JP4988345B2 - Ophthalmic hydrogel nanocomposites - Google Patents

Description

本出願は、係属中の米国特許出願第10/706081号の一部継続出願である。この出願はまた、米国特許仮出願第499887号および米国特許仮出願第564592号の優先権を主張する。   This application is a continuation-in-part of pending US patent application Ser. No. 10/706081. This application also claims priority from US Provisional Application No. 499887 and US Provisional Patent Application No. 556492.

本発明は、ナノ粒子もしくはナノ相を含むハイドロゲル系に関する。特に、本発明のハイドロゲルは、酸化状態、あるいは光の振動数と強度、あるいは機械的応力の変化がトリガーとなってハイドロゲルを生成し得る、ナノ粒子を含むコポリマー溶液からなる。例えば、コポリマー溶液は酸化されてハイドロゲルを生成し得る;また、ハイドロゲルは還元されてコポリマー溶液となり得る。光付加化学反応を用いて、あるいは、機械的応力に感応するポリマー(剪断による粘度低下を起こす物理的ゲル)を用いてもまた、可逆性は実現され得る。上の方法の原理はまた、コポリマーの希薄溶液から可逆的ナノゲルを生成させるためにも用いられ得る。ハイドロゲルをそれに埋め込まれたナノ粒子を含めて生成させると、その屈折率およびモジュラスをそれぞれナノ粒子の量とハイドロゲルのポリマー濃度を変えることにより制御できるナノコンポジットが生成する。   The present invention relates to a hydrogel system comprising nanoparticles or nanophases. In particular, the hydrogel of the present invention comprises a copolymer solution containing nanoparticles, which can generate a hydrogel triggered by changes in oxidation state, light frequency and intensity, or mechanical stress. For example, the copolymer solution can be oxidized to produce a hydrogel; and the hydrogel can be reduced to a copolymer solution. Reversibility can also be achieved using photoaddition chemistry or using polymers that are sensitive to mechanical stress (physical gels that cause viscosity reduction due to shear). The above method principles can also be used to generate reversible nanogels from dilute solutions of copolymers. When a hydrogel is formed including nanoparticles embedded in it, a nanocomposite is produced whose refractive index and modulus can be controlled by varying the amount of nanoparticles and the polymer concentration of the hydrogel, respectively.

白内障の混濁部分は、通常は透明な眼の水晶体の曇った部分あるいは混濁した部分である。混濁度が増すと、光線が水晶体を通過し、網膜(眼の後ろの内側を覆っている感光性組織)に焦点を合わせることが妨げられる。早期の水晶体の変化または混濁は視力に不自由を生じないかもしれないが、水晶体が変化し続けると、かすみ目、光と輝きに対する過敏、近視の進行、および/または、どちらかの目における乱視を含めて、いくつかの特殊な症状が現れることがある。   The cloudy part of the cataract is usually the cloudy part or cloudy part of the clear eye lens. As turbidity increases, light rays pass through the lens, preventing it from focusing on the retina (the photosensitive tissue covering the interior behind the eye). Early lens changes or opacity may not cause inconvenience in vision, but if the lens continues to change, blurred vision, sensitivity to light and shine, myopia progression, and / or astigmatism in either eye Some special symptoms may appear, including.

白内障の混濁部分が一旦できると、それらを消失させる治療薬、点眼液、訓練、または眼鏡は全くない。人が日々の正常な活動を行うのに十分なだけ見ることができなければ、白内障の混濁部分を除去し正常な視力を回復するために手術が必要である。   Once the turbid areas of cataracts are created, there is no therapeutic agent, eye drops, training, or glasses to eliminate them. If a person cannot see enough to perform normal daily activities, surgery is necessary to remove the cloudy part of the cataract and restore normal vision.

最新の白内障混濁部分摘出手術では、混濁部分は水晶体嚢(lens capsule)の開口部を通して水晶体から取り除かれる。手術用顕微鏡を用いて、目、次いて、水晶体嚢が小さく切開される。マイクロ手術器具を用いて、最初に、曇った水晶体を細かくし、次に、目から吸引する。水晶体の裏側の膜(後嚢と呼ばれる)は、もとのまま残される。この場合、予め作製された永続的な透明プラスチック眼内レンズ(intraocular lens、IOL)(1980年代初期に普及した)移植片に置き換えることにより、通常遠くの視力だけ、視覚系の焦点調節力は回復する。   In modern cataract opacity surgery, the opacity is removed from the lens through the opening of the lens capsule. Using a surgical microscope, the eye and then the lens capsule is cut small. Using a microsurgical instrument, the cloudy lens is first shredded and then aspirated through the eyes. The membrane behind the lens (called the posterior capsule) is left intact. In this case, the focus of the visual system is restored, usually by far vision, by replacing it with a prefabricated permanent transparent plastic intraocular lens (IOL) (popular in the early 1980s). To do.

IOLが進歩する以前には、白内障患者は、手術の後、「コークボトル(coke bottle)」の厚い眼鏡またはコンタクトレンズを付けることを余儀なくされた。残念ながら、視力は、厚い眼鏡によっては大してよくならないし、厚いコンタクトレンズはそれ程よい選択肢でない。IOLの発明はこの問題を解決した。   Prior to IOL advancement, cataract patients were forced to wear thick “coke bottle” glasses or contact lenses after surgery. Unfortunately, vision is not very good with thick glasses, and thick contact lenses are not a good option. The IOL invention solved this problem.

眼内レンズを、2つの主なグループ:ノン-フォールダブル(non-foldable)とフォールダブル:に分けることができる。最初の眼内レンズは、硬質プラスチック(ノン-フォールダブル)材料から作製されていて、そのために、レンズの直径と同じ大きさの切開によってのみ、目に導入することができた。白内障手術における目の外傷を減らすために、手術の処理が実施される切開はできるだけ小さくすることが望ましい。フォールダブルレンズはアクリルまたはシリコーン製であり、それを丸め、とても小さいチューブ内に入れることができる。このチューブは、長さが3.2mm未満の非常に小さい切開を通して挿入される。一旦目に入ると、IOLは徐々に広がる。   Intraocular lenses can be divided into two main groups: non-foldable and foldable. The first intraocular lens was made from a hard plastic (non-foldable) material, so that it could only be introduced into the eye by an incision of the same size as the lens diameter. In order to reduce eye trauma in cataract surgery, it is desirable to make the incision in which the surgical procedure is performed as small as possible. The foldable lens is made of acrylic or silicone and can be rolled and placed in a very small tube. The tube is inserted through a very small incision that is less than 3.2 mm in length. Once in the eye, IOL gradually spreads.

白内障の手術が実施される前に、挿入されるIOLに対する適切な焦点調節力を求めるために、患者の目の角膜曲率と眼軸長が測定される。複雑な式を用いてレンズの処方矯正倍率を計算すると、IOLは厚い眼鏡の必要性に取って代わるだけでなく、それはまた、目に存在する屈折異常を矯正できる。   Before cataract surgery is performed, the corneal curvature and axial length of the patient's eyes are measured to determine the appropriate focus for the inserted IOL. Using a complex formula to calculate the prescription correction magnification of a lens, IOL not only replaces the need for thick glasses, but it can also correct refractive errors present in the eye.

様々な焦点距離の標準的なIOLが入手可能であるが、これらの距離はレンズにより決まっている。このため、目の天然の水晶体と違って、標準的なIOLは、焦点を変化させることができない。したがって、標準的なIOLに頼らざるを得ない患者は手術後に調節能力を失う。IOLは通常、適当な距離が見えるように選択される。しかし、遠くがよく見えると、近くがぼやけるかもしれず、患者は、白内障の手術の後、読書用眼鏡を使う必要があり得る。   Standard IOLs with various focal lengths are available, but these distances are determined by the lens. For this reason, unlike the natural lens of the eye, a standard IOL cannot change focus. Thus, patients who have to rely on standard IOLs lose their ability to adjust after surgery. The IOL is usually selected so that a suitable distance is visible. However, if the distance is visible, the vicinity may be blurred, and the patient may need to use reading glasses after cataract surgery.

この問題を改善するために、2焦点および多焦点IOLが開発された。それらは、読書用眼鏡の必要性を減らすか、あるいは不要にさえするが、これらのIOLは、コントラスト感度の低下と、光源の回りのハローの主観的経験とを生じる。   To remedy this problem, bifocal and multifocal IOLs were developed. They reduce or even eliminate the need for reading glasses, but these IOLs result in reduced contrast sensitivity and a subjective experience of halos around the light source.

このように、目の天然の水晶体に似た動きをするので、白内障の手術後に読書用眼鏡を不要にすることができる材料が求められている。このような材料は、目の中でその形状を変えることにより、その屈折力を変えることができなければならない。白内障の手術においてIOLとして使用されるだけでなく、このような材料はまた、老眼(加齢による目の調節力の生理的低下)を含めて、他の屈折異常を治療するためにも使用され得るであろう。   Thus, there is a need for a material that can make reading glasses unnecessary after cataract surgery because it moves like the natural lens of the eye. Such a material must be able to change its refractive power by changing its shape in the eye. In addition to being used as an IOL in cataract surgery, such materials are also used to treat other refractive errors, including presbyopia (physiological loss of eye accommodation with age). You will get.

注入可能な、in situで生成するゲルには、医療においていくつかの可能な使用法(例えば、眼内レンズに、代用硝子体として、および薬物デリバリデバイスとして)がある。一般に、in situで生成するゲルは、他のやり方で予め作製することは困難であろう様々な形状に合致しながら、低侵襲で、容易に送り込むことができで、元々あるかまたは可能なキャビティを満たすことができるという利点がある。ゲル化の機構は、物理的(温度変化、水素結合、疎水相互作用)または化学的(イオン結合もしくは共有結合の生成)であり得る。通常、物理的架橋は化学的架橋より不安定である。in situなゲル化は、ラジカル重合により共有結合した網目を生成し、熱、化学開始剤、または光子の吸収により開始され得る。しかし、ラジカル重合は定量的であることがまれであり、得られるゲルは通常、相当量の未反応モノマー、開始剤、および促進剤を含んでおり、これらの何れかあるいは全てに毒性があり、反応それ自体が非常に発熱的であり得る。目の用途では特に要求が厳しく、その要求には、室温に非常に近くて狭い反応温度範囲、光学的に透明な材料、非常に低い化学的毒性および光毒性、ならびに、湿潤で酸素が供給され、また光が豊富な環境における長期の安定性が含まれる。in situでゲルを生成させる本発明の目的には、新しい代用硝子体と注入可能な眼内レンズ材料を開発することがある。   Injectable, in situ generated gels have several possible uses in medicine (eg, in intraocular lenses, as vitreous substitutes, and as drug delivery devices). In general, gels generated in situ are cavities that are minimally invasive, can be easily delivered, are inherently or possible, while conforming to various shapes that would otherwise be difficult to make in advance. There is an advantage that can be satisfied. The mechanism of gelation can be physical (temperature change, hydrogen bonding, hydrophobic interaction) or chemical (ion bond or covalent bond formation). Usually, physical cross-linking is more unstable than chemical cross-linking. In situ gelation produces covalently bonded networks by radical polymerization and can be initiated by the absorption of heat, chemical initiators, or photons. However, radical polymerization is rarely quantitative, and the resulting gel usually contains significant amounts of unreacted monomers, initiators, and accelerators, any or all of which are toxic, The reaction itself can be very exothermic. Particularly demanding for eye applications, the requirement is very close to room temperature and a narrow reaction temperature range, optically transparent materials, very low chemical and phototoxicity, and wet and oxygenated , Also includes long-term stability in light-rich environments. An object of the present invention to generate gels in situ is to develop new surrogate vitreous and injectable intraocular lens materials.

視覚系、主に水晶体の屈折力が自動的に調節されて網膜上に集光させる動的な過程が、調節である。この能力は、通常、人生の30歳代までに大幅に低下し、水晶体の容積と弾性の進行性の変化により人生の60歳代までにほぼ完全に失われて、腕の長さより近い対象に焦点を合わせることができなくなる(老眼と呼ばれる状態)。嚢(capsular bag)の内容物を吸い出し、それを適当な容積の適切な材料で満たすことによってもまた、老眼患者の調節力が回復する可能性がある。小さな開口部を通して水晶体嚢を空にする手術手順の開発と、嚢内に再び満たされる適切な材料の同定が探求されている。このような材料は、調節力の回復、現在半硬質の代用水晶体に要求されるものより小さい角強膜切開、眼内レンズの生理学的位置付けの改善、および、2次的混濁速度の低下を含めて、いくつかの利点をもつことが好ましい。   Adjustment is a dynamic process in which the refractive power of the visual system, mainly the lens, is automatically adjusted and focused on the retina. This ability is usually drastically reduced by the 30s of life and is almost completely lost by the 60s of life due to progressive changes in lens volume and elasticity, to subjects closer to the length of the arm It becomes impossible to focus (a state called presbyopia). It is also possible to restore the presbyopic patient's accommodation by sucking out the contents of the capsule bag and filling it with the right volume of the right material. The development of a surgical procedure that empties the capsular bag through a small opening and the identification of a suitable material that fills the sac again is sought. Such materials include restoration of accommodation, smaller scleral incisions smaller than those currently required for semi-rigid substitute lenses, improved physiological positioning of intraocular lenses, and reduced secondary turbidity rates. And preferably have several advantages.

嚢内でゲルを生成する物理的および化学的架橋が探求されている。例えば、Kessler(Experiments in refilling the lens. Arch. Ophthalmol. 71:412-417, 1964)は、Carquilleの浸漬オイル、シリコーン流体、および、ダンマル(damar)ガムを用いて、物理的に架橋されたゲルをウサギの目に生成させた。Parel等は化学的架橋によるゲルの生成を普及させ(Phaco-Ersatz: Cataract surgery designed to preserve accommodation. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 224:165-173, 1986)、この場合、室温で数時間以内に通常硬化される、フィラーを含まないジビニルメチルシクロシロキサンのエラストマーが利用された。Nishi等(Accommodation amplitude after lens refilling with injectable silicone by sealing the capsule with a plug in primates. Arch. Ophthalmol. 116:1358-1361, 1998)は、架橋剤としてハイドロジェンポリシロキサンを含むポリメチルジシロキサンを用いた。他の研究者は、モノマーを含む混合物を注入し、in situで光重合してゲルを生成させる嚢内(endocapsular)重合を報告した。Jacqueline等(Injectable intraocular lens materials based upon hydrogels, Biomacromolecules 2:628-634, 2001)は、最近、アクリルアミド系光開始剤を用いる、アクリレート変性N-ビニルピロリドン/ビニルアルコールコポリマーの嚢内での光重合を報告し、いくつかの組成物の寸法が安定であり光学的に透明であることを確認した。しかし、未反応モノマーの毒性と重合反応の発熱的性質のためにこの系は実用的でない。さらに、上の全ての場合において、再充填材料の機械的性質は研究されなかった。これらの化学的に架橋されたゲルの何れも可逆的でないので、水晶体の回復の見込みは全くやった結果次第である。   Physical and chemical crosslinks that produce gels within the sac are sought. For example, Kessler (Experiments in refilling the lens. Arch. Ophthalmol. 71: 412-417, 1964) is a gel that is physically cross-linked using Carquille immersion oil, silicone fluid, and damar gum. Was produced in the eyes of rabbits. Parel et al. (Phaco-Ersatz: Cataract surgery designed to preserve accommodation.Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 224: 165-173, 1986), in this case for several hours at room temperature. A filler-free divinylmethylcyclosiloxane elastomer that is normally cured within was utilized. Nishi et al. (Accommodation amplitude after lens refilling with injectable silicone by sealing the capsule with a plug in primates.Arch. Ophthalmol. 116: 1358-1361, 1998) uses polymethyldisiloxane containing hydrogen polysiloxane as a crosslinking agent. It was. Other researchers have reported endocapsular polymerization in which a mixture containing monomers is injected and photopolymerized in situ to form a gel. Jacqueline et al. (Injectable intraocular lens materials based upon hydrogels, Biomacromolecules 2: 628-634, 2001) recently reported photopolymerization of acrylate-modified N-vinylpyrrolidone / vinyl alcohol copolymer in the sac using an acrylamide photoinitiator. It was confirmed that the dimensions of some compositions were stable and optically transparent. However, this system is not practical due to the toxicity of the unreacted monomer and the exothermic nature of the polymerization reaction. Furthermore, in all the above cases, the mechanical properties of the refill material were not studied. Since none of these chemically cross-linked gels are reversible, the chances of lens recovery are entirely up to the result.

以前の我々の仕事において、我々は、典型的なマクロモノマーとしてポリエチレングリコールアクリレートを合成し、特性を評価し、それを用いてゲル化が同時に起こる嚢内重合を実施した。重合の間の転化の度合いは、多くのフリーラジカル反応で通常そうであるように、約95%であった。残留モノマーの毒性の問題に対処するために、我々は、構造と毒性の関係を定量的に探求し、以下のことを確認した:1)一般に、アクリレートはメタクリレートより毒性が強かった;2)どちらの種類においても、疎水性モノマーは親水性モノマーより毒性が強かった;また3)毒性の作用は、恐らく、残留モノマーが脂質2重層を横切り、次に、マイケル付加反応により細胞内タンパク質およびDNAと反応し得ることによっていた。我々はまた、親水性ハイドロゲルを含むアクリレートまたはメタクリレートが、組織培養培地において加水分解に対して不安定であることも認めた。眼科学におけるポリマーの使用に関する我々の理解を深める新しい技術を、特に、それらが調節力と老眼に影響する場合に、確立し発展させることが我々の継続的な意図である。
米国特許出願第10/706081号 米国特許仮出願第499887号 米国特許仮出願第564592号 Kessler, Experiments in refilling the lens. Arch. Ophthalmol. 71:412-417, 1964 Parel et al., Phaco-Ersatz: Cataract surgery designed to preserve accommodation. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 224:165-173, 1986 Nishi et al., Accommodation amplitude after lens refilling with injectable silicone by sealing the capsule with a plug in primates. Arch. Ophthalmol. 116:1358-1361, 1998 Jacqueline et al., Injectable intraocular lens materials based upon hydrogels, Biomacromolecules 2:628-634, 2001 Gupta et al., Laser Raman spectroscopy of polyacrylamide. J. Polym. Sci., Polym. Phys. Edn. 19:353-360, 1981 Hisano et al., Entrapment of islets into reversible disulfide hydrogels. J Biomed Mater Res. 40:115-123, 1998 Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82:70-77 Mori et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:3712 In our previous work, we synthesized polyethylene glycol acrylate as a typical macromonomer, evaluated its properties, and used it to perform intracapsular polymerization with simultaneous gelation. The degree of conversion during the polymerization was about 95%, as is usually the case with many free radical reactions. To address the problem of residual monomer toxicity, we quantitatively explored the relationship between structure and toxicity and confirmed the following: 1) In general, acrylates were more toxic than methacrylates; 2) which Also, the hydrophobic monomer was more toxic than the hydrophilic monomer in this type; and 3) the toxic effect was probably due to residual monomer crossing the lipid bilayer, and then with intracellular protein and DNA by Michael addition reaction. By being able to react. We have also observed that acrylates or methacrylates containing hydrophilic hydrogels are unstable to hydrolysis in tissue culture media. It is our continuing intention to establish and develop new technologies that deepen our understanding of the use of polymers in ophthalmology, especially when they affect accommodation and presbyopia.
U.S. Patent Application No. 10/706081 US Provisional Patent Application No. 499887 U.S. Provisional Patent Application No. 556492 Kessler, Experiments in refilling the lens. Arch. Ophthalmol. 71: 412-417, 1964 Parel et al., Phaco-Ersatz: Cataract surgery designed to preserve accommodation.Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 224: 165-173, 1986 Nishi et al., Accommodation amplitude after lens refilling with injectable silicone by sealing the capsule with a plug in primates. Arch. Ophthalmol. 116: 1358-1361, 1998 Jacqueline et al., Injectable intraocular lens materials based upon hydrogels, Biomacromolecules 2: 628-634, 2001 Gupta et al., Laser Raman spectroscopy of polyacrylamide. J. Polym. Sci., Polym. Phys. Edn. 19: 353-360, 1981 Hisano et al., Entrapment of islets into reversible disulfide hydrogels. J Biomed Mater Res. 40: 115-123, 1998 Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82: 70-77 Mori et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125: 3712

しかし、材料のモジュラスを相当に変えることなしには、ハイドロゲルの屈折率を制御することは困難である。伝統的に、ハイドロゲルの屈折率は、異なるポリマー濃度を用いることによって変えられることが多い。しかし、これは、材料のモジュラスも変える結果になる。したがって、材料の屈折率とモジュラスをほとんど独立に制御できる代替物が依然として求められている。   However, it is difficult to control the refractive index of the hydrogel without significantly changing the modulus of the material. Traditionally, the refractive index of hydrogels is often changed by using different polymer concentrations. However, this also results in changing the modulus of the material. Therefore, there remains a need for alternatives that can control the refractive index and modulus of a material almost independently.

一実施形態において、本発明は、酸化/還元によって、あるいは、波長の異なる光の照射によって、あるいは、物理的ゲルの場合には剪断を加えることによって、ゾル-ゲル相の間で可逆的に変換される可逆ハイドロゲル系を提供する。ハイドロゲルを逆に変化させて溶液にすることができる;また、その溶液を、ハイドロゲルとなるように、適当なトリガーにより変換することができる。こうして、その系は、ハイドロゲルと溶液の間で可逆的に変換される。   In one embodiment, the present invention reversibly converts between sol-gel phases by oxidation / reduction, by irradiation with light of different wavelengths, or by applying shear in the case of physical gels. A reversible hydrogel system is provided. The hydrogel can be reversed to form a solution; the solution can also be converted by a suitable trigger to become a hydrogel. Thus, the system is reversibly converted between the hydrogel and the solution.

本発明の化学的に可逆なレドックスハイドロゲル系は、架橋剤と共にモノマーを重合することにより生成するコポリマーを含む。架橋剤は、コポリマー分子内にジスルフィド結合を提供して、ハイドロゲルを生成する。ハイドロゲルが還元されると、ジスルフィド結合は壊されて可溶性コポリマー溶液を生じる。他方、コポリマー溶液は酸化されて(酸素添加反応、ジスルフィド交換反応、あるいは、リボフラビンおよび酸素の存在の下での光酸化による)、ジスルフィド結合を生成してハイドロゲルを再び生成することができる。酸化は、約7.0から約7.4の生理的なpHで実施され得る。ゲルはまた、2+2光付加を受ける感光性の基、あるいは、チオールと光化学的に反応する(例えば、チオール-アクリルアミド反応)基を組み入れることによっても生成され得る。疎水性ハイドロゲルまたは会合性ハイドロゲルもまた、剪断力に対して、このような可逆性を示す、すなわち、それらは、剪断を受けた時は溶液のように、そして、剪断力がなくなるかまたは特定の降伏応力より小さくなると、ゲルとして振舞う。   The chemically reversible redox hydrogel system of the present invention includes a copolymer formed by polymerizing a monomer with a crosslinker. The crosslinker provides disulfide bonds within the copolymer molecule to form a hydrogel. When the hydrogel is reduced, the disulfide bonds are broken to yield a soluble copolymer solution. On the other hand, the copolymer solution can be oxidized (by oxygenation reaction, disulfide exchange reaction, or photooxidation in the presence of riboflavin and oxygen) to form disulfide bonds and regenerate hydrogel. Oxidation can be performed at a physiological pH of about 7.0 to about 7.4. Gels can also be generated by incorporating photosensitive groups that undergo 2 + 2 photoaddition or groups that photochemically react with thiols (eg, thiol-acrylamide reactions). Hydrophobic hydrogels or associative hydrogels also exhibit such reversibility to shear forces, i.e., they are like solutions when subjected to shear and are free of shear forces or When it becomes smaller than a specific yield stress, it behaves as a gel.

別の実施形態において、本発明は、ジスルフィド架橋を含むナノゲル(ハイドロゲルナノ粒子)の製造方法を提供する。好ましくは、ナノゲルは、酸化/還元によって、あるいは、異なる波長の光によって、ハイドロゲル状態と溶液との間で可逆的に変換される可逆ハイドロゲル系から製造される。ハイドロゲルは、還元されて溶液となり得る;また、この溶液は酸化されてハイドロゲルとなり得る。こうして、この系はハイドロゲルと溶液との間で可逆的に変換される。ナノゲルは、モノマーを架橋剤と共重合して架橋ハイドロゲルを生成させること;架橋したハイドロゲルを還元してコポリマー溶液とすること;コポリマー溶液を稀釈して稀釈コポリマー溶液とすること;そして次に、稀釈コポリマー溶液を酸化してナノゲルを生成させること;により製造される。チオール含有ナノゲルはまた、それに金属粒子(例えば、金)を組み入れることができる。さらに、ハイドロゲルを生成させるのに用いられる上の基本的考え方の全ては、最初にコポリマー溶液をその臨界濃度まで稀釈することにより、可能性として、ナノゲルを生成させるために用いられ得る。   In another embodiment, the present invention provides a method for producing a nanogel (hydrogel nanoparticle) comprising a disulfide bridge. Preferably, the nanogel is made from a reversible hydrogel system that is reversibly converted between the hydrogel state and the solution by oxidation / reduction or by light of different wavelengths. The hydrogel can be reduced to a solution; and the solution can be oxidized to a hydrogel. This system is thus reversibly converted between the hydrogel and the solution. Nanogels consist of copolymerizing monomers with a crosslinking agent to form a crosslinked hydrogel; reducing the crosslinked hydrogel to a copolymer solution; diluting the copolymer solution to a diluted copolymer solution; and then Oxidizing a diluted copolymer solution to produce a nanogel; Thiol-containing nanogels can also incorporate metal particles (eg, gold) therein. Furthermore, all of the above basic concepts used to produce hydrogels can potentially be used to produce nanogels by first diluting the copolymer solution to its critical concentration.

さらに別の実施形態において、本発明は、注入可能な、調節可能眼内レンズとして用いるためのハイドロゲルナノコンポジットを生成させるために、可逆ハイドロゲルとナノ粒子を一緒にする。本発明のナノコンポジットは、ポリマーハイドロゲル配合物に分散したナノ粒子を含み、材料の屈折率およびモジュラスが、2つの変数(すなわち、ハイドロゲル中のナノ粒子の濃度とコポリマー濃度)を用いて制御され得る。屈折率は、ナノ粒子の量を変えることにより制御され、モジュラスはハイドロゲル中のポリマー濃度を変えることにより制御され得る。ナノ粒子は、好ましくは、約150nm未満、最も好ましくは、約3〜20nmの粒径をもち、それが非散乱性でなければならないことが最も重要である。ナノ粒子が、可視光を分散または散乱させないこのような寸法のものであることが、極めて重要である。ナノ粒子の性質はそれ程重要でなく、それが水性媒体に分散性があり、可視光を散乱させず、またポリマー配合物と共に安定であり続ける限り、ナノゲル、タンパク質、シリカ、金、銀、TiO₂、遷移金属、セラミック、または、これらの組合せであり得る。 In yet another embodiment, the present invention combines a reversible hydrogel and nanoparticles to produce a hydrogel nanocomposite for use as an injectable, adjustable intraocular lens. The nanocomposites of the present invention comprise nanoparticles dispersed in a polymer hydrogel formulation, and the refractive index and modulus of the material are controlled using two variables (i.e., the concentration of nanoparticles in the hydrogel and the copolymer concentration). Can be done. The refractive index can be controlled by changing the amount of nanoparticles and the modulus can be controlled by changing the polymer concentration in the hydrogel. Most importantly, the nanoparticle preferably has a particle size of less than about 150 nm, most preferably about 3-20 nm, and it must be non-scattering. It is very important that the nanoparticles are of such dimensions that do not disperse or scatter visible light. The nature of the nanoparticle is not so important, as long as it is dispersible in aqueous media, does not scatter visible light, and remains stable with the polymer formulation, nanogel, protein, silica, gold, silver, TiO ₂ , Transition metals, ceramics, or combinations thereof.

I. 可逆ハイドロゲル系
本発明のハイドロゲル系は、1つの状態ではハイドロゲルであり、別の状態では溶液であるコポリマーを含む。このコポリマーは、好ましくは、モノマーと架橋剤とを共重合することにより得られる。架橋剤は分子間を架橋してハイドロゲルを生成する。モノマーは、アクリルアミド、N-オルニチンアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド、ヒドロキシ-エチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、N-ビニルピロリドン、N-フェニルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、アクリル酸、ベンジルメタクリルアミド、メチルチオエチルアクリルアミド、またはこれらの組合せであり得る。ジスルフィド基もしくは可逆性の架橋を組み入れるために変性もしくは誘導され得る、官能基をもつマクロモノマーあるいはポリマー(例えば、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリビニルアルコールなど)もまた本発明にとって適切であり得る。好ましいポリマー系は、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、コラーゲン、多糖のような半屈曲性もしくは剛直な水溶性ポリマー骨格をもつ。 I. Reversible Hydrogel System The hydrogel system of the present invention comprises a copolymer that is a hydrogel in one state and a solution in another state. This copolymer is preferably obtained by copolymerizing a monomer and a crosslinking agent. The cross-linking agent cross-links between molecules to form a hydrogel. Monomers are acrylamide, N-ornithine acrylamide, N- (2-hydroxypropyl) acrylamide, hydroxy-ethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, N-vinyl pyrrolidone, N-phenyl acrylamide, dimethylaminopropyl methacrylamide, acrylic acid, benzyl methacryl It can be an amide, methylthioethylacrylamide, or a combination thereof. Functionalized macromonomers or polymers (eg, polyethylene glycol acrylate, polyethylene glycol methacrylate, polyvinyl alcohol, etc.) that can be modified or derivatized to incorporate disulfide groups or reversible crosslinks may also be suitable for the present invention. Preferred polymer systems have a semi-flexible or rigid water-soluble polymer backbone such as polyacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, collagen, polysaccharides.

前記ポリマーは、好ましくは、水溶液中にある時に、ポリマー内で、または他のポリマーと共有結合を生成することが可能である架橋性の基(熱もしくは光化学に依存するマクロマーのゲル化の後、あるいはそれとは独立に、ポリマーを架橋させてゲルを生成させ得る)を含む。当技術分野において知られている化学的もしくはイオン性の架橋性の基は、マクロマーに備わっていてもよい。好ましい架橋性の基は、不飽和基(ビニル基、アリル基、シンナメート、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、アクリルアミドが含まれる)、あるいは、生物学的に許容される他の光重合性の基である。架橋剤は、好ましくは、ジスルフィドリンカー、例えば、N,N'-ビス(アクリロイル)シスタミン(BAC)である。他の有用な架橋剤には、これらに限定されないが、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、不飽和モノ-もしくはポリカルボン酸とポリオールとのエステル、例えばジアクリレートまたはトリアクリレート(例えば、ブタンジオールジアクリレート、ブタンジオールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、またトリメチロールプロパントリアクリレート)、アリル化合物(例えば、アリル(メタ)アクリレート、トリアリルシアヌレート、ジアリルマレアート、ポリアリルエステル、テトラアリルオキシエタン、トリアリルアミン、テトラアリルエチレンジアミン、ペンタエリスリトールトリアリルエステル、またはリン酸のアリルエステル)、ならびに、ビニル化合物(例えば、ビニルアクリレート、ジビニルアジペート、ジビニルベンゼン、およびビニルホスホン酸誘導体)が含まれる。分岐を生成するように、他の非可逆的リンカーをポリマーに含めてもよい。   The polymer is preferably a crosslinkable group capable of forming covalent bonds within the polymer or with other polymers when in aqueous solution (after macromer gelation depending on heat or photochemistry, Alternatively, the polymer may be crosslinked to form a gel). Chemical or ionic crosslinkable groups known in the art may be provided on the macromer. Preferred crosslinkable groups are unsaturated groups (including vinyl, allyl, cinnamate, acrylate, diacrylate, oligoacrylate, methacrylate, dimethacrylate, oligomethacrylate, acrylamide) or biologically acceptable Other photopolymerizable groups. The cross-linking agent is preferably a disulfide linker, such as N, N′-bis (acryloyl) cystamine (BAC). Other useful cross-linking agents include, but are not limited to, methylene bisacrylamide, methylene bismethacrylamide, esters of unsaturated mono- or polycarboxylic acids and polyols, such as diacrylates or triacrylates (e.g., butanediol diacids). Acrylate, butanediol dimethacrylate, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, or trimethylolpropane triacrylate), allyl compounds (e.g., allyl (meth) acrylate, triallyl cyanurate, diallyl maleate, polyallyl ester, tetra Allyloxyethane, triallylamine, tetraallylethylenediamine, pentaerythritol triallyl ester, or allyl ester of phosphoric acid), and vinyl compounds (For example, vinyl acrylate, divinyl adipate, divinyl benzene, and vinyl phosphonic acid derivatives). Other irreversible linkers may be included in the polymer to produce branching.

本発明に適する光化学的に可逆なリンカーには、これらに限定されないが、スチルベン、アゾ、およびシンナモイルの誘導体が含まれ得る。通常、光化学的に可逆なリンカーにより、コポリマーのゲル化は特定の波長で起こり、そのコポリマーの液状化は異なる波長で起こる。例えば、コポリマー溶液は、第1の波長に曝すことによりハイドロゲルを生成し、このハイドロゲルは、第2の波長に曝すことによりコポリマー溶液に戻る。   Photochemically reversible linkers suitable for the present invention can include, but are not limited to, stilbene, azo, and cinnamoyl derivatives. Usually, due to the photochemically reversible linker, gelation of the copolymer occurs at a specific wavelength and liquefaction of the copolymer occurs at a different wavelength. For example, the copolymer solution produces a hydrogel upon exposure to a first wavelength, and the hydrogel returns to the copolymer solution upon exposure to a second wavelength.

図1は、ハイドロゲルの生成、コポリマーの可溶化、および、ハイドロゲルの再生成について概略的に示している。モノマーとリンカー共重合により、架橋ハイドロゲルが生成する。この重合は、水溶性もしくはモノマー可溶性の開始剤またはレドックス開始剤の組合せにより開始される。水溶性開始剤の例は、ペルオキソ二硫酸のナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩、過酸化水素、tert-ブチルペルオキシド、tert-ブチルヒドロペルオキシド、ペルオキソ二リン酸カリウム、tert-ブチルペルオキシピバレート、クミルヒドロペルオキシド、イソプロピルベンジルモノヒドロペルオキシドおよびアゾビスイゾブチロニトリルである。モノマー可溶性開始剤の例は、ジアセチルペルオキシジカルボナート、ジシクロヘキシルペルオキシジカルボナートおよびジベンゾイルペルオキシドである。通常、開始剤は、モノマーの全重量に対して、0.01から0.5重量%の量で用いられる。(複数の)還元剤との組合せとして前記開始剤の組合せは、レドックス開始剤として使用され得る。適切な還元剤は、これらに限定されないが、アルカリ金属およびアンモニアの亜硫酸塩と亜硫酸水素塩(例えば、亜硫酸ナトリウム)、ホルムアルデヒドスルホキシル酸の亜鉛もしくはアルカリ金属塩のようなスルホキシル酸の誘導体(例えば、ナトリウムヒドロキシメタンスルホナート)、およびアスコルビン酸であり得る。好ましくは、還元剤の量は、モノマーの全重量に対して、0.01から0.5重量%である。   FIG. 1 schematically illustrates hydrogel formation, copolymer solubilization, and hydrogel regeneration. Monomer and linker copolymerization forms a crosslinked hydrogel. The polymerization is initiated by a combination of a water soluble or monomer soluble initiator or redox initiator. Examples of water-soluble initiators are sodium, potassium and ammonium salts of peroxodisulfate, hydrogen peroxide, tert-butyl peroxide, tert-butyl hydroperoxide, potassium peroxodiphosphate, tert-butyl peroxypivalate, cumyl hydro Peroxide, isopropylbenzyl monohydroperoxide and azobisisobutyronitrile. Examples of monomer soluble initiators are diacetyl peroxydicarbonate, dicyclohexyl peroxydicarbonate and dibenzoyl peroxide. Usually, the initiator is used in an amount of 0.01 to 0.5% by weight, based on the total weight of the monomers. The initiator combination as a combination with the reducing agent (s) can be used as a redox initiator. Suitable reducing agents include, but are not limited to, alkali metal and ammonia sulfites and bisulfites (e.g., sodium sulfite), zinc formaldehyde sulfoxylate or derivatives of sulfoxylic acid such as alkali metal salts (e.g., Sodium hydroxymethanesulfonate), and ascorbic acid. Preferably, the amount of reducing agent is 0.01 to 0.5% by weight, based on the total weight of monomers.

一旦コポリマーが生成されると、未反応モノマーと架橋剤を完全に除去するために洗浄することが好ましい。洗浄ステップは、ヒトに使用されると毒性があるモノマーでは特に好ましい。例えば、アクリルアミドは発癌物質であり神経毒であることが知られているが、そのポリマーであるポリアクリルアミドは無害である。このように、アクリルアミドの重合の後、未反応アクリルアミドがハイドロゲルから完全に洗浄されることが非常に望まれる。未反応モノマーと架橋剤の除去の後、水含量を望まれるものとするために、コポリマーは液体(好ましくは、水)によってさらに膨潤させられる。   Once the copolymer is formed, it is preferably washed to completely remove unreacted monomer and crosslinker. The washing step is particularly preferred for monomers that are toxic when used in humans. For example, acrylamide is known to be a carcinogen and neurotoxin, but its polymer, polyacrylamide, is harmless. Thus, it is highly desirable that unreacted acrylamide be thoroughly washed from the hydrogel after acrylamide polymerization. After removal of unreacted monomer and crosslinker, the copolymer is further swollen with a liquid (preferably water) to make the water content desired.

このハイドロゲルは、架橋の破壊により、液状化されて、コポリマーの溶液となり得る。ジスルフィド結合の場合には、液状化は、ハイドロゲルを化学的に還元して、ジスルフィド結合をチオールに還元することにより実施され得る。好ましくは、還元は、ジチオスレイトール(DTT)のような還元剤の存在の下で行われる。他の還元剤には、これらに限定されないが、2-メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、システイン、ブタンチオール、水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素、メルカプトエチルアミン、エチルマレイミド、およびトリ(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP・HCl)があり得る。還元剤は、架橋の性質に基づいて選択される。ジスルフィド結合では、DTTが好ましい還元剤である。一旦還元されると、ハイドロゲルは液状化し、コポリマー溶液となる。ジスルフィド結合をもつコポリマーの場合には、還元により、水溶性のチオール含有コポリマーが得られる。   This hydrogel can be liquefied by breaking of the cross-links into a copolymer solution. In the case of disulfide bonds, liquefaction can be performed by chemically reducing the hydrogel and reducing the disulfide bonds to thiols. Preferably, the reduction is performed in the presence of a reducing agent such as dithiothreitol (DTT). Other reducing agents include, but are not limited to, 2-mercaptoethanol, dithioerythritol, cysteine, butanethiol, sodium borohydride, cyanoborohydride, mercaptoethylamine, ethylmaleimide, and tri (2-carboxyethyl) There may be phosphine hydrochloride (TCEP.HCl). The reducing agent is selected based on the nature of the crosslinking. For disulfide bonds, DTT is the preferred reducing agent. Once reduced, the hydrogel liquefies and becomes a copolymer solution. In the case of a copolymer having a disulfide bond, a water-soluble thiol-containing copolymer is obtained by reduction.

コポリマー溶液は、望みに応じて、稀釈、濃縮および/または乾燥され得る。保管のために、好ましくは、コポリマーは、例えばメタノールによって溶液から析出させられ、濾過され、乾燥される。凍結乾燥を含めて、他の方法もまた適切である。保管されたコポリマーの固体は、後に、使用のために望みの濃度まで溶液に溶かされる。   The copolymer solution can be diluted, concentrated and / or dried as desired. For storage, the copolymer is preferably precipitated from the solution, for example with methanol, filtered and dried. Other methods are also suitable, including lyophilization. The stored copolymer solids are later dissolved in the solution to the desired concentration for use.

ハイドロゲルは、コポリマー分子内の架橋を再生成させることによってコポリマー溶液から再生成され得る。ジスルフィド結合の場合には、好ましくは酸化剤(好ましくは大気中の酸素)の存在の下でのコポリマー溶液の酸化により再ゲル化を実施することができる。大気中の酸素が好ましいが、他の酸化剤、例えば、ジチオジプロピオン酸(DTDP)、シスタミン、2-ヒドロキシエチルジスルフィド、過酸化水素、有機過酸、ペルオキシカルボナート、硫酸アンモニウムペルオキシド(ammonium sulfate peroxide)、ベンゾイルペルオキシド、過ホウ酸塩なども使用できる。しかし、さらに重要なことは、好ましい酸化剤がヒトおよび/または動物に対する如何なる重大な毒性ももつべきでないということである。   The hydrogel can be regenerated from the copolymer solution by regenerating crosslinks within the copolymer molecule. In the case of disulfide bonds, the regelation can be carried out by oxidation of the copolymer solution, preferably in the presence of an oxidant (preferably atmospheric oxygen). Atmospheric oxygen is preferred, but other oxidizing agents such as dithiodipropionic acid (DTDP), cystamine, 2-hydroxyethyl disulfide, hydrogen peroxide, organic peracids, peroxycarbonates, ammonium sulfate peroxide Benzoyl peroxide, perborate and the like can also be used. More importantly, however, preferred oxidants should not have any significant toxicity to humans and / or animals.

スチルベン、アゾ、シンナモイルの誘導体のような、光化学に依存するリンカーを用いたポリマーでは、再ゲル化は、コポリマー溶液を、適切な波長の光に曝すことによって実施される。こうして、可逆性の基の液状化は、通常はゲル化波長と異なる波長である、適切な波長の光にゲルを曝すことにより実施され得る。   For polymers with photochemically dependent linkers, such as derivatives of stilbene, azo, cinnamoyl, regelation is performed by exposing the copolymer solution to light of the appropriate wavelength. Thus, liquefaction of the reversible group can be carried out by exposing the gel to light of an appropriate wavelength, usually a wavelength different from the gelation wavelength.

光化学に依存するリンカーと酸化に依存するリンカーは排他的でないことを注意しておく。望みの結果を実現するために、両タイプのリンカーを同じポリマーに使用してもよい。例えば、両タイプのリンカーを含むポリマーは、酸化/還元を用いて調製され洗浄され得る。しかし、一旦レンズが形成されると、光化学に依存するリンカーもまた活性化されて、より永続的で安定なハイドロゲルとなり得る。この実施形態において、可逆リンカーを、非可逆リンカーと一緒に用いてもよい。例えば、そのポリマーは酸化/還元可逆リンカーと非可逆的な光化学に依存するリンカー(例えば、チオール-アクリルアミドおよび/またはチオール-アクリレート)を用いることができる。   Note that photochemically dependent and oxidation dependent linkers are not exclusive. Both types of linkers may be used on the same polymer to achieve the desired result. For example, polymers containing both types of linkers can be prepared and washed using oxidation / reduction. However, once the lens is formed, photochemically dependent linkers can also be activated, resulting in a more permanent and stable hydrogel. In this embodiment, a reversible linker may be used with an irreversible linker. For example, the polymer can use an oxidation / reduction reversible linker and a linker that relies on irreversible photochemistry (eg, thiol-acrylamide and / or thiol-acrylate).

II. ナノゲル
上のハイドロゲルは、ナノゲル(その粒径はコポリマーの分子量に依存する)の製造にも使用され得る。本発明の方法は、直径が150nm未満、好ましくは約3〜20nmで、屈折率が天然の水晶体のそれに似たナノゲルの製造技術を教示する。上のセクションIにおける可逆ハイドロゲルの調製に含まれる化学はナノゲルの製造に適している。ナノゲルは、モノマーを架橋剤と共重合して架橋ハイドロゲルを生成させること;架橋ハイドロゲルを還元または照射して、コポリマー溶液を生成させること:コポリマー溶液を稀釈して稀釈コポリマー溶液とすること;および、稀釈コポリマー溶液を酸化してナノゲルとすること;によって製造される。このように、ナノゲルを製造する方法は、ナノゲルが希薄コポリマー溶液から生成すること以外は、可逆ハイドロゲルのそれと実質的に同じである。希薄により、コポリマー溶液の濃度が、1パーセント(w/v)未満、好ましくは、0.5パーセント(w/v)未満、最も好ましくは、0.01パーセント(w/v)未満であることを意味する。このように、コポリマーの濃度が希薄である時に、コポリマー溶液の酸化および/または照射によってナノゲルは生成し、コポリマー濃度が濃厚である時には、コポリマー溶液の酸化および/または照射によってハイドロゲルが生成する。希薄コポリマー溶液により、分子間相互作用が極めて少なくなるので、架橋は分子内で形成され、このために、ナノゲルが生成する。他方、コポリマー溶液がより濃厚であると、分子間架橋が支配的になってハイドロゲルが生成する。 II. Hydrogels on nanogels can also be used to make nanogels whose particle size depends on the molecular weight of the copolymer. The method of the present invention teaches the production of nanogels having a diameter of less than 150 nm, preferably about 3-20 nm and a refractive index similar to that of a natural lens. The chemistry involved in the preparation of the reversible hydrogel in Section I above is suitable for the production of nanogels. Nanogels are the copolymerization of monomers with a crosslinking agent to form a crosslinked hydrogel; reducing or irradiating the crosslinked hydrogel to form a copolymer solution: diluting the copolymer solution into a diluted copolymer solution; And oxidizing the diluted copolymer solution into a nanogel. Thus, the method of producing the nanogel is substantially the same as that of the reversible hydrogel, except that the nanogel is produced from a dilute copolymer solution. By diluting is meant that the concentration of the copolymer solution is less than 1 percent (w / v), preferably less than 0.5 percent (w / v), and most preferably less than 0.01 percent (w / v). Thus, when the copolymer concentration is dilute, the nanogel is produced by oxidation and / or irradiation of the copolymer solution, and when the copolymer concentration is dense, the hydrogel is produced by oxidation and / or irradiation of the copolymer solution. Because dilute copolymer solutions result in very little intermolecular interactions, crosslinks are formed within the molecule, thus producing a nanogel. On the other hand, if the copolymer solution is thicker, intermolecular crosslinking becomes dominant and a hydrogel is formed.

本発明の一実施形態において、チオール含有ナノゲル粒子は、金属粒子(例えば、金)もまた包み込むことができる。この場合、金属粒子は、それらのチオール基に向かう傾向によって、自発的に作用する。金属なしで、溶液は酸化または照射されて、分子内架橋をしてナノゲルを生成する。しかし、ナノゲル生成の間に、金属粒子がナノゲル内に捕捉される。金属粒子の濃度が十分に低ければ、1個のナノゲル粒子に1個の金属粒子を結び付けることが可能である。金属によっては、架橋は、金属粒子とナノゲルとの間でもまた起こり得る。例えば、金は、酸化に際してコポリマーの-SH基と架橋し得る。   In one embodiment of the invention, the thiol-containing nanogel particles can also encapsulate metal particles (eg, gold). In this case, the metal particles act spontaneously by their tendency towards their thiol groups. Without metal, the solution is oxidized or irradiated to intramolecular crosslinks to form nanogels. However, during nanogel production, metal particles are trapped within the nanogel. If the concentration of metal particles is sufficiently low, it is possible to bind one metal particle to one nanogel particle. Depending on the metal, crosslinking can also occur between the metal particles and the nanogel. For example, gold can crosslink with -SH groups of the copolymer upon oxidation.

III. ハイドロゲルナノコンポジット
これらのハイドロゲル材料は、天然の水晶体のそれに似たモジュラスを示すが、ハイドロゲルの屈折率は通常、天然の水晶体材料の屈折率より小さい。通常、屈折率はポリマー濃度に比例して増えるが、モジュラスは指数関数的に増加する。こうして、典型的なハイドロゲルでは、屈折率が高く、モジュラスが小さい材料を得ることはほとんど不可能である。出願人は、ハイドロゲルとナノ粒子のナノコンポジットが、天然の水晶体に似た高屈折率(RI)と低モジュラスを実現し得ることを見出した。ナノコンポジット系はまた、好ましくは、約1秒以内、より好ましくは約50〜250ミリ秒以内で、天然の水晶体に似た調節特性も示す。 III. Hydrogel nanocomposites These hydrogel materials exhibit a modulus similar to that of natural lens, but the refractive index of hydrogel is usually less than that of natural lens material. Usually, the refractive index increases in proportion to the polymer concentration, but the modulus increases exponentially. Thus, it is almost impossible to obtain a material with a high refractive index and a low modulus with a typical hydrogel. Applicants have found that nanocomposites of hydrogels and nanoparticles can achieve a high refractive index (RI) and low modulus similar to natural lenses. The nanocomposite system also exhibits accommodation properties similar to natural lenses, preferably within about 1 second, more preferably within about 50-250 milliseconds.

本発明のハイドロゲルナノコンポジットは、可逆ハイドロゲルマトリックスに分散したナノ粒子を含み、2つの変数(すなわち、ハイドロゲル中のナノ粒子の濃度と、ハイドロゲル中のコポリマー濃度)を変えることによって、材料の屈折率とモジュラスを制御できるという点に利点がある。RIは、ハイドロゲル中のナノ粒子の濃度を変えることにより制御され、モジュラスは、ハイドロゲル中のポリマー濃度を変えることにより制御され得る。これは、相互作用しないナノ粒子の場合において、特に正しい。しかし、ナノ粒子がコポリマー骨格と作用する場合には、架橋密度と粒径に応じて、モジュラスがナノ粒子(またはRI)と共に増加する系を得ることもある。   The hydrogel nanocomposite of the present invention comprises nanoparticles dispersed in a reversible hydrogel matrix, and by changing two variables (ie, the concentration of nanoparticles in the hydrogel and the concentration of copolymer in the hydrogel) There is an advantage in that the refractive index and the modulus can be controlled. RI can be controlled by changing the concentration of nanoparticles in the hydrogel, and the modulus can be controlled by changing the polymer concentration in the hydrogel. This is particularly true in the case of nanoparticles that do not interact. However, if the nanoparticles interact with the copolymer backbone, a system may be obtained in which the modulus increases with the nanoparticles (or RI) depending on the crosslink density and particle size.

ナノ粒子は、好ましくは、約150nm未満、最も好ましくは、約3〜20nmの粒径をもつ。ナノ粒子が、可視光を分散または散乱させない、このような大きさのものであることは非常に重要である。ナノ粒子は、それが水性媒体に分散し、ポリマー配合物と共に安定であり続け、また、好ましくは、ポリマー骨格と作用しない限り、これらに限定されないが、ポリマーナノゲル(上のセクションII参照)、タンパク質、シリカ、金属(例えば、金、銀、および遷移金属)、TiO₂、セラミック、あるいは、これらの組合せであり得る。 The nanoparticles preferably have a particle size of less than about 150 nm, most preferably about 3-20 nm. It is very important that the nanoparticles are of such a size that does not disperse or scatter visible light. Nanoparticles are preferably, but not limited to, polymer nanogels (see Section II above), proteins, as long as they are dispersed in an aqueous medium and remain stable with the polymer formulation, and preferably do not interact with the polymer backbone. , Silica, metal (eg, gold, silver, and transition metals), TiO ₂ , ceramic, or combinations thereof.

セクションIにおいてすでに記載された可逆ハイドロゲルは、ナノコンポジットの好ましいマトリックスとなる。しかし、他のハイドロゲルもまた本発明にとって適切である。   The reversible hydrogel already described in Section I is a preferred matrix for the nanocomposite. However, other hydrogels are also suitable for the present invention.

ナノコンポジットを製造するために、ナノ粒子は液状化されたコポリマー溶液に添加され、均一な分散体になるように撹拌される。次に、この分散体は、酸化および/または照射されて、本発明のナノコンポジットを生成する。   To produce the nanocomposite, the nanoparticles are added to the liquefied copolymer solution and stirred to form a uniform dispersion. This dispersion is then oxidized and / or irradiated to produce the nanocomposite of the present invention.

ナノゲルがナノ粒子として使用される場合、ナノゲルおよび可逆ハイドロゲルが異なる架橋性の基を含んでいることが好ましい。例えば、ハイドロゲルが酸化/還元のリンカーを用いる場合、ナノゲルは光化学に依存するリンカーを用いること、およびこの逆が好ましい。より好ましくは、ナノゲルは、安定性と性能をより向上させるために、酸化/還元および光化学依存性の両方の架橋基を含む。   When nanogels are used as nanoparticles, it is preferred that the nanogel and the reversible hydrogel contain different crosslinkable groups. For example, if the hydrogel uses an oxidation / reduction linker, the nanogel preferably uses a photochemically dependent linker and vice versa. More preferably, the nanogel comprises both oxidation / reduction and photochemical dependent crosslinking groups to further improve stability and performance.

好ましい一実施形態において、ナノ粒子は、ハイドロゲルマトリックスとナノ粒子との間の架橋が最少化されるように選択されるべきである。この場合、マトリックスとナノ粒子との間に架橋が全くないと、ナノコンポジットのRIおよびモジュラスを実質的に独立に制御することができる。具体的には、RIは、ハイドロゲル中のナノ粒子の濃度を調節することにより制御され、モジュラスは、ハイドロゲル中のコポリマー濃度を調節することにより制御され得る。ハイドロゲルマトリックスとナノ粒子との間の相互作用および/または架橋のレベルが大きくなるほど、ナノコンポジットのRIおよびモジュラスを独立に制御できる可能性はより小さくなる。   In a preferred embodiment, the nanoparticles should be selected so that cross-linking between the hydrogel matrix and the nanoparticles is minimized. In this case, if there is no cross-linking between the matrix and the nanoparticles, the RI and modulus of the nanocomposite can be controlled substantially independently. Specifically, RI can be controlled by adjusting the concentration of nanoparticles in the hydrogel, and the modulus can be controlled by adjusting the copolymer concentration in the hydrogel. The greater the level of interaction and / or crosslinking between the hydrogel matrix and the nanoparticles, the less likely it is that the RI and modulus of the nanocomposite can be independently controlled.

代用水晶体とするためには、ナノコンポジットは、約1.40から1.41のRIと、約1,000から1,500パスカルのモジュラスを実現すべきである。   To be a surrogate lens, the nanocomposite should achieve an RI of about 1.40 to 1.41 and a modulus of about 1,000 to 1,500 Pascals.

これ以上説明しなくても、当業者は、先の説明と以下の例示を用いて、本発明の合成物を製造し利用し、特許請求される方法を実施することができると思われる。以下の例は、本発明を例示するために与えられている。本発明は、この例に記載されている具体的な条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。   Without further explanation, one of ordinary skill in the art, using the preceding description and the following examples, will be able to make and utilize the composites of the present invention and implement the claimed methods. The following examples are given to illustrate the present invention. It should be understood that the invention is not limited to the specific conditions or details described in this example.

(実施例1)
アクリルアミド/BACのハイドロゲル
実験方法
ポリアクリルアミド/BACのハイドロゲルの合成
25%エタノール(25:75=エタノール:水 v/v)中、5%(w/w)で、様々な組成のハイドロゲルを、アクリルアミド(Aam)とBACとを、98/2、96/4、および94/6のアクリルモル比で反応させることにより合成した。重合開始の前に、約30分間溶液を通して窒素のバブリングを行い、溶存酸素を全て追い出した。反応を、2.1%(w/w)のTEMEDおよび0.4%(w/w)のAPSを加えることにより開始し、25℃で15時間続けた。水へのBACの限られた溶解性のために、水性エタノールを溶剤として用いた。得られたゲルをビーカーから取り出し、500mLの水の中で2日間膨潤させ、小さく砕いて、蒸留水で洗った。上のコポリマー組成物からのゲルを、それらがそれぞれ、2、4、および6アクリルモル%のBACを組み入れることによってジスルフィド(-SS-)結合を含んでいることを示して、ABSS2、ABSS4、およびABSS6と名づけた。 (Example 1)
Acrylamide / BAC Hydrogel Experimental Method Synthesis of Polyacrylamide / BAC Hydrogel
In 25% ethanol (25:75 = ethanol: water v / v), 5% (w / w) hydrogels of various compositions, acrylamide (Aam) and BAC, 98/2, 96/4 , And 94/6 acrylic molar ratio. Prior to the start of polymerization, nitrogen was bubbled through the solution for about 30 minutes to expel any dissolved oxygen. The reaction was started by adding 2.1% (w / w) TEMED and 0.4% (w / w) APS and continued for 15 hours at 25 ° C. Aqueous ethanol was used as the solvent due to the limited solubility of BAC in water. The resulting gel was removed from the beaker, swollen in 500 mL of water for 2 days, crushed into small pieces, and washed with distilled water. Gels from the above copolymer composition show that they contain disulfide (-SS-) bonds by incorporating 2, 4, and 6 acryl mol% BAC, respectively, ABSS2, ABSS4, and Named ABSS6.

モノマーを含まない膨潤ハイドロゲルの還元液状化
ゲルを小さく砕き、pH7.0で、10モル/(1モルのBAC)でDTTを加えることにより液状化させた。撹拌しながら、溶液を通して窒素のバブリングを行いながら、ABSS2、ABSS4、およびABSS6に対してそれぞれ、2、4、および6時間還元を行った。ゲルを完全に溶解させた後、10%(V/V)のHClを用いて溶液をpH3まで酸性にし、激しく撹拌しながら過剰のメタノール中に析出させた。析出した-SHポリマーを濾過し、真空の下で乾燥し、必要とするまで減圧下に保管した。ABSS2、ABSS4、およびABSS6からの上の可溶性ポリマーを、それらがジスルフィド結合の代わりに-SH基を今度は含んでいることを示して、それぞれ、ABSH2、ABSH4、およびABSH6と名づけた。 Reduced liquefaction of swollen hydrogel containing no monomer The gel was crushed into small pieces and liquefied by adding DTT at 10 mol / (1 mol of BAC) at pH 7.0. Reductions were performed on ABSS2, ABSS4, and ABSS6 for 2, 4, and 6 hours, respectively, with nitrogen bubbling through the solution while stirring. After complete dissolution of the gel, the solution was acidified to pH 3 using 10% (V / V) HCl and precipitated into excess methanol with vigorous stirring. The precipitated -SH polymer was filtered, dried under vacuum and stored under reduced pressure until needed. The soluble polymers above from ABSS2, ABSS4, and ABSS6 were named ABSH2, ABSH4, and ABSH6, respectively, indicating that they now contain -SH groups instead of disulfide bonds.

可溶性コポリマーの特性評価
各コポリマーのチオール(-SH)含量を、Ellman試薬を用いて求めた。簡単に言えば、50μLの0.5%(w/v)コポリマー溶液(pH4、窒素バブリングを行った)を、50μLの0.01MのEllman試薬(0.1Mリン酸緩衝液中、pH8.0)、500μLの0.1Mのリン酸緩衝液(pH8)、および450μLの蒸留水の混合物に加えた。得られた溶液の412nmでの吸光度(Beckman DU54分光光度計を用いた)を、混合後5分で求めた。各ABSHポリマー中の-SHの濃度を、13,600M^-1cm^-1のモル吸光係数を用いて計算した。 Characterization of soluble copolymers The thiol (-SH) content of each copolymer was determined using the Ellman reagent. Briefly, 50 μL of 0.5% (w / v) copolymer solution (pH 4, nitrogen bubbling) was added to 50 μL of 0.01 M Ellman reagent (0.1 M phosphate buffer, pH 8.0), 500 μL. It was added to a mixture of 0.1 M phosphate buffer (pH 8) and 450 μL distilled water. The absorbance of the resulting solution at 412 nm (using a Beckman DU54 spectrophotometer) was determined 5 minutes after mixing. The concentration of -SH in each ABSH polymer was calculated using a molar extinction coefficient of 13,600 M ^-1 cm ^-1 .

還元後のポリマーの分子量を、粘度検出器とタンデム式に連結した静的光散乱および屈折率検出器を装備したViscotek HPLC-GPCシステム(ヒューストン、テキサス州)を用いて求めた。固定相は、直列に連結されたG6000PWXLおよびG4000PWXI(Tosoh Biosep、Montgomeryville、ペンシルバニア州)の2つのカラムからなっており、移動相は20mMのBis-Tris緩衝液(pH6.0、0.1%のアジ化ナトリウム)であった。試料を0.5%(w/v)の濃度で、水(pH4、N₂で飽和させた)で調製した。分子量(Mw)1000から950,000までのポリエチレングリコール標準(Viscotek、ヒューストン、テキサス州)を用いて較正した。 The molecular weight of the polymer after reduction was determined using a Viscotek HPLC-GPC system (Houston, TX) equipped with a static light scattering and refractive index detector coupled in tandem with a viscosity detector. The stationary phase consists of two columns of G6000PWXL and G4000PWXI (Tosoh Biosep, Montgomeryville, PA) connected in series, and the mobile phase is 20 mM Bis-Tris buffer (pH 6.0, 0.1% azide). Sodium). Samples were prepared with water (pH 4, saturated with N ₂ ) at a concentration of 0.5% (w / v). Calibrated using polyethylene glycol standards (Viscotek, Houston, TX) with a molecular weight (Mw) of 1000 to 950,000.

可溶性ポリマー中のチオール基の存在と、再ゲル化に際してのそれらの消失を、ラマン分光法(Kaiser Holoprobe Series 5000ラマン分光光度計、514nmのアルゴンレーザ波長で運転)により調べた。バイアル中のポリマー試料水溶液に直接レーザ光線を照射し、2cm^-1の分解能でスペクトルを得た。市販の移動台上で特注の試料ホールダを用いて、レーザの焦点に対する試料の位置の再現性を確保した。スペクトルを、GRAMS/32ソフトウェアパッケージ(Galactic Industries Corporation、Salem、ニューハンプシャー州)を用いて解析した。 The presence of thiol groups in the soluble polymer and their disappearance upon regelation was investigated by Raman spectroscopy (Kaiser Holoprobe Series 5000 Raman spectrophotometer, operated at an argon laser wavelength of 514 nm). The aqueous polymer sample solution in the vial was directly irradiated with a laser beam, and a spectrum was obtained with a resolution of 2 cm ⁻¹ . Using a custom sample holder on a commercially available platform, reproducibility of the sample position relative to the laser focus was ensured. Spectra were analyzed using the GRAMS / 32 software package (Galactic Industries Corporation, Salem, NH).

コポリマー溶液の再ゲル化を、DTDPを用いて実施し(詳細は下に記載)、その後、ゲルを2日間膨潤させた。膨潤したゲルを、水で数回洗浄した後、ラマンの実験に用いて、-SH基のピークの消失と、ジスルフィド(-S-S-)結合の生成に対応するピークの出現を観察した。   Regelation of the copolymer solution was performed using DTDP (details are given below), after which the gel was allowed to swell for 2 days. After the swollen gel was washed several times with water, it was used in a Raman experiment to observe the disappearance of the -SH group peak and the appearance of a peak corresponding to the formation of a disulfide (-S-S-) bond.

コポリマー水溶液の再ゲル化
窒素で飽和させたpH4の水中の、3つの異なる濃度(% w/v)のポリマー溶液を、還元後のポリマーの各々から調製した:ABSH2から、10.0、12.5、および15.0%;ABSH4から、5.0、7.5、および10.0%;ABSH6から、2.0、3.0、4.0%。ポリマー溶液(それぞれ1mL)を試験管に入れ、溶液のpHを、10MのNaOHの計算量を用いて約7.4に調節し、その後、必要量のDTDP(0.5M、pH7)を加え、激しく撹拌した。各ABSHポリマー溶液の-SH含量に基づいて、等モル量のDTDPを加えた。試験管を傾けることによりゲル化を目で観察した。注入の容易さと、嚢内でのゲルの均一性を評価するために、天然のブタの水晶体を模倣した特殊な注入枠(mold)を用いた。 Regelation of aqueous copolymer solution Three different concentrations (% w / v) of polymer solution in pH 4 water saturated with nitrogen were prepared from each of the polymers after reduction: 10.0, 12.5, and 15.0 from ABSH2. %; From ABSH4, 5.0, 7.5, and 10.0%; from ABSH6, 2.0, 3.0, 4.0%. Polymer solutions (1 mL each) were placed in a test tube and the pH of the solution was adjusted to approximately 7.4 using a calculated amount of 10 M NaOH, after which the required amount of DTDP (0.5 M, pH 7) was added and stirred vigorously. . Based on the -SH content of each ABSH polymer solution, an equimolar amount of DTDP was added. Gelation was visually observed by tilting the test tube. To evaluate the ease of injection and the uniformity of the gel within the sac, a special mold that mimics the natural porcine lens was used.

円柱形のゲルの調製を、テフロン(登録商標)枠を用いて行った。再ゲル化試料(円柱または薄い円盤としての)の静的モジュラスを、動的粘弾性分析装置(Perkin Elmer DMA7e、Norwalk、米国)を用いて応力/歪みの実験から求め、分析をDTDP添加後1時間ほどで完了した。静的応力スキャンを、25℃で5mN/分の速度で、0から25mNまで実施した。コポリマーハイドロゲルの調製およびそれらの還元と、水溶性コポリマーからの再ゲル化を図2に概略的に示す。   A cylindrical gel was prepared using a Teflon (registered trademark) frame. The static modulus of the regelled sample (as a cylinder or thin disk) was determined from stress / strain experiments using a dynamic viscoelastic analyzer (Perkin Elmer DMA7e, Norwalk, USA) and the analysis was performed after addition of DTDP. Completed in about an hour. Static stress scans were performed from 0 to 25 mN at a rate of 5 mN / min at 25 ° C. The preparation of copolymer hydrogels and their reduction and regelation from water-soluble copolymers is schematically illustrated in FIG.

嚢内ゲル化
ABSH2から10.0および12.5%;ABSH4から5.0および7.5%;さらに、ABSH6から2.0%;のコポリマー溶液(% w/v)をそれぞれ、嚢内ゲル化について評価した。新しく摘出したブタの目を、地元の畜殺場から屠殺の後すぐに購入した。通常、それぞれの目をスタイロフォーム板上で安定化させ、角膜と虹彩を除去した。Ellman Surgitron用具(Edmonton、ニュージャージー州)を用いて、前嚢上の赤道近くで1.0から1.2mmの直径の嚢切開を実施した。次に、Storz Phacoemulsification超音波装置(Premiere型、Bausch and Lomb、セントルイス、ミズーリ州)を用いて嚢を空にした。DTDPを注入直前にコポリマー溶液に加えてよく混合した。典型的な事例では、800μLの5%(w/v)ABSH4溶液(10MのNaOHを用いてpH7.4に調節した)を、試験管に入れ、43μLのDTDP(0.5M、pH7.0)を加え、10秒間ボルテックススターラで十分に混合し、外径1.0mmの注射針(その先端はプラスチック製の円錐形微小先端部に取り付けられていた)の付いた注射器に吸い上げた。注意深く、素早くコポリマーを嚢内の底に注入し、こうして、泡なしに嚢を満たし、その後の2から3分の間、閉じたまま保った。ゲル化は、通常、3分以内に起こった。ハイドロゲルの注入と再ゲル化の手術方法を図3に概略的に示す。 Intracapsular gelation
Copolymer solutions (% w / v) of ABSH2 to 10.0 and 12.5%; ABSH4 to 5.0 and 7.5%; and ABSH6 to 2.0%; were evaluated for intracapsular gelation, respectively. Newly extracted pig eyes were purchased from a local slaughterhouse immediately after slaughter. Usually, each eye was stabilized on a styrofoam plate to remove the cornea and iris. A 1.0-1.2 mm diameter capsulotomy was performed near the equator on the anterior capsule using an Ellman Surgitron tool (Edmonton, NJ). The sac was then emptied using a Storz Phacoemulsification ultrasound device (Premiere type, Bausch and Lomb, St. Louis, Missouri). DTDP was added to the copolymer solution just before injection and mixed well. In a typical case, 800 μL of 5% (w / v) ABSH4 solution (adjusted to pH 7.4 using 10 M NaOH) is placed in a test tube and 43 μL of DTDP (0.5 M, pH 7.0) is added. In addition, the mixture was thoroughly mixed with a vortex stirrer for 10 seconds, and sucked into a syringe with an injection needle having an outer diameter of 1.0 mm (the tip of which was attached to a plastic conical micro tip). Carefully, the copolymer was quickly poured into the bottom of the sac, thus filling the sac without foam and keeping it closed for the next 2-3 minutes. Gelation usually occurred within 3 minutes. The operation method of hydrogel injection and regelation is schematically shown in FIG.

結果
ポリ(AAm-co-BAC)ハイドロゲルの合成
様々な組成の異なる3種のハイドロゲルを、アクリルアミドに対して、2、4、および6アクリルモル%のBACで、アクリルアミドとBACから調製した。予想したように、BACを増加させると構造の一体性がより良好なゲルとなった。より多量のBACを含むゲルでは、僅かであるが透明性がより低かった。ABSS2は安定なゲルを生成しなかったが、粘度の高い溶液であった。しかしながら、より高濃度では安定なゲルとなった(>15%)。 Results Synthesis of poly (AAm-co-BAC) hydrogels Three hydrogels with different compositions were prepared from acrylamide and BAC at 2, 4, and 6 acrylmol% BAC relative to acrylamide. As expected, increasing BAC resulted in a gel with better structural integrity. The gel with higher amounts of BAC was slightly less transparent. ABSS2 did not produce a stable gel but was a highly viscous solution. However, higher concentrations resulted in stable gels (> 15%).

ABSHコポリマーの合成と特性評価
水溶性コポリマー(ABSH)を架橋ゲル(ABSH)から得る鍵となるステップは、図2に示すように、ジスルフィド結合(-S-S-)のチオール(-SH)基への完全な還元を含んでいた。DTTによるゲルの還元により、ほぼ完全にジスルフィド結合は還元された(表1の-SH含量の値に示したように)。溶液を通して窒素のバブリングを行うと、ゲルの溶解がかなり加速された。水溶性コポリマー(ABSH)の-SH含量は、表1に示したように、共重合に使用されたBAC濃度に比例している。 Synthesis and Characterization of ABSH Copolymers A key step in obtaining water-soluble copolymers (ABSH) from cross-linked gels (ABSH) is the disulfide bond (-SS-) to thiol (-SH) groups, as shown in Figure 2. A complete reduction was included. Reduction of the gel with DTT almost completely reduced the disulfide bonds (as indicated by the -SH content values in Table 1). Nitrogen bubbling through the solution significantly accelerated gel dissolution. As shown in Table 1, the -SH content of the water-soluble copolymer (ABSH) is proportional to the BAC concentration used for the copolymerization.

図3は、HPLC-GPCの3種の検出器により観察されたABSHコポリマーのGPC曲線を示している。図3の曲線aに示すように、共重合におけるBAC含量の増加につれて分子量が増加し、分子量分布が広くなっている。ABSHポリマーの重量平均分子量(Mw)の結果を表1に示す。   FIG. 3 shows the GPC curve of the ABSH copolymer observed by three detectors of HPLC-GPC. As shown by curve a in FIG. 3, the molecular weight increases and the molecular weight distribution becomes wider as the BAC content in the copolymerization increases. The results of the weight average molecular weight (Mw) of the ABSH polymer are shown in Table 1.

チオールと、再ゲル化に際してのその消失(同時にジスルフィド(-S-S-)結合の生成を伴う)を、ラマン分光法により確認した。ABSH6(4w/v%水溶液)と、それに対応する再生成させたゲルであるRABSS6(この「R」は、ABSH6から再生成させたゲルを示す)のラマンスペクトルを図4に示す。2580cm^-1の特性吸収は、-SH伸縮振動(ν_SH)に対応し、図4の曲線bに認められ、これはゲル化により完全に消失した。-S-S-伸縮(ν_s-s)に対応する吸収は、それが他の振動と重ならなければ、通常、約510cm^-1に現れる。ポリマーは大部分ポリアクリルアミドであるので、図4の曲線cに認められるように、485cm^-1に中心があるポリアクリルアミドの広い非対称-C-C-骨格変角ピークからの干渉のために、ν_s-sをν_s-sで明瞭に認めるのは困難である。この問題を、RABSS6のスペクトルからポリアクリルアミドのスペクトル(図4の曲線a、BACなしで、同じ手順を用いて調製した)を引くことにより解決した。図2の挿入図に示すように、505cm^-1の肩ピークとして、ν_s-sを明瞭に認めた。 The thiol and its disappearance upon regelation (simultaneously accompanied by the formation of disulfide (-SS-) bonds) were confirmed by Raman spectroscopy. FIG. 4 shows the Raman spectrum of ABSH6 (4 w / v% aqueous solution) and the corresponding regenerated gel RABSS6 (where “R” indicates a gel regenerated from ABSH6). The characteristic absorption at 2580 cm ⁻¹ corresponds to —SH stretching vibration (ν _SH ) and is observed in the curve b in FIG. 4, which disappeared completely by gelation. Absorption corresponding to -SS ^- stretching (ν _ss ) usually appears at about 510 cm ^-1 unless it overlaps with other vibrations. Because the polymer is mostly polyacrylamide, as can be seen in curve c in FIG. 4, ν _ss is reduced due to interference from the wide asymmetry of the polyacrylamide centered at 485 cm ⁻¹ -CC-skeleton bend It is difficult to recognize clearly with ν _ss . This problem was solved by subtracting the polyacrylamide spectrum (curve a, FIG. 4, without BAC, prepared using the same procedure) from the RABSS6 spectrum. As shown in the inset of FIG. 2, ν _ss was clearly recognized as a shoulder peak at 505 cm ⁻¹ .

-SHおよび-S-S-振動だけでなく、図4の挿入図に示すように、ポリアクリルアミドのスペクトルを引いた後に、ABSH6の-C-S-H基とRABSS6の-C-S-S-C-とからの-C-S-伸縮(ν_C-s)もまた、662cm^-1および621cm^-1にそれぞれ明瞭に観察された。上の特性吸収に加えて、図4に示す他の吸収ピークは、ポリアクリルアミドのラマンスペクトルに対応する(Gupta et al. Laser Raman spectroscopy of polyacrylamide. J. Polym. Sci., Polym. Phys. Edn. 19:353-360, 1981)。 As shown in the inset of Fig. 4 as well as -SH and -SS-vibrations, after drawing the spectrum of polyacrylamide, -CS-stretching from the -CSH group of ABSH6 and -CSSC- of RABSS6 (ν _Cs ) was also clearly observed at 662 cm ^-1 and 621 cm ^-1 respectively. In addition to the characteristic absorption above, the other absorption peaks shown in FIG. 4 correspond to the Raman spectrum of polyacrylamide (Gupta et al. Laser Raman spectroscopy of polyacrylamide. J. Polym. Sci., Polym. Phys. Edn. 19: 353-360, 1981).

再ゲル化と機械的性質
ABSHポリマーの再ゲル化を、チオールの空気酸化により、あるいは、チオールジスルフィド交換反応(図5)により実施することができる(図5)。ABS^-イオン(ABSHからの)からの酸素への1電子移動の反応速度が、チオールの空気酸化の速度を決める。この反応速度は、pHを大きくすると増加する。pH7.4で、ゲル化は通常12時間以内に起こった。Hisano等(Entrapment of islets into reversible disulfide hydrogels. J Biomed Mater Res. 40:115-123, 1998)は、同じタイプのチオール化アクリルアミドポリマーで、pH8.8では、ゲルを生成させるのに、空気酸化では約6時間かかったことを報告した。空気酸化と異なり、チオールジスルフィド交換反応では、7.0と7.5の間のpH(生理的pHにより近い)で数分以内にゲル化が起こった。ゲル化時間がそれ程短いので(全て5分未満)、いくつかの異なる濃度のABSHポリマーについて再ゲル化の実験を行うことができた。ABSHポリマーの濃度と、再ゲル化試験体の静的モジュラスを表2に列挙する。同じ濃度で生成したゲルのモジュラスは、分子量および-SH含量の増加と共に大きくなった。全ての再生成ゲルは透明であった。 Regelation and mechanical properties
Regelation of ABSH polymers can be performed by air oxidation of thiols or by thiol disulfide exchange reaction (Figure 5) (Figure 5). The rate of one-electron transfer from ABS ^- ions (from ABSH) to oxygen determines the rate of thiol air oxidation. This reaction rate increases with increasing pH. At pH 7.4, gelation usually occurred within 12 hours. Hisano et al. (Entrapment of islets into reversible disulfide hydrogels. J Biomed Mater Res. 40: 115-123, 1998) is a thiolated acrylamide polymer of the same type, at pH 8.8 it produces gels, but with air oxidation Reported that it took about 6 hours. Unlike air oxidation, the thiol disulfide exchange reaction gelled within a few minutes at a pH between 7.0 and 7.5 (closer to physiological pH). Because the gel time was so short (all less than 5 minutes), regelation experiments could be performed on several different concentrations of ABSH polymer. The ABSH polymer concentration and the static modulus of the regelled specimen are listed in Table 2. The modulus of the gel produced at the same concentration increased with increasing molecular weight and -SH content. All regenerated gels were clear.

本実験において、ゲル化は、ABSH2の15%溶液、ABSH4の10%溶液、ならびに、ABSH6の3および4%溶液では、30秒より短時間に起こった。しかし、高粘度と素早い反応のために、これらの試料を用いて嚢内ゲル化を試みなかった。その代わりに、空気酸化は好ましい方法であった。より低濃度(これらは表2に含まれていない)は安定なゲルを生成させるのに適切でなかった。全体として、ゲル化の速度は、酸化剤、pH、および光の関数であった。   In this experiment, gelation occurred in less than 30 seconds with a 15% solution of ABSH2, a 10% solution of ABSH4, and 3 and 4% solutions of ABSH6. However, due to the high viscosity and quick reaction, no intracapsular gelation was attempted using these samples. Instead, air oxidation was the preferred method. Lower concentrations (these are not included in Table 2) were not appropriate to produce stable gels. Overall, the rate of gelation was a function of oxidant, pH, and light.

嚢内ゲル化
嚢内ゲル化に対する水溶性コポリマー溶液(ABSH)の適性を、予め内容物を取り出したブタの水晶体嚢で例示した。すでに記載したように、非常に速い再ゲル化により、いくつかのポリマー濃度での試験が妨げられた。嚢内ゲル化を、新たに調製されたABSH2の10.0および12.5%溶液、ABSH4の5.0および7.5%溶液、ならびに、ABSH6の2.0%溶液を用いて実施した。これらの全ての場合に、再ゲル化は5分以内に起こった。元々の高粘度(これはさらにDTDPの添加で増加する)のおかげで、再充填の間の漏れはなかった。嚢内ゲル化のためのin-vitroでの再充填手術の手順を図6に概略的に示す。ここで、角膜に穴をあけ、水晶体の内容物を破砕吸引(phagofragmentation)することにより取り除き嚢内を空にする。次に、空の嚢内を適当なABSH溶液で再び満たし、in situで再ゲル化させた。 Intracapsular gelation The suitability of an aqueous copolymer solution (ABSH) for intracapsular gelation was illustrated in a porcine lens capsule from which the contents had previously been removed. As already described, the very fast regelation prevented testing at several polymer concentrations. Intracapsular gelation was performed using freshly prepared 10.0 and 12.5% solutions of ABSH2, 5.0 and 7.5% solutions of ABSH4, and 2.0% solutions of ABSH6. In all these cases, regelation occurred within 5 minutes. Thanks to the original high viscosity, which increases with the addition of DTDP, there was no leakage during refilling. The procedure for in-vitro refilling surgery for intracapsular gelation is shown schematically in FIG. Here, a hole is made in the cornea and the contents of the lens are removed by phagofragmentation to empty the sac. The empty sac was then refilled with the appropriate ABSH solution and regelled in situ.

図7aは、ABSH4の10%(w/v)溶液で嚢内ゲル化を実施した場合の、ブタの目の代表的試料を示している。そのレンズを通して見ると対象ははっきりと歪みなく見える。図7bは、ブタの水晶体嚢内から分離された再ゲル化レンズを示している。水晶体の形に形作られた注入枠においてもまた、均一で透明なゲルの生成を確かめた(図7c)。   FIG. 7a shows a representative sample of pig eyes when intracapsular gelation was performed with a 10% (w / v) solution of ABSH4. When viewed through the lens, the object appears clearly undistorted. FIG. 7b shows a regelled lens separated from within the porcine lens capsule. The injection frame shaped into the lens shape also confirmed the formation of a uniform and transparent gel (Fig. 7c).

検討
本実験の主な目的は、生理的条件の下においてin vivoで化学架橋させるための注入可能な前駆体としてチオール含有コポリマーを用いることの実現可能性を具体的に示すことであった(室温、酸素の存在下、中性pH付近)。予め内容物を取り除いた嚢内に、光学的に透明なゲル(そのモジュラスは若年者の水晶体物質のモジュラス(約1000Pa)に近かった)を生成させることは可能である。ゲル化の化学は、遅い空気酸化、あるいは、適切な無毒のジスルフィド試薬が介在する速い交換反応によってジスルフィド化する、ペンダントチオールの円滑な酸化を用いる。このような系は、毒性モノマーを含んでおらず、生きた組織の近くでの熱反応を含まず、漏れがなく、また生体と共存し得る適切な促進剤および光子によって調節され得るゲル化速度をもつ。 Discussion The main purpose of this experiment was to demonstrate the feasibility of using a thiol-containing copolymer as an injectable precursor for chemical cross-linking in vivo under physiological conditions (room temperature In the presence of oxygen, near neutral pH). It is possible to produce an optically transparent gel (whose modulus was close to that of the young lens material (about 1000 Pa)) in the sac from which the contents had been previously removed. Gelling chemistry uses smooth oxidation of pendant thiols that disulfide by slow air oxidation or fast exchange reactions mediated by a suitable non-toxic disulfide reagent. Such systems do not contain toxic monomers, do not contain thermal reactions near living tissue, are leak-free, and can be controlled by suitable accelerators and photons that can coexist with living organisms. It has.

ここで、ポリアクリルアミドは、骨組みまたは骨格のモデルとして用いられており、任意のポリマー鎖によって置き換えられ得る。疎水性の基を組み入れることにより、コポリマー溶液の性質、すなわち、粘度および/またはチクソトロピーをかなり増大させることができる。さらに、チオールは、ペンダント状であっても、星型(multi-armed)ポリマーにおける鎖の末端にあってもよい。この化学は、チオール含有シリコーン(例外的に大きな酸素透過性をもつ)にも適用可能である。親水性で水溶性のアクリレートは通常、生分解性であり、代用硝子体あるいは眼内レンズ材料として長期の使用に適さないので、アクリルアミド誘導体は、一般に比較的大きいそれらの加水分解安定性のために選択される。この系の別の独特の利点は、身体の外で最初に網目を生成させることにより、熱ならびにモノマーおよび他の毒性化学物質の除去(除去されなければ、in vivoでの重合が厳しく制限される問題)が円滑に行われることである。水溶性ABSHコポリマーを得るための、ハイドロゲルのジスルフィド結合のDTTを用いる還元は、還元剤のレドックス電位によってだけでなく、濃度、時間、pH、および雰囲気窒素によってもまた影響される重要なステップである。これらの要因を考慮した上で、10モル過剰のDTTを用い、窒素の下で撹拌することが、嚢内再ゲル化のためのコポリマーを得るのに最も適した手法であることが分かる。ポリマー析出中に酸性メタノール(pH3)を使用することが、次の処理の間、チオールを還元状態に保つのに極めて重要である。そうしなければ、このコポリマーは、部分的にのみ可溶である。乾燥して、次に使用されるまで、試料を減圧に保った。表1における-SH含量から分かるように、ジスルフィド結合をほぼ定量的に還元することが可能である。ゲルは単に空気酸化によっても、あるいは、DTDPを加えることによるチオール-ジスルフィド交換反応によっても再生成され得る。-SH含量、濃度、コポリマーの分子量が、再ゲル化特性と得られたゲルのモジュラスに影響を及ぼしたが、表2から、非常に大きい、または小さい上のパラメータの値により、この材料は嚢内ゲル化に不適切になることが明らかである。一般に、ハイドロゲルのモジュラスは、-SHおよびコポリマー濃度の増大と共に増加し、ハイドロゲルは光学的に透明なままである。シスタミンおよび2-ヒドロキシエチルジスルフィドもまた再ゲル化に使用され得るが、DTDPはこれらの何れよりも毒性が低い。   Here, polyacrylamide is used as a framework or skeletal model and can be replaced by any polymer chain. By incorporating hydrophobic groups, the properties of the copolymer solution, i.e. viscosity and / or thixotropy, can be significantly increased. Furthermore, the thiol may be pendant or at the end of a chain in a multi-armed polymer. This chemistry is also applicable to thiol-containing silicones (with exceptionally high oxygen permeability). Because hydrophilic and water-soluble acrylates are usually biodegradable and not suitable for long-term use as a substitute vitreous or intraocular lens material, acrylamide derivatives are generally due to their relatively large hydrolytic stability. Selected. Another unique advantage of this system is that it initially removes the heat and removes monomers and other toxic chemicals (if not removed, in vivo polymerization is severely limited) Problem) is performed smoothly. Reduction with hydrogel disulfide bond DTT to obtain water-soluble ABSH copolymers is an important step that is influenced not only by the redox potential of the reducing agent but also by concentration, time, pH, and atmospheric nitrogen. is there. Considering these factors, it can be seen that using 10 molar excess of DTT and stirring under nitrogen is the most suitable technique to obtain a copolymer for intracapsular regelation. The use of acidic methanol (pH 3) during polymer precipitation is extremely important to keep the thiol in the reduced state during the next treatment. Otherwise, the copolymer is only partially soluble. The sample was kept under vacuum until dried and next use. As can be seen from the -SH content in Table 1, disulfide bonds can be reduced almost quantitatively. The gel can be regenerated either simply by air oxidation or by a thiol-disulfide exchange reaction by adding DTDP. -SH content, concentration, and molecular weight of the copolymer affected the regelation properties and the resulting modulus of the gel, but from Table 2 it can be seen that this material can be Clearly it becomes unsuitable for gelation. In general, the modulus of the hydrogel increases with increasing -SH and copolymer concentration, and the hydrogel remains optically clear. Cystamine and 2-hydroxyethyl disulfide can also be used for regelation, but DTDP is less toxic than any of these.

可逆ジスルフィド化学を用いる、in situでの嚢内ハイドロゲル生成は、注入可能な眼内レンズの開発のためだけでなく、代用硝子体、および局所治療薬としての使用でも、将来性のある技術である。in situでの重合およびゲル化と異なり、本明細書において記載されている可逆ハイドロゲル系は、in situでのゲル化のみを伴い、温度の認められるような変化はない。コポリマーはモノマーを含んでおらず、粘稠なコンシステンシーをもつ濃度で注入されたので、モノマーによる毒性および漏れは回避される。再ゲル化の時間は、DTDP、酸素、pH、および/または光子を用いて容易に操作され得る。   In situ capsular hydrogel generation using reversible disulfide chemistry is a promising technology not only for the development of injectable intraocular lenses, but also for use as a vitreous substitute and as a topical treatment . Unlike in situ polymerization and gelation, the reversible hydrogel systems described herein involve only in situ gelation with no appreciable change in temperature. Because the copolymer does not contain monomer and is injected at a concentration with a viscous consistency, monomer toxicity and leakage are avoided. The regelation time can be easily manipulated using DTDP, oxygen, pH, and / or photons.

(実施例2)
アクリルアミド/BAC/N-フェニルアクリルアミドのハイドロゲル(疎水性ハイドロゲル)
アクリルアミド(AAm)、ビスアクリロイルシスタミン(BAC)、および、N-フェニルアクリルアミド(NPA)の共重合を、25%エタノール(25:75=エタノール:水 v/v)中、5%(w/w)で、94/4/2のアクリルモル比で実施した。約30分間溶液を通して窒素のバブリングを行って、重合の開始の前に溶存酸素を全て除去した。反応を、2.1%(w/w)のテオトラメチレンジアミンおよび、0.4%(w/w)の過硫酸アンモニウムを添加することにより開始し、25℃で15時間続けた。水へのBACのかぎられた溶解性のために、水性エタノールを溶剤として用いた。得られたゲルをビーカーから取り出し、500mLの水の中で2日間膨潤させ、小さく砕いて、蒸留水で洗った。上のコポリマー組成物からのゲルを、それが4アクリルモル%のBACを組み入れることによるジスルフィド(-SS-)結合と2アクリルモル%のNPAを含んでいることを示して、AB4N2SSと名づけた。 (Example 2)
Acrylamide / BAC / N-phenylacrylamide hydrogel (hydrophobic hydrogel)
Copolymerization of acrylamide (AAm), bisacryloylcystamine (BAC), and N-phenylacrylamide (NPA) in 5% (w / w) in 25% ethanol (25: 75 = ethanol: water v / v). ) With an acrylic molar ratio of 94/4/2. Nitrogen was bubbled through the solution for about 30 minutes to remove any dissolved oxygen prior to the start of the polymerization. The reaction was started by adding 2.1% (w / w) theotramethylenediamine and 0.4% (w / w) ammonium persulfate and continued for 15 hours at 25 ° C. Aqueous ethanol was used as the solvent due to the limited solubility of BAC in water. The resulting gel was removed from the beaker, swollen in 500 mL of water for 2 days, crushed into small pieces, and washed with distilled water. The gel from the above copolymer composition was named AB4N2SS, indicating that it contained disulfide (-SS-) bonds and 2 acrylic mole% NPA by incorporating 4 acrylic mole% BAC.

砕かれたゲル(AB4N2SS)の液状化を、砕かれたハイドロゲルにジチオスレイトール(DTT)(10モル/使用された1モルのBAC)を加えることにより実施した。この還元を、pH7.0で4時間実施し、その間、撹拌しながら溶液を通して窒素のバブリングを行った。完全に可溶化させた後、コポリマー溶液を、10%(v/v)のHClを用いてpH4まで酸性化し、激しく撹拌しながらメタノール(pH4)中で析出させた。析出させた-SHコポリマーを濾過し、真空の下で乾燥し、常に減圧の下に保管した。AB4N2SSから上で得られたチオール含有水溶性コポリマーをAB4N2SHと名づけた。   Liquefaction of the crushed gel (AB4N2SS) was performed by adding dithiothreitol (DTT) (10 mol / 1 mol of BAC used) to the crushed hydrogel. This reduction was carried out at pH 7.0 for 4 hours, during which time nitrogen was bubbled through the solution with stirring. After complete solubilization, the copolymer solution was acidified to pH 4 using 10% (v / v) HCl and precipitated in methanol (pH 4) with vigorous stirring. The precipitated -SH copolymer was filtered, dried under vacuum and always stored under reduced pressure. The thiol-containing water-soluble copolymer obtained above from AB4N2SS was named AB4N2SH.

AB4N2SHの5%(w/v)溶液を、元々は約pH4の水(N₂で飽和させた)で調製し、完全に溶解した後、7μLの5MのNaOHを用いて、pHを7に調節した。次に、162μLの0.5MのDTDP(pH=7)を加えてハイドロゲルを再生成させた。組成物の全容積は3mlであった。同様に、AB4N2SHが、7%、9%、および11%(w/v)の溶液を調製し、ハイドロゲルの生成に用いた。これらのハイドロゲルを調べてモジュラスの値を求めた。ポリマー溶液(9%、11%)は、注射器により注入する時に「蜂蜜に似た」コンシステンシー、剪断による粘度低下(shear thinning)を示し、ブタの嚢内で、漏れることなく物理的ゲルとしてほとんど瞬時にゲルした。次に、この物理的ゲルを化学的ゲルに変換した。 A 5% (w / v) solution of AB4N2SH was originally prepared with about pH 4 water (saturated with N ₂ ) and after complete dissolution, the pH was adjusted to 7 using 7 μL of 5M NaOH. did. Next, 162 μL of 0.5 M DTDP (pH = 7) was added to regenerate the hydrogel. The total volume of the composition was 3 ml. Similarly, AB4N2SH prepared 7%, 9%, and 11% (w / v) solutions and used to generate hydrogels. These hydrogels were examined to determine the modulus value. The polymer solution (9%, 11%) shows a `` honey-like '' consistency when injected by syringe, shear thinning due to shear, almost instantaneously as a physical gel without leakage in the pig sac Gelled. This physical gel was then converted to a chemical gel.

(実施例3)
代用硝子体としてのハイドロゲル
アクリルアミドと、4アクリルモル%のビスアクリロイルシスタミン(BAC)を重合することにより得たハイドロゲルから、コポリマー(AB4SH)を調製した。詳細な実験手順は実施例1に記載したものと同様であった。 (Example 3)
Hydrogel as Substitute Vitreous Body A copolymer (AB4SH) was prepared from a hydrogel obtained by polymerizing acrylamide and 4 acrylic mol% bisacryloylcystamine (BAC). The detailed experimental procedure was the same as that described in Example 1.

ABSH4の7%(w/v)溶液を、元々は約pH4の水(N₂で飽和させた)で調製し、完全に溶解した後、15μLの1MのNaOHを用いて、pHを7に調節した。その後、62μLの0.5MのDTDP(pH=7)を加えた。組成物の全容積は1mlであり、ヒトの死体の目の、予め内用物を取り出した硝子体の腔に注入した。in-situでのゲルは硝子体の腔内の残留水と平衡に達するので、腔内でのゲルの最終組成は実質的に7%未満であった(図8)。しかし、一般に、BACをより高濃度で含むゲルは、ゲル化するのにより低濃度でよく、代用硝子体としては好ましい。 A 7% (w / v) solution of ABSH4, originally prepared with about pH 4 water (saturated with N ₂ ), completely dissolved, then adjusted to pH 7 with 15 μL of 1M NaOH did. 62 μL of 0.5 M DTDP (pH = 7) was then added. The total volume of the composition was 1 ml, which was injected into the vitreous cavity of the human cadaver eye from which the internal use had been previously removed. Since the in-situ gel reached equilibrium with residual water in the vitreous cavity, the final composition of the gel in the cavity was substantially less than 7% (FIG. 8). However, in general, a gel containing BAC at a higher concentration may be a lower concentration because it gels, and is preferable as a vitreous substitute.

この研究では、BACと共重合させるモノマーとしてアクリルアミドが用いられているが、他のアクリルアミド類もしくはビニルモノマーもまた使用され得る。ペンダントチオールをポリマーに導入するこの技術を、主ポリマーの適切な選択と併せて、具体的最終用途に合わせてゲルを設計するのに用いることができる。生体と共存し得るハイドロゲルを開発するために多大な努力が費やされてきたが、この可逆ハイドロゲル系は、in situでの治療用途にはこれまで研究されていなかった。総合的に、これらの情報は、この系に新規性があることを示している。   In this study, acrylamide is used as the monomer to be copolymerized with BAC, but other acrylamides or vinyl monomers can also be used. This technique of introducing pendant thiols into the polymer can be used in conjunction with an appropriate choice of the main polymer to design the gel for a specific end use. Although much effort has been expended to develop hydrogels that can coexist with living organisms, this reversible hydrogel system has not been studied for in situ therapeutic applications. Overall, this information indicates that the system is novel.

(実施例4)
ナノゲル
実験方法
コポリマーハイドロゲルの調製
ポリアクリルアミド/BACのハイドロゲルを、上の実施例1のようにして調製した。得られたポリマーをAB6SHと名づけた。続く他のタイプのコポリマーハイドロゲルの調製において、N-フェニルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド(DA)、アクリル酸(AA)を、疎水性、正および負の特徴をもつチオールコポリマーを調製するために付加的に用いた。コポリマーの調製とそれらの組成を表4に報告する。 (Example 4)
Nanogel Experimental Method Preparation of Copolymer Hydrogel A polyacrylamide / BAC hydrogel was prepared as in Example 1 above. The resulting polymer was named AB6SH. In the preparation of other types of copolymer hydrogels that follow, N-phenylacrylamide, dimethylaminopropylmethacrylamide (DA), acrylic acid (AA), to prepare thiol copolymers with hydrophobic, positive and negative characteristics Used additionally. The preparation of the copolymers and their composition are reported in Table 4.

可溶性コポリマーの特性評価
コポリマー中に存在するチオール(-SH)含量を、Ellman分析法(Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82:70-77)を用いて求めた。還元後のポリマー(ABSH)の分子量を、Viscotek HPLC-GPCシステム(ヒューストン、テキサス州、米国)を用い、G6000PWXLおよびG4000PWXL(Tosoh Biosep、Montgomery Ville、ペンシルベニア州、米国)の2つの直列に接続したカラムを用いて求めた。移動相は20mMのBis-Tris緩衝液(pH6.0、0.1%のアジ化ナトリウム)であった。試料を、0.5%(w/v)の濃度で、水(pH4、N₂で飽和させた)で調製した。分子量(Mw)1000から950,000のポリエチレングリコール標準(Viscotek、ヒューストン、テキサス州、米国)を用いて較正した。 Characterization of the soluble copolymer The thiol (-SH) content present in the copolymer was determined using Ellman analysis (Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82: 70-77). Two serially connected columns of molecular weight of the reduced polymer (ABSH) using the Viscotek HPLC-GPC system (Houston, Texas, USA), G6000PWXL and G4000PWXL (Tosoh Biosep, Montgomery Ville, PA, USA) Was determined using. The mobile phase was 20 mM Bis-Tris buffer (pH 6.0, 0.1% sodium azide). Samples were prepared with water (pH 4, saturated with N ₂ ) at a concentration of 0.5% (w / v). Calibrated using polyethylene glycol standards (Viscotek, Houston, TX, USA) with a molecular weight (Mw) of 1000 to 950,000.

ナノゲルの調製
大量の0.1% w/vのチオールコポリマー溶液を、pH4の水で調製した。少量の1MのNaOHを用いて、この溶液のpHを7に調節し、3日間空気でバブリングを行った。-SHのないことを、Ellman分析により確認し、溶液を25% w/wまで濃縮した。 Nanogel Preparation A large volume of 0.1% w / v thiol copolymer solution was prepared with pH 4 water. A small amount of 1M NaOH was used to adjust the pH of the solution to 7, and bubbled with air for 3 days. The absence of -SH was confirmed by Ellman analysis and the solution was concentrated to 25% w / w.

クリスタリン溶液の調製
ブタの目球を地元の畜殺場から得て、水晶体を切って取り出した。嚢から出した水晶体を緩衝液(50mMのTris、50mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTTおよび、0.1%のアジ化Na)に入れ、、ホモジナイズ後、12,000RPMで30分間遠心した。約1.2gの可溶性画分を、5X90cmのSephacryl S-300カラム(Pharmacia)に供して、1.3mL/分の流量で10分毎に画分を捕集した。ISCOのモデルUA-5モニターを用いて、吸光度を280nmで測定した。画分を、α、β_high、β_low、およびγクリスタリンのそれぞれのピークに集め、Amicon DC2濃縮装置を用いて濃縮した。分離し、濃縮した物質を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥して、使用するまで-20℃で保存した。試料を再懸濁させるために用いた標準緩衝液は、20mMのTris、0.1%のアジ化ナトリウム、pH7.6であった。 Crystalline solution preparation Pig eyes were obtained from a local slaughterhouse and the lens was cut out. The lens out of the sac was placed in buffer (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.1% Na azide), homogenized, and centrifuged at 12,000 RPM for 30 minutes. About 1.2 g of the soluble fraction was applied to a 5 × 90 cm Sephacryl S-300 column (Pharmacia), and the fraction was collected every 10 minutes at a flow rate of 1.3 mL / min. Absorbance was measured at 280 nm using an ISCO model UA-5 monitor. Fractions were collected in the respective peaks of α, β _high , β _low , and γ crystallin and concentrated using an Amicon DC2 concentrator. The separated and concentrated material was dialyzed against distilled water, lyophilized and stored at -20 ° C until use. The standard buffer used to resuspend the sample was 20 mM Tris, 0.1% sodium azide, pH 7.6.

レオロジーの実験
Vilastic-3 Rheometer(Vilastic Scientific、オースチン、テキサス州)を用いて、β_high-クリスタリン(CBH)およびNP-AB6SSの4% w/wの溶液の粘弾性挙動を調べた。直径が0.04953cmで長さが6.278cmの円柱管中、22℃で、2Hzの振動数で各試料を測定した。流体試料では2/秒から900/秒、ゲル試料では、0.2/秒から40/秒の剪断速度範囲に渡って、測定を実施した。各試料で、測定管を最初に充填した時と、測定管を2回目に充填した後で、測定を実施した。 Rheological experiments
The viscoelastic behavior of a 4% w / w solution of β _high -crystallin (CBH) and NP-AB6SS was investigated using a Vilastic-3 Rheometer (Vilastic Scientific, Austin, TX). Each sample was measured in a cylindrical tube having a diameter of 0.04953 cm and a length of 6.278 cm at 22 ° C. and a frequency of 2 Hz. Measurements were performed over a shear rate range of 2 / sec to 900 / sec for fluid samples and 0.2 / sec to 40 / sec for gel samples. For each sample, the measurement was performed when the measuring tube was first filled and after the measuring tube was filled a second time.

屈折率測定
アッベの屈折計(ATAGOのアッベ屈折計1T/4T、Kirkland、ワシントン州、米国)を用いて、25℃で、様々な濃度で全てのナノ粒子ならびにクリスタリン溶液の屈折率を測定した。 Refractive Index Measurement The refractive index of all nanoparticles and crystallin solutions at various concentrations was measured at 25 ° C. using an Abbe refractometer (ATAGO Abbe Refractometer 1T / 4T, Kirkland, WA, USA).

結果と考察
チオールコポリマーの調製と特性評価
AAmおよびBACの共重合によりハイドロゲルを得た。架橋ゲル(AB6SS)から望みの水溶性コポリマー(AB6SH)を得る際の重要なステップは、図2に示すように、ゲル中の全てのジスフフィド結合(-S-S-)の、-SH基への完全な還元を含んでいる。AB6SHの調製と同様に、他のポリマーを、表4に挙げた様々なモノマーを用いて調製した。 Results and Discussion Preparation and characterization of thiol copolymers
A hydrogel was obtained by copolymerization of AAm and BAC. An important step in obtaining the desired water-soluble copolymer (AB6SH) from the cross-linked gel (AB6SS) is the complete attachment of all disulfide bonds (-SS-) in the gel to the -SH group, as shown in Figure 2. Including a significant reduction. Similar to the preparation of AB6SH, other polymers were prepared using various monomers listed in Table 4.

-SHの測定により明白に示されるように、DTTによるゲルの還元によってジスルフィド結合はほぼ完全に還元された。Ellman分析により、BACが4および6アクリルモル%含まれるポリマーで、-SH含量が、それぞれ、5.1×10^-4および7.9×10^-4モル/gであることが示された。計算値は、5.4×10^-4および8.0×10^-4モル/gである。一般に、ポリマーの分子量分布は広い分布であった。重量平均分子量(Mw)は、AB6SH、AB4N4SH、AB4N4AA2SHおよびAB4N4DA2SHでそれぞれ、9.1、3.0、4.3、および1.75×10⁵Daであった。 As clearly shown by the measurement of -SH, the reduction of the gel with DTT almost completely reduced the disulfide bond. Ellman analysis showed that the -SH content was 5.1 × 10 ⁻⁴ and 7.9 × 10 ⁻⁴ mol / g for polymers containing 4 and 6 acrylic mol% BAC, respectively. The calculated values are 5.4 × 10 ⁻⁴ and 8.0 × 10 ⁻⁴ mol / g. In general, the molecular weight distribution of the polymer was wide. The weight average molecular weights (Mw) were 9.1, 3.0, 4.3, and 1.75 × 10 ⁵ Da for AB6SH, AB4N4SH, AB4N4AA2SH, and AB4N4DA2SH, respectively.

ナノゲルの調製
ペンダント-SH基を含むポリマー(AB6SH)を用いて、非常に希薄な濃度で、-SH基の間の分子内架橋により、ナノ粒子(NP-AB6SS)を調製した。非常に希薄な濃度は、分子内架橋だけによるナノ粒子の生成には有利であったが、本実験において調べられた濃度(0.1% w/v)では、依然としていくらかのナノ粒子が分子間で形成されたことが示された。超希薄な濃度とポリマーの分子量分布の制御により、十分に規定されたナノ粒子が調製されるであろう。分子内架橋によるナノ粒子の生成を図9に示した。同様に、他のチオールポリマーからナノゲルを調製した。 Nanogel Preparation Nanoparticles (NP-AB6SS) were prepared by intramolecular crosslinking between -SH groups at very dilute concentrations using a polymer containing pendant -SH groups (AB6SH). Although very dilute concentrations favored the generation of nanoparticles by intramolecular crosslinking alone, at the concentration investigated in this experiment (0.1% w / v), some nanoparticles still formed between molecules. It was shown that Well-defined nanoparticles will be prepared with ultra-dilute concentration and control of the molecular weight distribution of the polymer. The generation of nanoparticles by intramolecular crosslinking is shown in FIG. Similarly, nanogels were prepared from other thiol polymers.

ナノゲルおよび水晶体クリスタリンの屈折率
ジスルフィド含有ナノゲルと水晶体クリスタリンのタンパク質分子について、屈折率(RI)の値を図10に示す。ナノゲルのRI値は、クリスタリンのものに似ている。 Refractive Index of Nanogel and Lens Crystallin The refractive index (RI) values for the disulfide-containing nanogel and lens crystallin protein molecules are shown in FIG. The RI value of nanogel is similar to that of crystallin.

ナノゲルおよびクリスタリンのレオロジー測定
3種のポリマー試料の粘弾性特性を、同じ濃度(4% w/w)で、β_highクリスタリン(CBH)試料のそれと比較した。3つの全ての試料(AB6SH、RAB6SH、NPAB6SS)は同じポリマーに由来していた。 Rheological measurements of nanogels and crystallins
The viscoelastic properties of the three polymer samples were compared to that of the β _high crystallin (CBH) sample at the same concentration (4% w / w). All three samples (AB6SH, RAB6SH, NPAB6SS) were derived from the same polymer.

AB6SHは、アクリルアミドとBACを94/6のアクリルモル比で重合することにより調製したハイドロゲルから得られるコポリマーチオールである。RAB6SSは、AB6SHポリマーからの再ゲル化ハイドロゲル試料である。NP-AB6SSは、実験のセクションにおいて記載したように、同じAB6SHポリマーから調製されたナノゲル試料である。ナノゲル(NP-AB6SS)の粘弾性特性は、図11において認められるように、クリスタリンのそれに非常に似ていた。   AB6SH is a copolymer thiol obtained from a hydrogel prepared by polymerizing acrylamide and BAC at an acrylic molar ratio of 94/6. RAB6SS is a regelled hydrogel sample from AB6SH polymer. NP-AB6SS is a nanogel sample prepared from the same AB6SH polymer as described in the experimental section. The viscoelastic properties of the nanogel (NP-AB6SS) were very similar to those of crystallin, as can be seen in FIG.

結論
ジスルフィド含有架橋剤であるビスアクリルシスタミンを用い、アクリルアミドおよび他のモノマーの重合により得たハイドロゲルから、チオール含有ポリアクリルアミドコポリマーを調製した。これらのチオールポリマーを用いて、チオール基の間の分子内架橋によりナノゲルを調製した。これらのナノゲルの屈折率および粘弾性は、β_high水晶体クリスタリンのそれに類似していた。粘度の微妙な相違は、ナノゲルのより大きな流体力学的体積とそれらの大きさの多分散性に起因すると考えられる。 Conclusion Thiol-containing polyacrylamide copolymers were prepared from hydrogels obtained by polymerization of acrylamide and other monomers using the disulfide-containing crosslinker bisacrylcystamine. Using these thiol polymers, nanogels were prepared by intramolecular crosslinking between thiol groups. The refractive index and viscoelasticity of these nanogels were similar to that of β _high lens crystallin. The subtle differences in viscosity are thought to be due to the larger hydrodynamic volumes of the nanogels and their polydispersity.

(実施例5)
ハイドロゲルナノコンポジット
実験方法
ポリ(AAm-co-BAC)ハイドロゲルの調製とその還元
ポリアクリルアミド/BACのハイドロゲルを、上の実施例1のようにして調製した。得たポリマーをAB4SHと名づけた。 (Example 5)
Hydrogel Nanocomposite Experimental Method Preparation of poly (AAm-co-BAC) hydrogel and its reduction Polyacrylamide / BAC hydrogel was prepared as in Example 1 above. The polymer obtained was named AB4SH.

可溶性ポリマーの特性評価
コポリマー(AB4SH)に存在するチオール(-SH)の含量を、Ellman分析を用いて求めた。還元ポリマー(AB4SH)の分子量を、Viscotek HPLC-GPCシステム(ヒューストン、テキサス州、米国)を用い、G6000PWXLおよびG4000PWXL(Tosoh Biosep、Montgomery Ville、ペンシルベニア州、米国)の2つの直列に接続したカラムを用いて求めた。移動相は20mMのBis-Tris緩衝液(pH6.0、0.1%のアジ化ナトリウム)であった。試料を、0.5%(w/v)の濃度で、水(pH4、N₂で飽和させた)で調製した。分子量(Mw)1000から950,000のポリエチレングリコール標準(Viscotek、ヒューストン、テキサス州、米国)を用いて較正した。 Characterization of soluble polymer The content of thiol (-SH) present in the copolymer (AB4SH) was determined using Ellman analysis. Using a Viscotek HPLC-GPC system (Houston, Texas, USA) and two serially connected columns of G6000PWXL and G4000PWXL (Tosoh Biosep, Montgomery Ville, PA, USA) with the molecular weight of the reduced polymer (AB4SH) Asked. The mobile phase was 20 mM Bis-Tris buffer (pH 6.0, 0.1% sodium azide). Samples were prepared with water (pH 4, saturated with N ₂ ) at a concentration of 0.5% (w / v). Calibrated using polyethylene glycol standards (Viscotek, Houston, TX, USA) with a molecular weight (Mw) of 1000 to 950,000.

ナノ粒子の調製
a)AB4SHチオールポリマーから:0.1% w/vの大量のAB4SHポリマー溶液を、pH4の水で調製した。少量の1MのNaOHを用いて、溶液のpHを7に調節し、3日間空気でバブリングを行った。Ellman分析によって、-SHのないことを確認した上で、溶液を25% w/wに濃縮した。ナノ粒子(溶液)をNP-AB4SSと名づけた。
b)シリカから:水可溶性シリカナノ粒子を、Mori等(J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:3712)により報告されたようにして調製した。粒径は直径で約3nmと報告されており、この報告ではここでさらに特性評価しなかった。65% w/wの保存溶液を調製し、様々な濃度で、ナノコンポジットに用いた。
c)ウシ血清アルブミン(BSA)から:緩衝液(20mMのBis-Tris、pH6.0、0.1%のNaN₃)中のBSAの30% w/w溶液を調製した。この溶液を、様々な濃度で、ハイドロゲルナノコンポジット材料に用いた。 Preparation of nanoparticles
a) From AB4SH thiol polymer: A large amount of 0.1% w / v AB4SH polymer solution was prepared with pH 4 water. A small amount of 1M NaOH was used to adjust the pH of the solution to 7, and bubbled with air for 3 days. After confirming the absence of -SH by Ellman analysis, the solution was concentrated to 25% w / w. The nanoparticle (solution) was named NP-AB4SS.
b) From silica: Water-soluble silica nanoparticles were prepared as reported by Mori et al. (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125: 3712). The particle size was reported to be about 3 nm in diameter and was not further characterized here in this report. A 65% w / w stock solution was prepared and used in nanocomposites at various concentrations.
c) From bovine serum albumin (BSA): A 30% w / w solution of BSA in buffer (20 mM Bis-Tris, pH 6.0, 0.1% NaN ₃ ) was prepared. This solution was used in hydrogel nanocomposite materials at various concentrations.

ナノコンポジットの調製
最初に、pH4で、窒素で飽和した水でAB4SHの15% w/w溶液を調製した。この溶液を、様々な濃度の様々なナノ粒子溶液と混合した。AB4SHの濃度は、全ての組成物において、5% w/wで一定に保った。ナノ粒子の濃度を、表5に示すように、0から36% w/wまで変えた。コンポジットのpHを、ゲル化の直前に少量の1MのNaOHを用いて、約7に調節した。ナノコンポジットを、AB4SHポリマーのチオール含量と等モル量でジチオプロピオン酸(DTDP)を用いてゲル化させた。ポリマーおよびナノ粒子の組成と濃度を表5に示す。 Nanocomposite Preparation First, a 15% w / w solution of AB4SH was prepared in water saturated with nitrogen at pH4. This solution was mixed with various nanoparticle solutions at various concentrations. The concentration of AB4SH was kept constant at 5% w / w in all compositions. The concentration of nanoparticles was varied from 0 to 36% w / w as shown in Table 5. The pH of the composite was adjusted to about 7 using a small amount of 1M NaOH just prior to gelation. The nanocomposite was gelled with dithiopropionic acid (DTDP) in an equimolar amount with the thiol content of the AB4SH polymer. The composition and concentration of the polymer and nanoparticles are shown in Table 5.

ナノコンポジットの屈折率およびモジュラスの測定
コンポジット材料の再ゲル化を、円柱状のテフロン(登録商標)枠(直径が10mmで、高さが5mm)で実施した。これらの円柱状試料の機械的性質を、動的粘弾性分析装置(DMA7e、Perkin Elmer、Norwalk、コネチカット州、米国)を用いて平行平板の間で圧縮することによって求めた。再ゲル化コンポジット材料の屈折率を、アッベ屈折計(ATAGOのアッベ屈折計1T/4T、Kirkland、ワシントン州、米国)を用いて求めた。 Measurement of the refractive index and modulus of the nanocomposite The regelation of the composite material was carried out in a cylindrical Teflon frame (diameter 10 mm, height 5 mm). The mechanical properties of these cylindrical samples were determined by compression between parallel plates using a dynamic viscoelastic analyzer (DMA7e, Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA). The refractive index of the regelled composite material was determined using an Abbe refractometer (ATAGO Abbe Refractometer 1T / 4T, Kirkland, WA, USA).

結果と考察
AB4SHコポリマーの調製と特性評価
AAmとBACの共重合によりハイドロゲルを得た。架橋ゲル(AB4SS)から望みの水溶性コポリマー(AB4SH)を得る際の鍵となるステップは、図2に示されるように、ゲル中の全てのジスフフィド結合(-S-S-)の、-SH基への完全な還元を含んでいる。 Results and discussion
Preparation and characterization of AB4SH copolymer
Hydrogel was obtained by copolymerization of AAm and BAC. The key step in obtaining the desired water-soluble copolymer (AB4SH) from the cross-linked gel (AB4SS) is to the -SH group of all disulfide bonds (-SS-) in the gel, as shown in Figure 2. Includes a complete reduction of.

-SHの測定により明白に示されるように、DTTによるゲルの還元によってジスルフィド結合はほぼ完全に還元された。Ellman分析により、-SH含量が、5.1×10^-4モル/gであることが示された。計算値は5.4×10^-4モル/gである。AB4SHの分子量分布分析により、多分散度が3.4で広い分布であること、重量平均分子量(Mw)が3.8×10⁵Daであることが示された。 As clearly shown by the measurement of -SH, the reduction of the gel with DTT almost completely reduced the disulfide bond. Ellman analysis showed that the -SH content was 5.1 x ^10-4 mol / g. The calculated value is 5.4 × 10 ⁻⁴ mol / g. Molecular weight distribution analysis of AB4SH showed a polydispersity of 3.4 and a wide distribution, and a weight average molecular weight (Mw) of 3.8 × 10 ⁵ Da.

ナノ粒子の調製
ペンダント-SH基を含むポリマー(AB4SH)を用いて、非常に希薄な濃度で、-SH基の間の分子内架橋によってナノ粒子を調製した。非常に希薄な濃度は、分子内架橋だけによるナノ粒子の生成には有利であったが、本実験において調べられた濃度(0.1% w/v)では、いくらかのナノ粒子が分子間で形成されたことが示された。超希薄な濃度とポリマーの分子量分布の制御により、十分に規定されたナノ粒子が調製されるであろう。分子内架橋によるナノ粒子の生成を図9に示した。濃厚なナノ粒子溶液(25% w/v)を、様々な濃度でナノコンポジットを調製するのに用いた。 Nanoparticle Preparation Nanoparticles were prepared by intramolecular crosslinking between —SH groups at a very dilute concentration using a polymer containing pendant —SH groups (AB4SH). A very dilute concentration was advantageous for the formation of nanoparticles by intramolecular crosslinking alone, but at the concentration investigated in this experiment (0.1% w / v), some nanoparticles were formed between molecules. It was shown that Well-defined nanoparticles will be prepared with ultra-dilute concentration and control of the molecular weight distribution of the polymer. The generation of nanoparticles by intramolecular crosslinking is shown in FIG. Concentrated nanoparticle solution (25% w / v) was used to prepare nanocomposites at various concentrations.

シリカナノ粒子を、Mori等によって報告されたゾル−ゲル法により、グリシドールとアミノプロピルトリエトキシシランとの間の付加反応と、それに続く、付加生成物の酸性での縮合によって調製した。粒径は約3nmと報告されていた。各ケイ素原子のヒドロキシル基の比較的大きな反応性と、非常に小さい径のために、これらの粒子は、よく分散し、水に溶けた分子のような挙動をする。非常に高い濃度(65% w/w)の溶液を調製し、様々な濃度で、ナノコンポジットハイドロゲル組成物に用いた。シリカナノ粒子の調製を図12に示す。   Silica nanoparticles were prepared by an addition reaction between glycidol and aminopropyltriethoxysilane followed by acidic condensation of the addition product by the sol-gel method reported by Mori et al. The particle size was reported to be about 3 nm. Due to the relatively high reactivity of the hydroxyl groups of each silicon atom and the very small diameter, these particles are well dispersed and behave like molecules in water. Very high concentration (65% w / w) solutions were prepared and used in nanocomposite hydrogel compositions at various concentrations. The preparation of silica nanoparticles is shown in FIG.

非常に高い濃度の生体分子溶液により本発明の考え方を比較し、確認するために、BSA(30% w/w)を、ナノコンポジットにナノ粒子溶液として用いた。   In order to compare and confirm the idea of the present invention with a very high concentration of biomolecule solution, BSA (30% w / w) was used as the nanoparticle solution in the nanocomposite.

ナノコンポジットの屈折率とモジュラス
屈折率(RI)とモジュラスの値を、全てのナノコンポジットについて表に示す。ナノ粒子の濃度が増すにつれて、全てのコンポジットでRIは大きくなる。NP-AB4SSを含むコンポジットでは、モジュラスの値もまた大きくなる。NP-AB4SSをAB4SHから調製し、NP-AB4SSは還元性雰囲気に置かれなかれば安定であった。しかし、コンポジット中でAB4SHと混ざると、チオール-ジスルフィドの交換反応が起こるので、NP-AB4SSのジスルフィド結合は壊され、ゲル化の際にAB4SHの網目に組み込まれ、その結果、モジュラスの値が大きくなった。他の2つのナノコンポジットでは、BSAもシリカナノ粒子もAB4SHポリマーと反応しない代わりに、網目の欠陥が増え、したがってモジュラスの値はより小さかった。 Refractive index and modulus of nanocomposites The refractive index (RI) and modulus values are shown in the table for all nanocomposites. As the concentration of nanoparticles increases, the RI increases for all composites. For composites containing NP-AB4SS, the modulus value also increases. NP-AB4SS was prepared from AB4SH, and NP-AB4SS was stable if not placed in a reducing atmosphere. However, when mixed with AB4SH in the composite, a thiol-disulfide exchange reaction occurs, so the disulfide bond of NP-AB4SS is broken and incorporated into the AB4SH network during gelation, resulting in a high modulus value. became. In the other two nanocomposites, both BSA and silica nanoparticles did not react with AB4SH polymer, but increased network defects and hence lower modulus values.

結論
ポリアクリルアミド/BACのハイドロゲルを調製し、還元して、ペンダントチオール(-SH)基をもつ水溶性コポリマーを得た。このポリマーを用いて、異なる3つのタイプのナノ粒子でハイドロゲルナノコンポジットを調製し、チオール-ジスルフィドの交換反応により再ゲル化させた。チオールポリマーと反応しないナノ粒子を含むナノコンポジットは、屈折率が高くモジュラスが小さいハイドロゲルナノコンポジットを生じた。ナノ粒子とハイドロゲルが異なる機構により活性化される系がこの問題を解決するであろうと思われる。例えば、ナノ粒子が光で活性化され、ハイドロゲルがpHで活性化されるか、あるいはこの逆であるような系は、ハイドロゲルとナノ粒子の間のチオール反応を起こさないであろう。 Conclusion A polyacrylamide / BAC hydrogel was prepared and reduced to obtain a water-soluble copolymer with pendant thiol (-SH) groups. Using this polymer, hydrogel nanocomposites were prepared with three different types of nanoparticles and regelled by thiol-disulfide exchange reaction. Nanocomposites containing nanoparticles that did not react with the thiol polymer resulted in hydrogel nanocomposites with high refractive index and low modulus. It appears that systems in which nanoparticles and hydrogel are activated by different mechanisms will solve this problem. For example, a system in which the nanoparticles are activated with light and the hydrogel is activated with pH, or vice versa, will not cause a thiol reaction between the hydrogel and the nanoparticles.

現時点で好ましい本発明の特定の実施形態が本明細書において詳細に説明されたが、本明細書において示され説明された様々な実施形態の変形および修正が本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明に関連する分野における技術者には明らかであろう。このように、本発明は、添付の請求範囲および適用可能な法の規則によって求められる範囲でのみ限定されるべきであると見なされている。   While specific embodiments of the presently preferred invention have been described in detail herein, variations and modifications of the various embodiments shown and described herein depart from the spirit and scope of the invention. It will be apparent to those skilled in the field relevant to the present invention that this can be done. Thus, it is considered that the present invention should be limited only to the extent required by the appended claims and the applicable rules of law.

可逆ハイドロゲル系を製造する一般的方法を示す。1 shows a general method for producing a reversible hydrogel system. ポリアクリルアミド/BAC可逆ハイドロゲル系の調製の概略を示す。An outline of the preparation of a polyacrylamide / BAC reversible hydrogel system is shown. ABSH2(連続線)、ABSH4(----)、およびABSH6(......)ポリマーの、HPLC-GPCトリプル検出器クロマトグラムを示す。信号は、a)RI、b)粘度、およびc)光散乱検出器による。Shown are HPLC-GPC triple detector chromatograms for ABSH2 (continuous line), ABSH4 (----), and ABSH6 (......) polymers. Signals are from a) RI, b) viscosity, and c) light scattering detector. a)ゲル化前のABSH6の4%(w/v)水溶液;b)ゲル化後のABSH6の4%(w/v)水溶液;およびc)ポリアクリルアミドの5%(w/v)水溶液(BACなしで、同じ実験条件を用いて調製された);のラマンスペクトルを示す。挿入図は、a)が差し引かれた後のb)およびc)の拡大部分を示している。a) 4% (w / v) aqueous solution of ABSH6 before gelation; b) 4% (w / v) aqueous solution of ABSH6 after gelation; and c) 5% (w / v) aqueous solution (BAC) of polyacrylamide. Without and prepared using the same experimental conditions); The inset shows an enlarged portion of b) and c) after a) has been subtracted. a)アルカリpHでの空気酸化;およびb)チオールジスルフィド交換反応による、チオール含有ABSHポリマーの酸化による再ゲル化を示す。Figure 2 shows a) re-gelation by oxidation of a thiol-containing ABSH polymer by a) air oxidation at alkaline pH; 嚢内でハイドロゲルを生成させる手術手順の概略:a)角膜の穿孔と虹彩の後退と、その後の水晶体内容物の除去;b)空の水晶体嚢への可逆ハイドロゲル材料溶液の再充填;およびc)可逆ハイドロゲル材料のin situでの再ゲル化;を示す。Summary of surgical procedure to generate hydrogel in the sac: a) perforation of the cornea and retraction of the iris followed by removal of the lens contents; b) refilling the empty capsular bag with reversible hydrogel material solution; and c ) In-situ regelation of reversible hydrogel materials. a)ブタの水晶体嚢内の;b)水晶体嚢から分離された;また、c)モールド内で調製された;10w/v %のABSH4の再ゲル化試料を示す。a) in porcine lens capsule; b) isolated from lens capsule; c) prepared in mold; 10 w / v% ABSH4 regelled sample. a)強膜、RPE、および角膜の切除の後に観察された、ヒトの死体の目における代用硝子体;およびb)視軸に沿って切断された目;を示す。1a shows a vitreous substitute in a human cadaver eye observed after excision of the sclera, RPE, and cornea; and b) an eye cut along the visual axis. -SH基の間の分子内架橋による、ABSHポリマーからのナノ粒子の生成を概略的に示す。Figure 3 schematically shows the generation of nanoparticles from an ABSH polymer by intramolecular crosslinking between -SH groups. ジスルフィド含有ナノゲルおよびブタ水晶体クリスタリンタンパク質の屈折率の値を示す。Refractive index values of disulfide-containing nanogel and porcine lens crystallin protein are shown. 合成ポリマーとクリスタリンの粘弾性を示す。Shows viscoelasticity of synthetic polymer and crystallin. a)付加、およびb)酸性縮合反応による、シリカナノ粒子の調製を概略的に示す。Figure 3 schematically shows the preparation of silica nanoparticles by a) addition and b) acidic condensation reaction.

Claims (17)

a)モノマーを用意するステップ;
b)前記モノマーを架橋剤と共重合して架橋ハイドロゲルを生成させるステップ;
c)前記架橋ハイドロゲルを液状化してコポリマー溶液を生成させるステップ;
d)前記コポリマー溶液を７％（ｗ／ｖ）未満の濃度まで稀釈して稀釈コポリマー溶液を
生成させるステップ;
e)前記稀釈コポリマー溶液をゲル化させてハイドロゲルを生成させるステップ;
を含むハイドロゲル製造方法であって、
前記ハイドロゲルが光化学的な可逆性または酸化還元による可逆性を有し、
前記の液状化およびゲル化のステップが、
（ｉ）それぞれ還元と酸化、または
（ｉｉ）液状化およびゲル化のステップの各々について異なる波長での照射の少なくとも一方によって実施され、
ステップe)を実施する前に、金属ナノ粒子が前記稀釈コポリマー溶液に添加される、方法。a) providing a monomer;
b) copolymerizing the monomer with a crosslinking agent to form a crosslinked hydrogel;
c) liquefying the crosslinked hydrogel to form a copolymer solution;
d) diluting the copolymer solution to a concentration of less than 7% (w / v) to form a diluted copolymer solution;
e) gelling the diluted copolymer solution to form a hydrogel;
A hydrogel production method comprising:
The hydrogel has photochemical reversibility or redox reversibility,
The liquefaction and gelation steps are
Carried out by at least one of (i) reduction and oxidation, respectively, or (ii) irradiation at different wavelengths for each of the liquefaction and gelation steps,
A method wherein metal nanoparticles are added to the diluted copolymer solution prior to performing step e). 前記モノマーが、アクリルアミド、N-オルニチンアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド、ヒドロキシ-エチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、N-ビニルピロリドン、N-フェニルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、アクリル酸、ベンジルメタクリルアミド、メチルチオエチルアクリルアミド、およびこれらの組合せからなる群から選択される請求項1に記載の方法。  The monomer is acrylamide, N-ornithine acrylamide, N- (2-hydroxypropyl) acrylamide, hydroxy-ethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol acrylate, polyethylene glycol methacrylate, N-vinyl pyrrolidone, N-phenyl acrylamide, dimethylamino 2. The method of claim 1 selected from the group consisting of propyl methacrylamide, acrylic acid, benzyl methacrylamide, methylthioethyl acrylamide, and combinations thereof. 前記架橋剤が、N,N'-ビス(アクリロイル)シスタミン、シンナメート、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、不飽和モノ-またはポリカルボン酸とポリオールのエステル、トリメチロールプロパントリアクリレート、アリル化合物、ビニル化合物、スチルベン誘導体、アゾ誘導体、シンナモイル誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される請求項1に記載の方法。The crosslinking agent is, N, N'-bis (acryloyl) cystamine, shea N'nameto, acrylates, diacrylates, oligo acrylate, methacrylate, dimethacrylate, oligo methacrylate, methylene bisacrylamide, methylene bis-methacrylamide, unsaturated mono- - or poly 2. The method of claim 1 selected from the group consisting of esters of carboxylic acids and polyols, trimethylolpropane triacrylate, allyl compounds, vinyl compounds, stilbene derivatives, azo derivatives, cinnamoyl derivatives, and combinations thereof. 前記架橋剤がジスルフィドリンカーである請求項1に記載の方法。  2. The method according to claim 1, wherein the cross-linking agent is a disulfide linker. ステップc)が、還元剤により実施される請求項1に記載の方法。  The method of claim 1, wherein step c) is performed with a reducing agent. 前記還元剤が、2-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、ブタンチオール、水素化ホウ素ナトリウム、および水素化シアノほう素からなる群から選択される請求項5に記載の方法。  6. The method of claim 5, wherein the reducing agent is selected from the group consisting of 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, dithioerythritol, cysteine, butanethiol, sodium borohydride, and cyanoborohydride. ステップe)が、大気中の酸素により実施される請求項1に記載の方法。  The method according to claim 1, wherein step e) is performed with atmospheric oxygen. ステップe)が、中性pHで実施される請求項1に記載の方法。  The process according to claim 1, wherein step e) is carried out at neutral pH. 前記ハイドロゲルを濃縮および凍結乾燥するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, further comprising concentrating and lyophilizing the hydrogel. 前記ハイドロゲルが疎水性である請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the hydrogel is hydrophobic. 前記ハイドロゲルが親水性である請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the hydrogel is hydrophilic. 前記ハイドロゲルが陰イオン性である請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the hydrogel is anionic. 前記ハイドロゲルが陽イオン性である請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the hydrogel is cationic. ステップb)の後、直ちに、前記架橋ハイドロゲルを洗浄して全ての未反応モノマーを除去する請求項1に記載の方法。  The method according to claim 1, wherein immediately after step b), the crosslinked hydrogel is washed to remove all unreacted monomers. ステップd)が、前記コポリマー溶液を、0.1パーセント(w/v)未満の濃度まで稀釈することを含む請求項1に記載の方法。  The method of claim 1, wherein step d) comprises diluting the copolymer solution to a concentration of less than 0.1 percent (w / v). 前記金属が金である請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the metal is gold. （ａ）前記コポリマー溶液を、９６／４のアクリルモル比でアクリルアミド／N,N'-ビス(アクリロイル)シスタミンを反応させて得られたゲルを還元することにより作製したコポリマーをｐＨ４のＮ_２飽和水に溶解した７％（ｗ／ｖ）溶液として調製し、
（ｂ）前記コポリマー溶液を、ＮａＯＨを使用してｐＨ７に調整し、及び
（ｃ）前記酸化工程を、酸素添加反応、ジスルフィド交換反応、またはリボフラビンおよび酸素の存在下における光酸化によって達成する、
ステップをさらに含む、請求項６に記載のハイドロゲル製造方法。(A) A copolymer prepared by reducing the gel obtained by reacting acrylamide / N, N′-bis (acryloyl) cystamine at an acrylic molar ratio of 96/4 with the copolymer solution was subjected to pH 4 N ₂ saturation. Prepared as a 7% (w / v) solution in water,
(B) the copolymer solution is adjusted to pH 7 using NaOH, and (c) the oxidation step is accomplished by oxygenation reaction, disulfide exchange reaction, or photooxidation in the presence of riboflavin and oxygen.
The method for producing a hydrogel according to claim 6, further comprising a step.

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