JP4975231B2 - セマフォリン阻害剤を有効成分とする神経再生促進剤 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明はセマフォリン阻害剤を有効成分とする中枢又は末梢における神経再生促進剤、該神経再生促進剤を含有する神経変性疾患等の予防・治療剤、非ペプチド・非ヌクレオチド系セマフォリン阻害剤、セマフォリン阻害活性を有する化合物、及び該化合物の微生物学的製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は成体において***能を持っていない特殊な組織である。そのため一旦障害を受けると長期にわたって障害が続く。特に脳や脊髄といった中枢神経系では全く再生能がない。脊髄損傷に代表される外因性の傷害やアルツハイマー病、パーキンソン病といった神経変性疾患に対する治療方法がないことも、中枢神経における再生能が無いことが一つの原因になっているということができる。他方、末梢神経は再生能を有しており、一旦切断された後も軸索が再生し機能が回復する。しかしこの場合にも再生に要する期間は数ヶ月から１年以上と非常に長時間を要し、患者にとっての苦痛は大きい。更にこのように再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し機能回復に至らない場合も多い。このように再生能を有する末梢神経の場合も、脳や脊髄といった中枢神経系の環境では全く伸長することはできない。そのため、中枢神経系には神経の伸長を阻止する物質が存在しているとされている。この中枢神経系に存在する神経再生阻害物質を抗体などで抑制すると一部ではあるが、中枢での神経再生が起こり、機能の回復も見られる。最近、この中枢神経再生阻害因子としてNogoが発見された（Nature 403, 434, 2000、Nature 403, 439, 2000）。しかし、Nogoを阻害することによって、再生する神経線維は一部であり、他の再生阻害物質が存在するのではないかと考えられている。かかる神経再生阻害の候補物質として、ＭＡＧ（ミエリン会合糖タンパク質）、テネイシン、ガングリオシド、エフリン、ネトリン、スリット、セマフォリンなどが挙げられているが、その根拠はインビトロで神経伸長を阻害することのみであり、インビボで実際にこれらの物質が神経の再生阻害に働いているかはこれまで明らかにされていない。
【０００３】
ところで、セマフォリンは、もともと発生期におけるバッタの神経系形成に関係する因子としてその遺伝子が単離されたものであるが、その後、線虫、魚、哺乳類さらにはある種のウイルスなどにも分布する大きな遺伝子ファミリーを形成していることが報告され、現在ではセマフォリン遺伝子は構造上８つの遺伝子サブファミリー、クラス、に分類されている（Cell 97, 551, 1999）。セマフォリンは神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質であり、これまでに約２０種の分子種が知られている（Cell 97, 551, 1999）が、多くのセマフォリンファミリーの大部分の機能について詳しいことはわかっていない。最も良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、これらの翻訳産物はすべて分泌型蛋白質である。これらの遺伝子がコードする蛋白質はインビトロで強い神経突起伸長抑制活性、成長円錐退縮活性を有していることが知られているが、ある条件下では神経突起伸長に誘引的に作用するとの報告もある。中でも最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（Cell 75, 217, 1993、Cell 75, 1389, 1993）であり、この蛋白は１０ｐＭという低濃度で短時間のうちに培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発する。セマフォリンのインビボでの機能を解析する研究として、Ｓｅｍａ３Ａの受容体の一つのコンポーネントであるニューロピリン−１のノックアウトマウスの研究がなされている（Neuron 19, 995, 1997）。当該ノックアウトマウスは胎生致死であるが、三叉神経など一部の神経系の走行異常、血管形成異常が起こることが知られている。一方、Ｓｅｍａ３Ａのノックアウトマウスでも同様の神経系の走行異常は認められるが、大きな異常も無く成体にまで発育する個体もあるとされており、生体内でのＳｅｍａ３Ａの機能については未だ不明な点も多い。
【０００４】
その他セマフォリンに関しては、セマフォリンＷ、セマフォリンＹ、セマフォリンＺに対する抗体等のアンタゴニストやアンチセンスヌクレオチドを中枢神経の再生促進剤とすること（WO98/15628、WO98/11216、WO98/20928）や、神経細胞とヒトコラプシンに特異的に結合する抗体とを接触させることにより、神経突起成長を誘導する方法（米国特許第５４１６１９７号明細書）が知られている。しかし、インビボにおけるこれら抗体等の作用は明らかにされていない。また、セマフォリンに対する抗体やアンチセンスヌクレオチド等のペプチド系・ヌクレオチド系以外の物質でセマフォリンを特異的に阻害する低分子化合物は、これまで全く知られていなかった。
【０００５】
本発明の課題は、セマフォリン阻害剤や、かかるセマフォリン阻害剤を有効成分として含有する、末梢あるいは中枢における神経再生促進剤や、かかる神経再生促進剤を含有する神経障害性疾患・神経変性疾患に対する予防剤や治療剤等を提供することにある。
【発明の開示】
【０００６】
セマフォリンは多くの作用を有していると考えられ、一部ではセマフォリンが神経の発生のみでなく再生にも関与しているとの考えもあったが、実際のところは全くわかっていなかった。また、古くから多くの研究によって神経再生阻害に関係していると考えられてきたＭＡＧのノックアウト動物において、神経再生促進が認められなかったことからもわかるように、特定の遺伝子を欠損した動物においては他の遺伝子による代償作用のため、遺伝子欠損動物において必ずしもその遺伝子本来の機能が欠失するとは限らない。そこで本発明者らは、セマフォリンを標的として、セマフォリンノックアウト動物を用いることなく、セマフォリンのインビボにおける神経再生促進作用を検証する研究に着手した。
【０００７】
まずインビトロでセマフォリンの活性を完全に阻害する物質をスクリーニングし、スクリーニングしたセマフォリン阻害剤を神経再生モデル動物に投与することによって、該セマフォリン阻害剤のインビボでの神経再生促進作用を明らかにした。この過程で、セマフォリンの成長円錐退縮活性を完全に抑制すると同時に、コラーゲンゲル中でセマフォリン活性を持続的に阻害してセマフォリン存在下でも神経突起伸長を促進する物質が、インビボで神経再生促進作用を示すことを見い出した。さらにセマフォリン活性を抑制することによって、末梢のみでなく、中枢においても神経再生が促進されることを見い出した。かかる研究により、セマフォリンのインビボでの作用が解明されただけでなく、これまで全く知られていなかったセマフォリン阻害剤を有効成分とする神経再生促進剤や、かかる神経再生促進剤を含有する医薬品を提供することが可能となった。また、本発明者らがスクリーニングしたペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物中に見い出される分子内に特定構造を有する化合物がセマフォリン阻害活性を有することも明らかにした。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、セマフォリン阻害剤を有効成分とすることを特徴とする神経再生促進剤（請求項１）や、セマフォリン阻害剤が、クラス３型セマフォリン阻害剤であることを特徴とする請求項１記載の神経再生促進剤（請求項２）や、クラス３型セマフォリン阻害剤が、セマフォリン３Ａ阻害剤であることを特徴とする請求項２記載の神経再生促進剤（請求項３）や、セマフォリン阻害剤が、クラス６型セマフォリン阻害剤であることを特徴とする請求項１記載の神経再生促進剤（請求項４）や、クラス６型セマフォリン阻害剤が、セマフォリン６Ｃ阻害剤であることを特徴とする請求項４記載の神経再生促進剤（請求項５）や、セマフォリン阻害剤が、中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項６）や、セマフォリン阻害剤が、セマフォリンの有する成長円錐退縮活性及び／又はセマフォリンの有するコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項７）や、成長円錐退縮活性の抑制活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物が、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すことを特徴とする請求項７記載の神経再生促進剤（請求項８）や、成長円錐退縮活性の抑制活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物が、１０μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すことを特徴とする請求項８記載の神経再生促進剤（請求項９）や、成長円錐退縮活性の抑制活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物が、３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すことを特徴とする請求項９記載の神経再生促進剤（請求項１０）や、セマフォリン阻害剤が、セマフォリンと接触することによってセマフォリンの機能を阻害する化合物であることを特徴とするセマフォリン阻害剤である請求項１〜１０のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項１１）や、セマフォリン阻害剤が、実質的に細胞増殖に影響を与えることがない化合物であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項１２）や、セマフォリン阻害剤が、分子量１０００以下の化合物であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項１３）や、セマフォリン阻害剤が、非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の神経再生促進剤（請求項１４）や、非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物が、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株を培養することにより得られる非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物であることを特徴とする請求項１４記載の神経再生促進剤（請求項１５）や、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株を培養することにより得られる非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物が、分子内に式［１］、式［２］、式［４］若しくは式［５］で表される基、及び／又は、式［６］若しくは式［７］で表される基を有する非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物であることを特徴とする請求項１５記載の神経再生促進剤
【化１】
（式中、
【化２】
は単結合若しくは二重結合を表し、Ｒ^１は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
【化３】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義であり、Ｒ^３は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
【化４】
を表す。）
【化５】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義である。）
【化６】
【化７】
（式中、Ｒ^４は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
【化８】
（式中、Ｒ^４及びＲ^５は式［６］と同義である。）（請求項１６）に関する。
【０００９】
また本発明は、分子内に式［１］、式［２］、式［４］又は式［５］で表される基、及び、式［６］若しくは式［７］で表される基を有する化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有するセマフォリン阻害剤
【化９】
（式中、
【化１０】
は単結合若しくは二重結合を表し、Ｒ^１は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
【化１１】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義であり、Ｒ^３は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
【化１２】
を表す。）
【化１３】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義である。）
【化１４】
【化１５】
（式中、Ｒ^４は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
【化１６】
（式中、Ｒ^４及びＲ^５は式［６］と同義である。）（請求項１７）や、式［８］で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤
【化１７】
［式中、Ｒ^４及びＲ^５は式［６］と同義であり、Ｒ^６及びＲ^７は、下記の（１）又は（２）のいずれかで表される。
（１）Ｒ^６はメチル基を表し、Ｒ^７は式［２］で表される基、式［９］で表される基、又は式［１０］で表される基を表す。
【化１８】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義であり、Ｒ^３は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
【化１９】
を表す。
【化２０】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義である。）
【化２１】
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は式［１］と同義である。）
（２）Ｒ^６は式［５］で表される基、又は式［１１］で表される基を表し、Ｒ^７はアセチル基を表す。
【化２２】
【化２３】
（請求項１８）や、式［１３］で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤
【化２４】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、式［１］及び式［６］と同義である。）（請求項１９）や、式［１３］において、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項１９記載のセマフォリン阻害剤（請求項２０）や、式［１３］において、Ｒ^２が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項２０記載のセマフォリン阻害剤（請求項２１）や、式［１３］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項２０記載のセマフォリン阻害剤（請求項２２）や、式［１３］において、Ｒ^４がカルボキシル基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか記載のセマフォリン阻害剤（請求項２３）や、式［１３］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表し、Ｒ^１がカルボキシル基を表し、Ｒ^４が水素原子を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項１９記載のセマフォリン阻害剤（請求項２４）や、式［１３］において、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^５が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項１９記載のセマフォリン阻害剤（請求項２５）や、請求項１７〜２５のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤（請求項２６）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、式［１３］
【化２５】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、式［１］及び式［６］と同義である。）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項２７）や、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項２７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項２８）や、Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項２８記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項２９）や、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項２８記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項３０）や、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項２７〜３０のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項３１）や、Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項２７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項３２）や、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項２７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項３３）に関する。
【００１１】
また本発明は、式［１２］で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
【化２６】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、式［１］及び式［６］と同義である。）（請求項３４）や、式［１２］において、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項３４記載のセマフォリン阻害剤（請求項３５）や、式［１２］において、Ｒ^２が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項３５記載のセマフォリン阻害剤（請求項３６）や、式［１２］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項３５記載のセマフォリン阻害剤（請求項３７）や、式［１２］において、Ｒ^４がカルボキシル基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項３４〜３７のいずれか記載のセマフォリン阻害剤（請求項３８）や、式［１２］において、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２が水酸基を表す化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項３４記載のセマフォリン阻害剤（請求項３９）や、請求項３４〜３９のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤（請求項４０）に関する。
【００１２】
また本発明は、式［１２］
【化２７】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は式［１］及び式［６］と同義である。）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４１）や、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項４１記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４２）や、Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項４２記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４３）や、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４２記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４４）や、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項４１〜４４のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４５）や、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項４１記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４６）に関する。
【００１３】
また本発明は、式［１４］
【化２８】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、式［２］及び式［６］と同義である。）
で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４７）や、Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４８）や、Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項４８記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項４９）や、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４８記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５０）や、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項４７〜５０のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５１）や、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５２）や、Ｒ^１がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表し、Ｒ^３がメトキシメチル基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５３）や、Ｒ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５４）や、Ｒ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項５４記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５５）や、Ｒ^３が式［３］に示される基を表すことを特徴とする請求項４７〜５２のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５６）や、
【化２９】
請求項４７〜５６のいずれかの化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤（請求項５７）や、請求項５７記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤（請求項５８）に関する。
【００１４】
また本発明は、式［１５］
【化３０】
（式中、Ｒ^４及びＲ^５は、式［６］と同義である。）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項５９）や、Ｒ^５が水酸基表すことを特徴とする請求項５９記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６０）や、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項５９又は６０記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６１）や、請求項５９〜６１のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤（請求項６２）や、請求項６２記載のセマフォリン阻害剤を有効成分とすることを特徴とする神経再生促進剤（請求項６３）に関する。
【００１５】
また本発明は、式［１６］
【化３１】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、式［１］及び式［６］と同義である。）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６４）や、Ｒ^２及びＲ^５の少なくとも一方が水素原子を表すことを特徴とする請求項６４記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６５）や、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項６４記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６６）や、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項６４〜６６のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体（請求項６７）や、請求項６４〜６７のいずれか記載の化合物、その医薬的に許容される塩、又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤（請求項６８）や、請求項６８記載のセマフォリン阻害剤を有効成分とすることを特徴とする神経再生促進剤（請求項６９）に関する。
【００１６】
また本発明は、請求項１〜１６のいずれか、２６、４０、５８、６３又は６９記載の神経再生促進剤を含有することを特徴とする神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤（請求項７０）や、神経障害疾患及び／又は神経変性疾患が、脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患であることを特徴とする請求項７０記載の神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤（請求項７１）や、神経障害疾患及び／又は神経変性疾患が、嗅覚異常症、外傷性神経傷害、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、又は外傷性神経変性疾患であることを特徴とする請求項７０記載の神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤（請求項７２）や、ペニシリウム属に属する式［８］、[１２]、［１３］、［１４］、［１５］又は［１６］で表わされる化合物の生産菌を培養して、その培養物から前記化合物を採取することを特徴とする前記化合物の製造方法（請求項７３）や、ペニシリウム属に属する生産菌が、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株であることを特徴とする請求項７３記載の製造方法（請求項７４）や、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）又は該ＳＰＦ−３０５９株から誘導される菌株（請求項７５）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の神経再生促進剤としては、セマフォリン等の神経伸長反発因子の阻害剤を有効成分とするものであれば特に制限されるものではない。ここでセマフォリンとは、およそ５００アミノ酸残基からなる類似構造のセマフォリンドメインを有する蛋白質の総称であり（Neuron 14, 941-948, 1995）、現在までに約２０種以上が報告されているが、これら公知のセマフォリンに限定されるものではない。かかるセマフォリンとしては、ヒト等の哺乳類のセマフォリン、好ましくは文献（Cell 97, 551, 1999）において定義されたクラス３型，４型，５型又は６型のセマフォリン、更に好ましくはクラス３型又はクラス６型セマフォリンを例示することができ、最も好ましくはクラス３型セマフォリンにおいてはセマフォリン３Ａ（Cell 75, 217, 1993、Cell 75, 1389, 1993）を、またクラス６型セマフォリンにおいてはセマフォリン６Ｃ（国際公開第９８／１１２１６号パンフレット、Moll. Cell. Neurosci. 13, 9-23(1999)）を例示することができる。これらセマフォリンをコードする遺伝子の配列情報は、GenBankデータベースや前記文献等において公開されているため、当該配列情報に基づき、適当なＤＮＡ部分をハイブリダイゼーションのプローブ又はＰＣＲのプライマーとし、例えば脳由来のｃＤＮＡライブラリー等を用いることにより、セマフォリンをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、以上のようにして得られたセマフォリンをコードする遺伝子を発現させてタンパクを産生することも、例えば前述のMolecular Cloning等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。また、本発明におけるセマフォリンには、天然型・組換え型のタンパク質に限ることなく、膜結合型セマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグやフラグなどのタグを付けたもの、さらには一部のアミノ酸を欠失、置換、付加させた変異体なども含まれる。
【００１８】
例えば、セマフォリン６Ｃ（Ｓｅｍａ６Ｃ）は膜結合型タンパク質であり、Ｓｅｍａ６Ｃの有する活性の促進・抑制作用を利用して被験物質の活性を測定する場合等においては、通常Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインが使用される。Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインには２つのアイソフォームが知られているが（国際公開第９８／１１２１６号パンフレット及びMoll. Cell. Neurosci. 13, 9-23(1999)）、そのいずれも成長円錐退縮活性を有している。かかるＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質も、Ｓｅｍａ６Ｃ活性を損なわない限り、被験物質の活性を測定する場合等において有利に用いることができ、マーカータンパク質としては、例えばアルカリホスファターゼ（Cell 63, 185-194(1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、ＨＲＰなどの従来よく知られたマーカータンパク質を、またペプチドタグとしては、例えばミックタグ、ヒスタグ、フラグタグなどの従来よく知られたペプチドタグを挙げることができる。
【００１９】
また本発明においてセマフォリン阻害剤とは、上記セマフォリンのいずれかが有する活性、例えば、細胞の遊走活性、細胞死誘導活性、細胞の球状化や成長円錐の退縮といった細胞の形態変化、神経突起伸長抑制あるいは促進活性、神経細胞の樹状突起の伸長促進あるいは抑制活性、神経軸索ガイダンス活性などを阻害する物質をいい、かかるセマフォリン阻害剤としては、前記セマフォリン活性を阻害する物質であれば特に制限されるものではないが、好ましくは中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用を有する化合物、より好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性及び／又はコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物、さらに好ましくはセマフォリンの有する成長円錐退縮活性とコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の両方に対して抑制作用を有する化合物を挙げることができる。
【００２０】
上記中枢及び／又は末梢における神経再生促進作用とは、脳及び脊髄などからなる中枢（組織）、及び／又は該中枢（組織）以外の周辺・末梢部である体表や体内の諸器官である末梢（組織）における神経の再生を促進する作用を言う。ここで中枢における神経再生促進作用には、網膜神経や大脳皮質神経のような、中枢領域にある神経細胞体から軸索を出し同じく中枢にある他の神経細胞に投射する神経の再生促進作用のみならず、嗅神経、後根神経節感覚神経の中枢性線維等の、末梢に存在する神経細胞体から出る神経であっても、神経軸索が再生される環境が中枢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。また、末梢における神経再生促進作用としては、末梢にある神経細胞体から出て末梢組織の中を伸びる神経の再生促進作用のみならず、中枢（脳及び脊髄など）にある神経細胞体から出る神経であっても、再生される環境が末梢（組織）であるときの神経再生促進作用も含まれる。後者としては具体的に、脊髄運動神経、交感神経・副交感神経といった自律神経系の節前神経等の神経再生促進作用を例示することができる。また坐骨神経のように、前記の両方の神経を含む神経の再生促進作用も含まれる。そして、本発明のセマフォリン阻害剤としては、中枢及び末梢における神経再生促進作用を有する化合物が特に好ましい。なお、前記において中枢（組織）とは、脳、延髄、脊髄、眼などからなる組織で詳しくは血液脳関門・血液網膜関門といった構造によって高分子量物質の輸送が制限されている領域であり、末梢組織とは身体のそれ以外の領域を指す。一般に、神経線維は末梢組織の中では再生が可能であるが、中枢組織の中では再生することができない。
【００２１】
上記セマフォリンの有する成長円錐退縮（コラプス）活性とは、神経細胞（通常は神経節の組織片）をインビトロで所定時間培養し、伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態にした後、所定の濃度（例えば、約３ユニット／ｍｌ；なお、１ユニット／ｍｌは５０％の成長円錐を退縮させるセマフォリンの濃度をいう）のセマフォリンを加えさらに所定時間（例えば１時間）培養を続けた後に観察される成長円錐を消失させる活性をいう。伸長した神経突起とその神経突起先端の成長円錐を観察しうる状態とするために、神経細胞のインビトロでの培養は通常１０時間から２０時間行われるが、神経の種類、培養条件によって適宜変更することができる。そして、例えばこの実験系において、セマフォリンを添加する約１時間前にあらかじめ適当濃度の化合物を加えておいた場合に、セマフォリンによる成長円錐の退縮が抑制されたとき、かかる化合物をセマフォリン阻害剤、特にセマフォリンの成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物ということができる。また、かかる成長円錐退縮活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。さらに、セマフォリン阻害剤としては、神経細胞やセマフォリン発現細胞等の細胞の増殖に実質的に影響を与えることがない化合物が、本発明のセマフォリン阻害剤の効果を確認する上で、また、医薬品として用いた場合の安全性の点で好ましい。
【００２２】
また上記セマフォリンの有するコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性とは、例えばセマフォリン産生細胞と神経細胞（通常は神経節）とを共に含むコラーゲンゲル中で観察される神経伸長阻害活性をいう。そして当該神経伸長阻害活性の抑制作用とは、コラーゲンゲル中でのセマフォリン活性を持続的に阻害する活性であり、例えばコラーゲンゲル中で神経細胞と近接してセマフォリン産生細胞を培養し、通常一晩以上経過した後に神経突起伸長を観察したときに、セマフォリン産生細胞と逆側へ伸長している神経突起に比べてセマフォリン産生細胞の方へは１／３以下しか伸長しない実験条件において、その物質存在下で培養すると１／２以上の長さにまで伸長することのできる活性をいう。また、かかるコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有する化合物としては特に制限されるものではないが、１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３μｇ／ｍｌ以下の濃度で前記抑制作用を示すものを例示することができる。
【００２３】
上記セマフォリンの２種類の活性測定において用いられるセマフォリンとしては、天然型のセマフォリンに限定されることなく、前記の膜結合型のセマフォリンの細胞外ドメインのみを発現可溶化させたもの、抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質との融合タンパク質、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたもの、一部のアミノ酸を変化させたものなども使用することができる。また、培養に用いる神経細胞としては、ニワトリ７日齢、８日齢の胎仔から取り出した後根神経節が便利であるが、ニワトリ以外の動物の後根神経節、また、後根神経節以外の交感神経節、網膜神経節、上頚神経節など、インビトロ培養下において神経突起を伸長する神経細胞であればどのような神経細胞でも用いることができる。培養条件としては、神経突起の伸長を観察でき、セマフォリンの活性が測定できる条件であれば、特に制限されるものではない。
【００２４】
本発明におけるセマフォリン阻害剤の作用機序は、以下のように考えられる。すなわち、セマフォリンの神経突起伸長抑制活性あるいは成長円錐退縮活性の発現は、まずセマフォリンが神経細胞表面（成長円錐）上のレセプターに結合することに始まる。セマフォリンの結合したレセプターから細胞内にシグナルが伝達され最終的にアクチン繊維の脱重合が惹起され、その結果として神経突起伸長抑制、成長円錐退縮が生じる。セマフォリン活性阻害はこれら一連の反応のいずれかの部分を阻害・遮断することで達成される。上記セマフォリンのレセプターとしては、前述のセマフォリンのいずれかのレセプターであればよく、セマフォリンが結合することができれば、その改変体や、その一部のコンポーネントであってもよい。具体的には、ニューロピリン−１、プレキシン等が例示される。そして、本発明のセマフォリン阻害剤は、作用機序により限定されるものではなく、また上記の作用機序において、いずれの段階を阻害するものであっても本発明の範疇に含まれる。すなわち、上記セマフォリンのレセプター結合からアクチン繊維脱重合までに至る細胞内情報伝達に関わる反応を阻害することによりセマフォリン活性を阻害する化合物もまた、本発明の範疇に含まれる。なお、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法としては、当業者により適宜選択される方法であればどのような方法であってもよく、例えば、前述の抗体やアルカリホスファターゼなどの他のタンパク質を融合したセマフォリン、あるいはヒスタグや、フラグなどのタグを付けたセマフォリンを、被験物質存在下において当該セマフォリンレセプターあるいはレセプターコンポーネントを発現する細胞に対して結合させることで、セマフォリンのレセプター結合阻害活性を測定する方法を例示することができる。
【００２５】
例えば、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）のコラプス活性及び神経伸長阻害活性を共に阻害する、本発明者らにより見い出された化合物であるＳＰＦ−３０５９−１のニューロピリン−１への結合阻害活性を、実際に、アルカリホスファターゼ融合Ｓｅｍａ３Ａ（＝Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰ）及びニューロピリン−１発現ＣＯＳ７細胞を用いて調べたところ、ＳＰＦ−３０５９−１はＳｅｍａ３Ａ−ＡＰのニューロピリン−１への結合を濃度依存的に阻害することがわかった。更にその阻害の作用機序、すなわち、ＳＰＦ−３０５９−１がＳｅｍａ３Ａとそのレセプターのどちらに作用するかを解明するために、コラプス活性の測定実験において、（１）十分な阻害活性が認められる濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）のＳＰＦ−３０５９−１とＳｅｍａ３Ａをあらかじめ混合した試料を、後根神経節の培養液に添加した場合のコラプス活性と、（２）ＳＰＦ−３０５９−１を上記培養液に加えた後、Ｓｅｍａ３Ａを添加した場合のコラプス活性を比較した。（１）、（２）の場合ともに、培養液中のＳＰＦ−３０５９−１の最終濃度（０．０５μｇ／ｍｌ）は、同じになるように設定している。この濃度は、（２）においては、コラプス活性阻害は認められない濃度である。ところが、（１）においてはコラプス活性阻害が認められた。この結果は、Ｓｅｍａ３ＡにＳＰＦ−３０５９−１が接触したことによって、そのコラプス活性が失われたことを意味する。以上の検討から、ＳＰＦ−３０５９−１は、Ｓｅｍａ３Ａに直接作用することでレセプターへの結合を阻害するというメカニズムで作用することが考えられた。かかる知見より、本発明のセマフォリン阻害剤としては、セマフォリンと接触することによってそのレセプター結合を阻害し、ひいてはセマフォリンの機能・活性を阻害する化合物が好ましい。このように、コラプス活性を測定する方法やレセプター結合阻害活性を測定する方法などにより、セマフォリン阻害剤、特にセマフォリンと接触することによってセマフォリンの機能を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
【００２６】
本発明におけるセマフォリン阻害剤としては、セマフォリン阻害剤が、実質的に細胞増殖に影響を与えることがない化合物、すなわち細胞増殖抑制作用を示さない化合物、例えばセマフォリン阻害活性が認められる濃度の５０〜３０００倍以上の濃度でも細胞増殖抑制作用を示さない化合物が好ましい。また、本発明におけるセマフォリン阻害剤の分子量は特に制限されるものではないが、分子の拡散性、膜透過性、組織移行性、特に血液脳関門透過性などを考慮した場合、分子量が小さい化合物が望ましく、例えば分子量１００００未満の低分子化合物、好ましくは分子量５０００以下、より好ましくは分子量１０００以下、特に分子量６００以下の化合物を好適に例示することができる。また、本発明におけるセマフォリン阻害剤としては、非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物を例示することができる。かかる非ペプチド・非ヌクレオチド系化合物としては、後述するペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られる化合物の他、脂肪族化合物であるＭ１６２や、放線菌由来の化合物であるＡ７２１を例示することができる。
【００２７】
上記ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られる化合物としては、例えば、分子内に前記一般式［１］、一般式［２］、一般式［４］若しくは式［５］で表される基及び／又は前記一般式［６］若しくは一般式［７］で表される基を有し、セマフォリン阻害活性を有する化合物、好ましくは、前記一般式［８］で表される化合物、さらに好ましくは、前記一般式［１２］ないし［１６］で表される化合物を挙げることができる。これら化合物における、一般式［１］、［２］、［４］、［９］、［１０］、［１１］、［１２］、［１３］、［１４］及び［１６］において、Ｒ^１は、水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基、好ましくは水素原子又はカルボキシル基を表し、上記アルコキシカルボニル基としてはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基等を挙げることができ、中でもメトキシカルボニル基が好ましい。特に、一般式［１］、［４］、［９］、［１０］、［１１］、［１２］、［１３］及び［１６］におけるＲ^１は、好ましくは水素原子又はカルボキシル基を表し、一般式［２］及び［１４］におけるＲ^１は、好ましくは水素原子、カルボキシル基又はメトキシカルボニル基、更に好ましくは水素原子又はカルボキシル基を表す。同様に、一般式［１］、［２］、［４］、［９］、［１０］、［１１］、［１２］、［１３］、［１４］及び［１６］において、Ｒ^２は、水素原子、水酸基又はアシルオキシ基、好ましくは水素原子又は水酸基を表し、上記アシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ピバロイルオキシ基等を挙げることができる。一般式［２］及び［１４］において、Ｒ^３は、水素原子、メトキシメチル基又は式［３］に示される基を表す。一般式［６］、［７］、［８］、［１２］、［１３］、［１４］、［１５］及び［１６］において、Ｒ^４は、水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基、好ましくは水素原子又はカルボキシル基を表し、上記アルコキシカルボニル基としてはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基等を挙げることができ、中でもメトキシカルボニル基が好ましい。同様に、一般式［６］、［７］、［８］、［１２］、［１３］、［１４］、［１５］及び［１６］において、Ｒ^５は、水素原子、水酸基又はアシルオキシ基、好ましくは水素原子又は水酸基を表し、上記アシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ピバロイルオキシ基等を挙げることができる。一般式［８］において、Ｒ^６及びＲ^７は、（１）Ｒ^６がメチル基を表わすときは、Ｒ^７は式［２］に示される基、式［９］に示される基、又は式［１０］に示される基を表し、（２）Ｒ^６が式［５］に示される基又は式［１１］に示される基を表わすときは、Ｒ^７はアセチル基を表す。
【００２８】
上記の分子内に前記一般式［１］、一般式［２］、一般式［４］若しくは式［５］で表される基及び／又は一般式［６］若しくは一般式［７］で表される基を有する化合物、好ましくは、前記一般式［８］で表される化合物、特に前記一般式［１２］ないし［１６］で表される化合物は、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株の培養物からセマフォリン阻害活性を指標として得ることができる。また、このようにして得られたセマフォリン阻害活性を有する化合物等から公知の転換方法や公知の合成方法により作製した化合物からセマフォリン阻害活性を指標として同定することができる。本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物として、具体的には、後述する本件明細書実施例に記載された式［１７］〜［３７］に示される化合物、より詳細には、式［１７］、［２０］、［２３］、［２４］及び［３２］に示される一般式［１２］で表される化合物や、式［１８］、［１９］、［２１］、［２５］、［２６］、［２７］及び［２８］に示される一般式［１３］で表される化合物や、式［２２］、［３０］、［３１］、［３４］、［３６］及び［３７］に示される一般式［１４］で表される化合物や、式［２９］及び［３５］に示される一般式［１５］で表される化合物や、式［３３］に示される一般式［１６］で表される化合物を例示することができる。なお、上記具体的に例示された化合物は、式［１７］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−１（特開平５−２３９０５０号公報）、式［１８］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２（Pure & Appl. Chem. 66, 2383-2386, 1994）及び式［１９］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−５（Pure & Appl. Chem. 66, 2383-2386, 1994、特表平６−５０６２０２号公報）を除き、いずれも新規化合物である。
【００２９】
また、本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物においては、それらの塩やそれらの誘導体、好ましくは医薬的又は獣医薬的に許容される塩や誘導体も本発明の範疇に含まれる。ここで、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩や、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩や、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸塩などを挙げることができる。また誘導体としては、化合物のカルボキシル基や水酸基がエステル基に変換された誘導体が挙げられ、例えば水酸基がアセチル基、プロピオニル基などの炭素数２〜５のアシル基でアシル化された誘導体や、カルボキシル基がメチルエステル、エチルエステルなどの炭素数２から５のエステルへ変換された誘導体等を挙げることができる。
【００３０】
本発明の化合物、好ましくはセマフォリン阻害活性を有する化合物、特に、ペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られ、セマフォリン阻害活性を有する化合物としては、前記一般式［１２］（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は先に説明したとおり）において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物、好ましくは、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物、例えばＲ^２が水酸基を表す化合物（Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^５が水素原子を表す化合物等）やＲ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２が水酸基を表す上記化合物等を例示することができ、具体的には、式［２０］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３、［２３］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−７、［２４］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−９及び［３２］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３０を挙げることができる。また、本発明の化合物には、上記一般式［１２］で表される化合物の医薬的に許容される塩や誘導体も含まれる。
【００３１】
また、本発明の化合物、好ましくはセマフォリン阻害活性を有する化合物、特に、ペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られ、セマフォリン阻害活性を有する化合物としては、前記一般式［１３］（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は先に説明したとおり）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物、好ましくは、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物、例えばＲ^２が水酸基を表す化合物（Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^５が水素原子を表す化合物等）やＲ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物、Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^５が水酸基を表す上記化合物等を例示することができ、具体的には、式［２１］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−４、［２５］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−１２、［２６］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２４、［２７］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２５及び［２８］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２６を挙げることができる。さらに、本発明の化合物には、上記一般式［１３］で表される化合物の医薬的に許容される塩や誘導体も含まれる。
【００３２】
また、本発明の化合物、好ましくはセマフォリン阻害活性を有する化合物、特に、ペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られ、セマフォリン阻害活性を有する化合物としては、前記一般式［１４］（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は先に説明したとおり）で表される化合物、好ましくは、Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物、例えばＲ^２が水酸基を表す化合物（Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^５が水素原子を表す化合物等）やＲ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^１がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表し、Ｒ^３がメトキシメチル基を表す化合物、Ｒ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表す化合物、特にＲ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^３が前記式［３］に示される基を表す化合物等を例示することができ、具体的には、式［２２］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−６、［３０］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２８、［３１］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−２９、［３４］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３５、［３６］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３７及び［３７］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３９を挙げることができる。さらに、本発明の化合物には、上記一般式［１４］で表される化合物の医薬的に許容される塩や誘導体も含まれる。
【００３３】
また、本発明の化合物、好ましくはセマフォリン阻害活性を有する化合物、特に、ペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られ、セマフォリン阻害活性を有する化合物としては、前記一般式［１５］（式中、Ｒ^４及びＲ^５は先に説明したとおり）で表される化合物、好ましくは、Ｒ^５が水酸基表す化合物、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物等を例示することができ、具体的には、式［２９］に示される化合物ＳＰＦ−０３０５９−２７及び［３５］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３６を挙げることができる。さらに、本発明の化合物には、上記一般式［１５］で表される化合物の医薬的に許容される塩や誘導体も含まれる。
【００３４】
また、本発明の化合物、好ましくはセマフォリン阻害活性を有する化合物、特に、ペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株の培養物から得られ、セマフォリン阻害活性を有する化合物としては、前記一般式［１６］（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は先に説明したとおり）で表される化合物、好ましくはＲ^２及びＲ^５の少なくとも一方が水酸基を表す化合物、特にＲ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物、Ｒ^４がカルボキシル基を表す上記化合物等を例示することができ、具体的には、式［３３］に示される化合物ＳＰＦ−３０５９−３４を挙げることができる。さらに、本発明の化合物には、上記一般式［１６］で表される化合物の医薬的に許容される塩や誘導体も含まれる。
【００３５】
そして、分子内に前記一般式［１］、一般式［２］、一般式［４］若しくは式［５］で表される基及び／又は前記一般式［６］若しくは一般式［７］で表される基を有し、セマフォリン阻害活性を有する化合物、好ましくは、前記一般式［８］で表される化合物、さらに好ましくは、前記一般式［１２］ないし［１６］で表される化合物、より具体的には上記の式［１７］〜［３７］等に示される本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物は、いずれも本発明者らが大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビＳＰＦ−３０５９株を培養することにより効果的に得ることができる。ＳＰＦ−３０５９株は次のような菌学的性質を有する。
【００３６】
（ａ）培養的・形態的性質
麦芽エキス寒天培地上で、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．８〜２．９ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は黄色、コロニー裏面は濃い黄色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ポテト・グルコース寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．２〜３．３ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面の色は白色又はクリーム色、コロニー裏面は濃い黄色又は黄褐色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。ツアペック寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径３．１〜３．２ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色又は灰色、コロニー裏面はクリーム色であり、可溶性色素の産生及び胞子形成は認められない。オートミール寒天培地（日本製薬製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は遅く、２５℃、２１日で直径２．０〜２．１ｃｍ、綿毛状を呈し、コロニー表面は白色、灰緑色又は黄色、コロニー裏面はクリーム色又は灰色であり、可溶性色素の産生は認められないが、分生胞子を形成する。分生子柄は平滑、長さ５〜２０μｍであり、分生子柄の先端に３〜６個のフィアライドを単輪生する。フィアライドは長さ３〜４μｍであり、その先端から分生子が２〜１０個の連鎖を形成する。分生子は球形で、直径２．２〜２．４μｍ、表面には縦に通常１０本のしわがある。テレオモルフは認められない。
【００３７】
（ｂ）生理学的性質
(1)生育ｐＨ範囲
サブローブロス中、２７℃、３日間の振盪培養における生育は次の通り。
ｐＨ 生育
３．１ −
４．５ ＋
５．５ ＋＋
７．１ ＋＋＋
８．０ ＋＋
９．０ ±
１０．０ −
(2)生育温度範囲
オートミール寒天培地上、３８℃、５日間の培養で生育が認められる。
以上の菌学的性質より、本菌株をペニシリウム属に属する菌株であると同定し、ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９と命名した。本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、２００１年７月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３として寄託されている。
【００３８】
上記ＳＰＦ−３０５９株の培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養又は通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、ヒスチジン等のアミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。そして、培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度を挙げることができ、培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲を挙げることができ、培養期間としては例えば、５〜１０日間の範囲を例示することができる。
【００３９】
上記式［１７］〜［３７］等に示される本発明のセマフォリン阻害剤を構成する化合物を培養液から単離・精製するには、微生物の生産する二次代謝物の培養物から、通常使用される単離・精製手段を用いることができる。培養液上清から目的物を単離・精製する場合は、培養濾液からの通常の単離・精製法、例えば溶媒抽出、イオン交換樹脂、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー等を用いることができ、これらの単離・精製法は単独又は組み合わせて行うことができる。また、培養菌体から目的物を単離・精製する場合は、濾過又は遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン、メタノール等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができ、抽出物は培養液上清からの単離・精製と同様の方法で、目的化合物を得ることができる。該目的化合物は、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の適当な溶媒を用いて、約１当量の塩基を作用させることによって、塩とすることもできる。また、該目的化合物は、公知の方法で水酸基をアシル化したり、カルボキシル基をエステル化することができる。例えば、適当な有機溶媒中、塩基の存在下、無水酢酸やアセチルクロリド等のアシル化剤を加えることによって、水酸基をアシル化することや、あるいは、適当な有機溶媒中、塩基の存在下、ヨウ化メチル、臭化エチルなどのハロゲン化アルキルを用いてカルボキシル基をエステル化することができる。該有機溶媒としてはアセトン、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル、ＤＭＦ、ピリジン等が挙げられる。塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム等が挙げられる。
【００４０】
さらに、本発明における別のセマフォリン阻害剤として、実施例に記載のＭ１６２やＡ７２１が挙げられる。Ｍ１６２は脂肪族化合物であり、また紫外吸収スペクトルが弱い化合物であり、Ａ７２１は放線菌由来で分子量４３７、紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）３９７ｎｍで極大を有する天然物である。これらのことから、Ｍ１６２やＡ７２１は、前記式［１７］〜［３７］等に示される化合物とは構造・骨格の全く異なる低分子化合物である。
【００４１】
本発明の脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤は、神経伸長反発因子阻害剤、特に上記セマフォリン阻害剤を有効成分とする前記の神経再生促進剤を含有するものであれば特に制限されるものではないが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００４２】
投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、病床部位に局所的に投与する方法が好ましい。神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要するので、その間セマフォリンの活性を抑制するために１回又は２回以上投与することが好ましい。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。投与量は一回当たりセマフォリン阻害剤として数百μｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ以下を用いることができ、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いたり、オスモティックポンプなどで長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。そして、これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてセマフォリンの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
【００４３】
上記脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患としては、末梢神経や中枢神経の傷害、変性疾患、すなわち老化等に起因する嗅覚異常症、脊髄損傷などの外傷による嗅覚以外の神経傷害、脳梗塞などに起因する神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病やパーキンソン病、ＡＬＳといった神経変性疾患、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、外傷性神経変性疾患などを具体的に挙げることができる。さらに、受容体がニューロピリンである点が共通であるＶＥＧＦ１６５が関与する血管新生を伴う疾患も、対象となる。
【００４４】
また、本発明の神経再生促進剤の用途は、神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤等の医薬品に限定されることなく、動物薬、さらにはセマフォリンシグナル阻害剤として産業上重要な実験試薬としても利用が可能である。本発明の神経再生促進剤はセマフォリン阻害剤を有効成分として含むことから、末梢神経である嗅神経の再生や、脳や脊髄の中の嗅球、大脳皮質、海馬、線条体、視床、間脳、中脳、小脳、橋、延髄、精髄、網膜などにあって脳脊髄関門で区切られた領域である中枢内での神経の再生を促進する。
【００４５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１（化合物ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５の製造）
グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地７５ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）を１白金耳接種し、２７℃、１３０ｒｐｍにて５日間振盪培養して前培養とした。２リットル容坂口フラスコ１０本に上記と同じ組成の培地を３００ｍｌずつ分注しオートクレーブで滅菌した後、上記の前培養液を６ｍｌずつ添加し、２７℃、１１０ｒｐｍにて７日間振盪培養した。
【００４７】
培養終了後、培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清液と菌体に分離し、上清液画分を３リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で抽出した。菌体画分は３リットルのアセトンで抽出し、濾過、濃縮後、水溶液となったところで１リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で抽出した。両抽出液を混合し、減圧濃縮して粗抽出物１０．４ｇを得た。これを１００ｍｌのメタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物２．６ｇを得た。これを１００ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＳＫｇｅｌ ＴＯＹＯＰＥＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物１．６ｇを得た。これを５０ｍｇずつ１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、逆相ＨＰＬＣに付した。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ−Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（２０×５０ｍｍと２０×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合３５％から６５％へ９０分間の直線的グラジエント、流速：５ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間５９分、７４分、８１分の溶出画分を集め、減圧下に溶媒を留去することによって、それぞれ化合物ＳＰＦ−３０５９−５（３４．２ｍｇ）、ＳＰＦ−３０５９−１（６４．１ｍｇ）、ＳＰＦ−３０５９−２（１２．０ｍｇ）を得た。得られた化合物の物理化学的性状はそれぞれ次の通りである。
【００４８】
（化合物ＳＰＦ−３０５９−１）
性状：黄色粉末
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５７９．０７７２
計算値：５７９．０７７６
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１８Ｏ_１４
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
241(31,600)、315(23,400)、365(16,500)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3400、1701、1615、1570、1457、1273
^１Ｈ―ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.28、2.67、2.69、4.6〜4.7、5.02、6.40、6.91、7.91、8.52、9.33、
11.1〜11.6、12.8
^１３Ｃ―ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.5、17.0、32.4、56.2、65.7、68.0、102.3、104.2、108.8、110.1、
118.2、118.5、120.6、122.2、125.8、127.7、132.4、134.9、137.6、139.1、
140.7、140.8、150.1、150.2、152.2、153.8、154.5、156.3、167.5、167.6、
172.7、172.8、186.3、199.1、202.7、202.9
これらから化合物ＳＰＦ−３０５９−１の構造式を、下式［１７］：
【化３２】
（互変異性体）と決定した。
【００４９】
（化合物ＳＰＦ−３０５９−２）
性状：クリーム色粉末
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５３３．０７１０
計算値：５３３．０７２１
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１６Ｏ_１２
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
209(40,600)、236(42,600)、283(28,500)、323(25,400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3266、1678、1654、1623、1562、1471、1296
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.53(6H,s)、6.93(1H,s)、6.95(1H,s)、7.47(1H,s)、8.15(1H,s)、8.54(1H,s)、9.38(1H,brs)、9.89(1H,brs)、10.78(1H,brs)、11.37(1H,brs)、12.68(1H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.1、32.1、102.3、103.1、108.7、112.5、113.5、119.6、119.8、120.9、
126.2、132.4、133.6、136.1、141.7、144.5、150.71、150.74、152.49、
152.54、152.7、154.4、167.4、172.9、173.4、199.2、201.2
これらから化合物ＳＰＦ−３０５９−２の構造式を次式［１８］：
【化３３】
と決定した。
【００５０】
（化合物ＳＰＦ−３０５９−５）
性状：クリーム色粉末
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５７７．０６１５
計算値：５７７．０６１９
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１６Ｏ_１４
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
229(35,800)、284(22,600)、322(21,000
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3260、1684、1626、1567、1467、1288
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.53(3H,s)、2.55(3H,s)、6.93(1H,s)、6.96(1H,s)、8.17(1H,s)、8.53(1H,s)、9.5〜13.0(6H)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.1、32.1、102.26、102.32、109.9、112.4、119.6、119.8、120.3、120.9、
126.3、132.5、133.4、136.2、141.2、141.7、150.4、150.8、152.1、152.68、
152.73、154.5、167.4、167.5、172.5、172.9、199.1、201.1
これらから化合物ＳＰＦ−３０５９−５の構造式を次式［１９］：
【化３４】
と決定した。
【００５１】
実施例２（Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する本発明の化合物ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５、Ｍ１６２、Ａ７２１の抑制作用）
ポリリジンを塗布した９６ウェルプレート（住友ベークライト）にさらにラミニン塗布（２０μｇ／ｍｌのラミニン、室温１時間）を行った。各ウェルに１００μｌの培地（１０％の牛胎仔血清、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＦ１２培地）を入れ、ここに７日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節を接種し、１６〜２０時間５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。その後、対象化合物を種々の濃度で培地に添加し１時間培養後、２ユニット／ｍｌのマウスセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）を添加し、更に１時間培養した。１時間経過後、速やかに最終濃度１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１５分間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を測定した。また、Ｓｅｍａ３Ａを添加しないウェルを対照とした。結果を図１及び図２に示す。
【００５２】
図１及び図２に示すように、化合物の濃度が増すに従って退縮する成長円錐の割合が減少した。一方、化合物単独では何ら影響を及ぼさなかった。これらの結果から、これら化合物（ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５、Ｍ１６２、Ａ７２１）は、Ｓｅｍａ３Ａの成長円錐退縮活性を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。なお、図中の縦軸は退縮した成長円錐の割合を、横軸は化合物の濃度を示し、●■▲は化合物処理後にＳｅｍａ３Ａを添加した場合、○□△はＳｅｍａ３Ａを添加しなかった場合の結果を示す。さらに、以下の方法で阻害剤のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を測定した。すなわち、陰性対照群（化合物、Ｓｅｍａ３Ａ共に不添加）の成長円錐退縮率（Ａ）％を求め、次に陽性対照群（化合物不添加、Ｓｅｍａ３Ａ添加）の成長円錐退縮率（Ｂ）％を求めて、各化合物における成長円錐退縮率が（Ａ＋Ｂ）／２％になる濃度をグラフより求めＩＣ５０値とした。結果を以下に示す。
化合物 ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）
ＳＰＦ−３０５９−１ ＜０．１
ＳＰＦ−３０５９−２ ＜０．１
ＳＰＦ−３０５９−５ ＜０．１
Ｍ１６２ ２．０
Ａ７２１ ５．０
【００５３】
かかる結果から、ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５は強くセマフォリンを阻害することがわかる。
【００５４】
実施例３（Ｓｅｍａ６Ｃのコラプス活性に対するＳＰＦ−３０５９−１の抑制作用）
マウスセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）に代えてラットセマフォリン６Ｃ−ＡＰ（Ｓｅｍａ６Ｃ−ＡＰ：Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外領域とヒト胎盤由来アルカリホスファターゼの融合蛋白）を、７日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節に代えて８日齢ニワトリ胚から摘出した後根神経節を用いる以外は実施例２と同様に行い、種々の濃度の化合物ＳＰＦ−３０５９−１を添加後にＳｅｍａ６Ｃ−ＡＰを加えたときの成長円錐の退縮の割合を測定した。結果を図３に示す。図中の縦軸は退縮した成長円錐の割合を、横軸はＳＰＦ−３０５９−１の濃度を示し、●はＳＰＦ−３０５９−１処理後にＳｅｍａ６Ｃ−ＡＰを添加した場合、○はＳｅｍａ６Ｃ−ＡＰを添加しなかった場合の結果を示す。図３に示されるように、ＳＰＦ−３０５９−１の濃度が増すに従って退縮する成長円錐の割合が減少した。一方、ＳＰＦ−３０５９−１単独では何ら影響を及ぼさなかった。これらの結果から、ＳＰＦ−３０５９−１は、Ｓｅｍａ６Ｃ−ＡＰの成長円錐退縮活性を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。
【００５５】
実施例４（セマフォリン３Ａの神経伸長阻害活性の阻害剤による抑制）
Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊と７〜８日齢ニワトリ胚後根神経節のコラーゲンゲル共培養（Neuroprotocols 4, 116, 1994）により、対象化合物（ＳＰＦ−３０５９−１、Ｍ１６２、Ａ７２１）が、Ｓｅｍａ３Ａに対する持続的阻害作用を示すかどうかを検討した。Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊は以下の方法で作製した。一夜培養したＣＯＳ７細胞（１０００００細胞／３５ｍｍ培養皿）にＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロッシュ）を用いて１μｇのＳｅｍａ３Ａ発現プラスミドを導入した。トランスフェクション開始２．５時間経過後、トリプシンを用いてＣＯＳ７細胞を培養皿から剥離し、遠心分離により集め、２００μｌの培地に再懸濁した。細胞懸濁液２０μｌを培養皿の蓋（内側）に載置し、この蓋を反転させ２０時間培養した（ハンギングドロップカルチャー）（Cell 78, 425, 1994）。培養後、凝集したＣＯＳ７細胞（塊）を培地に回収し、０．５ｍｍ径の大きさにトリミングした。このＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊と上記後根神経節を０．５〜１ｍｍの距離を隔てて０．２％のコラーゲンゲル内に並置し、このコラーゲンゲルを上記化合物を種々の濃度で含む培地内で２日間５％ＣＯ_２、３７℃の条件下に培養した。その後、速やかに最終濃度が１％になるようにグルタルアルデヒドを添加し、室温に１時間放置して組織片を固定した後、顕微鏡下で神経突起伸長の様子を観察した。結果を図４に示す。
【００５６】
上記コラーゲンゲル内では、Ｓｅｍａ３Ａ発現プラスミドを導入したＣＯＳ７細胞塊からＳｅｍａ３Ａが分泌され濃度勾配が形成される（ＣＯＳ７細胞塊に近い方が高濃度）。被験化合物を含まない培地を用いた場合、神経突起はＳｅｍａ３Ａ濃度が高いＣＯＳ７細胞塊が存在する方向には伸長できず、反対方向のみに伸長するが、化合物ＳＰＦ−３０５９−１やＭ１６２を培地に添加した場合、Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊方向への神経突起伸長が認められた。このＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊方向への神経突起伸長は化合物濃度が高いほど顕著であり、濃度依存性が認められた。この結果からＳＰＦ−３０５９−１及びＭ１６２はＳｅｍａ３Ａの活性を持続的に阻害し得ることが明らかとなった。ただし、Ａ７２１を添加した場合についてのみ、ＳＰＦ−３０５９−１及びＭ１６２のようなＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ７細胞塊方向への神経突起伸長は認められなかった。このことからＡ７２１はＳｅｍａ３Ａに対する持続的阻害作用を有さないことが分かった。
【００５７】
実施例５（セマフォリン３Ａの神経伸長阻害活性の阻害剤による抑制）
実施例４と同様にして、神経伸長阻害活性の抑制の検討を、化合物ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５について行った。Ｓｅｍａ３Ａ非発現ＣＯＳ７細胞を用いた対照群と同様の、完全に同心円状に神経突起が伸長している場合を＋＋＋（強いＳｅｍａ３Ａ阻害効果）、ほぼ同心円状だがＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ細胞側への伸長がやや抑えられている場合を＋＋、半月状にＳｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ細胞側への伸長がかなり抑えられている場合を＋、Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ細胞側への伸長が全くない場合（Ｓｅｍａ３Ａ阻害効果なし）を−の判定とした測定結果を次に示す。
化合物 被験化合物濃度（μｇ／ｍｌ）
０．５ １．０ ２．０
ＳＰＦ−３０５９−１ ＋ ＋＋ ＋＋＋
ＳＰＦ−３０５９−２ ＋ ＋＋ ＋＋＋
ＳＰＦ−３０５９−５ ＋ ＋＋ ＋＋
ＰＢＳ（対照） − − −
【００５８】
この結果から、化合物ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５は、４８時間の培養期間中、Ｓｅｍａ３Ａ発現ＣＯＳ細胞から分泌されるＳｅｍａ３Ａの作用を持続的に阻害することが判明した。
【００５９】
実施例６（セマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のインビボにおける嗅神経切断に対する神経再生促進作用）
雄性Wistar系ラット（６．５週齢）を日本チャールズリバー（株）より購入し、専用飼育室で自由摂餌、摂水下で飼育した。ＳＰＦ−３０５９−１を１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳにて希釈したものをサンプル液とし、浸透圧ポンプ（alzet 2004, ALZA co., USA）に充填した。なお、対照としてＰＢＳを充填したものを用いた。これらサンプル液等の調製は手術前日に行い、浸透圧ポンプはＰＢＳに浸漬、室温で一晩静置しておいた。手術直前にサンプル液等を満たしたシリコンチューブの一方にＬ型カニューレを接続し、他方をポンプに接続した。ラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔し、脳定位固定装置に頭部を固定した。頭部皮膚を正中に沿って切開し、ドリルで頭蓋嗅球上を開口し、嗅球（前部）を露出した。嗅神経切断用ナイフ（カミソリを幅１．５ｍｍに切断したもの）を嗅球と篩板の間に挿入し嗅神経を切断した。この操作により嗅球上部に投射する嗅神経が切断される。頭蓋嗅球上の開口に、カニューレ先端が切断部位付近に位置するよう、Ｌ型カニューレを外科用瞬間接着剤、歯科用セメントで固定した。サンプル排出量は６μｌ（６μｇ）／日に設定した。ポンプを背首部皮下に挿入、創部を縫合し、動物を回復させた。
【００６０】
術後２週間及び３週間にペントバルビタールで麻酔したラットを仰向けに置き、マイクロシリンジを用いて鼻腔内に１００μｌの１％のＷＧＡ−ＨＲＰ／ＰＢＳ（ＴＯＹＯＢＯ）を投与した。ＨＲＰ投与２４時間後、再度ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔し、胸部を切開して左心室よりＰＢＳを灌流した後、２００ｍｌの４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを灌流した。嗅球を摘出し、３０％のシュークロースを含むＰＢＳに入れ、４℃で一夜浸漬後、ドライアイスで凍結した。嗅球をドライアイス上でＯＴＣコンパウンドに包埋後、クリオスタットで３０μｍの切片を作製し、トリス緩衝液（ＴＢＳ）中に分取した（３枚おきに１枚）。ＴＢＳにて洗浄後、０．４８％のＤＡＢ、０．０９６％のＮｉＣｌ、０．０３６％のＨ_２Ｏを含む０．１ＭのＴＢＳを添加し、１５分間反応させた。ＴＢＳにて洗浄後、切片をスライドグラス上に乗せ、乾燥後に封入した。顕微鏡下で観察し、嗅球外側部の糸球体のＨＲＰ反応を観察した。
【００６１】
頭頂より何枚目の嗅球の水平切片からＨＲＰ陽性の糸球体が現れるかで嗅神経の再生を定量評価した。結果を図５及び表１に示す。評価には、２週間目にＨＲＰ投与時に窒息死した１匹以外の全例を採用した。ＳＰＦ−３０５９−１投与の場合、２週目及び３週目とも対照のＰＢＳ投与よりも浅い切片でＨＲＰ陽性となることが示された。ＳＰＦ−３０５９−１投与群のＰＢＳ投与群に対する有意差検定を行ったところ、３週目で有意にＰＢＳ投与よりも浅い切片でＨＲＰ陽性となることが示された。これらの結果より、成体ラットの嗅神経切断モデルにおいて、ＳＰＦ−３０５９−１は顕著な神経再生の促進作用を示すことが分かった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
実施例７（セマフォリン阻害剤Ｍ１６２及びＡ７２１のインビボにおける嗅神経切断に対する神経再生促進作用）
実施例６と同じ実験を、Ｍ１６２及びＡ７２１を用いて行った。結果を図６に示す。この結果から、Ｍ１６２にはインビボにおける神経再生の促進作用があるが、Ａ７２１にはかかる作用がないことがわかった。
【００６４】
実施例８（セマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のインビボにおける坐骨神経挫滅に対する神経再生促進作用）
Wistar系雄性ラットを７週齢にて購入し（日本チャールズリバー）、１２時間明暗サイクルの条件下で飼育した。ラット用固形飼料（日本クレア、ＣＥ２）と水は自由に摂取させ、約１週間の予備飼育を経て実験に使用した。ペントバルビタール麻酔下にて大腿部の坐骨神経を露出し、これを５ｍｍ幅ピンセットで３０秒間挟むことで挫滅した。挫滅部位は１０−０ナイロン糸にてマーキングした。ＳＰＦ−３０５９−１はＰＢＳに８．３ｕｇ／ｍｌで溶解し、浸透圧ポンプ（２ＭＬ２，５μｌ／ｈｒ，alzet社）を用いて流速１μｇ／ｄａｙで障害部位に１４日間連続的に局所投与した。対照群にはＰＢＳ投与した。投与１４日後に坐骨神経を摘出し、障害部位（マーキングの位置）から２ｍｍ、６ｍｍ、１０ｍｍの遠位部位で坐骨神経を切り出し、２．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸バッファー中で一昼夜固定した。固定後、アルコール脱水を経て、エポキシ樹脂に包埋した。坐骨神経の横断切片を作製しトルイジン染色を施し光顕下にて写真をとり有髄線維数を測定した。有髄線維密度は、坐骨神経の面積を測定後、面積を有髄線維数で割って算出した。結果を図７に示す。挫滅部位から２ｍｍ及び６ｍｍ遠位側においてＰＢＳ投与群に比べＳＰＦ−３０５９−１投与群で有髄線維密度の増加が認められた。この結果からＳＰＦ−３０５９−１に障害を受けた坐骨神経の再生を促進する効果のあることがわかった。
【００６５】
実施例９（セマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１の細胞増殖への影響）
ＣＯＳ７細胞を９６ウェルプレート（培地１００μｌ／ウェル）に１ウェル当たり１００００個撒き込み、同時に種々の濃度のＳＰＦ−３０５９−１を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で２日間培養した。その後、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに１０μｌ添加し、さらに１時間培養した後、培養上清を除き、５０μｌのＤＭＳＯで細胞内に蓄積したホルマザン（Formazan；生細胞中で生成されたＭＴＴ変換体）を溶解し、５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＣＯＳ７細胞の増殖を測定した。結果を図８に示す。図８に示すように、ＳＰＦ−３０５９−１存在下で培養しても非存在下の場合と同程度の細胞増殖が認められた。この結果からＳＰＦ−３０５９−１に細胞増殖抑制活性のないことが明らかとなった。なお、図中の縦軸は細胞増殖を、横軸はＳＰＦ−３０５９−１の濃度を示し、各カラムには標準偏差（ｎ＝４）を付加した。
【００６６】
実施例１０（セマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５の細胞増殖への影響）
実施例９と同様の細胞増殖への影響の検討を、化合物ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５について行った。これら化合物を用いたウェルをサンプル、ＰＢＳを用いたウェルを対照とし、細胞を添加せずに同様に実験を行なったウェルをブランクとし、以下の式で求められる細胞増殖阻害率のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を測定した。
【００６７】
細胞増殖阻害率（％）＝（１−（サンプルウエルの吸光度−ブランクウエルの吸光度）／（対照ウエルの吸光度−ブランクウエルの吸光度））×１００
【００６８】
上記各化合物の細胞増殖阻害率の測定結果は次の通りとなり、セマフォリン阻害活性が認められる濃度の１０００〜３０００倍以上の濃度でも細胞毒性は認められないことが判明した。
化合物 ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）
ＳＰＦ−３０５９−１ ＞３００
ＳＰＦ−３０５９−２ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−５ ＞３００
【００６９】
実施例１１（Ｓｅｍａ３Ａのレセプター結合に対する阻害活性）
ＳＰＦ−３０５９−１がＳｅｍａ３Ａとそのレセプター複合体の構成成分であるニューロピリン−１への結合を阻害するかどうかをレセプター結合実験により調べた。現在、Ｓｅｍａ３Ａレセプターの構成成分にはニューロピリン−１とプレキシンＡ１が知られているが、Ｓｅｍａ３Ａの結合には主にニューロピリン−１の寄与が大きいことがわかっている。レセプター結合実験のリガンドにはアルカリホスファターゼ（ヒト由来：熱耐性）融合Ｓｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰ）を用い、そのレセプターへの結合量はアルカリホスファターゼ活性を指標に検出した。Ｓｅｍａ３Ａはマウス由来のものを用いた。当該Ｓｅｍａ３Ａの７５８番目のアミノ酸からＣ末端側にアルカリホスファターゼを融合した組換え遺伝子を作製し、これをＣＯＳ７細胞に導入し発現分泌させることでＳｅｍａ３Ａ−ＡＰを調製した。
レセプター結合実験は以下に記載する方法で行った。ニューロピリン−１発現プラスミド（ｐＵＣＳＲα−ニューロピリン‐１）をＣＯＳ７細胞に導入し、２４時間培養した。この細胞はニューロピリン−１を細胞表面に発現する。細胞をＨＢＨ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．２］，０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡塩緩衝液）で１回洗浄した後、Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰを含むＨＢＨ緩衝液と種々濃度（０〜１０μｇ／ｍｌ）のＳＰＦ−３０５９−１を同時に添加した。振とうしながら１時間室温に放置することでＳｅｍａ３Ａ−ＡＰをニューロピリン−１発現細胞に結合させた後、上清を除き、過剰のＳｅｍａ３Ａ−ＡＰを除くためＨＢＨ緩衝液で細胞を６回洗浄した。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で細胞に結合したＳｅｍａ３Ａ−ＡＰを可溶化した（細胞抽出液）。遠心により細胞抽出液中の不溶物を除いた後、６５℃で１時間処理することにより細胞自身が持つアルカリホスファターゼを失活させた。この細胞抽出液中のＳｅｍａ３Ａ−ＡＰ由来のアルカリホスファターゼ活性（＝Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰ結合量）を測定した。一定量の細胞抽出液をＳＥＡＰ緩衝液（１Ｍ diethanolamine，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ L-homoarginine）、発色基質（１０ｍＭ p-nitirophenyl phosphate）と混合し３７℃で保温した後、溶液の４０５ｎｍの吸光度（p-nitrophenol：p-nitirophenyl phosphateからアルカリホスファターゼにより生成）を測定した。結果を図９に示す。その結果、Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰの結合量がＳＰＦ−３０５９−１の濃度依存的に減少した。このことからＳＰＦ−３０５９−１のセマフォリン３Ａ活性阻害はＳｅｍａ３Ａのレセプター結合阻害によることが明らかとなった。
【００７０】
実施例１２（Ｓｅｍａ３Ａの阻害剤との接触によるコラプス活性阻害）
Ｓｅｍａ３Ａをあらかじめ十分阻害活性の認められる濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）のＳＰＦ−３０５９−１と混合した（＝Ｐｒｅ−Ｍｉｘサンプル）。その後、Ｐｒｅ−Ｍｉｘサンプルを後根神経節の培養液に添加し、Ｓｅｍａ３Ａの成長円錐退縮活性が阻害されるかどうかを調べた。Ｐｒｅ−Ｍｉｘサンプルの添加量は培養液の１／４容量とした。すなわち、後根神経節の培養液への添加時にはＳＰＦ−３０５９−１濃度は、０．２５μｇ／ｍｌから０．０５μｇ／ｍｌに希釈（１／５倍）される。この濃度はＳＰＦ−３０５９−１とＳｅｍａ３Ａを別々に添加した際には阻害活性の認められない濃度である。結果を図１０に示す。図１０から、Ｐｒｅ−Ｍｉｘサンプルを後根神経節の培養液に添加したものではＳＰＦ−３０５９−１の最終濃度が０．０５μｇ／ｍｌ（阻害活性のない濃度）であるにもかかわらず、Ｓｅｍａ３Ａ活性が阻害されることがわかる。すなわち、ＳＰＦ−３０５９−１に接触したＳｅｍａ３Ａはその時点で活性が阻害されるということになる。この結果からＳＰＦ−３０５９−１の作用点はＳｅｍａ３Ａであることが考えられた。
【００７１】
実施例１３（セマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のインビボにおける脊髄神経（大脳皮質‐脊髄路）切断に対する神経再生促進作用）
雄性Wistar系ラット（１０週齢）を日本チャールズリバー（株）より購入し、専用飼育室で自由摂餌、摂水下で飼育した。約１週間の予備飼育を経て実験に使用した。ＳＰＦ−３０５９−１は、ＰＢＳにて０．１ｍｇ／ｍＬに調製した。対照としてＰＢＳを用いた。薬剤は浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社製 ｍｏｄｅｌ２００４、４週投与用、流速０．２５μｌ／ｈｒ）に充填した。ポンプにはサンプル液等を満たしたカニューレを接続した。生理食塩水中で、室温にて一夜、プレインキュベーションを行った。
【００７２】
ラットにペントバルビタールを腹腔内投与し（５０ｍｇ／ｋｇ）、麻酔下にて、背側胸髄部の皮膚、筋肉を切開し、Ｔ８〜Ｔ１２椎骨を露出した。顕微鏡下でＴ１１胸椎骨について椎弓切除（laminectomy）を施した。マニピュレーターに取り付けた眼科用ハサミを、正中線をまたいで硬膜表面より１．５ｍｍの位置まで刺入し、大脳皮質‐脊髄路を切断した。椎骨の開口部にスポンゼルを充填した。カニュレーションはＴ９椎骨より行なった。Ｔ９椎骨をサージカルドリルで穿孔して硬膜を露出した。注射針でカニューレを刺入する部分の硬膜に穿孔し、ポンプを接続したシリコンチューブを挿入した。Ｔ１１の脊損部にカニューレの先端が到達していることを確認し、椎骨の開口部にスポンゼルを充填して、外科用瞬間接着剤を少量染み込ませた。カニューレは近傍の筋肉に縫合糸で固定し、抜けるのを防止した。術部の筋肉を縫合した後、切開した皮膚を外科用クレンメで縫合した。サンプル排出量は０．６μｇ／日で、４週間連続投与した。
【００７３】
術後２週間後のラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔し、頭部を脳定位固定装置に固定した。頭部皮膚を正中に沿って切開し、ドリルで頭蓋を開口し、大脳を露出した。マイクロシリンジを用いて大脳皮質運動野に１０％のＤＢＡ（Dextran Biotinylated Amine）を０．１μｌずつ１８箇所に注入した。その後、創部を縫合し動物を回復させた。ＤＢＡは神経核から脊髄路神経に輸送される。２週間飼育後、再度ペントバルビタールで麻酔し、胸部を切開して左心室よりＰＢＳを灌流した後、２００ｍｌの４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを灌流した。脊髄（切断部）を摘出し、一夜同液中で後固定した。その後、３０％のシュークロースを含むＰＢＳに入れ、４℃で浸漬した。脊髄をＯＴＣコンパウンドに包埋後、ドライアイス上で凍結した。クリオスタットで３０μｍの切片を作製し、トリス緩衝液（ＴＢＳ）中に分取した。切片はＴＢＳにて洗浄後、ＡＢＣ反応液中に２時間浸漬した。洗浄後、ＤＢＡ基質にて視覚化し、プレパラートを作製した。顕微鏡下にて切断部位の再生神経線維の様子を観察した。本発明のＳＰＦ−３０５９−１投与の結果を図１１に、対照としてのＰＢＳ投与の結果を図１２に示す。図１１Ａ，Ｂ，Ｃ及び図１２Ａ，Ｂ，Ｃはそれぞれ傷害部付近の連続切片を示し、図１１Ｄ及び図１２Ｄはそれぞれ図１１Ｂ及び図１２Ｂの強拡大図である。ＳＰＦ−３０５９−１投与の場合、図１１Ｄに示されるように、傷害部吻側にＤＢＡの滞留（濃い矢頭）が観察され、滞留部から多数のＤＢＡ陽性線維が傷害部（薄い矢頭）に沿って尾側まで観察され、切断部位を回避して伸長する再生神経線維が多く認められた。一方、ＰＢＳ投与の場合、図１２Ｄに示されるように、傷害部吻側にＤＢＡの滞留（濃い矢頭）が観察され、ごく少数のＤＢＡ陽性線維が傷害部（薄い矢頭）に沿って尾側まで観察され、神経線維はごくわずかであった。これらの結果より、成体ラットの脊髄損傷モデルにおいて、ＳＰＦ−３０５９−１は神経再生の促進作用を示すことが分かった。
【００７４】
実施例１４（本発明の新規化合物の製造）
グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌを５０ｍｌ容の三角フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）を１白金耳接種し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前々培養とした。５００ｍｌ容三角フラスコ５本に上記と同じ組成の培地を１２５ｍｌずつ分注しオートクレーブで滅菌した後、上記の前々培養液を４ｍｌずつ添加し、２７℃、１８０ｒｐｍにて４日間回転振盪培養して前培養とした。５０リットル容ジャーファーメンターに、グルコース１．４３％、ショ糖３．５７％、綿実粉１．４３％、硝酸ナトリウム０．０７％、Ｌ−ヒスチジン０．０７％、リン酸２カリウム０．０３６％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．００１％、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製消泡剤）０．０１％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地を３０リットル分注し、高圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分）した後、上記の前培養液を５００ｍｌ添加し、２７℃、４００ｒｐｍ、通気量１５リットル／分にて９日間通気攪拌培養した。
【００７５】
培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上清液と菌体に分離し、上清液画分を２０リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で２回抽出した。菌体画分は３０リットルのアセトンで抽出し、濾過、濃縮後、水溶液となったところで１０リットルの酢酸エチル−蟻酸（９９：１）で抽出した。両抽出液を混合し、減圧濃縮して粗抽出物２２４ｇを得た。粗抽出物１００ｇを５００ｍｌのメタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、油状物４８．８ｇを得た。これを４００ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＳＫｇｅｌ ＴＯＹＯＰＥＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。活性画分を集め、溶媒を減圧留去し、粗精製物２１．８ｇを得た。これを２００ｍｇずつ２ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、分取逆相ＨＰＬＣに付した。分取逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ登録商標Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（φ５×１０ｃｍとφ５×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合４５％から７５％へ２時間の直線的グラジエント、流速：２５ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とし、溶出液を１分ずつ分取した。
【００７６】
上記分取した画分を分析用ＨＰＬＣで分析した。分析用ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ登録商標Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（φ４．６×１５０ｍｍ、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％蟻酸水溶液、溶出液Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液割合２０％から６７％へ７１．１分間の直線的グラジエント、流速：１．３ｍｌ／分、検出：２６０ｎｍにおける吸光度、とした。この分析用ＨＰＬＣにおける保持時間を指標に分取用ＨＰＬＣの溶出画分を集め、減圧下に溶媒を留去した後、再度分取用ＨＰＬＣに付して上記と同様に精製し、さらにＴＳＫｇｅｌ ＴＯＹＯＰＥＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（東ソー）を用いるカラムクロマトグラフィーに付して上記と同様に精製し、溶媒を減圧留去、乾燥することにより、以下に示す精製品を得た。
化合物 取得量（ｍｇ） 分析用ＨＰＬＣでの保持時間（分）
ＳＰＦ−３０５９−１２ ６．２ ３４．４
ＳＰＦ−３０５９−２４ ２８．０ ３４．５
ＳＰＦ−３０５９−４ １０．２ ３６．０
ＳＰＦ−３０５９−２５ ４．０ ３９．３
ＳＰＦ−３０５９−３４ ２．９ ４０．８
ＳＰＦ−３０５９−６ ３４．９ ４５．６
ＳＰＦ−３０５９−２７ １７．４ ４６．１
ＳＰＦ−３０５９−２６ ６．２ ４６．５
ＳＰＦ−３０５９−２８ １１．８ ４６．６
ＳＰＦ−３０５９−７ １３．０ ４７．０
ＳＰＦ−３０５９−３９ ２．８ ４９．９５
ＳＰＦ−３０５９−３７ ４．０ ５０．０
ＳＰＦ−３０５９−３ １１８．２ ５０．１
ＳＰＦ−３０５９−３５ １１．０ ５１．５
ＳＰＦ−３０５９−９ １００．９ ５２．７
ＳＰＦ−３０５９−２９ ４５．６ ５４．０
ＳＰＦ−３０５９−３６ ３．７ ５７．８
ＳＰＦ−３０５９−３０ ２３．５ ６３．０
得られた化合物の物理化学的性状は次の通り。
【００７７】
（ＳＰＦ−３０５９−３）
外観：黄色粉末
分子量：５３４
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１８Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５３５．０９０５
計算値：５３５．０８７７（Ｃ_２７Ｈ_１９Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
242(30,800)、317(22,700)、367(14,000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3356、1700、1652、1610、1515、1475、1283
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.28、2.29、2.68、2.69、4.62、4.62、4.64、4.72、5.03、6.38、6.40、6.90、6.91、7.44、7.98、8.54、8.90〜11.10、12.70
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.5、17.0、32.3、32.4、56.2、65.8、68.0、103.0、104.2、108.7、108.8、109.4、113.5、118.2、118.6、122.2、125.7、127.5、129.8、132.0、132.6、134.8、137.6、137.9、138.8、144.3、150.5、150.6、152.0、152.6、154.2、154.5、155.5、156.3、167.6、167.7、173.4、183.5、186.2、199.2、202.8、203.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３の構造式を、次式［２０］と決定した（互変異性体）。
【化３５】
【００７８】
（ＳＰＦ−３０５９−４）
外観：クリーム色粉末
分子量：５６０
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１６Ｏ_１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５６１．０６６７
計算値：５６１．０６７０（Ｃ_２８Ｈ_１７Ｏ_１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
221(35,600)、250(38,100)、276sh(25,800)、323(24,300)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3412、1665、1619、1563、1465、1427、1263
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.53(3H,s)、2.56(3H,s)、6.84(1H,d,2.1)、6.95(1H,s)、6.96(1H,d,2.1)、8.17(1H,s)、8.52(1H,s)、10.10〜11.40(3H,brs)、12.71(1H,brs)、13.26(1H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.2、32.1、102.3、103.2、110.1、112.4、112.8、119.6、120.3、120.8、126.3、133.1、133.4、136.7、137.5、141.7、150.8、152.3、152.7、152.8、157.2、163.9、167.4、169.3、172.2、172.9、199.3、201.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−４の構造式を次式［２１］と決定した。
【化３６】
【００７９】
（ＳＰＦ−３０５９−６）
外観：クリーム色粉末
分子量：５９２
分子式：Ｃ_２９Ｈ_２０Ｏ_１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５９３（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５９１（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５９３．０９４９
計算値：５９３．０９３２（Ｃ_２９Ｈ_２１Ｏ_１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
210sh(45,900)、223(47,700)、317(25,800)、358sh(14,700)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3418、1701、1617、1565、1465、1301
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.22(3H,s)、2.72(3H,s)、3.11(3H,s)、3.98(2H,brs)、6.78(1H,s)、6.88(1H,s)、8.21(1H,s)、9.00〜13.00(6H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.8、32.4、57.8、64.4、102.1、102.3、109.3、111.9、118.4、118.6、119.1、119.6、127.6、128.2、131.6、139.0、141.6、142.1、150.7(2C)、151.9、152.9、155.5、162.0、167.8、167.9、172.4、174.6、202.6
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−６の構造式を次式［２２］と決定した。
【化３７】
【００８０】
（ＳＰＦ−３０５９−７）
外観：黄色粉末
分子量：５６２
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１８Ｏ_１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６３（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５６３．０８４３
計算値：５６３．０８２６（Ｃ_２８Ｈ_１９Ｏ_１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
242(31,600)、312(24,500)、385(10,200)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3424、1701、1603、1504、1448、1420、1270
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.28、2.29、2.68、2.69、4.62、4.67、4.71、5.04、6.38、6.41、6.81、6.92、6.93、7.95、8.52、9.33、11.22、11.35、12.93
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.6、17.0、32.3、32.4、56.2、65.7、67.9、102.3、102.8、103.1、104.3、108.7、109.3、110.1、112.5、112.6、118.5、118.7、121.6、122.1、125.9、127.6、130.1、131.9、132.4、135.3、137.4、137.6、138.9、139.7、151.9、152.3、154.5、155.5、156.2、157.1、163.6、167.6、169.3、172.7、172.8、183.7、186.2、199.1、202.5、202.7
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−７の構造式を次式［２３］と決定した（互変異性体）。
【化３８】
【００８１】
（ＳＰＦ−３０５９−９）
外観：黄色粉末
分子量：５３４
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１８Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５３５．０８７６
計算値：５３５．０８７７（Ｃ_２７Ｈ_１９Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
207(47,600)、243(41,800)、314(34,000)、369(23,000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3444、1702、1614、1474、1289
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.29、2.31、2.67、2.70、4.60、4.65、4.69、5.97、6.32、6.35、6.89、6.90、7.03、7.17、7.94、8.50、12.50、9.20〜10.80
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.6、17.1、32.3、32.4、56.2、65.9、68.2、102.3、103.0、103.2、103.9、109.9、110.0、110.4、110.5、111.9、112.2、118.2、118.6、120.5、125.7、127.7、130.0、131.9、132.4、134.8、138.2、139.1、140.9、141.1、141.5、150.2、150.3、151.7、152.2、154.1、154.6、154.9、155.8、156.6、167.5、172.6、172.7、183.5、187.2、199.3、202.7、202.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−９の構造式を次式［２４］と決定した（互変異性体）。
【化３９】
【００８２】
（ＳＰＦ−３０５９−１２）
外観：クリーム色粉末
分子量：５６０
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１６Ｏ_１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５６１（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５５９（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５６１．０６８０
計算値：５６１．０６７０（Ｃ_２８Ｈ_１７Ｏ_１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
232(37,400)、250sh(34,800)、285(28,000)、308sh(23,200)、360sh(9,000)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3080、1698、1608、1468、1291
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.54(3H,s)、2.55(3H,s)、6.82(1H,d,2.1)、6.87(1H,s)、6.95(1H,d,2.1)、8.22(1H,s)、8.55(1H,s)、9.50〜13.50(5H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.1、32.2、102.1、103.0、109.4、112.1、113.5、119.8、120.0、121.7、126.6、132.0、133.3、135.9、136.7、141.7、150.6、152.1、153.0、155.4、157.6、162.4、167.4、167.6、172.2、172.9、199.1、201.1
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−１２の構造式を次式［２５］と決定した。
【化４０】
【００８３】
（ＳＰＦ−３０５９−２４）
外観：クリーム色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１６Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５３１．０６２１
計算値：５３１．０５６４（Ｃ_２７Ｈ_１７Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
212(36,900)、229sh(34,500)、283(26,300)、323(21,700)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3447、1697、1629、1578、1470、1290
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.52(3H,s)、2.54(3H,s)、6.92(1H,s)、6.93(1H,s)、7.28(1H,s)、8.13(1H,s)、8.54(1H,s)、9.50〜13.00(5H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.1、32.3、102.3、102.9、107.9、110.0、115.8、119.8、120.4、120.7、126.5、133.0、133.3、136.0、141.2、145.0、150.4、151.1、152.2、152.9、153.0、154.3、167.5、172.6、173.6、199.1、201.1
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２４の構造式を次式［２６］と決定した。
【化４１】
【００８４】
（ＳＰＦ−３０５９−２５）
外観：クリーム色粉末
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１６Ｏ_１１
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５１７（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５１５（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５１７．０７７８
計算値：５１７．０７７１（Ｃ_２７Ｈ_１７Ｏ_１１）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
215(35,000)、253(35,100)、276sh(25,200)、323(23,400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3417、1691、1625、1471、1293
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.54(6H,s)、6.82(1H,brs)、6.92(2H,brs)、7.27(1H,s)、8.14(1H,s)、8.53(1H,s)、9.5〜14.0(4H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.2、32.3、102.9、103.0、107.8、109.9、113.0、115.7、120.4、120.6、126.4、133.3、133.4、136.4(2C)、145.0、151.2、152.3、152.98、153.01、157.3、164.2、169.4、172.6、173.6、199.2、201.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２５の構造式を次式［２７］と決定した。
【化４２】
【００８５】
（ＳＰＦ−３０５９−２６）
外観：クリーム色粉末
分子量：４８８
分子式：Ｃ_２６Ｈ_１６Ｏ_１０
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：４８９（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：４８７（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：４８９．０８２３
計算値：４８９．０８２２（Ｃ_２６Ｈ_１７Ｏ_１０）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
212(31,500)、235(30,900)、284(23,900)、324(19.500)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3454、1694、1625、1517、1471、1293
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.53(3H,s)、2.54(3H,s)、6.91(1H,s)、6.92(1H,s)、7.27(1H,s)、7.47(1H,s)、8.11(1H,s)、8.57(1H,s)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
29.1、32.2、102.9、103.0、107.9、108.5、113.3、115.7、119.8、120.7、126.3、132.7、133.5、135.8、144.6、145.0、150.8、151.1、152.5、152.9(2C)、154.7、173.3、173.6、199.1、201.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２６の構造式を次式［２８］と決定した。
【化４３】
【００８６】
（ＳＰＦ−３０５９−２７）
外観：黄色粉末
分子量：６４２
分子式：Ｃ_３３Ｈ_２２Ｏ_１４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：６４３（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：６４１（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：６４３．１０８８
計算値：６４３．１０８９（Ｃ_３３Ｈ_２３Ｏ_１４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(46,100)、246(46,600)、287(31,700)、354(19,900)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3400、1694、1640、1604、1468、1290
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.41(3H,s)、2.45(3H,s)、2.67(3H,s)、6.34(1H,s)、6.63(1H,s)、6.90(1H,s)、7.48(1H,d,2.1)、7.97(1H,d,2.1)、8.49(1H,s)、11.9(1H,brs)、12.5(1H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
27.4、30.2、32.7、102.3、102.8、109.8、111.8、117.4、119.6、119.7、120.3、126.7、127.5、128.4、133.0、133.4、135.1、135.8、138.6、139.9、141.3、150.5、151.7、154.6、155.8、157.5、158.3、167.5、172.5、196.3、200.0、201.6、205.3
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２７の構造式を次式［２９］と決定した。
【化４４】
【００８７】
（ＳＰＦ−３０５９−２８）
外観：クリーム色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１６Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５３３．０７３５
計算値：５３３．０７２１（Ｃ_２７Ｈ_１７Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
217(35,300)、236(34,100)、309(26,100)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3502、3096、1690、1598、1503、1434、1303
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.39(3H,s)、2.71(3H,s)、6.52(1H,s)、6.85(1H,d,2.1)、6.92(1H,d,2.1)、6.98(1H,d,2.1)、8.25(1H,s)、9.5〜13.5(5H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
17.3、32.4、102.3、103.3、110.0、112.1、112.3、113.4、118.8、120.6、127.6、128.9、132.1、136.1、138.8、140.9、150.2、152.0、154.1、157.8、162.2、162.6、167.5、169.2、172.6、175.3、202.7
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２８の構造式を次式［３０］と決定した。
【化４５】
【００８８】
（ＳＰＦ−３０５９−２９）
外観：クリーム色粉末
分子量：５４８
分子式：Ｃ_２８Ｈ_２０Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５４９．１０２７
計算値：５４９．１０３４（Ｃ_２８Ｈ_２１Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
226(48,900)、316(26,200)、352sh(17,400)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3388、1687、1662、1626、1469、1296
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.23(3H,s)、2.72(3H,s)、3.11(3H,s)、3.98(2H,brs)、6.89(1H,s)、6.93(1H,s)、7.44(1H,s)、8.27(1H,s)、9.00〜13.00(5H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.8、32.4、57.8、64.4、102.3、103.1、108.6、112.0、113.5、118.46、118.48、119.1、127.7、128.1、131.8、138.9、141.8、144.3、150.6、150.7、151.9、152.6、154.2、162.1、167.8、173.5、174.6、202.7
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−２９の構造式を次式［３１］と決定した。
【化４６】
【００８９】
（ＳＰＦ−３０５９−３０）
外観：クリーム色粉末
分子量：４９０
分子式：Ｃ_２６Ｈ_１８Ｏ_１０
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：４９１（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：４８９（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：４９１．０９６６
計算値：４９１．０９７９（Ｃ_２６Ｈ_１９Ｏ_１０）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
206(36,000)、240(32,700)、315(26,500)、372(17,900)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3396、1704、1618、1518、1479、1294
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.28、2.30、2.67、2.69、4.62、4.66、4.70、4.96、6.32、6.36、6.90、6.91、7.03、7.17、7.43、7.98、8.54、9.20〜10.80
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.5、17.0、32.3、32.4、56.2、65.9、68.3、103.0、103.2、103.8、108.6、110.4、111.8、113.4、118.6、125.6、127.5、129.5、132.1、132.6、134.4、137.9、138.8、141.2、141.5、144.3、150.6、152.0、152.5、154.3、154.6、154.9、155.8、156.6、172.6、173.4、183.5、187.2、199.3、202.7、202.9
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３０の構造式を次式［３２］と決定した（互変異性体）。
【化４７】
【００９０】
（ＳＰＦ−３０５９−３４）
外観：黄色粉末
分子量：５５０
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１８Ｏ_１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５５１（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５５１．０８４６
計算値：５５１．０８２６（Ｃ_２７Ｈ_１９Ｏ_１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
211(35,600)、240(31,100)、283(24,100)、349(14,500)
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.18(3H,s)、2.66(3H,s)、4.39(1H,d,11.9)、4.64(1H,d,11.9)、6.37(1H,s)、6.84(1H,s)、7.09(1H,s)、8.47(1H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.8、32.4、72.5、80.0、102.1、103.0、109.5、110.6、111.1、117.7、120.0、126.5、131.8、133.6、138.6、141.4、141.5、150.5、151.7、154.9、155.0、156.2、167.7、172.6、188.5、202.8、204.0
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３４の構造式を次式［３３］と決定した。
【化４８】
【００９１】
（ＳＰＦ−３０５９−３５）
外観：クリーム色粉末
分子量：５４６
分子式：Ｃ_２８Ｈ_１８Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４５（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５４７．０９１１
計算値：５４７．０８７７（Ｃ_２８Ｈ_１９Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
216(38,600)、237(37,300)、307(30,100)、356sh(8,800)
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：
3460、3076、1734、1699、1629、1466、1302
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.39(3H,s)、2.71(3H,s)、3.82(3H,s)、6.49(1H,s)、6.86(1H,d,2.1)、6.92(1H,s)、7.01(1H,d,2.1)、8.25(1H,s)、9.5〜13.5(4H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
17.3、32.4、52.5、102.3、103.8、110.0、112.1、112.8、113.5、118.8、120.6、127.7、129.0、132.1、134.3、138.8、140.9、150.3、152.1、154.1、157.7、162.2、162.8、167.5、168.6、172.6、175.1、202.7
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３５の構造式を次式［３４］と決定した。
【化４９】
【００９２】
（ＳＰＦ−３０５９−３６）
外観：クリーム色粉末
分子量：５９８
分子式：Ｃ_３２Ｈ_２２Ｏ_１２
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５９９（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５９７（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：
実測値：５９９．１１９８
計算値：５９９．１１９０（Ｃ_３２Ｈ_２３Ｏ_１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
213(46,300)、246(48,700)、287(33,200)、360(20,000)
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.41(3H,s)、2.45(3H,s)、2.66(3H,s)、6.34(1H,s)、6.63(1H,s)、6.90(1H,s)、7.46(1H,d,2.0)、7.46(1H,s)、7.95(1H,d,2.0)、8.52(1H,s)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
27.3、30.2、32.7、102.8、103.1、108.6、111.7、113.4、117.3、119.6(2C)、126.7、127.5、128.5、133.2、133.4、135.1、135.6、138.6、139.7、144.6、150.8、152.1、154.6、155.9、157.5、158.4、173.3、196.3、200.0、201.6、205.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３６の構造式を次式［３５］と決定した。
【化５０】
【００９３】
（ＳＰＦ−３０５９−３７）
外観：黄色粉末
分子量：８０６
分子式：Ｃ_４１Ｈ_２６Ｏ_１８
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：８０７（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：８０５（Ｍ−Ｈ）⁻
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）⁻：
実測値：８０７．１１９７
計算値：８０７．１１９８（Ｃ_４１Ｈ_２７Ｏ_１８）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
219(68,900)、323(30,700)、349(30,600)
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.08(3H,s)、2.20(3H,s)、2.53(3H,s)、3.42(1H,d,15.6)、3.56(1H,d,15.6)、4.64(1H,d,13.4)、4.71(1H,d,13.4)、6.27(1H,s)、6.83(1H,s)、6.84(1H,s)、6.88(1H,s)、8.15(1H,s)、9.0〜13.0(8H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
16.6、17.7、20.0、32.0、62.3、102.1、102.25、103.8、106.0、108.4、108.7、109.9、111.55、118.56、119.2、119.6、120.4、121.7、127.9、129.13、131.1、139.5、140.6、141.00、141.7、150.1、150.23、150.46、150.51、151.6、152.3、154.09、154.17、158.7、161.1、167.7、168.0、172.5、173.2、175.1、202.2
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３７の構造式を次式［３６］と決定した。
【化５１】
【００９４】
（ＳＰＦ−３０５９−３９）
外観：黄色粉末
分子量：５４８
分子式：Ｃ_２７Ｈ_１６Ｏ_１３
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５４９（Ｍ＋Ｈ）^＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５４７（Ｍ−Ｈ）⁻
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
223(40,000)、319(23,900)、349(20,100)
^１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
2.37(3H,s)、2.71(3H,s)、6.47(3H,s)、6.91(1H,s)、6.98(1H,s)、8.22(1H,s)、9.0〜13.0(6H,brs)
^１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ：
17.3、32.4、102.3、102.7、109.9、111.49、112.4、118.64、118.8、120.5、127.5、129.12、132.1、138.8、140.96、142.5、150.29、151.1、152.0、152.6、154.24、162.1、167.5、167.9、172.6、175.5、202.7
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
これらからＳＰＦ−３０５９−３９の構造式を次式［３７］と決定した。
【化５２】
【００９５】
実施例１５（Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する本発明の新規化合物の抑制作用）
実施例２と同様に、Ｓｅｍａ３Ａのコラプス活性に対する本発明の新規化合物の抑制作用を測定した。ＩＣ５０は次の通りで、何れもＳｅｍａ３Ａを強く阻害した。
化合物 ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）
ＳＰＦ−３０５９−３ ０．２
ＳＰＦ−３０５９−４ ２．０
ＳＰＦ−３０５９−６ ０．１
ＳＰＦ−３０５９−７ １．０
ＳＰＦ−３０５９−９ ０．１
ＳＰＦ−３０５９−１２ ２．０
ＳＰＦ−３０５９−２４ ０．１
ＳＰＦ−３０５９−２５ ４．０
ＳＰＦ−３０５９−２６ ０．２
ＳＰＦ−３０５９−２７ ０．５
ＳＰＦ−３０５９−２８ ２．０
ＳＰＦ−３０５９−２９ ０．１
ＳＰＦ−３０５９−３０ ０．２
ＳＰＦ−３０５９−３４ ０．１
ＳＰＦ−３０５９−３５ ２．０
ＳＰＦ−３０５９−３６ ４．０
ＳＰＦ−３０５９−３７ ＜０．１
ＳＰＦ−３０５９−３９ ０．１
【００９６】
実施例１６（セマフォリン３Ａの神経伸長阻害活性の阻害剤による抑制）
実施例５と同様に、セマフォリン３Ａの神経伸長阻害活性に対する本発明の新規化合物の抑制作用を測定した。測定結果を次に示す。
被験化合物 化合物濃度（μｇ／ｍｌ）
２ ６ ２０
ＳＰＦ−３０５９−２ ＋＋＋ ＮＴ ＮＴ
ＳＰＦ−３０５９−３ ＋＋＋ ＮＴ ＮＴ
ＳＰＦ−３０５９−５ ＋＋ ＮＴ ＮＴ
ＳＰＦ−３０５９−４ − ＋ ＋＋
ＳＰＦ−３０５９−６ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋
ＳＰＦ−３０５９−７ ＋ ＋ ＋＋
ＳＰＦ−３０５９−１２ ＋ ＋ ＋＋
ＰＢＳ（対照） − − −
（ＮＴ＝ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ）
この結果から、本発明の新規化合物はＳｅｍａ３Ａが示す神経伸長阻害活性を持続的に阻害し得ることが明らかとなった。
【００９７】
実施例１７（本発明の新規化合物の細胞毒性の測定）
実施例１０と同様に、ＣＯＳ７細胞を用いて細胞増殖への影響を測定した。本発明の新規化合物の細胞増殖阻害率の測定結果は次の通りとなり、セマフォリン阻害活性が認められる濃度の５０〜１０００倍の濃度でも細胞毒性は認められないことが判明した。
被験化合物 ＩＣ_５０（μｇ／ｍｌ）
ＳＰＦ−３０５９−３ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−４ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−６ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−７ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−９ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−１２ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−２４ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−２９ ＞１００
ＳＰＦ−３０５９−３０ ＞１００
【００９８】
実施例１８（本発明の化合物の塩の製造）
本発明の化合物をメタノールに溶解して１ｍＭ溶液を調製する。この溶液１ｍｌに、１ｍＭ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を、本発明の化合物が２個のカルボキシル基を持つ場合は２ｍｌ、本発明の化合物が１個のカルボキシル基を持つ場合は１ｍｌ加え、十分に混合する。この溶液を減圧下に溶媒を留去、乾燥し、本発明の化合物のナトリウム塩１μｍｏｌを得る。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の神経再生促進剤の有効成分であるセマフォリン阻害剤は、低濃度においても、末梢あるいは中枢における神経再生促進作用を有し、セマフォリンの有する成長円錐退縮活性及び／又はセマフォリンの有するコラーゲンゲル中での神経伸長阻害活性の抑制作用を有し、特に分子量１０００以下の低分子化合物セマフォリン阻害剤を用いた場合、分子の拡散性、膜透過性、組織移行性、特に血液脳関門透過性などに優れていることから、各種神経障害性疾患・神経変性疾患に対する予防剤や治療剤として有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１、Ｍ１６２及びＡ７２１のＳｅｍａ３Ａの成長円錐退縮活性に対する濃度依存的な抑制作用を示す図である。
【図２】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１、ＳＰＦ−３０５９−２、ＳＰＦ−３０５９−５のＳｅｍａ３Ａの成長円錐退縮活性に対する濃度依存的な抑制作用を示す図である。
【図３】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のＳｅｍａ６Ｃの成長円錐退縮活性に対する濃度依存的な抑制作用を示す図である。
【図４】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１、Ｍ１６２及びＡ７２１の、コラーゲンゲル共培養法におけるＳｅｍａ３Ａの神経伸長阻害活性の抑制作用を示す写真である。
【図５】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のインビボにおける嗅神経切断に対する神経再生促進作用を示す図である。
【図６】本発明のセマフォリン阻害剤Ｍ１６２及びＡ７２１のインビボにおける嗅神経切断に対する神経再生促進作用を示す図である。
【図７】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１の坐骨神経挫滅に対する神経再生促進作用を示す図である。
【図８】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のＣＯＳ７細胞の増殖に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図９】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のセマフォリン３Ａのレセプター（ニューロピリン−１）結合に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図１０】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１の標的分子がセマフォリン３Ａであることを調べた結果を示す図である。
【図１１】本発明のセマフォリン阻害剤ＳＰＦ−３０５９−１のインビボにおける脊髄神経（大脳皮質‐脊髄路）切断に対する神経再生促進作用を調べた結果を示す写真である。
【図１２】対照としてのＰＢＳのインビボにおける脊髄神経（大脳皮質‐脊髄路）切断に対する神経再生促進作用を調べた結果を示す写真である。

Claims (57)

1. 式［８］で表される化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
   ［式中、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^６及びＲ^７は、下記の（１）又は（２）のいずれかで表される。
   （１）Ｒ^６はメチル基を表し、Ｒ^７は式［２］で表される基、式［９］で表される基、又は式［１０］で表される基を表す。
   （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^３は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
   を表す。）
   （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
   （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
   （２）Ｒ^６は式［５］で表される基、又は式［１１］で表される基を表し、Ｒ^７はアセチル基を表す。
   （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）］
2. 式［１３］で表される化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
   （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
3. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載のセマフォリン阻害剤。
4. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^２が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項３記載のセマフォリン阻害剤。
5. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項３記載のセマフォリン阻害剤。
6. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^４がカルボキシル基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載のセマフォリン阻害剤。
7. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表し、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載のセマフォリン阻害剤。
8. 請求項２記載の式［１３］において、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^５が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載のセマフォリン阻害剤。
9. 請求項１〜８のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤。
10. 式［１３］
    （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物又はその医薬的に許容される塩。
11. Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項１０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
12. Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項１１記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
13. Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項１１記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
14. Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
15. Ｒ^２が水酸基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項１０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
16. Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項１０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
17. 式［１２］で表される化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
    （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
18. 請求項１７記載の式［１２］において、Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項１７記載のセマフォリン阻害剤。
19. 請求項１７記載の式［１２］において、Ｒ^２が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項１８記載のセマフォリン阻害剤。
20. 請求項１７記載の式［１２］において、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項１８記載のセマフォリン阻害剤。
21. 請求項１７記載の式［１２］において、Ｒ^４がカルボキシル基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか記載のセマフォリン阻害剤。
22. 請求項１７記載の式［１２］において、Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２が水酸基を表す化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項１７記載のセマフォリン阻害剤。
23. 請求項１７〜２２のいずれか記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤。
24. 式［１２］
    （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、及びＲ^５のうち少なくとも１つが水素原子で表される化合物又はその医薬的に許容される塩。
25. Ｒ^２又はＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項２４記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
26. Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項２５記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
27. Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項２５記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
28. Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
29. Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項２４記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
30. 式［１４］
    （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^３は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
    を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    で表される化合物又はその医薬的に許容される塩。
31. Ｒ^２及びＲ^５のうち少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項３０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
32. Ｒ^２が水酸基を表すことを特徴とする請求項３１記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
33. Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項３１記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
34. Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項３０〜３３のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
35. Ｒ^１及びＲ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項３０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
36. Ｒ^１がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表し、Ｒ^３がメトキシメチル基を表すことを特徴とする請求項３０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
37. Ｒ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項３０記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
38. Ｒ^１がカルボキシル基若しくはメトキシカルボニル基を表し、Ｒ^４がカルボキシル基を表し、Ｒ^２及びＲ^３が水素原子を表し、Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項３７記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
39. Ｒ^３が式［３］に示される基を表すことを特徴とする請求項３０〜３５のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
    
40. 請求項３０〜３９のいずれかの化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
41. 請求項４０記載のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする神経再生促進剤。
42. 式［１５］
    （式中、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    で表される化合物又はその医薬的に許容される塩。
43. Ｒ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４２記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
44. Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項４２又は４３記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
45. 請求項４２〜４４のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
46. 請求項４５記載のセマフォリン阻害剤を有効成分とすることを特徴とする神経再生促進剤。
47. 式［１６］
    （式中、Ｒ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ^５は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    で表される化合物又はその医薬的に許容される塩。
48. Ｒ^２及びＲ^５の少なくとも一方が水酸基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
49. Ｒ^２及びＲ^５が水酸基を表すことを特徴とする請求項４７記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
50. Ｒ^４がカルボキシル基を表すことを特徴とする請求項４７〜４９のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
51. 請求項４７〜５０のいずれか記載の化合物又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするセマフォリン阻害剤。
52. 請求項５１記載のセマフォリン阻害剤を有効成分とすることを特徴とする神経再生促進剤。
53. 請求項９、２３、４１、４６又は５２記載の神経再生促進剤を含有することを特徴とする神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
54. 神経障害疾患及び／又は神経変性疾患が、脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患であることを特徴とする請求項５３記載の神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
55. 神経障害疾患及び／又は神経変性疾患が、嗅覚異常症、外傷性神経傷害、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、又は外傷性神経変性疾患であることを特徴とする請求項５３記載の神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤。
56. ペニシリウム属に属する式 [１２]：
    （式中、Ｒ ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^５ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    、［１３］：
    （式中、Ｒ ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^５ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    、［１４］：
    （式中、Ｒ ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ ^３ は水素原子、メトキシメチル基、又は式［３］
    を表し、Ｒ ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^５ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    、［１５］：
    （式中、Ｒ ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^５ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    又は［１６］：
    （式中、Ｒ ^１ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^２ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表し、Ｒ ^４ は水素原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ ^５ は水素原子、水酸基又はアシルオキシ基を表す。）
    で表わされる化合物の生産菌であるペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株を培養して、その培養物から前記化合物を採取することを特徴とする前記化合物の製造方法。
57. ペニシリウム・エスピー（Penicillium sp.）ＳＰＦ−３０５９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６３）又は該ＳＰＦ−３０５９株から誘導される菌株。