAIDO strain were divided into two groups of 16 heads with statistically unbiased appearance, body weight, physical condition, etc. The mixed feed of Comparative Example 1 was fed and reared for 42 days.

実施例５及び比較例１の配合飼料は、それぞれ、自動哺乳機を用いて１頭あたり１日５００ｇを４Ｌのぬるま湯で溶いた物を４回に分けて給与した。子牛の体重は、試験開始後０、７、２１、３５、及び４２日目に測定した。結果を以下の表３に示す。   Each of the formulated feeds of Example 5 and Comparative Example 1 was fed in 4 portions by dissolving 500 g per day with 4 L of lukewarm water using an automatic baby machine. Calf body weights were measured on days 0, 7, 21, 35, and 42 after the start of the study. The results are shown in Table 3 below.

表３から明らかなように、実施例５の配合飼料を給与して飼育した子牛は、比較例１の配合飼料を給与して飼育した子牛よりも、良好な体重の増加を示した。   As is clear from Table 3, the calf fed with the formula feed of Example 5 showed a better weight gain than the calf fed with the formula feed of Comparative Example 1.

表４は、１日あたりの体重増加量（各飼養期間の平均値）を示す。   Table 4 shows the weight gain per day (average value for each feeding period).

表４から明らかなように、実施例５の配合飼料を給与した子牛の３６〜４２日における１日あたりの体重増加量は１．３２ｋｇであり、比較例１の配合飼料を給与した子牛の３６〜４２日における１日あたりの体重増加量の１．１４ｋｇより有意に大きかった（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による一元配置分散分析（Ｐ＝０．０７））。その他の日齢についても、２２−３５日を除いて、実施例５の配合飼料を給与した子牛は比較例１の配合飼料を給与した子牛より、良好な体重増加を示した。したがって、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の給与により、子牛の体重増加量が向上したことがわかる。   As is apparent from Table 4, the amount of weight gain per day on the 36th to 42nd days of the calf fed with the mixed feed of Example 5 was 1.32 kg, and the calf fed with the mixed feed of Comparative Example 1 Was significantly greater than 1.14 kg of daily weight gain on days 36-42 (one-way analysis of variance (P = 0.07) by the Tukey-Kramer method). Regarding other ages, the calves fed the mixed feed of Example 5 showed a better weight gain than the calves fed the mixed feed of Comparative Example 1 except for 22-35 days. Therefore, it can be seen that the weight gain of the calf was improved by the supply of the HOKKAIDO strain.

上述の子牛の各個体について、体重測定と共に、下痢、軟便発生状況を毎日確認した。評価に当たっては、下痢の発生１回について２、軟便の発生１回につき１、正常便の場合を０として点数化し、各飼養期間における１頭あたりの合計点を求めて下痢軟便指数とした。表５に結果を示す。   For each individual calf described above, the occurrence of diarrhea and loose stool was confirmed daily along with the weight measurement. In the evaluation, the diarrhea stool index was determined by assigning a score of 2 for each occurrence of diarrhea, 1 for each occurrence of soft stool, and 0 for normal stool, and obtaining the total score per head during each feeding period. Table 5 shows the results.

表５に示した通り、飼養期間０〜２１日における下痢軟便指数は、実施例５の配合飼料を給与した子牛に関しては１．１であり、比較例１の配合飼料を給与した子牛に関する指数２．８より有意に小さかった（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による一元配置分散分析（Ｐ＝０．０７））。また全飼養期間０〜４２日においても、実施例５の配合飼料を給与した子牛に関しては下痢軟便指数が１．８であり、比較例１の配合飼料を給与した子牛に関する指数４．２より有意に少なかった。（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による一元配置分散分析（Ｐ＝０．０７））。以上の結果から、強いストレスにさらされる子牛の導入初期にＨＯＫＫＡＩＤＯ株を給与することにより、子牛の下痢や軟便の発生が明らかに抑制されたことがわかる。   As shown in Table 5, the diarrhea soft stool index in the feeding period 0 to 21 days was 1.1 for the calf fed with the formulated feed of Example 5, and related to the calf fed with the formulated feed of Comparative Example 1 The index was significantly smaller than 2.8 (one-way analysis of variance (P = 0.07) by Tukey-Kramer method). Moreover, the diarrhea loose stool index is 1.8 regarding the calf which supplied the compound feed of Example 5 also in the whole feeding period 0 to 42 days, and the index 4.2 regarding the calf which supplied the compound feed of the comparative example 1 It was significantly less. (One-way analysis of variance (P = 0.07) by Tukey-Kramer method). From the above results, it can be seen that the occurrence of diarrhea and loose stool in calves was clearly suppressed by feeding the HOKKAIDO strain at the early stage of introduction of calves exposed to strong stress.

飼養例２： 市販の複合生菌剤との比較
実施例５のＨＯＫＫＡＩＤＯ株を含有する配合飼料と、市販の複合生菌剤を配合した配合飼料（比較例２）とを子牛に給与して、子牛の各個体の体重増加量及び下痢軟便指数を比較した。 Feeding Example 2: Comparison with a commercially available complex live fungus agent A fed feed containing the HOKKAIDO strain of Example 5 and a blended feed blended with a commercially available complex live fungus agent (Comparative Example 2) were fed to a calf. The weight gain and diarrhea loose stool index of each individual calf were compared.

比較例２：
比較例１の配合飼料に、子牛の下痢軟便抑制のために汎用されている市販の三種の生菌を含有する複合生菌剤「ボバクチン」（製品１ｇあたり、乳酸菌のラクトバチルス・プランタラム２２０株を１×１０⁵〜９×１０⁶ＣＦＵ、ストレプトコッカス・フェシウム２６株を１×１０⁴〜９×１０⁵ＣＦＵ、及び、これらの乳酸菌に対して発育促進作用を有するクロストリディウム・ブチリカムＭｉｙａｉｒｉ株を１×１０³〜９×１０⁴ＣＦＵ含有、株式会社ミヤリサン製）を混入することにより製造した。この配合飼料５００ｇあたり、「ボバクチン」を使用基準量とされる１０ｇの量で配合した。 Comparative Example 2:
The compound feed of Comparative Example 1 is a complex live fungus “Bobactin” containing three types of commercially available live bacteria commonly used for calf diarrhea loose stool control (Lactobacillus plantarum 220 of lactic acid bacteria per gram of product) Strains of 1 × 10 ^{5 to} 9 × 10 ⁶ CFU, Streptococcus faecium 26 strains of 1 × 10 ^{4 to} 9 × 10 ⁵ CFU, and Clostridium butyricum Miyairi having growth-promoting action against these lactic acid bacteria The strain was prepared by mixing 1 × 10 ^{3 to} 9 × 10 ⁴ CFU (manufactured by Miyarisan Co., Ltd.). “Bobactin” was blended in an amount of 10 g, which is the standard amount for use, per 500 g of this blended feed.

市場で購入したホルスタイン雄子牛８頭を、外観、体重、体調等について統計学的に偏りの無い４頭ずつの二群に分け、それぞれ、実施例５及び比較例２の配合飼料を給与し、３５日間飼育した。   Eight Holstein calves purchased on the market were divided into two groups of four heads with no statistically biased appearance, weight, physical condition, etc., respectively, and fed the mixed feed of Example 5 and Comparative Example 2, respectively. Raised for 35 days.

実施例５及び比較例２の配合飼料は、それぞれ、１頭あたり１日５００ｇを４Ｌのぬるま湯で溶いた物を２回に分けて哺乳ビンで給与した。子牛の体重は、試験開始後０、７、２１、及び３５日目に測定した。また、各個体の下痢、軟便発生状況は毎日確認した。   The mixed feeds of Example 5 and Comparative Example 2 were each fed with baby bottles in which 500 g per day was dissolved in 4 L of lukewarm water in two portions. Calf body weights were measured on days 0, 7, 21, and 35 after the start of the study. In addition, diarrhea and loose stool occurrence status of each individual was confirmed daily.

以下の表６に、子牛の体重増加量を示す。   Table 6 below shows the weight gain of calves.

表６から明らかなように、実施例５の配合飼料を給与した場合の１日あたりの体重増加量は比較例２の配合飼料を給与した場合より常に大きく推移した。   As is clear from Table 6, the amount of weight gain per day when the mixed feed of Example 5 was fed constantly changed larger than when the mixed feed of Comparative Example 2 was fed.

以下の表７に、下痢軟便指数を示す。   Table 7 below shows the diarrhea loose stool index.

表７から明らかなように、実施例５の配合飼料を使用した場合の下痢軟便指数は、比較例２の配合飼料を給与した場合の下痢軟便指数と同等かむしろ良好に推移した。   As is clear from Table 7, the diarrhea soft stool index when using the mixed feed of Example 5 was equal to or better than the diarrhea soft stool index when the mixed feed of Comparative Example 2 was fed.

以上の結果をまとめると、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株単独の給与でも、体重増加や下痢軟便の抑制について、ラクトバチルス・プランタラムを含む市販の複合生菌剤と同等か、それよりも良好な結果が得られることがわかった。   To summarize the above results, even with the supply of the HOKKAIDO strain alone, the suppression of weight gain and diarrhea and loose stool is equivalent to or better than that of a commercially available complex probiotic agent containing Lactobacillus plantarum. I understood.

４． 発酵した飼料組成物の製造
以下に、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株をスタータとした発酵飼料（飼料組成物）の調製例を示す。調製に当っては、基礎飼料として市販のオカラを用い、パウチ袋に１袋あたり１００ｇずつ詰めて密封して使用した。 4). Production of fermented feed composition An example of preparing a fermented feed (feed composition) using the HOKKAIDO strain as a starter is shown below. In the preparation, commercially available okara was used as the basic feed, and 100 g per bag was packed in a pouch bag and sealed.

実施例６：ＨＯＫＫＡＩＤＯ株接種区
実施例５の配合飼料をオカラ１ｇあたりＨＯＫＫＡＩＤＯ株が１０⁵ＣＦＵになるように接種し、２５℃の定温庫内で発酵させた。 Example 6: HOKKAIDO strain inoculation section The mixed feed of Example 5 was inoculated so that the HOKKAIDO strain was 10 ⁵ CFU per 1 g of okara and fermented in a constant temperature chamber at 25 ° C.

実施例７：ＨＯＫＫＡＩＤＯ株＋セルラーゼ区
実施例５の配合飼料を、オカラ１ｇあたりＨＯＫＫＡＩＤＯ株が１０⁵ＣＦＵになり、セルロリティカス由来及びトリコデルマ ビリデ由来セルラーゼがオカラ１００ｇあたり３．３ｍｇになるように混合し、２５℃の定温庫内で発酵させた。 Example 7: HOKKAIDO strain + cellulase group The mixed feed of Example 5 was mixed so that the HOKKAIDO strain was 10 ⁵ CFU per 1 g of okara and the cellulase derived and Trichoderma viride derived cellulase was 3.3 mg per 100 g of okara. And fermented in a constant temperature chamber at 25 ° C.

比較例３：無添加オカラ区
乳酸菌を添加しない未処理のオカラを、２５℃の定温庫内で発酵させた。 Comparative Example 3: Additive-free Okara Group Untreated Okara to which lactic acid bacteria were not added was fermented in a constant temperature chamber at 25 ° C.

比較例４：市販乳酸菌スタータ区
雪印種苗製「スノーラクトＬスプレー」（ラクトバチルス・ラムノーサスＳＢＴ−２３００株含有）５ｇを１Ｌの水に溶かし、オカラ１ｋｇあたり１ｍＬになる量で噴霧した（製品に記載された基準使用量）。この処理により、オカラ１ｇあたりラクトバチルス・ラムノーサスＳＢＴ−２３００株が１０⁵ＣＦＵ接種される。噴霧後のオカラを２５℃の定温庫内で発酵させた。 Comparative Example 4: Commercially available lactic acid bacteria starter ward "Snowlacto L spray" (containing Lactobacillus rhamnosus SBT-2300) made by Snow Brand Seedlings was dissolved in 1 L of water and sprayed in an amount of 1 mL per kg of okara (described in the product) Standard usage). By this treatment, 10 ⁵ CFU of Lactobacillus rhamnosus SBT-2300 strain is inoculated per 1 g of okara. The sprayed okara was fermented in a constant temperature chamber at 25 ° C.

比較例５：市販スタータ＋セルラーゼ区
雪印種苗製「スノーラクトＬアクレモスプレー」（ラクトバチルス・ラムノーサスＳＢＴ−２３００株とアクレモニウム セルロリティカス由来及びトリコデルマ ビリデ由来セルラーゼを含有）３５ｇを１Ｌの水に溶かしたものを、オカラ１ｋｇあたり１ｍＬになる量で噴霧した（製品に記載された基準使用量）。この処理により、オカラ１ｇあたりラクトバチルス・ラムノーサスＳＢＴ−２３００株が１０⁵ＣＦＵ接種され、セルラーゼがオカラ１００ｇあたり３．３ｍｇ添加される。噴霧後のオカラを２５℃の定温庫内で発酵させた。 Comparative Example 5: Commercial starter + cellulase group “Snowlacto L Acremopray” made by Snow Brand Seedling (containing Lactobacillus rhamnosus SBT-2300 strain and Acremonium cellulolyticus-derived and Trichoderma viride-derived cellulase) in 1 L of water The melted material was sprayed in an amount of 1 mL per kg of okara (standard usage amount described on the product). By this treatment, 10 ⁵ CFU of Lactobacillus rhamnosus SBT-2300 strain is inoculated per 1 g of okara, and 3.3 mg of cellulase is added per 100 g of okara. The sprayed okara was fermented in a constant temperature chamber at 25 ° C.

いずれの処理区とも１５袋ずつ調製し、貯蔵１日後、３日後、７日後、１４日後、２８日後に、各処理３袋ずつ開封し、発酵飼料を調査した。具体的には、サンプル１０ｇと蒸留水９０ｍＬを１分間ストマカーにかけて、約３時間５℃で抽出した後、Ｎｏ．５Ａのろ紙でろ過した液を水抽出液とし、この液のｐＨをガラス電極ｐＨメーターを用いて測定した。また、水抽出液を更に１０倍に希釈して０．２μｍのメンブランフィルターでろ過後、高速液体クロマトグラフィーのポストラベル法で有機酸の種類と量を測定した。   In each treatment zone, 15 bags were prepared, and after 1 day, 3 days, 7 days, 14 days, and 28 days, each treatment 3 bags were opened and the fermented feed was investigated. Specifically, 10 g of sample and 90 mL of distilled water were placed in a stoma for 1 minute and extracted at 5 ° C. for about 3 hours. The liquid filtered with 5A filter paper was used as the water extract, and the pH of this liquid was measured using a glass electrode pH meter. Further, the aqueous extract was further diluted 10 times and filtered through a 0.2 μm membrane filter, and then the type and amount of organic acid were measured by a post-label method of high performance liquid chromatography.

図１に示した通り、貯蔵１日後までは、各処理区とも発酵飼料のｐＨに差が見られなかったが、貯蔵４日後以降では、比較例３及び比較例４の発酵飼料に比べて実施例６の発酵飼料のｐＨは有意に低かった（Ｄｕｎｃａｎ法による一元配置分散分析（ｐ＝０．０５））。同様に図２に示した通り、セルラーゼと乳酸菌を併用した処理区の比較においても、比較例５の発酵飼料に比べて実施例７の発酵飼料は貯蔵４日後以降のｐＨの低下度合いが良好であった。   As shown in FIG. 1, no difference was observed in the pH of the fermented feed in each treatment section until 1 day after storage, but after 4 days after storage, the comparison was performed as compared with the fermented feed of Comparative Example 3 and Comparative Example 4. The pH of the fermented feed of Example 6 was significantly lower (one-way analysis of variance (p = 0.05) by Duncan method). Similarly, as shown in FIG. 2, also in the comparison of the treatment sections using cellulase and lactic acid bacteria in combination, the fermented feed of Example 7 has a better pH decrease after 4 days after storage than the fermented feed of Comparative Example 5. there were.

また、図３に示した通り、貯蔵４日後以降、比較例３及び比較例４の発酵飼料に比べて実施例６の発酵飼料の乳酸含有量が多かった。さらに、図４に示した通り、セルラーゼとの併用区においても、比較例５の発酵飼料に比べて実施例７の発酵飼料の乳酸含有量が多かった。また、乳酸以外の有機酸は酢酸以外検出されず、酢酸も０．２％程度と少なく、実施例６、７はいずれも外観、香気とも優れ、極めて良好であった。   Moreover, as shown in FIG. 3, after 4 days after storage, the lactic acid content of the fermented feed of Example 6 was higher than that of the fermented feed of Comparative Examples 3 and 4. Furthermore, as shown in FIG. 4, the lactic acid content of the fermented feed of Example 7 was higher than that of Comparative Example 5 in the combined use with cellulase. Further, organic acids other than lactic acid were not detected except for acetic acid, and acetic acid was as low as about 0.2%, and Examples 6 and 7 were both excellent in appearance and aroma and very good.

以下の表８に、各発酵飼料についての乳酸菌濃度（オカラ１ｇあたりの菌数）と発酵時間との関係を示す。   Table 8 below shows the relationship between the concentration of lactic acid bacteria (number of bacteria per 1 g of okara) and fermentation time for each fermented feed.

表８から明らかなように、発酵飼料の乳酸菌数に関しても、比較例３〜５の発酵飼料に比べて、実施例６、７の発酵飼料は多くの生菌を含んでいた。   As is clear from Table 8, regarding the number of lactic acid bacteria in the fermented feed, the fermented feeds of Examples 6 and 7 contained more viable bacteria than the fermented feeds of Comparative Examples 3 to 5.

実施例６、７の乳酸菌の菌種の生化学的性状や遺伝学的性状（特開２００５−２２４２２４号参照）を調査した。遺伝学的性状に関しては、乳酸菌をＭＲＳブロース培地により３５℃で２日間培養した後、培養液からＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲにより増幅して分析した。その結果、ほぼ１００％近くがＨＯＫＫＡＩＤＯ株であると確認された。   The biochemical properties and genetic properties (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-224224) of the lactic acid bacteria of Examples 6 and 7 were investigated. Regarding genetic properties, lactic acid bacteria were cultured in an MRS broth medium at 35 ° C. for 2 days, and then DNA was extracted from the culture solution, amplified using PCR as a template, and analyzed. As a result, nearly 100% was confirmed to be the HOKKAIDO strain.

以上の結果から、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株は市販の乳酸菌よりも速い発酵速度を示し、発酵飼料の乳酸菌スタータとして極めて優れていた。また、このように調製した発酵飼料は嗜好性や保存性も良好で、その上ＨＯＫＫＡＩＤＯ株が飼料中に大量に増殖しているので、この発酵飼料を家畜に給与することによりＨＯＫＫＡＩＤＯ株を自然な形態で大量かつ持続的に投与することが可能となり、低コストのプロバイオテック飼料としての利用が可能である。   From the above results, the HOKKAIDO strain showed a faster fermentation rate than commercially available lactic acid bacteria, and was extremely excellent as a lactic acid bacteria starter for fermented feed. Moreover, since the fermented feed prepared in this way has good palatability and storage stability, and the HOKKAIDO strain is proliferated in large quantities in the feed, the fermented feed can be naturally produced by feeding this fermented feed to livestock. It can be administered in a large amount and continuously in a form, and can be used as a low-cost probiotic feed.

発酵飼料（飼料組成物）のｐＨの変化を示す図である。It is a figure which shows the change of pH of fermented feed (feed composition). 発酵飼料（飼料組成物）のｐＨの変化を示す図である。It is a figure which shows the change of pH of fermented feed (feed composition). 発酵飼料（飼料組成物）の乳酸含量の変化を示す図である。It is a figure which shows the change of the lactic acid content of fermented feed (feed composition). 発酵飼料（飼料組成物）の乳酸含量の変化を示す図である。It is a figure which shows the change of the lactic acid content of fermented feed (feed composition).

Claims (10)

ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）を含有する動物用生菌剤。 A live bacterial agent for animals containing Lactobacillus plantarum HOKKAIDO strain (FERM P-19645). 生菌として実質的にラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）のみを含有することを特徴とする請求項１に記載の動物用生菌剤。 The live bacterial agent for animals according to claim 1, characterized in that it contains substantially only Lactobacillus plantarum HOKKAIDO strain (FERM P-19645) as a viable bacterium. ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）が、動物由来材料を含まない培地で培養されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の動物用生菌剤。 Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) HOKKAIDO strain (FERM P-19645) is cultured in a medium containing no animal-derived material, The live animal bacterium according to claim 1 or 2 Agent. 飲料と共に又はサプリメントとして動物に給与されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動物用生菌剤。   The live bacterial agent for animals according to any one of claims 1 to 3, which is fed to an animal together with a beverage or as a supplement. ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）を含有する飼料組成物。 A feed composition containing Lactobacillus plantarum HOKKAIDO strain (FERM P-19645). 基礎飼料に請求項１又は２に記載の動物用生菌剤を添加して発酵させたものであることを特徴とする請求項５に記載の飼料組成物。   The feed composition according to claim 5, wherein the animal composition according to claim 1 or 2 is added to a basic feed and fermented. 代用乳であることを特徴とする請求項５又は６に記載の飼料組成物。   The feed composition according to claim 5 or 6, wherein the feed composition is milk replacer. 牛を飼育するための飼料組成物であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の飼料組成物。   The feed composition according to any one of claims 5 to 7, which is a feed composition for raising a cow. 動物の下痢又は軟便の治療又は予防のために、請求項１〜４のいずれか１項に記載の動物用生菌剤又は請求項５〜８のいずれか１項に記載の飼料組成物を使用する方法。   For the treatment or prevention of diarrhea or loose stool of animals, the live bacterial agent for animals according to any one of claims 1 to 4 or the feed composition according to any one of claims 5 to 8 is used. how to. 動物の体重増加量の向上のために、請求項１〜４のいずれか１項に記載の動物用生菌剤又は請求項５〜８のいずれか１項に記載の飼料組成物を使用する方法。   The method of using the live bacterial agent for animals according to any one of claims 1 to 4 or the feed composition according to any one of claims 5 to 8 for improving the weight gain of an animal. .

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