JP4988433B2 - Biological and chemical reaction analysis kits - Google Patents
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Description
本発明は核酸、タンパク質、微生物などの生体物質を対象とする分析デバイスと、当該キットを応用した分析システムに関する。また、無線機能を有するセンサチップを適用した安価・簡便かつ高感度・迅速な分析デバイスと、本デバイスを応用した分析システムに関する。 The present invention relates to an analysis device that targets biological materials such as nucleic acids, proteins, and microorganisms, and an analysis system to which the kit is applied. The present invention also relates to an inexpensive, simple, highly sensitive and rapid analysis device to which a sensor chip having a wireless function is applied, and an analysis system to which this device is applied.
成人病・腫瘍などの疾患マーカやウィルス・細菌などの免疫検査あるいは糖や電解質などの生化学検査などの検体検査では、従来、省力化によるコスト削減の観点から専ら大規模病院や検査センタに設置された集中検査装置が利用されてきた。一方で、診療所や小規模の病院においてその場で結果を得て治療や処方に利用できるようなPOCT(Point of Care Testing)に対するニーズが拡大している。例えばインフルエンザなどのウィルス感染症や心筋梗塞マーカなどの検出においてイムノクロマトが広く利用されるようになっている。また、血糖値や血中電解質についてもその場で簡便に検査結果が得られる小型の検査装置が上市されている。 Conventionally, in laboratory tests such as disease markers such as adult diseases and tumors, immunological tests such as viruses and bacteria, and biochemical tests such as sugars and electrolytes, it has been set up mainly in large-scale hospitals and test centers from the viewpoint of cost reduction through labor saving. Centralized inspection devices have been used. On the other hand, there is an increasing need for POCT (Point of Care Testing) that can be used for treatment and prescription at clinics and small hospitals. For example, immunochromatography is widely used for detection of viral infections such as influenza and myocardial infarction markers. In addition, small-sized testing devices that can easily obtain test results on the spot for blood glucose levels and blood electrolytes are on the market.
イムノクロマト法は安価・簡便なその場検査キットに適した技術である。しかし、目視によって呈色反応を検出するため、集中検査装置に比較すると感度が低く、定量計測が困難である。広く利用されているインフルエンザウィルス用のイムノクロマト検査薬は15分以内にウィルス感染の有無を表示できる迅速性を持つが[非特許文献1]，感染初期のウィルスが少ない時期の検体については偽陰性となり[非特許文献2]，感度の向上が望まれている[非特許文献3]。また，代表的な生活習慣病のひとつである心筋梗塞については，troponinやmyoglobinなどの疾患マーカと重篤な血栓発症の危険率との間には強い相関が見出されている[非特許文献4-6]。リスクを有する人が胸部不快を感じた場合，迅速な定量計測が望ましい。こうした背景から感度を向上し、定量計測に向けた検査装置が提案されている。イムノクロマトのもつ安価・簡便性を維持して、高感度化、定量計測を可能にするためイムノクロマトの膜部材を利用し、ここに発光ダイオード(LED; Light Emitting Diode)やレーザダイオード(LD; Laser Diode)によって光を照射し、フォトダイオード(PD; Photo Diode)で反射光を読取って呈色反応あるいは微粒子凝集の濃淡を数値化する方法が提案されている[特許文献1-3]。 The immunochromatography method is a technique suitable for an inexpensive and simple in-situ inspection kit. However, since the color reaction is detected by visual observation, the sensitivity is lower than that of a centralized inspection apparatus, and quantitative measurement is difficult. Although widely used immunochromatographic reagents for influenza virus can display the presence or absence of virus infection within 15 minutes [Non-Patent Document 1], specimens with few early-stage viruses are false negatives. [Non-patent document 2], improvement in sensitivity is desired [Non-patent document 3]. In addition, for myocardial infarction, one of the typical lifestyle-related diseases, a strong correlation has been found between disease markers such as troponin and myoglobin and the risk of developing serious thrombosis [Non-patent document 4-6]. If the person at risk feels chest discomfort, rapid quantitative measurements are desirable. In view of this background, an inspection apparatus for improving the sensitivity and for quantitative measurement has been proposed. In order to maintain the low cost and simplicity of immunochromatography, and to enable high sensitivity and quantitative measurement, immunochromatography membrane members are used, where light emitting diodes (LEDs) and laser diodes (LDs) are used. ) And irradiating light, and reading reflected light with a photodiode (PD; Photo Diode) to quantify the color reaction or the density of fine particle aggregation [Patent Documents 1-3].
また、生化学分析を対象としたPOCTでは酵素センサとして機能する電極あるいはISFET(Ｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ)を組み込んだカートリッジ式のテストデバイスが使用される。テストデバイスに試料溶液を滴下し、信号を読み取り装置によって検出する。テストデバイス中では試料溶液中のターゲット濃度に対応した信号（ボルタンメトリでは電圧、アンペロメトリでは電流）が発生する。これを信号読み取り装置に読み取ることにより、ターゲットを計測することができる。ＰＯＣＴの場合、テストデバイスは一つの計測が終わると廃棄するディスポーザブル型である。テストデバイスと信号読み取り装置には着脱可能な電極コネクタが設けられている。 In POCT for biochemical analysis, an electrode that functions as an enzyme sensor or a cartridge-type test device incorporating an ISFET (Ion sensitive Field Effect Transistor) is used. A sample solution is dropped on the test device, and the signal is detected by a reader. In the test device, a signal corresponding to the target concentration in the sample solution (voltage in voltammetry, current in amperometry) is generated. The target can be measured by reading this with a signal reading device. In the case of POCT, the test device is a disposable type that is discarded after one measurement. The test device and the signal reading apparatus are provided with detachable electrode connectors.
イムノクロマト法によってタンパク質やウィルスなどの対象物を検出する際、従来は目視によって微粒子凝集や酵素による呈色反応によって免疫反応を計測してきた。高い感度が必要とされる場合には、例えば特許文献５、特許文献６に示されるように、化学発光を誘起する酵素や蛍光色素を使い、化学発光や蛍光を読み取り装置によって読み取る方式が提案されている。化学発光は蛍光法で必要な励起光源が不要であるため、読み取り装置を小型化することが容易である。 When an object such as protein or virus is detected by an immunochromatography method, conventionally, an immune reaction has been measured by visual observation through agglomeration of fine particles or a color reaction by an enzyme. When high sensitivity is required, for example, as shown in Patent Document 5 and Patent Document 6, a method of reading chemiluminescence or fluorescence with a reader using an enzyme or fluorescent dye that induces chemiluminescence is proposed. ing. Since chemiluminescence does not require an excitation light source necessary for the fluorescence method, it is easy to reduce the size of the reading device.
化学発光の一例として発光基質CDP-starを使った場合の発光反応を図１９に示す。この反応では酵素としてアルカリフォスファターゼが使用される。光基質CDP-starを使った場合の化学発光を、無線機能を内蔵したセンサチップで読み取る場合のイムノクロマトデバイス構成を図２（及び図３(a)）に示す。測定対象となるタンパク質やウィルスなどの計測対象抗原４１を含む試料溶液４５はフィルタ層３３から導入される。試薬層３１には酵素４３で修飾された抗体４２があらかじめ保持されており、試料溶液４５の導入とともに酵素に修飾された抗体１００は反応層３０に浸透する。反応層３０の一部にはターゲットに特異的な抗体４２が固定化されたテスト部３４が設けられ、ここに対面もしくは密着する様にセンサチップ５０が配置される。免疫反応や酵素反応は多孔質の反応層３０で専ら行われる。酵素で修飾された抗体１００は抗原４１と結合しながら反応層を拡散し、テスト部３４において反応層に固定化された抗体４２に結合し、酵素４３が局在する。発光基質４４が発光基質溶液４６として流され、テスト部３４に局在した酵素によって触媒された化学発光を検出層５０で検出する。一般にイムノクロマト法では、反応層３０にはニトロセルロースが用いられるが、ニトロセルロース製反応層における発光基質の拡散距離が問題となる。 As an example of chemiluminescence, the luminescence reaction in the case where the luminescent substrate CDP-star is used is shown in FIG. In this reaction, alkaline phosphatase is used as an enzyme. FIG. 2 (and FIG. 3 (a)) shows an immunochromatographic device configuration in the case of reading chemiluminescence using a photosubstrate CDP-star with a sensor chip incorporating a wireless function. A sample solution 45 containing a measurement target antigen 41 such as a protein or virus to be measured is introduced from the filter layer 33. The reagent layer 31 holds the antibody 42 modified with the enzyme 43 in advance, and the antibody 100 modified with the enzyme penetrates into the reaction layer 30 as the sample solution 45 is introduced. A part of the reaction layer 30 is provided with a test unit 34 on which an antibody 42 specific to the target is immobilized, and a sensor chip 50 is disposed so as to face or be in close contact therewith. The immune reaction and the enzyme reaction are performed exclusively in the porous reaction layer 30. The antibody 100 modified with the enzyme diffuses in the reaction layer while binding to the antigen 41, and binds to the antibody 42 immobilized on the reaction layer in the test unit 34, and the enzyme 43 is localized. The luminescent substrate 44 is flowed as the luminescent substrate solution 46, and chemiluminescence catalyzed by the enzyme localized in the test unit 34 is detected by the detection layer 50. In general, in immunochromatography, nitrocellulose is used for the reaction layer 30, but the diffusion distance of the luminescent substrate in the reaction layer made of nitrocellulose becomes a problem.
POCTのカートリッジ式のテストデバイスでは、テストデバイスで検出された信号は電極コネクタを介して読み取り装置に伝達され、増幅や信号処理された後、表示や転送や記録が行われる。ここでこの電極コネクタはテストデバイス製造の上でコストを増大させる要因となる他、着脱の繰り返しによる電気的接続の信頼性の低下が問題であった。 In a POCT cartridge type test device, a signal detected by the test device is transmitted to a reading device via an electrode connector, and after amplification and signal processing, display, transfer and recording are performed. Here, the electrode connector becomes a factor in increasing the cost in manufacturing the test device, and there is a problem that the reliability of the electrical connection is lowered due to repeated attachment and detachment.
高感度で定量計測が可能であって簡便・安価な反応分析装置を実現するため，免疫反応あるいは酵素反応を利用する新規の検査・分析デバイスを考案した。本デバイスは，試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟む。ここで試薬層とは検出対象物質に作用する酵素や抗体を含有する層，反応層とは，試薬と試料溶液中の検出対象物質の反応が行われる層，検出層とは，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光，蛍光，電流，電気ポテンシャル，磁気ポテンシャル，機械的応力などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する層，吸収層とは，計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する層である。検出層と反応層の位置は入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。試薬溶液は吸収層のドレイン機能によって反応層内の溶液流れを促進して洗浄効果を向上する。 In order to realize a simple and inexpensive reaction analyzer capable of quantitative measurement with high sensitivity, we have devised a new test and analysis device that uses immune reaction or enzyme reaction. This device has a structure in which a reagent layer, a reaction layer, a detection layer, and an absorption layer are laminated, and this detection layer is sandwiched between the reagent layer and the absorption layer together with the reaction layer. Here, the reagent layer is a layer containing an enzyme or an antibody that acts on the detection target substance, the reaction layer is a layer in which the reagent and the detection target substance in the sample solution are reacted, and the detection layer is a detection in the reaction layer. Detects the occurrence or fluctuation of chemiluminescence, fluorescence, current, electrical potential, magnetic potential, mechanical stress, etc. generated as a result of the interaction between the target and reagent, and performs signal processing such as amplification and digitization for wireless communication The layer that transmits a detection signal to an external reader by function and the absorption layer are layers that absorb the reagent solution and sample solution that have passed through the reaction layer during measurement. The positions of the detection layer and the reaction layer can be interchanged. The sample solution is dropped from the reagent layer side, and reacts with the reagent and the measurement object in the sample solution in the reaction layer. The reagent solution improves the cleaning effect by promoting the solution flow in the reaction layer by the drain function of the absorption layer.
本発明に係る分析デバイスは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、保持領域と対面して設置される検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有する。 As an example, the analysis device according to the present invention includes a first film including a holding region that holds a first antibody that specifically binds to a test target substance, a detection layer that is placed facing the holding region, and a test target substance. And a second membrane that retains in part a second antibody that specifically binds to.
ここで、検出層は、第１膜と第２膜の間に位置してもよい。また、第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有し、検出層は第２膜と第３膜との間に位置してもよい。また、第１抗体は、化学発光を触媒する酵素が結合されていてもよい。 Here, the detection layer may be positioned between the first film and the second film. In addition, a third film may be further provided that faces the first film and absorbs liquid, and the detection layer may be located between the second film and the third film. The first antibody may be bound with an enzyme that catalyzes chemiluminescence.
本発明に係る分析システムは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、前記保持領域と対面して設置され、通信回路を備える検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有するデバイスと、デバイスと情報を送受信するリーダライタと、リーダライタと接続する制御機とを有する。 The analysis system according to the present invention includes, as an example, a first film having a holding region that holds a first antibody that specifically binds to a substance to be examined, and a detection layer that is placed facing the holding region and includes a communication circuit. And a device having a second film that holds in part a second antibody that specifically binds to the substance to be examined, a reader / writer that transmits / receives information to / from the device, and a controller connected to the reader / writer.
試薬層，反応層，検出層，吸収層からなる積層構造を有する検査デバイス構成により、反応層において試薬が試薬層から反応層の抗体固定領域に拡散する距離を短縮することができ，発光反応における発光基質の輸送効率向上によって発光強度が増大する。さらに反応層において検出対象物質に作用する固定試薬領域を限定することにより基質が周囲の面内の全方位から供給されるためやはり感度の向上を期待することができる。さらに本検査デバイスは基本的に積層構造であるので単純かつ安価な製造工程を利用することができる。 The test device configuration with a laminated structure consisting of a reagent layer, reaction layer, detection layer, and absorption layer can reduce the distance in which the reagent diffuses from the reagent layer to the antibody fixing region of the reaction layer in the reaction layer. The emission intensity is increased by improving the transport efficiency of the luminescent substrate. Further, by limiting the fixed reagent region acting on the detection target substance in the reaction layer, the substrate can be supplied from all directions in the surrounding plane, so that an improvement in sensitivity can also be expected. Furthermore, since this inspection device basically has a laminated structure, a simple and inexpensive manufacturing process can be used.
本発明からなる検査デバイス、分析デバイス、計測デバイスとして実施の一例を示す。試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟むことを特徴とする。ここで、試薬層は親水性であって空孔（径１−１００μｍ）を有する層、反応層は空孔（径０．１−１００μｍ）を有し、ＩｇＧとして１０μｇ／ｃｍ２のタンパク質吸着性能を有する層、検出層は有機あるいは無機の半導体材料を用いることによって光、電荷、イオン、電磁場、温度、圧力、歪を電気信号に変換する性質を有する層、吸収層は親水性であって例えば１ｇ／１００ｃｍ２以上の吸水性能を有する層、試料として血液を用いる場合には血球を除去するため、親水性であって空孔径１−１００μｍを有するフィルタ層を試薬層の上部に追加してもよい。本実地例では、フィルタ層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより異物の除去、血球の分離を行う。試薬層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより修飾抗体などの試薬を保持し、計測デバイス外から試料溶液あるいは試薬溶液が導入されたときに、導入溶液によって保持する修飾抗体を開放する機能を有する。反応層はニトロセルロースメンブレンあるいはナイロン、あるいはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を用いることにより、ここに抗体を固定して抗原抗体反応を起こし、その後，抗原に結合した酵素修飾抗体による酵素反応が起こる場所を提供する。 検出層として、信越半導体Siliconウェハ ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーを用いることにより形成したフォトダイオード，信号処理回路（増幅器，ＡＤ変換器），受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を形成する。検出層は，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する機能を有する。吸収層として，Ｗｈａｔｍａｎ ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓなどを用いることにより計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する。検出層と反応層は互いにそれらの位置を入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。 An example of implementation as an inspection device, an analysis device, and a measurement device according to the present invention will be described. It has a structure in which a reagent layer, a reaction layer, a detection layer, and an absorption layer are laminated, and this detection layer is sandwiched between the reagent layer and the absorption layer together with the reaction layer. Here, the reagent layer is hydrophilic and has pores (diameter 1-100 μm), the reaction layer has pores (diameter 0.1-100 μm), and IgG has a protein adsorption performance of 10 μg / cm 2. The detection layer and the detection layer are made of an organic or inorganic semiconductor material, and the light, charge, ion, electromagnetic field, temperature, pressure, strain is converted into an electric signal, and the absorption layer is hydrophilic. A layer having a water absorption performance of 1 g / 100 cm 2 or more. When blood is used as a sample, a hydrophilic filter layer having a pore diameter of 1-100 μm may be added above the reagent layer in order to remove blood cells. Good. In this practical example, the filter layer uses Borosicate glass fiber to remove foreign substances and separate blood cells. The reagent layer has a function of holding a reagent such as a modified antibody by using Borosicate glass fiber, and releasing the modified antibody held by the introduction solution when a sample solution or a reagent solution is introduced from outside the measurement device. The reaction layer uses a nitrocellulose membrane, nylon, or PVDF (Polyvinylidene Fluoride) to fix the antibody to cause an antigen-antibody reaction, and then provide a place where an enzyme-modified antibody bound to the antigen undergoes an enzyme reaction To do. As a detection layer, Shin-Etsu Semiconductor Silicon wafer, p-type 10Ωcm, photodiode formed by using 0.35 micron CMOS technology on 6 inches in diameter, signal processing circuit (amplifier, AD converter), passive RF communication circuit, power generation An integrated circuit including the circuit is formed. The detection layer detects the occurrence or fluctuation of chemiluminescence, etc. generated as a result of the interaction between the detection target and reagent in the reaction layer, performs signal processing such as amplification and digitization, and transmits it to an external reader by wireless function. It has a function of transmitting a detection signal. By using Whatman 900 Cotton printers or the like as the absorption layer, the reagent solution and sample solution that have passed through the reaction layer during measurement are absorbed. The detection layer and the reaction layer can exchange their positions with each other. The sample solution is dropped from the reagent layer side, and reacts with the reagent and the measurement object in the sample solution in the reaction layer.
本発明の一実施例を図１により説明する。フィルタ層１３としてＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバー、試薬層１１としてＷｈａｔｍａｎ ３３Ｇｌａｓｓ Ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ，反応層１０としてＷｈａｔｍａｎ(登録商標) ＰＲＩＭＡ８５ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，吸収層１２として，Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標) ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓ，検出層５０として、ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチSiliconウェハ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーにより形成したフォトダイオード，増幅器，ＡＤ変換器，受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を用いる。検出対象物の一例として妊娠マーカや腫瘍マーカとして使われているhCG(human Chorionic Gonadotropin)を検出する方法について説明する。ここで反応層１０部材としてニトロセルロースの他、ナイロン、ポリビニリジンフルオライド（PVDF、polyvinylidene-Fluoride）などを使うことができるが、抗体固定化の容易さの点でニトロセルロースが多く利用される。検出対象物質の検出・定量はイムノクロマトの場合と同様に図６に示すようなサンドイッチ法による。試薬層１１にはhCGに特異的に結合する抗体４２が保持されている。ここで抗体４２は酵素４３で修飾されている。試料溶液４５をフィルタ層１３上から滴下する。試料溶液中の抗原４１は試薬層１１に保持された酵素修飾抗体４２と反応しながら、反応層１０に固定された抗体１００と反応する。その後、発光基質４４を含む溶液４６が滴下されると発光基質は反応層１０の中を拡散して、反応層１０中の１次抗体の固定領域に局在した酵素４３によって発光基質４４の発光が触媒される。未反応の抗原や抗体は反応層に局在することなく、吸収層１２に到達する。発光は検出層５０によって検出される。抗原４１の例であるhCGとして、ロート製薬R-505（マウス由来細胞）を用い、固定化抗体１００として、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100066、マウス由来monoclonal anti-human alpha-subunit 6601 SPR-5）をスポッタ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ(登録商標)）により反応層３０となるニトロセルロース製メンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標)、PRIMA 85）へ固定化した。アルカリフォスファターゼ（AP）修飾抗体４２は、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100006、マウス由来monoclonal anti-hCG 5008 SP-5）に、APラベリングキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ(登録商標)、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH）を用いてAP修飾する。発光基質４４にはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(登録商標)、CDP-StarTM、（ready-to-use仕様、0.25mＭ）を用いることができる。なお、発光基質溶液にはNitro-Block-II（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を5%（v/v）添加してニトロセルロースメンブレンを疎水化処理することで発光基質を動きやすくすることができる。 An embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. As a filter layer 13, Borossilicate glass fiber, as a reagent layer 11 Whatman 33 Glass Borosicate glass fiber, as a reaction layer 10 as Whatman (registered trademark) PRIMA85 Nitrocellulose, as an absorption layer 12, as a Whatman (registered trademark) 900 Cotton layer, as a detection layer 50 An integrated circuit including a photodiode, an amplifier, an AD converter, a passive RF communication circuit, and a power generation circuit formed on a silicon wafer having a size of 10 Ωcm and a diameter of 6 inches by a 0.35 micron CMOS technology is used. A method for detecting hCG (human Chorionic Gonadotropin) used as a pregnancy marker or tumor marker as an example of a detection target will be described. Here, nylon, polyvinylidene fluoride (PVDF), etc. can be used as the reaction layer 10 member in addition to nitrocellulose, but nitrocellulose is often used in terms of ease of antibody immobilization. . The detection / quantification of the detection target substance is performed by a sandwich method as shown in FIG. 6 as in the case of immunochromatography. The reagent layer 11 holds an antibody 42 that specifically binds to hCG. Here, the antibody 42 is modified with an enzyme 43. The sample solution 45 is dropped from the filter layer 13. The antigen 41 in the sample solution reacts with the antibody 100 immobilized on the reaction layer 10 while reacting with the enzyme-modified antibody 42 held in the reagent layer 11. Thereafter, when the solution 46 containing the luminescent substrate 44 is dropped, the luminescent substrate diffuses in the reaction layer 10, and the luminescent substrate 44 emits light by the enzyme 43 localized in the fixed region of the primary antibody in the reaction layer 10. Is catalyzed. Unreacted antigens and antibodies reach the absorption layer 12 without being localized in the reaction layer. Luminescence is detected by the detection layer 50. ROHTO Pharmaceutical R-505 (mouse-derived cell) is used as hCG as an example of antigen 41, and anti-hCG IgG (Medix Biochemica, product number 100066, mouse-derived monoclonal anti-human alpha-subunit 6601 SPR- 5) was immobilized on a nitrocellulose membrane (Whatman (registered trademark), PRIMA 85) serving as the reaction layer 30 by a spotter (Cartesian (registered trademark)). Alkaline phosphatase (AP) -modified antibody 42 is prepared by adding anti-hCG IgG (Medix Biochemica, product number 100006, mouse-derived monoclonal anti-hCG 5008 SP-5) to AP labeling kit (Dojindo (registered trademark), Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH). To modify AP. As the luminescent substrate 44, Applied Biosystems (registered trademark), CDP-Star ™ (ready-to-use specification, 0.25 mM) can be used. The luminescent substrate solution can be made to move easily by adding 5% (v / v) Nitro-Block-II (Applied Biosystems) to the luminescent substrate solution to hydrophobize the nitrocellulose membrane.
検出層の構造を図８（ａ）のブロックダイアグラムに示す。反応層１０で発生した光は検出層５０のセンサ６４によって検出される。検出層５０は無線を介して制御用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）８０およびリーダ７０によってデータの通信を行う。ここでセンサ６４はシリコンウェハ上に形成されたフォトダイオード(ＰＤ; Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ)、フォトトランジスタ、フォトセル、ＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）など光に感応する素子によって構成することができる。センサ６４で捕獲された光は検出層５０を構成するシリコンチップ上に形成された信号処理回路６３で増幅、アナログ−ディジタル（A-D）変換され、同じくシリコンチップ上に形成された通信回路６１に送られ、アンテナコイル７４からリーダに送信される。 The structure of the detection layer is shown in the block diagram of FIG. The light generated in the reaction layer 10 is detected by the sensor 64 of the detection layer 50. The detection layer 50 communicates data with a control personal computer (PC) 80 and a reader 70 via radio. Here, the sensor 64 can be composed of a light-sensitive element such as a photodiode (PD), a phototransistor, a photocell, or an FET (Field Effect Transistor) formed on a silicon wafer. The light captured by the sensor 64 is amplified and analog-digital (AD) converted by the signal processing circuit 63 formed on the silicon chip constituting the detection layer 50, and sent to the communication circuit 61 also formed on the silicon chip. Is transmitted from the antenna coil 74 to the reader.
図８（ｂ）は検出デバイスとリーダコイル７１の配置を示す。検出層とリーダとの通信には電磁波、交流磁場、交流電場などを用いることができる。本発明ではいずれを用いることも可能であるが、ここでは一般的に多く用いられている、13.56MHzの交流磁場を採用した場合について説明する。リーダ７０で生成された交流磁場はリーダコイル７１によって検出デバイスの置かれた領域に向けて放射される。本交流磁場は磁場振幅を変動することによってデータを転送する。 FIG. 8B shows the arrangement of the detection device and the reader coil 71. An electromagnetic wave, an alternating magnetic field, an alternating electric field, or the like can be used for communication between the detection layer and the reader. Any of them can be used in the present invention, but here, a case where an AC magnetic field of 13.56 MHz, which is generally used, will be described. The alternating magnetic field generated by the reader 70 is radiated by the reader coil 71 toward the area where the detection device is placed. The AC magnetic field transfers data by changing the magnetic field amplitude.
図１３に、本発明における検出デバイスの積層の例を示す。なお、簡単のため、ここでは各層を分離して表示する。ここで検出層５０は試薬層１１と反応層１０の間に配置されている。そして、フィルタ層１３と吸収層１２がこれらの構造を挟み込むように配置される。図１４に示すように、検出層５０は反応層１０と吸収層１２の間に配置することも可能である。検出層５０を試薬層１１と反応層１０に間に配置した場合は、試料溶液中の抗原は試薬層１１を通過して試薬層１１中に保持された修飾抗体と混合しながら検出層１１を迂回して反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に到達する。試料溶液が検出層１１を迂回すると、試料溶液が検出層１１を迂回する間に試料中の抗原４１と試薬層中に保持されていた修飾抗体４２が反応する時間を確保することができ、抗原抗体反応の効率をより向上することができる。一方、検出層５０を反応層１０と吸収層１２に間に配置した場合は、抗原４１が反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に早期に到達するため早い信号の立ち上がり期待できる。したがって、より高い感度を得たい場合には検出層を試薬層と反応層の間に配置し、より早い応答速度を得たい場合には検出層を反応層と吸収層の間に配置してもよい。 FIG. 13 shows an example of stacking of detection devices in the present invention. For simplicity, each layer is displayed separately here. Here, the detection layer 50 is disposed between the reagent layer 11 and the reaction layer 10. And the filter layer 13 and the absorption layer 12 are arrange | positioned so that these structures may be pinched | interposed. As shown in FIG. 14, the detection layer 50 can be disposed between the reaction layer 10 and the absorption layer 12. When the detection layer 50 is disposed between the reagent layer 11 and the reaction layer 10, the antigen in the sample solution passes through the reagent layer 11 and mixes with the modified antibody held in the reagent layer 11 while the detection layer 11 is being mixed. It detours and reaches the antibody fixing part (test part) 14 in the reaction layer 10. When the sample solution bypasses the detection layer 11, it is possible to secure time for the antigen 41 in the sample and the modified antibody 42 held in the reagent layer to react while the sample solution bypasses the detection layer 11. The efficiency of the antibody reaction can be further improved. On the other hand, when the detection layer 50 is disposed between the reaction layer 10 and the absorption layer 12, the antigen 41 arrives at the antibody fixing part (test part) 14 in the reaction layer 10 at an early stage, so an early rise of the signal can be expected. Therefore, if you want higher sensitivity, place the detection layer between the reagent layer and the reaction layer, and if you want faster response speed, place the detection layer between the reaction layer and the absorption layer. Good.
ここで図１３および１４の構造の検出デバイスについて、図８（ｂ）で示したようなリーダコイルについては、積層構造の上部、下部のいずれに配置しても通信を行うことができる。 Here, regarding the detection device having the structure shown in FIGS. 13 and 14, the reader coil as shown in FIG. 8B can be communicated regardless of whether the reader coil is arranged at the upper part or the lower part of the laminated structure.
本構造によれば、外部読取装置による信号検出用の窓形成が不要であることから、以下に述べるような窓形成に伴う信号強度の低下やバックグランド増加の要因を少なくできる。検出層５０は測定対象物の濃度に応じて変動する信号、ここでは化学発光が発生する反応層１０に密着して配置される。すなわち、本発明の構造では、試薬層１１、反応層１０、吸収層１０が密着して配置されることにより、試薬層から反応層に対する試薬の供給や未反応物の吸収層１２への排出が効率的に行われる。従来の検出デバイスでは、特許文献１にあるように、試薬層あるいは吸収層の全部または一部を除去することによって反射率や吸収率や発光を外部計測装置によって計測する構造を採用している。また特許文献２にあるように反応層の色変化を目視によって確認できるように試薬層に相当する部分を着脱式とし、計測時にはこれをはずして観察している。従来方式によれば、このように信号観察用の窓の形成により、窓領域の反応層は試薬層あるいは吸収層とは接していない部分ができ、この部分では試薬の供給が不足による信号強度の低下、あるいは未反応の修飾抗体の吸収層への排出が滞ることによるバックグランド信号の増加、などの問題が発生する。本構造によれば、信号検出は検出層５０によって行われ、検出結果は無線によって外部に伝達されるため、反応層における信号観察のために試薬層や吸収層に観察用の窓を形成する必要がなく、このため、試薬供給や未反応修飾抗体の排出が阻害する要因が除かれることで感度の向上、バックグランド信号の低減が可能になる。 According to this structure, it is not necessary to form a window for signal detection by an external reading device, so that the factors of a decrease in signal intensity and an increase in background due to window formation as described below can be reduced. The detection layer 50 is disposed in close contact with the reaction layer 10 in which chemiluminescence is generated, which is a signal that varies according to the concentration of the measurement object. That is, in the structure of the present invention, the reagent layer 11, the reaction layer 10, and the absorption layer 10 are arranged in close contact with each other, so that the reagent can be supplied from the reagent layer to the reaction layer and the unreacted material can be discharged to the absorption layer 12. Done efficiently. As disclosed in Patent Document 1, the conventional detection device employs a structure in which the reflectance, absorption, and luminescence are measured by an external measurement device by removing all or part of the reagent layer or absorption layer. Further, as disclosed in Patent Document 2, the portion corresponding to the reagent layer is made detachable so that the color change of the reaction layer can be visually confirmed, and this is removed during the measurement. According to the conventional method, by forming the signal observation window in this manner, the reaction layer in the window region has a portion not in contact with the reagent layer or the absorption layer, and in this portion, the signal intensity due to insufficient supply of the reagent is generated. Problems such as a decrease or an increase in background signal due to a delay in the discharge of unreacted modified antibodies to the absorption layer occur. According to this structure, since signal detection is performed by the detection layer 50 and the detection result is transmitted to the outside by radio, it is necessary to form an observation window in the reagent layer and the absorption layer for signal observation in the reaction layer For this reason, it is possible to improve the sensitivity and reduce the background signal by removing factors that hinder the supply of reagents and the discharge of unreacted modified antibodies.
また、本構造によれば、２次抗体の標識酵素としてアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を用いた場合に発光基質の輸送効率を向上できる。これは特にCDP-starのようなジオキセタン系の発光基質をニトロセルロースの反応層中で用いた場合に顕著となる。 Moreover, according to this structure, when alkaline phosphatase (AP) is used as the labeling enzyme for the secondary antibody, the transport efficiency of the luminescent substrate can be improved. This is particularly noticeable when a dioxetane-based luminescent substrate such as CDP-star is used in the nitrocellulose reaction layer.
図３にイムノクロマトデバイスについて発光基質の拡散を調べた結果を示す。 ここに発光基質４４を含む溶液４６を図３(a)のＡで示す位置から滴下した場合の反応層３０の発光分布をＣＣＤカメラで観察した結果を図３（ｂ）に示す。ここで、発光基質の滴下位置は中心部に白丸で示す。
反応層３０の一部に一次抗体１００を固定化し、抗原４１を含む試料溶液、続いて発光酵素４３で修飾された抗体１００を含む溶液を流す。修飾抗体を３４の領域に局在させた後、発光基質４４を含む溶液４６を流して抗体が固定されていないブランク部の発光分布を調べた。図３（ｂ）は発光のＣＣＤイメージである。ここで抗原と結合していない未反応の酵素修飾抗体を洗い流す洗浄工程は入れていないのでブランク部には修飾抗体溶液の濃度に応じた未反応の酵素修飾抗体が一様に分布している。酵素の一様分布にもかかわらず発光は基質の添加位置（滴下部）近傍に限定されていることがわかった。このことから化学発光反応で用いた発光基質のニトロセルロース製の反応層３０の中では拡散が大きく阻害されていることがわかった。
FIG. 3 shows the results of examining the diffusion of the luminescent substrate for the immunochromatographic device. FIG. 3B shows the result of observing the emission distribution of the reaction layer 30 with a CCD camera when the solution 46 containing the luminescent substrate 44 is dropped from the position indicated by A in FIG. Here, the dropping position of the luminescent substrate is indicated by a white circle at the center.
The primary antibody 100 is immobilized on a part of the reaction layer 30, and a sample solution containing the antigen 41 and then a solution containing the antibody 100 modified with the luminescent enzyme 43 are allowed to flow. After the modified antibody was localized in the region 34, the solution 46 containing the luminescent substrate 44 was flowed to examine the luminescence distribution of the blank portion where the antibody was not fixed. FIG. 3B is a light-emitting CCD image. Here, since there is no washing step for washing away the unreacted enzyme-modified antibody not bound to the antigen, the unreacted enzyme-modified antibody corresponding to the concentration of the modified antibody solution is uniformly distributed in the blank portion. Despite the uniform distribution of the enzyme, luminescence was found to be limited to the vicinity of the substrate addition position (dropping portion). From this, it was found that diffusion was greatly inhibited in the reaction layer 30 made of nitrocellulose as the luminescent substrate used in the chemiluminescence reaction.
図３（ｂ）にさらに、基質滴下点周辺（ＣＣＤカメラ確認結果に両端が矢印の線分で示した範囲）の発光分布を数値化し，下記に示す定常的な拡散の式（数１）でフィッティングした結果を示す。 Further, in FIG. 3 (b), the light emission distribution around the substrate dropping point (the range indicated by the arrow line at both ends in the CCD camera confirmation result) is quantified, and the steady diffusion equation (Equation 1) shown below is used. The result of fitting is shown.
ここでは，発光の強度は発光基質の濃度を反映していると考えられる。xは反応層の長さ方向に沿った位置座標，ＬＤはニトロセルロース製反応層内の拡散長である。フィッティングからＬＤを求めた結果，約1mmであった。ラテラルフロー型のイムノクロマト検査デバイスでは、計測対象物に伴う呈色反応を目視によって判定するために試料導入部と呈色部には一定の距離が必要であり、反応層３０の中で発光反応が起こる抗体１００が固定された領域３４と基質を滴下する試薬滴下位置（図３(a) Ａ）は10mm程度の距離に設定されている。
以上のように、定常状態における拡散の式から拡散距離ＬDは約１ｍｍであることがわかった。したがって、基質添加位置を抗体固定領域３４に近づけることにより信号強度は大幅に増大する。
Here, the intensity of luminescence is considered to reflect the concentration of the luminescent substrate. x is the position coordinate along the length of the reaction layer, L D is the diffusion length of the nitrocellulose reaction layer. Result of obtaining L D from the fitting was about 1 mm. In the lateral flow type immunochromatography inspection device, a certain distance is required between the sample introduction part and the coloration part in order to visually determine the coloration reaction associated with the measurement object, and the luminescence reaction occurs in the reaction layer 30. The region 34 where the antibody 100 is fixed and the reagent dropping position (FIG. 3 (a) A) for dropping the substrate are set to a distance of about 10 mm.
As described above, the diffusion distance L D was found to be about 1 mm from the diffusion equation in the steady state. Therefore, the signal intensity is greatly increased by bringing the substrate addition position closer to the antibody fixing region 34.
図４（ａ）に従来のラテラルフローによるイムノクロマト構造における試薬層３１からの試薬の供給を示す。ここでラテラルフロー構造とは、試料溶液や試薬溶液がデバイスの積層構造の層に対して主として実質的に平行に流れる構造、すなわち、イムノクロマト構造において、試料溶液が導入される試薬層３１と試薬溶液が吸収される吸収層５２が上面からみて重なりをもたない構造である。図４（ｂ）はフロースルー構造における試薬の流れを示す。ここでフロースルー構造とは、試料溶液や試薬溶液は積層構造の層に主として実質的に垂直に流れることを特徴とする構造、すなわち、試料溶液が導入される試薬層１１と試薬溶液が吸収される吸収層１２が上面からみて重なりをもつ構造である。フロースルー構造では反応層の中で１次抗体が固定され、酵素が局在する領域１７に対して吸収層１２は反応層１０の下部（吸収層と対面する関係）に配置されているため、発光試薬（基質）を効率的に供給することができる。特にＡＰを使った化学発光の系で発光基質の拡散距離が短く、図４（ｂ）に示すフロースルー構造では、検出層５０の大きさを基質の拡散距離ＬDに対して同じかそれ以下にすることによって抗体固定領域１７に対して反応層面内のあらゆる方向から基質が供給される。図４（ｃ）はラテラルフローとフロースルーのイムノクロマト構造について基質滴下位置と反応領域の距離と基質到達量（相対値）の関係を示す。ここで基質の拡散距離ＬDは図３（ｂ）で求めた値（１ｍｍ）を用いた。フロースルー構造はラテラルフロー構造に比べて基質滴下位置と反応領域の距離が短くなるため図に示すように信号強度の増加が期待できる。 FIG. 4A shows the supply of the reagent from the reagent layer 31 in the immunochromatographic structure by the conventional lateral flow. Here, the lateral flow structure is a structure in which a sample solution or a reagent solution flows mainly substantially in parallel with the layers of the stacked structure of the device, that is, in the immunochromatographic structure, the reagent layer 31 into which the sample solution is introduced and the reagent solution This is a structure in which the absorption layer 52 that absorbs is not overlapped when viewed from above. FIG. 4B shows the reagent flow in the flow-through structure. Here, the flow-through structure is a structure characterized in that the sample solution and the reagent solution flow mainly vertically in the layer of the laminated structure, that is, the reagent layer 11 into which the sample solution is introduced and the reagent solution are absorbed. The absorption layer 12 has an overlapping structure when viewed from above. In the flow-through structure, the primary antibody is immobilized in the reaction layer, and the absorption layer 12 is disposed below the reaction layer 10 (the relationship facing the absorption layer) with respect to the region 17 where the enzyme is localized. A luminescent reagent (substrate) can be supplied efficiently. In particular, in the chemiluminescence system using AP, the diffusion distance of the luminescent substrate is short, and in the flow-through structure shown in FIG. 4B, the size of the detection layer 50 is equal to or less than the diffusion distance L D of the substrate. Thus, the substrate is supplied from all directions within the reaction layer surface to the antibody fixing region 17. FIG. 4C shows the relationship between the substrate dropping position, the reaction region distance, and the substrate arrival amount (relative value) in the lateral flow and flow-through immunochromatographic structures. Here, the value (1 mm) obtained in FIG. 3B was used as the diffusion distance L D of the substrate. Since the distance between the substrate dropping position and the reaction region is shorter in the flow-through structure than in the lateral flow structure, an increase in signal intensity can be expected as shown in the figure.
また、本構造によれば、検出デバイス組み立て工程の簡略化することができる。ＡＰに対するジオキセタン系発光基質のように拡散距離の短い発光試薬を供給しようとする場合、検出デバイスの感度ばらつきを抑えるには１次抗体が固定化されたテスト部に対して発光基質の添加位置を正確に規定する必要があるが、図４（ａ）の構造では、試薬層３１と抗体固定位置３４および検出層５０を正確に決める必要があり、製造組み立ての工数増が問題になる。図４（ｂ）のフロースルー構造では、反応層１０中の抗体固定領域１７と検出層５０の位置を正確に決めれば、試薬層１１や吸収層１２は単に積層するだけでよく、正確な位置決めは不要である。これについて以下説明する。抗体固定領域１７と検出層５０を互いに位置合わせする場合、検出デバイス組立て時における位置合わせばらつきに対してデバイス毎に感度が異ならないようにすることが重要である。抗体固定領域の形状と検出層における受光部の形状が同一の場合、位置合わせばらつきが生ずると抗体固定領域と受光部の重なり面積が変化して感度が低下する方向に変化する。これに対し、受光部の大きさに対して抗体固定領域を大きく設定する、あるいは受光部の大きさに対して抗体固定領域を小さく設定することによって組立て時の位置合わせばらつきによる感度の変動を抑制することができる。一般の組立工程において位置合わせ精度を100μmとすることは格別に困難ではない。そこで、受光部と抗体固定領域の形状を100μmの位置合わせずれがあっても重なり部分の面積が変化しないように形状を定めればよい。位置合わせの具体的手段としては、反応層に位置合わせマークをつけることによって精度良くデバイスを組立てることができる。位置合わせマークは反応層上への染料の滴下、反応層の加工（穿孔、切りかき形成、圧刻）等によって形成することができる。抗体固定領域１７と検出層５０の形状をこのように定めて位置を合わせれば、他の試薬層１１や吸収層１２は抗体固定領域に対して十分に大きいため1mm程度の位置合わせ精度で十分であり組立て時の位置合わせについて精密な注意をはらう必要はない。検出層５０は一般にシリコンなどの溶液に対して非浸透性の材料で構成されているため、発光試薬の供給経路は検出層５０の形状によって規定される。 Moreover, according to this structure, the detection device assembly process can be simplified. When supplying a luminescent reagent with a short diffusion distance, such as a dioxetane-based luminescent substrate for AP, in order to suppress variations in sensitivity of the detection device, the addition position of the luminescent substrate should be set to the test section on which the primary antibody is immobilized. Although it is necessary to define precisely, in the structure of Fig.4 (a), it is necessary to determine correctly the reagent layer 31, the antibody fixing position 34, and the detection layer 50, and the increase in the man-hour of manufacture assembly becomes a problem. In the flow-through structure shown in FIG. 4B, the reagent layer 11 and the absorption layer 12 need only be laminated if the positions of the antibody immobilization region 17 and the detection layer 50 in the reaction layer 10 are accurately determined. Is unnecessary. This will be described below. When the antibody immobilization region 17 and the detection layer 50 are aligned with each other, it is important that the sensitivity does not differ for each device with respect to alignment variations during assembly of the detection device. When the shape of the antibody fixing region and the shape of the light receiving portion in the detection layer are the same, if an alignment variation occurs, the overlapping area of the antibody fixing region and the light receiving portion changes and the sensitivity decreases. In contrast, by setting the antibody fixing area larger than the size of the light receiving part, or by setting the antibody fixing area smaller than the size of the light receiving part, fluctuations in sensitivity due to alignment variations during assembly can be suppressed. can do. It is not particularly difficult to set the alignment accuracy to 100 μm in a general assembly process. Therefore, the shape of the light receiving portion and the antibody fixing region may be determined so that the area of the overlapping portion does not change even if there is a misalignment of 100 μm. As a specific means of alignment, a device can be assembled with high accuracy by providing alignment marks on the reaction layer. The alignment mark can be formed by dropping a dye on the reaction layer, processing the reaction layer (perforation, notching, stamping) or the like. If the shapes of the antibody immobilization region 17 and the detection layer 50 are determined and aligned in this way, the other reagent layers 11 and absorption layers 12 are sufficiently large relative to the antibody immobilization region, so that an alignment accuracy of about 1 mm is sufficient. There is no need to pay close attention to alignment during assembly. Since the detection layer 50 is generally made of a material that is impermeable to a solution such as silicon, the supply path of the luminescent reagent is defined by the shape of the detection layer 50.
図５（ａ）および図７に、１次抗体が固定された領域１４からの発光と同時に１次抗体が固定されていないブランク部分からの発光を計測して、その差分を実際の信号として処理する実施例を示す。ここでは、１次抗体が固定された領域を複数有しかつ検出層を複数有し、複数の検出層は、複数の検査領域の少なくとも２つに対面して設置される。本構造は、実際の計測において感度と再現性の向上に有効である。 5 (a) and FIG. 7, the light emission from the blank portion where the primary antibody is not fixed is measured simultaneously with the light emission from the region 14 where the primary antibody is fixed, and the difference is processed as an actual signal. An embodiment is shown. Here, a plurality of regions to which the primary antibody is immobilized and a plurality of detection layers are provided, and the plurality of detection layers are disposed so as to face at least two of the plurality of examination regions. This structure is effective in improving sensitivity and reproducibility in actual measurement.
これは、抗体固定部１４からの信号を検出するための検出層５１とブランク部からの信号を検出する検出層５２を設けることによって容易に実現することができる。ここで検出層５１と検出層５２が接しないように配置すれば抗体固定部１４への試料溶液あるいは試薬溶液の流れを検出層５１の中心に対して対称にすることができ、固定抗体と抗原の反応効率を向上できる。各検出層は図８（ａ）の構造を有し、検出層が１個の時と同様にひとつのリーダによってデータを読み出すことができる。識別番号（ＵＩＤ：ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）による衝突防止制御機能を有する無線通信プロトコルを使用することにより、複数の検出層についても図９（ａ）のようにデータ読み出しシステムは検出層１個の場合とまったく変わらない。図９（ｂ）の制御フローに示すようにｉｎｖｅｎｔｏｒｙ(通信フィールド内にある検出層の確認)、ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅ(フォトダイオードのリセットと計測開始)、ｍｅａｓｕｒｅ(計測データのＡＤ変換)などの共通コマンドはリーダから一括して各検出層に送信される。各検出層からの信号はＵＩＤを使って個別に順次読み取る。 This can be easily realized by providing a detection layer 51 for detecting a signal from the antibody fixing part 14 and a detection layer 52 for detecting a signal from the blank part. Here, if the detection layer 51 and the detection layer 52 are arranged so as not to contact each other, the flow of the sample solution or reagent solution to the antibody fixing portion 14 can be made symmetric with respect to the center of the detection layer 51, and the fixed antibody and antigen The reaction efficiency of can be improved. Each detection layer has the structure shown in FIG. 8A, and data can be read out by one reader as in the case of one detection layer. By using a wireless communication protocol having a collision prevention control function based on an identification number (UID: unique identifier), the data reading system for a plurality of detection layers is completely the same as in the case of one detection layer as shown in FIG. does not change. Common commands such as inventory (confirmation of detection layer in communication field), pre-charge (photodiode reset and measurement start), measurement (AD conversion of measurement data) as shown in the control flow of FIG. 9B Are collectively transmitted from the reader to each detection layer. Signals from each detection layer are individually read sequentially using a UID.
複数の検出層を制御してそれぞれの信号を検出する場合、各検出層に固有のＵＩＤが必要となる。ＵＩＤを付与する方法としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＰＲＯＭ（Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路を用いることができる。PROMについては電気的に書き換えが可能なＥＥＰＲＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｅｒａｓａｂｌｅ Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路としてはＭＯＳトランジスタの閾値ばらつきを利用する方式を用いることができる。 When detecting a signal by controlling a plurality of detection layers, a unique UID is required for each detection layer. As a method for assigning a UID, a ROM (Read Only Memory), a PROM (Programmable ROM), or a random number generation circuit can be used. As for the PROM, an electrically erasable EEPROM (Electrical Erasable Programmable ROM) can be used, and as a random number generation circuit, a method utilizing a threshold variation of MOS transistors can be used.
他の実施例を図５（ｂ）により説明する。本実施例は１個の検査デバイスで複数の計測対照物をする手段を容易に提供することができる。反応層１０の中に第１の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１４を形成し、さらに第２の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１５を形成する。各抗体固定化領域に隣接して第１の検出層５１および第２の検出層５３を配置する。さらに抗体を固定化しないブランク部には検出層５２を配置する。第１の計測対象物からの信号は検出層５１とブランク部の検出層５２の差分、第２の計測対象物からの信号は検出層５３と検出層５２の差分をとって算出する。この場合、３つの検出層を同時に駆動する必要があるが、図９に示した２個の検出層の駆動の場合と同様に各検出層に固有のＵＩＤを用いた輻輳制御機能によって３個の検出層を駆動して、独立にデータを読み取るこが可能である。なお、３個以上の計測対象物についても、各々について検出層と計測対象物に特異的に結合する交代を固定化した領域とを新たに設置することによって対応できる。 Another embodiment will be described with reference to FIG. This embodiment can easily provide a means for performing a plurality of measurement objects with a single test device. An antibody in which an antibody fixing region 14 in which an antibody that specifically binds to the first measurement object is immobilized is formed in the reaction layer 10 and an antibody that specifically binds to the second measurement object is further immobilized A fixed region 15 is formed. A first detection layer 51 and a second detection layer 53 are arranged adjacent to each antibody immobilization region. Further, a detection layer 52 is disposed in a blank portion where the antibody is not immobilized. The signal from the first measurement object is calculated by taking the difference between the detection layer 51 and the detection layer 52 in the blank portion, and the signal from the second measurement object is calculated by taking the difference between the detection layer 53 and the detection layer 52. In this case, it is necessary to drive the three detection layers at the same time. However, as in the case of driving the two detection layers shown in FIG. 9, the congestion control function using a unique UID for each detection layer is used. It is possible to read the data independently by driving the detection layer. Note that it is possible to deal with three or more measurement objects by newly setting a detection layer and a region in which a shift that specifically binds to the measurement object is fixed.
他の実施例を図１０により説明する。本発明からなる計測デバイスを構成する各層の保護性能、計測時の遮光性能、取扱の容易性を向上するため、フィルタ層１３、試薬層１１、検出層５０、反応層１０、吸収層１２の各層をケース(カバー)２０に収納する。試料はケースに設けられた試料導入部から添加する。ケースは検出層と外部の読み出しリーダとの通信を阻害しないように、樹脂等の誘電体材料たとえばポリエチレンテレフタレート、ＡＢＳ樹脂等で構成する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。 Another embodiment will be described with reference to FIG. Each layer of the filter layer 13, the reagent layer 11, the detection layer 50, the reaction layer 10, and the absorption layer 12 in order to improve the protection performance of each layer constituting the measurement device according to the present invention, the light shielding performance during measurement, and the ease of handling. Is stored in a case (cover) 20. The sample is added from the sample introduction part provided in the case. The case is made of a dielectric material such as a resin such as polyethylene terephthalate or ABS resin so as not to hinder communication between the detection layer and the external readout reader. The measurement device is the same as the device described in the above embodiment.
本発明の計測デバイスをケースに収納する場合についての実施例を、さらに図１１および１２により説明する。検出層により化学発光を正確に計測するには、試料導入部２１からの外部光侵入を抑制する手段が必要になる。これに対し、光吸収性の染料をガラスファイバ、ＰＶＦ（ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ｎｙｌｏｎなどの多孔質材料を遮光層２２を試料導入部２１に配置する。これにより、試料導入部２１から進入する光は、試料溶液の流れは妨げられず、試料導入部２１からケースの内側に進入した光が各層（１３、１１、１０、１２）において散乱されて検出層２２に到達して雑音源となることを抑制することができる。図１２は遮光性能を向上するケースの構造を示す。ケース２０の内側に試料導入部２１を囲むように凸部２３を設けることにより、ケース２０と遮光層２２の間隙にそって侵入する光を遮断することができる。また、テーパ形状を有する試料導入部２０を設けることでデバイスに導入する溶液の飛散を防止できる。また、図１１におけるケース２０を図１２のように２４と２５に分割することにより、積層構造部分の収納を容易に行うことが可能になる。 An embodiment in which the measuring device of the present invention is housed in a case will be further described with reference to FIGS. In order to accurately measure chemiluminescence with the detection layer, means for suppressing external light intrusion from the sample introduction part 21 is required. On the other hand, a light-shielding layer 22 is disposed in the sample introduction part 21 with a porous material such as a glass fiber, PVF (poly vinyl fluoride), or nylon as a light-absorbing dye. Thereby, the light entering from the sample introduction unit 21 is not disturbed by the flow of the sample solution, and the light entering the case from the sample introduction unit 21 is scattered and detected in each layer (13, 11, 10, 12). Reaching the layer 22 and becoming a noise source can be suppressed. FIG. 12 shows a structure of a case for improving the light shielding performance. By providing the convex portion 23 so as to surround the sample introduction portion 21 inside the case 20, it is possible to block light entering along the gap between the case 20 and the light shielding layer 22. Further, by providing the sample introduction part 20 having a tapered shape, it is possible to prevent the solution introduced into the device from being scattered. Further, by dividing the case 20 in FIG. 11 into 24 and 25 as shown in FIG. 12, the stacked structure portion can be easily stored.
他の実施例を図１５により説明する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。図１５（ａ）に示すように、溶液流の制限層１８を設けることにより、１次抗体の固定領域に溶液流を集中して感度を向上することができる。制限層１８は、吸収層の少なくとも一部に面する層状部材である。さらには、抗体固定部１４に接さないように配置される。制限層は液体を浸透しない材料であって、分子吸着の少ない材料あるいは表面処理がなされていることが必要である。このような性質を有する材料としてたとえばポリエステルフィルム、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）フィルム等を用いることができる。 Another embodiment will be described with reference to FIG. The measurement device is the same as the device described in the above embodiment. As shown in FIG. 15A, by providing the solution flow restriction layer 18, the solution flow can be concentrated on the primary antibody fixing region to improve the sensitivity. The limiting layer 18 is a layered member that faces at least a part of the absorption layer. Furthermore, it arrange | positions so that the antibody fixing | fixed part 14 may not be contact | connected. The restricting layer is a material that does not penetrate liquid and needs to be a material with little molecular adsorption or a surface treatment. As a material having such properties, for example, a polyester film, a PVC (Poly vinyl chloride) film, or the like can be used.
微量試料を計測する場合には、ブランク部を設けてブランク部の発光をさらに計測することができる。図１５（ｂ）に示すようにブランク部にも溶液流が集中するように溶液流制限層を設けることによりブランク部の洗浄効果が向上してバックグランド信号を低減することができる。 When measuring a trace amount sample, the blank part can be provided and the light emission of the blank part can be further measured. As shown in FIG. 15B, by providing the solution flow restricting layer so that the solution flow is concentrated also in the blank portion, the cleaning effect of the blank portion is improved and the background signal can be reduced.
図１７に、検出層として光センサだけでなく、温度センサ、ＩＳＦＥＴ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）センサを組み込んだ検出層を同時に利用する実施例の制御のフローを示す。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。各検出層の制御と信号の読み出しは図９で説明した複数の同種センサを搭載した検出層を用いる場合と同様に、ＵＩＤを用いて各検出層を識別することにより、ひとつのリーダで複数の検出層を制御することができる。本実施例の特徴は異なる物理量・化学量をひとつのリーダによって同時に計測することである。光センサによって免疫反応を使ったタンパク質計測を行いながら、温度およびｐＨを計測してその計測条件を明確にし、タンパク質計測結果を補正することが可能になる。ここで温度センサは半導体のバンドギャップの温度依存性によりダイオード特性が変化することを使って温度を計測する。図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にｐｎ接合を使った温度計測部を形成することにより、計測した温度をディジタル化して外部に送信することができる。 FIG. 17 shows a control flow of an embodiment in which a detection layer incorporating not only an optical sensor but also a temperature sensor and an ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) sensor is used simultaneously as the detection layer. The measurement device is the same as the device described in the above embodiment. As in the case of using a detection layer equipped with a plurality of sensors of the same type described in FIG. 9, each detection layer is controlled and a signal is read out by identifying each detection layer using a UID. The detection layer can be controlled. The feature of this embodiment is that different physical quantities and chemical quantities are simultaneously measured by one reader. While performing protein measurement using an immune reaction with an optical sensor, it is possible to measure temperature and pH, clarify the measurement conditions, and correct the protein measurement result. Here, the temperature sensor measures the temperature by using the change in the diode characteristics due to the temperature dependence of the band gap of the semiconductor. By forming a temperature measurement unit using a pn junction in the sensor 64 portion of the detection layer structure of FIG. 8, the measured temperature can be digitized and transmitted to the outside.
ＩＳＦＥＴは、通常のＭＯＳトランジスタのゲート電極を試料溶液に接するようにしてここにイオン感応膜を堆積することによって形成する。温度センサの場合と同様に、図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にＩＳＦＥＴを形成することにより、計測したｐＨをディジタル化して外部に送信することができる。ここで、図２０(ａ)に示すように検出層におけるセンサ、信号処理回路、通信回路の一部または全部を有機半導体で構成される検出層３８を導入する。有機半導体材料としては例えば比較的低分子量のペンタセン（例えば非特許文献７）、あるいは比較的項分量のポリチオフェン（例えば非特許文献８）などを用いることができる。 The ISFET is formed by depositing an ion sensitive film on the gate electrode of a normal MOS transistor so that the gate electrode is in contact with the sample solution. As in the case of the temperature sensor, the measured pH can be digitized and transmitted to the outside by forming an ISFET in the sensor 64 portion of the detection layer structure of FIG. Here, as shown in FIG. 20A, a detection layer 38 composed of an organic semiconductor is introduced for some or all of the sensor, signal processing circuit, and communication circuit in the detection layer. As the organic semiconductor material, for example, a relatively low molecular weight pentacene (for example, Non-Patent Document 7) or a relatively high molecular weight polythiophene (for example, Non-Patent Document 8) can be used.
有機半導体による検出層３８の形成方法と材料構成について以下説明する。ＰＥＴ（poly ethylene terephthalate）やpolyesterなどフィルム５２上に前記半導体材料をグリニヤール法、電解重合、溶液塗布法や化学的気相成長法などによって堆積し、フォトリソグラフィー技術によってセンサ、信号処理回路、通信回路を含む層５１を形成する(図２０(ｂ))。図２０(ａ)の検出層３８は層５１とフィルム５２を合わせたものである。ここで実施例１の試薬層、検出層、反応層、吸収層の一部、あるいはすべてを共通のフィルム５２上の層５１に連続して堆積することにより、簡便かつ安価に検出デバイスを形成できる(図２０（ｃ）)。有機半導体は大面積のフィルム上に回路やセンサを形成できるため、製造コストの点で有利である。しかし、一般に有機半導体が形成されるフィルムには溶液透過性がないので、フィルムには図２１（ａ）のように溶液を透過させるためのスルーホール３９を形成する。上記各層の一部を別々のフィルム上に形成する場合には、同様に吸収層以外の層が形成されたフィルムにスルーホールを形成する。スルーホール３９の間隔d1は前記の基質の拡散長に対して同程度以下とすることが望ましい(図２１（ｂ）)。これにより、発光基質がメンブレンによって捕獲される割合を減らして基質の利用効率を向上し、発光強度を増大することができる。 The formation method and material structure of the detection layer 38 using an organic semiconductor will be described below. The semiconductor material is deposited on a film 52 such as PET (polyethylene terephthalate) or polyester by a Grignard method, electrolytic polymerization, solution coating method, chemical vapor deposition method, etc., and a sensor, a signal processing circuit, a communication circuit by photolithography technology. A layer 51 containing (FIG. 20B) is formed. The detection layer 38 in FIG. 20A is a combination of the layer 51 and the film 52. Here, a part of the reagent layer, the detection layer, the reaction layer, and the absorption layer of Example 1 or all of them are continuously deposited on the layer 51 on the common film 52, so that a detection device can be formed easily and inexpensively. (FIG. 20 (c)). Organic semiconductors are advantageous in terms of manufacturing cost because circuits and sensors can be formed on a large-area film. However, since a film on which an organic semiconductor is formed generally does not have solution permeability, a through hole 39 for allowing the solution to pass therethrough is formed in the film as shown in FIG. When a part of each of the above layers is formed on a separate film, a through hole is similarly formed in the film on which a layer other than the absorbing layer is formed. It is desirable that the distance d1 between the through holes 39 be equal to or less than the diffusion length of the substrate (FIG. 21B). Thereby, the rate at which the luminescent substrate is captured by the membrane can be reduced, the substrate utilization efficiency can be improved, and the luminescence intensity can be increased.
本実施例では、計測デバイスを全血試料計測関連に用いる例を記載する。ここでは特に、心筋梗塞のマーカして利用されているtroponinなどを全血試料から計測する例を検討する。 In the present embodiment, an example in which the measurement device is used for whole blood sample measurement will be described. Here, in particular, an example of measuring troponin used as a marker for myocardial infarction from a whole blood sample will be considered.
計測デバイスは上記の実施例の構成と同様の構成を基本とする。従来の目視によるイムノクロマトデバイスでは視認性の点から血球を除くことが必須であるが、本実施例では検出層による発光や電位によって免疫反応を計測するため、反応層における免疫反応は酵素反応が阻害されなければ血球除去は必須ではない。しかし、メンブレンの目詰まり防止の観点から本実施例においても血球を除去するフィルタ層を設けることが望ましい。血球フィルタ層４０を導入した計測デバイスの実施例を図２２に示す。血球フィルタ層４０は、試料の流路において試薬層よりも実質的に下流に配置される。ここで血球フィルタ層４０として、例えばＰＡＬＬ社製ＢＴＳを用いることができる（図２２）。前述のとおり計測は目視計測にたよらないため、反応層１０への着色汚染は問題とならず血球フィルタ性能の選定条件は緩和され、血球フィルタコストの点で有利である。 The measurement device is based on the same configuration as that of the above embodiment. In conventional immunochromatographic devices, it is essential to remove blood cells from the viewpoint of visibility, but in this example, the immune reaction is measured by the light emission and potential of the detection layer, so the immune reaction in the reaction layer is inhibited by the enzyme reaction. If not done, blood cell removal is not essential. However, from the viewpoint of preventing clogging of the membrane, it is desirable to provide a filter layer for removing blood cells also in this embodiment. An embodiment of a measuring device in which the blood cell filter layer 40 is introduced is shown in FIG. The blood cell filter layer 40 is disposed substantially downstream of the reagent layer in the sample flow path. Here, for example, BTS manufactured by PALL can be used as the blood cell filter layer 40 (FIG. 22). Since the measurement does not depend on visual measurement as described above, coloring contamination to the reaction layer 10 is not a problem, and the selection conditions for blood cell filter performance are relaxed, which is advantageous in terms of blood cell filter cost.
図において、１０：反応層、１１：試薬層、１２：吸収層、１３：フィルタ層、１４：抗体固定部（テスト部）、１５：抗体固定部（テスト部）、１６：試薬・試料の流れ、１７：試薬・試料の流れ、１８：溶液流の制限層、２０：ケース、２１：試料導入口、２２：遮光層、２３：ケース内側に設けられた遮光用の凸部、２４：ケース部品、３０：反応層、３１：試薬層、３３：フィルタ層、３４：抗体固定部（テスト部）、３５：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３６：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３７：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３８：有機半導体検出層、３９：スルーホール、４０：血球フィルタ層、４１：抗原、４２：抗体、４３：酵素、４４：発光基質、４５：試料溶液、４６：発光基質溶液、４７：血球、５０：検出層、５１：検出層を構成する有機半導体で形成された回路やセンサを含む層、５２：フィルム、５３：試薬層、６０：検出層、６１：通信回路、６２：通信処理回路、６３：信号処理回路、６４：センサ、６５：ＵＩＤ格納部、６６：補正データ収納部、７０：リーダ、７１：リーダコイル、７２：検出層からリーダに送信される信号、７３：リーダから検出層に送られる信号、７４：チップコイル：７５：共振用容量、７６：磁力線、８０：制御用PC、８１：ｉｎｖｅｎｔｏｒｙコマンド、８２：ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅコマンド、８３：ｍｅａｓｕｒｅコマンド、８４：readコマンド、85:readコマンド、８６：検出層１に固有のＵＩＤ、８７：検出層１における信号蓄積期間、８８：検出層１におけるＡ−Ｄ変換期間、８９：検出層１から送信される計測データ、９０：検出層２に固有のＵＩＤ、９１：検出層２における信号蓄積期間、９２：検出層２におけるＡ−Ｄ変換期間、９３：検出層２から送信される計測データ、を示す。 In the figure, 10: reaction layer, 11: reagent layer, 12: absorption layer, 13: filter layer, 14: antibody fixing part (test part), 15: antibody fixing part (test part), 16: reagent / sample flow 17: Flow of reagent / sample, 18: Restriction layer of solution flow, 20: Case, 21: Sample introduction port, 22: Light shielding layer, 23: Projection for light shielding provided inside case, 24: Case parts , 30: reaction layer, 31: reagent layer, 33: filter layer, 34: antibody fixing part (test part), 35: flow of reagent / sample solution in membrane, 36: flow of reagent / sample solution in membrane, 37: Flow of reagent / sample solution in membrane, 38: Organic semiconductor detection layer, 39: Through hole, 40: Blood cell filter layer, 41: Antigen, 42: Antibody, 43: Enzyme, 44: Luminescent substrate, 45: Sample Solution, 46: Luminescent substrate solution, 4 : Blood cell, 50: Detection layer, 51: Layer including circuit and sensor formed of organic semiconductor constituting the detection layer, 52: Film, 53: Reagent layer, 60: Detection layer, 61: Communication circuit, 62: Communication Processing circuit 63: Signal processing circuit 64: Sensor 65: UID storage unit 66: Correction data storage unit 70: Reader 71: Reader coil 72: Signal transmitted from the detection layer to the reader 73: Reader 74: Chip coil: 75: Resonance capacity, 76: Magnetic field line, 80: Control PC, 81: Inventory command, 82: Pre-charge command, 83: Measurement command, 84: Read command 85: read command 86: UID unique to the detection layer 1, 87: signal accumulation period in the detection layer 1, 88: A-D conversion period in the detection layer 1, 8 : Measurement data transmitted from detection layer 1, 90: UID unique to detection layer 2, 91: signal accumulation period in detection layer 2, 92: AD conversion period in detection layer 2, 93: transmission from detection layer 2 Measurement data to be displayed.
Claims (18)
前記検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜と、
前記第１膜と前記第２膜の間に位置し、前記保持領域と対面して設置される検出層とを有する分析デバイス。 A first membrane having a holding region for holding a first antibody that specifically binds to a test substance;
A second membrane that retains in part a second antibody that specifically binds to the test substance;
An analysis device having a detection layer located between the first film and the second film and disposed to face the holding region.
前記デバイスと情報を送受信するリーダライタと、
前記リーダライタと接続する制御機とを有する分析システム。 A first film having a holding region for holding a first antibody that specifically binds to a test substance; a second film that partially holds a second antibody that specifically binds to the test substance; A device that is located between one membrane and the second membrane, is placed facing the holding region, and has a detection layer comprising a communication circuit;
A reader / writer for transmitting and receiving information to and from the device;
An analysis system having a controller connected to the reader / writer.
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