JP4975013B2 - 組織が工作された心臓弁の製造 - Google Patents
組織が工作された心臓弁の製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4975013B2 JP4975013B2 JP2008501039A JP2008501039A JP4975013B2 JP 4975013 B2 JP4975013 B2 JP 4975013B2 JP 2008501039 A JP2008501039 A JP 2008501039A JP 2008501039 A JP2008501039 A JP 2008501039A JP 4975013 B2 JP4975013 B2 JP 4975013B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- matrix
- cells
- electrospun
- seeded
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/24—Heart valves ; Vascular valves, e.g. venous valves; Heart implants, e.g. passive devices for improving the function of the native valve or the heart muscle; Transmyocardial revascularisation [TMR] devices; Valves implantable in the body
- A61F2/2412—Heart valves ; Vascular valves, e.g. venous valves; Heart implants, e.g. passive devices for improving the function of the native valve or the heart muscle; Transmyocardial revascularisation [TMR] devices; Valves implantable in the body with soft flexible valve members, e.g. tissue valves shaped like natural valves
- A61F2/2415—Manufacturing methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y10/00—Nanotechnology for information processing, storage or transmission, e.g. quantum computing or single electron logic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Description
本出願は、2005年3月11日に出願された特許文献1、および2005年6月1日に出願された特許文献2の優先権を主張し、両出願の内容は引用により全部、本明細書に編入する。
本発明の技術分野は、組織が工作された(engineered)心臓弁に関する。心臓弁代用物は、ドナーの組織の供給が不十分であることから限られている。機械的な心臓弁および生体人工器官(bioprosthetic)の弁のように、数種の弁が心臓移植に使用されてきた。生体人工器官の弁は、多くは他の種から得られたものであり、そして異種移植片として知られている。ブタの弁が最も多い異種移植片である。
本発明は、組織を工作した心臓弁を調製するための方法および組成物を提供する。組織を工作した弁は、生育可能な細胞成分を有し、患者自身の心臓組織と表現型的に適合性がある。代用弁は内皮細胞および平滑筋細胞のような筋肉細胞から生産される。弁表面の内皮細胞の覆いは、血栓症形成の発生を防止する。本発明では、循環している前駆細胞が管の疾患を有する患者の末梢血から単離され得る。これらの単離された前駆細胞は、マトリックスを播種するために使用することができる内皮および筋肉細胞に成長させ、そして分化させることができる。これらの細胞を播種したマトリックスは心臓を通る血流を模する流体条件に暴露され、予備調整されて自然な心臓弁に類似する組織が工作された心臓弁を生じることができる。このように工作された弁はそれらが自然に有する以上の柔軟性を保持し、すなわちその生体内の相対物のようにより効率的に機能するように設計することができる。
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。
本発明はエレクトロスピンされたマトリックスを製造し、そして使用するための方法および組成物に関する。エレクトロスピニングの方法には、一般に液体の表面に電場を作成することが関与する。生じた電力は電荷を運ぶ液体ジェットを作成する。液体ジェットは適切な電位で他の電気的に荷電した物体に引き付けられることができる。液体ジェットが延長し、そして移動すると、硬化し、そして乾燥する。延長した液体ジェットの硬化および乾燥は液体を冷却すること、すなわち液体は通常、室温で固体であり;例えば脱水による溶媒の蒸発(物理的に誘導された硬化)により;あるいは硬化(curing)メカニズム(化学的に誘導された硬化)により生じることができる。製造された繊維は適切に配置された反対に荷電した標的基質上に集められる。
自然な生体構造、例えば血管もしくは臓器は、個体と同じ種のドナー、例えばヒトの受容者にはヒトの死体の血管もしくは臓器から得ることができる。また自然な生体構造は限定するわけではないがサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジを含む様々な種から得ることもできる。また自然な生体構造は再構成される臓器を必要とする個体から得、そして以下に記載する工程を使用して取り出し、そして機能不全血管を取り出し、そして脱細胞化することができる。個体の脱細胞化血管は、個体から単離した培養内皮細胞(例えばヒトの内皮細胞)を使用して人工血管を再構成するための3次元的スカフォールドとして使用することができる。1つの態様では、内皮細胞がヒトの伏在静脈から単離される。別の態様では、内皮細胞は個体の血液または骨髄から単離された前駆細胞から生産され得る。人工的な再構成血管はさらに発育するために個体に戻して移植され得る。
また本発明は、利用可能な生体適合性マトリックス上もしくは中に培養した組織細胞を播種することにより人工組織構造を生成することに関する。生体適合性とは、生物学的機能に毒性もしくは傷害性効果をもたない物質を指す。生分解性とは、患者の体内に吸収もしくは分解され得る物質を指す。生分解性物質を形成する代表的な材料には、コラーゲン、ポリ(乳酸)のようなポリ(アルファ エステル)、ポリ(グリコール酸)、ポリオルトエステルおよびポリ無水物およびそれらのコポリマーのような天然もしくは合成のポリマーを含み、これらは制御された速度で加水分解により分解され、そして再吸収される。これらの物質は、分解性、扱い易さ(manageability)、サイズおよび形状の最大の制御を提供する。好適な生分解性ポリマー物質には、吸収性の合成縫合材料として開発されたポリグリコール酸およびポリグラクチン(polyglactin)がある。
マトリックス(例えばエレクトロスピンされたマトリックス、天然の脱細胞化マトリックス、または合成マトリックス)は、治療薬もしくは生物製剤(biological agents)に結合した量子ドット(QD)のようなナノ粒子の取り込みにより機能化することができる。またマトリックスは官能化されて造影増強剤(例えばガドリニウム)を取り込むことができる。
実施例の章における実験は、ヘパリンナノ粒子に結合した量子ドットがNIR照射により照射された時、経時的にヘパリンのバースト放出を示す。この系により術後に治療薬/生物製剤の放出速度を医療従事者が調節できるようになる。
人工組織は、個体自身の組織に由来する同種異系の細胞群を使用することにより作成することができる。人工組織は異種であることもでき、この場合、細胞群は個体と異なる哺乳動物種に由来する。例えば組織細胞はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジのような哺乳動物に由来することができる。
、成長ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、肝性赤血球生成因子(ヘパトポエチン)等のような種々の増殖因子により影響を受け得る。増殖および/または分化を調節する他の因子は、プロスタグランジン、インターロイキンおよび自然に存在するカローンを含む。
血管は、予備調整する小室の1つの態様である図11に示すように、予備調整する小室で作成することができる。小室の寸法は、細胞を播種したマトリックスを保持することができるようなものである。適切なサイズの範囲は、約200×200×600mm、100×100×300mm、好ましくは約50×50×150mmのレンジフォーム(range form)である。図11Aは、第1および第2の長壁42および第1および第2の短壁44を持つ予備調整する小室40の1つの態様の上面図である。第1および第2の短壁44はそれぞれ、取り付け要素52を有する容器50を保持することができるプラットホーム48を収容する開口46を有する。細胞を播種したマトリックス(破線で示す)は、容器の第1および第2の取り付け末端53に取り付けることができる。容器は、生物学的流体を容器50の一端を介し、細胞を播種した取り付けた管状マトリックスを介し、そして容器のもう一端に連続する様式でポンプ送液することができる流体流系(示さず)と操作可能に連結される。図11Bは、図11Aの予備調整す小室の側面を示し、そして図11Cは図11Aの断面を示す。
本発明の方法および組成物は、治療薬/生物製剤の局所化された送達、ならびに個体の標的部位にそのような作用物質の制御された放出に使用することができる。
本発明の方法および組成物は、血管を構築するために使用することができる。エレクトロスピンされたマトリックスまたは脱細胞化マトリックスの1つの応用は、媒体および小径の管構造物の形成にある。この態様のための幾つかの好適な物質はコラーゲンおよびエラスチン、特にコラーゲンI型およびコラーゲンIII型である。血管構造物の例には、限定するわけではないがバイパスもしくはグラフトのための冠状血管、大腿部動脈、膝窩動脈、上腕動脈、脛骨動脈、ぎょう橈骨動脈または対応する静脈を含む。エレクトロスピンされた物質は、内皮細胞および平滑筋細胞と組み合わせた時、特に有用である。先細型および/または分枝型血管を含むより複雑な形状も構築され得る。
本発明の方法および組成物は、工作された組織臓器構造物、または臓器構造物の一部、例えば心臓、心弁、肝臓、腎臓等を構築するために使用できる。生体工学によって組織または臓器を作るためにエレクトロスピンされた物質およびマトリックスを使用する能力は、生体工学によって作成される広範な組織代替的応用を創造する。生体工学によって作られる部品の例には限定するわけではないが、血管、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、心筋および神経ガイドを含む。幾つかの態様では、そのようなマトリックスはインプラントの機能を改善する治療薬と合わせられる。例えば抗生物質、抗炎症剤、局所麻酔薬またはそれらの組み合わせを生物工学で作った臓器のマトリックスに加えて、治癒プロセスを早め、そして不快を減少することができる。
本発明の方法および組成物は、1もしくは複数の治療薬を所望する場所に送達するために使用することができる。本組成物は治療薬をインビボの場所に、インビトロの場所に、または他の場所に送達するために使用することができる。本組成物は任意の方法を使用してこれらの場所に投与され得る。あるいは細胞を含有するエレクトロスピンされたマトリックスが体内に移植され、そして移植後の細胞により生産された分子を送達するために使用することができる。
マトリックスは保存され、そして移植直前にそれに細胞を播種することにより使用することができる。多くのエレクトロスピンされたマトリックスは、いったんスピンされると乾燥され、そして乾燥もしくは凍結状態で保存することができる。保存条件は使用したエレクトロスピンされた化合物、および治療薬がマトリックス上または中に包含されているかどうかに依存する。治療薬が包含されている態様では、マトリックスは0℃未満の温度で真空下、または凍結乾燥状態で保存することができる。他の保存条件、例えばマトリックス中および上の物質に依存して室温、暗中、真空もしくは減圧下、不活性な雰囲気下、冷蔵温度、水性もしくは他の液体溶液中、または粉末状態を使用することができる。
材料
他に言及しない限り、すべての化学品はシグマ(Sigma)(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。ECLバッファーおよび125I−ナトリウムはパーキンエルマー(PerkinElmer)NEN(ボストン、マサチューセッツ州)から購入した。コラゲナーゼII型(1mg/ml)はベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)(マンハイム、ドイツ)から購入した。内皮培地(EBM−2)はカムブレックスバイオサイエンス(Cambrex Bio Science)(ウォーカーズヴィル、メリーランド州)から購入した。PCR試薬およびプライマー、M199培地、ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリンは、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)(ゲチスバーグ、メリーランド州)から購入した。塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)は、Judith Abraham(サイオス ノバ、カリフォルニア州)からの贈呈であった。抗ヒトCD31抗体、抗−フォンビルブランド因子(vWF)、および抗−平滑筋アクチン抗体は、ダコ(DAKO)(グロストラップ、デンマーク)から購入した。抗−CD105抗体はBDファーミンゲン(Pharmingen)(サンディエゴ、カリフォルニア州)から購入した。抗Flk−1抗体は、サンタクルズ(サンタクルズ、カリフォルニア州)から購入した。FITC結合アビジンは、ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)(ベーリンガム、カリフォルニア州)から購入した。無胸腺マウスはジャクソンラボズ(Jackson Labs)(バーハーバー、メイン州)から購入した。
(i)スカフォールドの調製
エレクトロスピンされたナノファイバースカフォールドは、コラーゲンI型、エラスチンおよびポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA、モル.比50:50、Mw 110,000)(ベーリンガー−インゲルハイム(Ingelheim)、ドイツ)の溶液を使用して作成した。ウシの皮膚由来のコラーゲンI型(エラスチン プロダクツ カンパニー(Elastin Products Company)、オウンズヴィル、ミズーリ州)、項靭帯(ウシ首の靭帯)由来のエラスチン(エラスチン プロダクツ カンパニー、オウンズヴィル、ミズーリ州)およびPLGAを、45%のコラーゲン、40%のPLGAおよび15%のエラスチンの相対的重量濃度で混合する。溶液を1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(99+%)(シグマケミカルカンパニー、セントルイス、ミズーリ州)に、15(重量/容量)%(150mg/mL)の総溶液濃度で溶解する。高分子量PLGA(前に組織スカフォールドをエレクトロスピニングするために使用した)を溶液に加えて、スカフォールドの機械的強度を上げ、そして溶液の粘度およびスピニング特性を上げる。
内皮細胞のコンフルエントな単層は、血栓形成に対する最も重要なバリアであり、そして内皮細胞が媒介するNO生産は血管のトーン(tone)を維持するために重要である。細胞はマウスの内皮細胞株MS1細胞を播種した。組織培養ポリスチレンフラスコ中で、5%CO2の雰囲気下、37℃にて通常に培養した細胞を、0.1%トリプシン−EDTAで処理した後に回収した。スカフォールドは組織培養皿に乗せられた。PBSで平衡化した後、細胞(1×105/mL)をスカフォールドに播種した。使用した培養基は、10%FBSおよび抗生物質を含有するDMEM培地であった。2日間培養した後、細胞の接着を走査型電子顕微鏡を使用して評価した。
血管スカフォールド中のコラーゲンおよびエラスチンの相対的量および分布は、播種した移植片の機械的特性および機能に重要である(図1)。スカフォールドの成分分布を決定するために、組織−および免疫組織化学的分析を行ってコラーゲンおよびエラスチンの分布を同定した。
細胞の長期生育能が、生きている利用可能な(patent)血管に播種したスカフォールドを改造するために必要である。標準的な方法を使用して、生育能および増殖を評価した。細胞の生育能を試験するために、構造物を24ウェルプレートにウェルあたり約100mgの物質で入れた。4種の型の物質を生体適合性および細胞の生育能について試験し、1つの陰性対照ウェルは物質を含まなかった:(1)GA−NFS(1%グルタルアルデヒド架橋結合化エレクトロスピン化スカフォールド);(2)EDC−NFS(EDC−架橋結合化エレクトロスピン化スカフォールド);(3)nBV(自然な血管、脱細胞化);(4)Latex(ラテックスゴム、陽性対照)。
コンプライアンスの不釣り合いが管移植片の失敗の最も多い原因であり、内膜過形成および閉塞を生じる。スカフォールドがコンプライアントすぎると、動脈瘤を形成する恐れがある。
管は軸方向よりも周囲方向で、より高い応力に抵抗しなければならない。自然な管はそれらの機能的構造をそれらの負荷環境に適応させる。エレクトロスピンされたスカフォールドは少なくとも自然な管の機械的強度を現すことが重要である。機械的負荷試験は、一軸負荷試験機を使用して軸および周囲方向でエレクトロスピンされた管について行った(インストロン社(Instron Corporation)、イサックアー、ワシントン州)。軸の試験には、管状スカフォールドからの短いセグメントをその切断末端で挟んだ。クロスヘッドスピードは0.5mm/秒に設定し、そして試験は落下が起こった後、歪みが10%まで減少した時、止めた。周囲方向での試験では、物質のリングをスカフォールドから切り取り、ストリップに開き、次いでストリップのいずれかの末端を挟んだ。この試験も0.5mm/秒の速度で行った。
管スカフォールドに関するバースト圧は、落下が起こるまで管内の圧を上げることをモニタリングすることにより見いだされた。圧カテーテルは管の1端でカニューレの固定を介して挿入した。60ccの圧シリンジを、血管のもう1端で通例のカニューレを介して挿入した。圧は破壊、落下もしくは漏出が起こるまで上げ、そして圧の変化を記録した。
マトリックスを機能化するために、EDC(10mg)およびスルホ−NHS(2mg)を水溶液中5mL(0.05mg/mL)のカルボキシル化量子ドットに、室温で1時間、穏やかに撹拌しながら加えた。EDC活性化ヘパリン(30mg/20μl)を同じEDCおよびNHS法に従い調製した。量子ドットとヘパリンを結合させるために、5mgのPDAを活性化量子ドットおよびヘパリン溶液に、室温で2時間撹拌しながら加えた。量子ドット−ヘパリン(QD−ヘパリン)結合体は、等容量の1M Trisバッファー溶液(pH7.4)を加えることによりクエンチし、そして4℃で保存することができる(図2)。
QD−ヘパリンのマイクロカプセル化は、二重エマージョン(emersion)により行った。簡単に説明すると、30mgのQD−ヘパリンおよび安定化剤として10mgのウシ血清アルブミン(BSA)を含有する4mLの内部水性相を、ジクロロメタン中100mgのPLGAおよび100mgのPCLの8ml溶液中で乳化した。溶液は室温で5分間、ボルテックス混合することより乳化した。このW/O分散物を200mlの1(重量/容量)%の水性PVA溶液に、室温で4時間撹拌しながら希釈した。マイクロカプセルを脱イオン水で数回洗浄し、次いで一晩、凍結乾燥した。
ヘパリンのバースト放出を評価するために、QD−ヘパリンを含有する0.55mgのPLGAマイクロカプセルを、2mlのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)に懸濁した。溶液は0、10および30分間、75mW/cm2のAM1.5ソーラーシュミレーターを使用して照射した。次いで1、3および5日目に、サンプルを4℃に冷却し、4500rpmで20分間遠心し、そして濾過(0.45μmの孔サイズ)して、光学的測定用にマイクロカプセルを取り出した。ルミネセンス測定は、アルゴンイオンレーザー(400mW/cm2で514.5nm)を励起源として使用して行い、そしてスペクトルはCCD分光光度計を使用して40秒の積分時間で集めた。
マウス(C57BL6)は、メリーランド州、バーハーバーのジャクソンラボラトリーズ(Jackson laboratories)から得られる。マウスを対象としたすべての実験は、全身麻酔下で無菌的に行う(ケタミン;45〜75mg/kgおよびキシラジン;10〜20mg/kg、IP)。切開部位はベタジンで洗い、そしてアルコールで拭く。痛覚脱失(ブプレノルフィン0.05〜0.1mg/kg、SC)を移植の手術後に与える。予防的な抗生物質(セファゾリン25mg/kg、sc)を移植後、術後に与える。準備された血管(2×0.5cm)は、動物あたり2個のインプラントを最小縦断正中切開を介してマウスの背側皮下空間に移植する。創傷は断続的吸収糸で閉じ、そして動物を分析のために移植後1、2、4、8、12、18および24週に屠殺する。血管サンプルの回収には、マウスに麻酔をかけ、そして血液は心臓穿刺を使用してヘパリンを含有する管を回収し(retrieved)、そしてマウスをその後に屠殺する。
全部で120匹のヒツジを使用する。実験は6つの異なる血管群からなる。各動物はそれ自身を対照として用いる。動物は移植後1、3、6、12および18月に屠殺される。動物は0、1、2、3および4週間、そして1カ月以上移植した移植片について毎月モニタリングする。
エレクトロスピンされたマトリックスは、実施例1に概説する方法を使用して形成された。コラーゲンI型、エラスチンおよびPLGAの溶液を使用した。コラーゲンI型、エラスチンおよびPLGAは、重量で45%のコラーゲン、40%のPLGAおよび15%のエラスチンの相対濃度で混合した。
この実施例は、化学的な架橋結合によりエレクトロスピンされたスカフォールドの強度および安定性がどのように上昇するかを示す。スカフォールドは架橋結合する前にリン酸緩衝化生理食塩水中の20%デキストラン溶液に浸して、水和が誘導する膨潤およびスカフォールドの収縮を下げる。スカフォールドは、MES/EtOH溶液中のEDC/NHSに室温で2時間含浸することにより架橋結合された。生じた繊維の走査型電子顕微鏡では、500nm以下の繊維直径および無作為な方向性の繊維が示された。スカフォールドの原子間力顕微鏡および接着している内皮細胞を含むナノファイバーの共焦点画像は、スカフォールド構造を示す。これらのデータは、生物学的ポリマーから、脱細胞化スカフォールドおよび自然な動脈に類似する機能的特性および構造をもつ管スカフォールドを作成することが可能であることを示す。
管スカフォールド中のコラーゲンおよびエラスチンの相対的量および分布は、播種した移植片の機械的特性および機能に重要である。スカフォールド組成はコラーゲンI、IIおよびIII型、エラスチンに関する組織化学的分析を使用して評価し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)も行った。
これらの実験は、脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドのコラーゲンおよびエラスチン含量が自然な管の含量に類似することを示す。
コンプライアンスの不釣り合いは、管移植片の失敗の最も多い原因であり、内膜の過形成および閉塞を生じる。スカフォールドがコンプライアントすぎると、動脈瘤を形成する恐れがある。この実施例はスカフォールドのコンプライアンスについてどのように試験するかを記載する。脱細胞化およびエレクトロスピンされた管に形状化されたスカフォールドを水浴に浸し、そして各末端にカニューレを挿入した。1つのカニューレは水のカラムにつなぎ、もう1つは廃液管につないだ。水のカラムは管形スカフォールド内に120mmHgの圧を形成するために十分高かった。水は10mmHgの増分で圧を下げるために、スカフォールドを通して廃液した。各増分で、スカフォールドの直径はデジタルカメラを使用して記録した。この工程を圧が0mmHgになるまで繰り返した。結果は自然な管について典型的な圧−直径曲線を、そして脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドについて実験的曲線を示す。直径の変化は、ブタおよびヒトの動脈のインビボでの機械的挙動と一致する生理学的圧の範囲内で、自然な管およびエレクトロスピンされたスカフォールドについて約5%であり、そして脱細胞化されたスカフォールドについて15%であった。このように脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドの両方が、自然な管に類似するコンプライアンスを有する。
管は軸方向よりも周囲方向で、高い応力に抵抗しなければならない。自然な管はその機能的構造をそれらの負荷環境に適応させる。脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドは、自然な管の機械的挙動を現すことが重要である。このように機械的負荷試験は、一軸負荷試験機(インストロン社(Instron Corporation)、イサックアー、ワシントン州)を使用して軸および周囲方向で脱細胞化された管およびエレクトロスピンされた管について行った。軸の試験には、全体が管状のスカフォールドをその切断末端で挟んだ。クロスヘッドスピードは0.5mm/秒に設定し、そして試験はひずみが落下の発生後10%まで減少した時、止めた。周囲での試験では、リング状の物質をスカフォールドから切り取り、ストリップに開き、次いでストリップのいずれかの末端を挟んだ。この試験も0.5mm/秒の速度で行った。エレクトロスピンされたスカフォールドからの軸および周囲方向の機械的試験の結果は、図5Aおよび5Bにそれぞれ示す。
前駆細胞EPCおよび前駆筋肉細胞(MPC)は、ヒツジの内頸静脈の60mlの末梢血から単離した。白血球画分は、Histopaque密度勾配で遠心により得た。幾つかの細胞を培地に再懸濁し、そしてフィブロネクチンを被覆したプレートに播いた。24時間間隔で、浮遊する細胞を新たなフィブロネクチン被覆プレートに移した。EPCは、VEGFおよびbFGFの含有するEGM−2培地で成長させることにより誘導した。残りの細胞は10μMの5−アザシチジンの存在下、24時間培養した。その後、浮遊する細胞を新しいフィブロネクチン被覆プレートに移し、そしてMPCを誘導するために筋性培地(20%ウシ胎児血清、10%ウマ血清、1%ニワトリ胚エキスおよび1%抗生物質を含むDMEM低グルコース)で培養した。EPCおよびMPCは分化した形態を受け入れるために、4〜6週間培養した。EPCの免疫組織化学的分析は、ほとんどの細胞がVEカドヘリンおよびCD31を発現したが、デスミンは発現しなかったことを示した。しかしMPCはビメンチンおよびデスミンの発現を示したが、VEカドヘリンの発現は示さなかった。これらのマーカーの発現はインビトロの培養中に維持された。これらの結果は培養したEPCおよびMPCがそれぞれECおよび筋肉細胞の表現型を有することを示す。
内皮細胞のコンフルエントな単層は、血栓形成に対して最も重要なバリアとなる。内皮細胞が媒介するNO生産は、管のトーンを維持するために重要である。細胞の付着を調査するために、脱細胞化およびエレクトロスピンされた管に内皮細胞を播いた。細胞の付着は、マウスの内皮細胞株(MS1)を播種したスカフォールドの走査型電子顕微鏡を使用して評価した。SEMの顕微鏡写真では、脱細胞化およびエレクトロスピンされた管の両方の内側表面上に48時間でコンフルエントな単層が明らかとなった。これらの結果は、内皮細胞が脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールド上にコンフルエントな単層を形成することを示す。
細胞の長期生育能は、播種したスカフォールドを生育可能な利用できる管へ改造するために必要である。細胞の生育能を試験するために、脱細胞化およびエレクトロスピンされた構造物を24ウェルプレートにウェルあたり約100mgの物質で入れた。4種の型の物質を生体適合性および細胞の生育能について試験し、1つの陰性対照ウェルは物質を含まなかった:(1)GA−NFS(1%グルタルアルデヒド架橋結合エレクトロスピン化スカフォールド);(2)EDC−NFS(EDC−架橋結合エレクトロスピン化スカフォールド);(3)nBV(自然な血管、脱細胞化);(4)Latex(ラテックスゴム、陽性対照)。
この実施例は、画像強化剤および量子ドットを用いてどのようにマトリックスを生成するかを記載する。特に外部スカフォールドのGd−DPTAおよび量子ドット機能化。スカフォールドは合成PGAマトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスまたは脱細胞化マトリックスのような任意の生体適合性基質であることができる。現在、インビボでの移植片の取り組みを非侵襲的にモニタリングできる臨床的に利用可能な管移植片は無く、抗凝固剤をその構造に包含する移植片もない。機能性を上げるために、特に物質マーカーとして、および抗凝固用にナノ物質をスカフォールド、例えば管スカフォールドに付けるための信頼できる方法が必要である。カルボキシル化Gdおよび量子ドット(QD)物質は、脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドの両方の表面に、EDC/スルホ−NHS法を使用してカップリングされた。いかなる未反応物質もクエンチされ、そしてスカフォールドを0.1M Trisバッファーですすぐことにより除去された。最終洗浄からの液体はUV除去下で無色であった。
この実施例は画像強化剤および治療薬を用いてエレクトロスピンされたマトリックスの生産を記載する。特に内部エレクトロスピンスカフォールドへのGd−DPTAおよびQD添加。エレクトロスピンを使用した管のスカフォールドを作成することは、バルク材料中に画像強化剤を包含する好機を提供する。15mg/mLの濃度でHFP中にガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸(Gd−DPTA)を含有する溶液は成功裏にスピンされ、そして量子ドットはトルエン中25.5ナノモル/mLの量子ドット溶液から8容量%の濃度で加えられた。Gd−DPTAまたはQDの添加により、スカフォールド中で形態学的変化は記録されなかった。これらの結果はスカフォールドへのナノ粒子の取り込みが、生じる構造の形態に最小の効果を有するだけであることを示す。
この実施例はヘパリンのような治療薬を量子ドット(QD)にどのようにカップリングするかを記載する。ヘパリンは有力な抗凝固剤である。全身的投与を回避するために、管スカフォールドからヘパリンの放出を制御し、そしてヘパリンをスカフォールドに結合させる方法が必要である。この実施例では、EDC(10mg)およびスルホ−NHS(2mg)を水溶液中5mL(0.05mg/mL)のカルボキシル化量子ドットに、室温で1時間、穏やかに撹拌しながら加えた。EDC活性化ヘパリン(30mg)は、上記に記載した同じEDCおよびNHS法に従い調製した。量子ドットおよびヘパリンを結合するために、5mgのフェニレンジアミン(PDA)を活性化量子ドットおよびヘパリン溶液に、室温で2時間、撹拌しながら加えた。量子ドット−ヘパリン(QD−ヘパリン)結合体は、等容量の1M Trisバッファー溶液(pH7.4)を加えることによりクエンチし、そして4℃に保存した。
ヘパリンの送達制御について量子ドットの効果を評価するために、薬剤の放出動力学を照射バースト後に分析した。ヘパリンのバースト放出を評価するために、QD−ヘパリンを含む0.55mgのPLGAマイクロカプセルを、2mlの緩衝化塩溶液に懸濁した。溶液はAM1.5ソーラーシミュレーターを使用して75mW/cm2で0.0、10および30分間照射した。次いで1、3および5日に、サンプルを4℃に冷却し、そして4500rpmで20分間遠心した。溶液を濾過して(0.45mの孔サイズ)、光学測定のためにマイクロカプセルを取り出した。
インビボモデルにおいてヘパリンの効力を評価するために、ヘパリンはスカフォールドの外植後に評価されなければならない。マウスに移植された機能化された血管(ヘパリン−QD)中に残るヘパリンは、トルイジンブルー染色により測定され、そしてほとんどのヘパリンが移植から2週間後に管の外へ拡散したことが示される。ヘパリン含量はRotachromeキットにより分析され、そしてデータでは大変少量のヘパリンが2週間後に残っていることが確認される。データはヘパリンの活性がスカフォールド中でその通常の1〜2時間の半減期を越えて成功裏に延長されたことを示す(図9)。
ヘパリンは強力な抗凝固剤であるが、この特性が固定化後でも存在することを確認することが重要であった。2つのヘパリン結合法を試験した。30ミリグラムのヘパリンを、PBS中の20mM EDCおよび10mM スルホ−NHS中で室温にて2時間インキュベーションし、そして3mm直径の脱細胞化スカフォールドを次いでヘパリン−EDC溶液に室温で2時間、浸した。架橋結合後、サンプルをPBS中で数回すすぎ、残存するEDCを完全に除去した。続いて物理的吸着によるヘパリンの固定化は、ポリ(L−リシン)(PLL)を使用して行った:3mm直径の脱細胞化スカフォールドを室温にて2時間、2mg/mLのPLL溶液中でインキュベーションした。PLL−吸着スカフォールドを15mg/mLのヘパリン溶液に室温にて1時間浸した。各方法の抗−血栓形成性は、トルイジンブルー染色によりヒツジ由来の全血を使用して評価した。即座の凝固が脱細胞化スカフォールドから観察されたが、血液処置後36時間、EDCおよびPLLと反応した脱細胞化スカフォールドの両方から有意な凝固の兆候は見られなかった。ヘパリン−PLL脱細胞化スカフォールドは、ヘパリンをスカフォールドに最高に負荷したことを示す最も弱い染色が示された。これらの結果は固定化されたヘパリンが血栓の防止に効果的であったことを示した。
この実施例は、ガドリニウムで観察された改善された造影を示す。インビトロの実験は、磁気共鳴造影において改善を測定するために、ガドリニウムを含む細胞スカフォールドについて行った。20ミリメートルの長さ、10ミリメートルの内部半径、および14ミリメートルの外部半径の円筒状の細胞スカフォールドを、種々のGd負荷濃度で作成した。細胞スカフォールドは個別に試験管に配置し、そしてPBSに沈めた。4つの試験管を左から右へ以下の順序で配置した:非機能化細胞スカフォールド(対照1)、機能化スカフォールド(対照2)、1xGd濃度の細胞スカフォールド、100xGd濃度(対照3)および1000xGd濃度の細胞スカフォールド。(100xとはGd−DPTAの55mg/kgの機能化中、溶液中の濃度を表す)軸T1強調スピンエコー画像は、GEヘルスケア テクノロジーズ(Healthcare Technologies)の磁気共鳴造影(MRI)1.5T TwinSpeedスキャナーで得た。
Gdはインビトロでスカフォールド中に維持され得るが、それがインビボで機能性を維持することを示す必要がある。この実験はスカフォールドのインビボ機能性を調査する。エレクトロスピンされた管のスカフォールドは、造影の2週間前にマウスの皮下に移植された。Gdを管のスカフォールドの1つに加えて、T1強調画像でそのコントラストを強化した。矢状縫合局所化画像はマウスから得、そして2つのスカフォールドを含有するT1強調冠状面画像は、矢状縫合画像を規定した(prescribed off)。T1強調画像の重要な造影パラメーターは、反復時間(TR)300ミリ秒、エコー時間(TE)14ミリ秒およびスライス厚2ミリメートルである。対照に比べてGdスカフォールドの画像コントラストに50%の改善。齧歯類モデルにおけるこれらの結果は、インビトロで見られる特徴がインビボでも維持されることを示す。
齧歯類を対象としたインビボの結果は、皮下検体に限られた。大きな動物モデルの血流に暴露されたスカフォールドにおいて、類似の結果を示す必要があった。細胞を播種したスカフォールドを含有するナノ粒子(量子ドットに結合したヘパリンおよびGd−DTPA)を使用する可能性を決定するために、大腿動脈バイパス法をヒツジで行った。末梢血サンプルを集め、循環している前駆細胞を選択し、そして培養で内皮および平滑筋細胞に分化させた。各細胞型を成長させ、別個に拡大し、そしてナノ粒子を含有する脱細胞化された管状スカフォールドに播種した(30mm長)。ナノ粒子を含有する細胞を含まないスカフォールドを対照とした。全身麻酔下で、スカフォールドの移植前に高解像15MHzプローブ(HDI−5000、ATL)でヒツジの大腿動脈を二重超音波検査法(B−モード超音波およびドップラースペクトル分析)で造影した。大腿動脈は6〜8cmの長さにわたる縦軸切開を介して露出した。アスピリンおよびヘパリンを抗凝固剤として使用し、そして大腿動脈を挟み、そして基部方向に(proximally)分割した。末端から側面への吻合は、自然の、および工作した動脈との間に作成した。遠位吻合を類似様式で作成し、そして血流をインプラントを介して回復し、続いて2つの吻合間に自然な大腿動脈を連結した。ドップラー超音波検査法は滅菌プローブを使用して行い、移植後のスカフォールドの寸法および血流を確立した。創傷を閉じ、そして動物は3500の前に麻酔から回復さて、標準的部屋に戻した。アスピリンは抗凝固のために7日間、経口的に規則的に投与した。
最初に内皮細胞および筋肉細胞を播種した回収した工作管への細胞付着を示すために、走査型電子顕微鏡を移植から2週間後に行った。細胞を播種した移植した脱細胞化スカフォールドでは、正常な管に類似する工作した動脈の管腔表面上への均一な細胞の付着が示された。細胞を含まないスカフォールドは、細胞の付着を表すことができなかった。これらの考察は、脱細胞化管のスカフォールドに播種された細胞が生存でき、そして手術後も付着したままであることを示す。
管が正常に機能するために、管は断続的な容量変化を収容するための適切な構造的特性を有するべきである。病的な状態では、正常な管機能および機械的特性は拘束され得る。生体工学で作成した管の使用を患者に移すために、最初に正常な管が形成され、そしてそれらが十分な表現型および機能的特性を経時的、特に成長しながら保持していることを確認することが必要である。
外植した管の機械的特性の解明は、宿主動物中でそれらの管が受けた適応できる改造についての情報を提供する。機械的試験は動脈の伸長(軸および周囲)、コンプライアンス、バースト圧、ストレス緩和およびクリープを含む。
組織学的および免疫組織化学的分析は、回収した管の移植片について行うことができる。縦および断面は、自然な管と移植片との間の転移ゾーンからおよび移植片の残りから取る。検体を固定し、処理し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)およびMassonのトリクロームで染色した。外膜、中膜、内膜(intima)および管腔の断面積は、コンピューターによるデジタル画像分析(NIH画像ソフトウェア)を使用して測定する。工作した動脈体の断面分析に加えて、自然な動脈と工作した動脈との間の吻合領域について別個の分析を行う。近位および遠位吻合をホルマリンで固定し、パラフィンに埋包し、次いで各吻合に広がる段階−区分(step−section)の管腔の内径および動脈壁厚化を分析するために断面に切断した。平行して血栓形成の定量をH&E染色を使用して行う。回収した組織の表現型の特性は経時的に測定する。
硝酸(NO)のような血管に作用する薬剤を合成する能力は、工作した管のスカフォールドの機能性を決定する。血管のホメオスタシスにおけるNOの重要性に関する証拠が増えてきている。NOは静止している管のトーンに貢献し、血小板の活性化を減じ、そして白血球の内皮への付着を防ぐ。
以下の方法は、臓器または組織の複雑な3次元的インフラ構造を破壊せずに、臓器または組織の全細胞含量を除去する工程を記載する。
肝臓はC7ブラックマウスから組織摘出の標準的な技法を使用して外科的に取り出した。肝臓は単離した肝臓を覆う適当容量の蒸留水を含むフラスコに入れた。磁気撹拌プレートおよび磁気スターラーを使用して単離した肝臓を蒸留水中で4℃にて24〜48時間、適切な速度で回転した。この工程は細胞屑および単離された肝臓の回りの細胞膜を除去する。
ブタの動脈セグメントは、ブタ(20〜30Kg、パターソン ファーム(Paterson Farm)、マサチューセッツ州)から得た。3〜4mmの内膜管腔サイズを持つ血管を、約4cm長のセグメントに切断した。管を蒸留水中に1時間置いて赤血球の溶解を誘導し、徹底的に洗浄し、そして機械的回転シェーカー(120RPM)内で塩水中に1%Triton 100Xおよび0.1%水酸化アンモニウムを含有する脱細胞化溶液中で、4℃にて48時間インキュベーションした。この工程を2回繰り返し、次いで蒸留水で徹底的に洗浄した。脱細胞化された管をPBS中に24時間置き、次いで凍結乾燥し(ビルティス(Virtis);ガルディナー、ニューヨーク州)、そして冷ガス中で滅菌した。
十分な説明に基づく同意を得た後、伏在静脈の捨てたセグメントをCABGを受けている患者から得た。管は20%FCSを含有するM199培地に入れた。約1cmのセグメントを両端で挟み、そして無血清M199培地中の1mg/mlのコラゲナーゼII型で満たし、そして5%CO2湿潤化インキュベーターに37℃にて20分間置いた。次いで静脈に50mlのM199を流し、そして細胞は300×gで10分間遠心することにより集めた。続いて細胞は、20%FBSを含有する3mlのEBM−2培地に再懸濁し、そして3cmのゼラチン被覆皿に播種した。コンフルエンス付近に達した後、HSVECはUlexユーロピアスIレクチン(UEA−I:ベクター(Vector)、ベーリンガム、カリフォルニア州)被覆磁気ビーズ(ダイナル:Dynal、ノルウェイ)をJackson et al.,(1990)J.Cell Sci.:257−262に記載されているように使用して免疫単離により精製した。続いてHSVECはゼラチン被覆10cmプレートで培養し、そして培地を3日毎に交換した。細胞の回収および免疫単離工程は、数回繰り返して同じ結果を得、そし細胞は12継代以上培養した。免疫組織化学的分析には、8個のチャンバースライドに播種したHSVECを2%パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、そして1次抗体とインキュベーションした。ビオチン化2次抗体を使用し、そしてFITC結合アビジンにより検出した。スライドにDAPI含有培地を乗せ、そして蛍光顕微鏡下で視覚化した。10cm皿内の培養したHSVECは、10mM Tris、pH7.0、50mM NaCl、1% Tritonおよびプロテアーゼインヒビターを含有するバッファーに溶解した。免疫沈降およびウエスタンブロットは抗−KDR抗体を用いて行った。
自然なインビボの血管(すなわち血流および脈拍数の変動に耐えることができる)を模する機械的特性を有する血管を製造するために、バイオリアクター小室を設計し、そして工作する血管を予備調整するために使用した。
実施例23に記載したバイオリアクターから管の出口の一つを密閉し、そして約0.5mlのHSVEC(5x106細胞/ml)懸濁液をもう一つの出口から挿入し、そして管を15分毎に回転しなが1時間放置した。その後、EBM−2を穏やかに加え、そして培地を2〜3日毎に交換した。細胞はマトリックス上で5〜7日成長させた。16個のHSVECを播いた脱細胞化されたブタの管を、8匹の無胸腺マウスの皮下空間に移植し、そして7日後に組織学的分析のために回収した。回収したマトリックスをO.C.T.化合物(サクラ ファインテック(Sakura Finetek)、トランス、カリフォルニア州)に浸し、そして液体窒素中で凍結した。低温切片(5μm)をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で組織学的に、そして抗CD−31抗体で免疫染色することにより分析した。対照染色は正常なヤギ血清を使用して行った。1次抗体はアビジン−ビオチン−イムノペルオキシダーゼ法を使用して検出した。対照として、1次抗体を正常ヤギ血清に置き換えた。
この実施例は播種した血管の特性を決定するために使用した様々な技術を説明する。
脱細胞化されたブタの管、HSVECを播種した管(約4cm)および培養したHSVECをRNAzol試薬で40Cにて組織ホモジナイザーを使用して均一化した。RNAは製造元(テルテスト(TelTest)、フレンズウッド、テキサス州)のプロトコールに従い単離した。相補的DNAは2mgのRNAからSuperscriptII逆転写酵素およびプライマーとしてランダムヘキサマーを使用して合成した。Flt−1、KDR、ニューロピリン−1(NRP−1)およびグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)プライマー(インビトロジェン(Invitrogen)、カールスバット、カリフォルニア州)を使用したRT−PCR分析は、製造元のプロトコールを使用して行った。Flt−1(416bp)、KDR(479bp)、NRP−1(409bp)およびGAPDH(673bp)に相当するPCR産物は、2%アガロースゲルで解析し、エチジウムブロミドで染色し、そしてU.V.光下で視覚化した。
プロスタグランジンF1αの合成は、調整培養中の6−ケトプロスタグランジンF1αを測定することにより決定した。簡単に説明すると、HSVECを脱細胞化したマトリックス(約1.5x105細胞/50mm2)に播種した。48時間後、マトリックスを48ウェル皿の別個のウェルに移した。平行して、HSVECの量を上げながら48ウェル皿に播種した。3日後、50mlの調整した培地を製造元(ケイマンケミカル;ケイマン諸島)の使用説明に従い酵素イムノアッセイキットを使用してアッセイした。レベルは細胞数あたり3日間の6−ケトプロスタグランジンF1aの生産として算出した。
NO媒介型の管の弛緩は、臓器−チャンバー中で評価した。簡単に説明すると、モルモットの胸大動脈を回収し、内皮層を穏やかに掻き取るにとにより取り出し、そして5mmのセグメントに切断した。各セグメントを等尺性の張力の測定のために、2つのタングステンスターラップの間に掛けた。管のセグメントは、37℃で5%CO2、15%O2およびN2のバランスの混合物を含む10mlのクレブスバッファー溶液を含む臓器チャンバーに置いた。各HSVEC播種管(2〜3cm長)を21G針に結び、これをプラスチックIVチュービングに付け、そして新しい大動脈セグメントを臓器チャンバーの上に配置した。セグメントは80mMのKClクレブスバッファーを用いて段階的様式で収縮させて、4gの静止張力を得た。90分間の静止後、セグメントは最大KCl誘導型収縮の約50%の安定な収縮が達成されるまで、10−7の最終濃度までプロスタグランジンF2αに応答して収縮した。次いで血管作用物質およびアンタゴニストを、注入ポンプを使用してHSVEC播種管を介して加えてNO生産を誘導した。10−7M〜10−3Mの間の用量の血管作用物質を試験し、そして用量応答曲線を構築した。
この実施例は血管に疾患がある患者から得た循環している前駆細胞から、心臓弁を製造し、そして予備調整するための種々の技術を記載した。
Claims (26)
- 単離された内皮前駆細胞および単離された筋肉前駆細胞の少なくとも1種から分化した細胞群を取得する工程、
心臓弁形を有する生体適合性マトリックスに、該分化した細胞がマトリックスに付着して細胞層を形成するように該細胞を播種する工程、
該分化した細胞の播種されたマトリックスを、予備調整用小室内の取付け要素に取り付ける工程であって、該取付け要素が、流体流系に流動的につながれたチャンネルを有するものである、工程、かつ、
該播種されたマトリックスを、該流体流系を用い、該マトリックスが天然の心臓弁を通る血液流に似せる流体流条件に暴露されるように、血液に似せる組成および粘度を有する生物学的流体を移動させることにより予備調整する工程であって、生物学的流体の流速および脈拍数が、予備調整された心臓弁が作製されるように制御されるものである、工程
を含むことを特徴とする予備調整された心臓弁の製造方法。 - 生体適合性マトリックスが脱細胞化マトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスおよび合成ポリマーマトリックスからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 予備調整用小室が心臓弁リーフレットを取り付けるために適する寸法を有する容器である請求項1に記載の方法。
- マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、閉鎖された一方向の流体流系に取り付けられたマトリックスの内側表面を通して移動させる工程を含んでなる請求項1に記載の方法。
- マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、取り付けられたマトリックスの内側表面を通して連続流として移動させる工程を含んでなる請求項1に記載の方法。
- 連続流が約1ダイン/cm2〜約30ダイン/cm2の範囲の壁体剪断応力を誘導するように経時的に増やされる流速を有する請求項5に記載の方法。
- マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、取り付けられたマトリックスの内側表面を通してパルス流として移動させる工程を含んでなる請求項1に記載の方法。
- パルス流が、約10ダイン/cm2〜約45ダイン/cm2の範囲の壁体剪断応力を誘導するように経時的に増やされる脈拍数を有する、請求項7に記載の方法。
- パルス流が、約60〜約200mHgの範囲の壁体圧分布を誘導するように経時的に増やされる脈拍数を有する、請求項7に記載の方法。
- 生物学的流体が、播種された管状マトリックスを通ってポンプにより移動される、請求項1に記載の方法。
- 生物学的流体が、培養基、バッファー媒質および生理学的媒質からなる群から選択される請求項1に記載方法。
- 管状マトリックスの外側表面が生理学的流体に暴露されるように、ある容量の生物学的流体を予備調整用小室にさらに加えることを含んでなる請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、少なくとも1つの天然成分および少なくとも1つの合成ポリマー成分およびナノ粒子に結合した治療薬を含んでなるエレクトロスピンされたマトリックスである、請求項1に記載の方法。
- 天然成分がコラーゲンであり、そして合成ポリマー成分がポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)である請求項13に記載の方法。
- さらにエラスチンを含んでなる請求項13に記載の方法。
- 治療薬がヘパリンであり、そしてナノ粒子が量子ドットである請求項13に記載の方法。
- ヘパリンおよび量子ドットがポリマーにカプセル化されている請求項16に記載の方法。
- ナノ粒子からのヘパリンの放出が、約700nm〜約1000nmの範囲の波長の放射の適用により制御される請求項17に記載の方法。
- 加熱がポリマーの超構造を改変するように、ナノ粒子を加熱することによりナノ粒子からヘパリンが局所的に放出される請求項18に記載の方法。
- エレクトロスピンされたマトリックスがさらに画像強化剤を含んでなる請求項13に記載の方法。
- 画像強化剤がガドリニウムである請求項20に記載の方法。
- 内皮細胞がヒトの伏在静脈から単離される請求項1に記載の方法。
- 内皮細胞が末梢血または骨髄から単離された前駆細胞から誘導される請求項1に記載の方法。
- 単離された内皮前駆細胞および単離された筋肉前駆細胞の少なくとも1種から分化した細胞群を播種した心臓弁形を有する生体適合性マトリックスを含んでなり、
該細胞がマトリックスに付着して細胞層を形成するものであり、かつ、
予備調整用小室内で該播種された細胞が、心臓を通る正常な血流と等価の流速および脈拍数で播種されたマトリックスを通過する血液に似せる成分および粘度を有する生物学的流体に対して該播種された細胞を暴露するように予備調整されているものである、
ことを特徴とする予備調整された組織を工作した心臓弁。 - 生体適合性マトリックスが脱細胞化マトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスおよび合成ポリマーマトリックスからなる群から選択される請求項24に記載の心臓弁。
- 生体適合性マトリックスが脱細胞化心臓弁である請求項24に記載の心臓弁。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US66083205P | 2005-03-11 | 2005-03-11 | |
US60/660,832 | 2005-03-11 | ||
US68631605P | 2005-06-01 | 2005-06-01 | |
US60/686,316 | 2005-06-01 | ||
PCT/US2006/008964 WO2006099334A2 (en) | 2005-03-11 | 2006-03-10 | Production of tissue engineered heart valves |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008532653A JP2008532653A (ja) | 2008-08-21 |
JP2008532653A5 JP2008532653A5 (ja) | 2009-06-04 |
JP4975013B2 true JP4975013B2 (ja) | 2012-07-11 |
Family
ID=36933598
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008501039A Active JP4975013B2 (ja) | 2005-03-11 | 2006-03-10 | 組織が工作された心臓弁の製造 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9248015B2 (ja) |
EP (1) | EP1863546B1 (ja) |
JP (1) | JP4975013B2 (ja) |
AU (1) | AU2006223112B2 (ja) |
CA (1) | CA2602050C (ja) |
WO (1) | WO2006099334A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10751447B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-08-25 | Wake Forest University Health Sciences | Laminous vascular constructs combining cell sheet engineering and electrospinning technologies |
Families Citing this family (69)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1863546B1 (en) | 2005-03-11 | 2015-10-07 | Wake Forest University Health Sciences | Production of tissue engineered heart valves |
US20060204539A1 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Anthony Atala | Electrospun cell matrices |
US8728463B2 (en) * | 2005-03-11 | 2014-05-20 | Wake Forest University Health Science | Production of tissue engineered digits and limbs |
CN101626682B (zh) | 2006-10-27 | 2014-04-16 | 爱德华兹生命科学公司 | 用于外科植入的生物组织 |
US9101691B2 (en) | 2007-06-11 | 2015-08-11 | Edwards Lifesciences Corporation | Methods for pre-stressing and capping bioprosthetic tissue |
US8357387B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-01-22 | Edwards Lifesciences Corporation | Capping bioprosthetic tissue to reduce calcification |
WO2009152384A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | The Children's Mercy Hospital | Solutions for tissue engineering and methods of use |
WO2010064403A1 (ja) * | 2008-12-02 | 2010-06-10 | 富士フイルム株式会社 | 生体高分子と生体分解性合成高分子を含む組成物の製造方法 |
WO2010101962A1 (en) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | The Children's Mercy Hospital | Tissue engineered human pulmonary valves with cyclic pressure bioreactor accelerated seeding strategies and methods for assessing inflammatory potential of putative scaffolds for tissue engineered heart valves |
DE102009013012A1 (de) * | 2009-03-16 | 2010-09-30 | TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH | Mit Therapeutika und Diagnostika beladene Kompositmaterialien umfassend Polymernanopartikel und Polymerfasern |
WO2011115612A1 (en) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | Peridyne Medical, Llc | Thin collagen tissue for medical device applications |
US9211361B2 (en) * | 2010-03-15 | 2015-12-15 | Kemal Schankereli | Thin collagen tissue for medical device applications |
EP3636293A1 (en) | 2010-03-23 | 2020-04-15 | Edwards Lifesciences Corporation | Methods of conditioning sheet bioprosthetic tissue |
US8579964B2 (en) | 2010-05-05 | 2013-11-12 | Neovasc Inc. | Transcatheter mitral valve prosthesis |
US8906601B2 (en) | 2010-06-17 | 2014-12-09 | Edwardss Lifesciences Corporation | Methods for stabilizing a bioprosthetic tissue by chemical modification of antigenic carbohydrates |
CA2808225C (en) * | 2010-08-24 | 2019-02-12 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for cardiac therapy |
US9351829B2 (en) | 2010-11-17 | 2016-05-31 | Edwards Lifesciences Corporation | Double cross-linkage process to enhance post-implantation bioprosthetic tissue durability |
US20120221099A1 (en) * | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Alexander Borck | Coated biological material having improved properties |
US9925296B2 (en) | 2011-03-23 | 2018-03-27 | The Regents Of The University Of California | Mesh enclosed tissue constructs |
US10610616B2 (en) | 2011-03-23 | 2020-04-07 | The Regents Of The University Of California | Mesh enclosed tissue constructs |
US9968446B2 (en) | 2011-03-23 | 2018-05-15 | The Regents Of The University Of California | Tubular scaffold for fabrication of heart valves |
US10016461B2 (en) | 2012-12-03 | 2018-07-10 | The Regents Of The University Of California | Apparatus and process for growing a heart valve in three-dimensions |
US8936650B2 (en) * | 2011-03-23 | 2015-01-20 | The Regents Of The University Of California | Mesh enclosed tissue constructs |
US9554897B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-01-31 | Neovasc Tiara Inc. | Methods and apparatus for engaging a valve prosthesis with tissue |
US9308087B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-04-12 | Neovasc Tiara Inc. | Sequentially deployed transcatheter mitral valve prosthesis |
US8945209B2 (en) * | 2011-05-20 | 2015-02-03 | Edwards Lifesciences Corporation | Encapsulated heart valve |
GB201113060D0 (en) | 2011-07-29 | 2011-09-14 | Univ Ulster | Tissue scaffold |
CN103987392A (zh) * | 2011-09-02 | 2014-08-13 | Adeka株式会社 | 脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片 |
EP2609893B1 (en) * | 2011-12-29 | 2014-09-03 | Sorin Group Italia S.r.l. | A kit for implanting prosthetic vascular conduits |
WO2013163358A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Harvard Bioscience, Inc. | Engineered tissue scaffolds and supports therefor |
US9345573B2 (en) | 2012-05-30 | 2016-05-24 | Neovasc Tiara Inc. | Methods and apparatus for loading a prosthesis onto a delivery system |
US9669141B2 (en) * | 2012-07-20 | 2017-06-06 | President And Fellows Of Harvard College | Tissue-engineered pumps and valves and uses thereof |
US10238771B2 (en) | 2012-11-08 | 2019-03-26 | Edwards Lifesciences Corporation | Methods for treating bioprosthetic tissue using a nucleophile/electrophile in a catalytic system |
WO2014110300A1 (en) | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Harvard Apparatus Regenerative Technology | Synthetic scaffolds |
US9572665B2 (en) | 2013-04-04 | 2017-02-21 | Neovasc Tiara Inc. | Methods and apparatus for delivering a prosthetic valve to a beating heart |
US9615922B2 (en) | 2013-09-30 | 2017-04-11 | Edwards Lifesciences Corporation | Method and apparatus for preparing a contoured biological tissue |
US10959839B2 (en) | 2013-10-08 | 2021-03-30 | Edwards Lifesciences Corporation | Method for directing cellular migration patterns on a biological tissue |
WO2015103149A1 (en) | 2013-12-30 | 2015-07-09 | The New York Stem Cell Foundation | Tissue grafts and methods of making and using the same |
LT3230044T (lt) * | 2014-12-11 | 2020-08-25 | ETH Zürich | Transplantato karkasas, skirtas kremzlėms atkurti, ir jo gamybos procesas |
EP3261584A4 (en) * | 2015-02-27 | 2018-10-10 | University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education | Double component mandrel for electrospun stentless, multi-leaflet valve fabrication |
US10583004B2 (en) * | 2015-02-27 | 2020-03-10 | University of Pittsburgh — Of the Commonwealth System of Higher Education | Retrievable self-expanding non-thrombogenic low-profile percutaneous atrioventricular valve prosthesis |
CN105983134A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-10-05 | 刘畅 | 一种人工血管及其制备方法 |
MX2017016701A (es) * | 2015-06-25 | 2018-11-09 | Auckland Uniservices Ltd | Aparato y metodo de cultivo de tejidos. |
US10405975B2 (en) * | 2015-10-07 | 2019-09-10 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Cultured cell leaflet material |
US11384328B2 (en) | 2015-11-18 | 2022-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cartridge-based system for long term culture of cell clusters |
CN113633435A (zh) | 2016-01-29 | 2021-11-12 | 内奥瓦斯克迪亚拉公司 | 用于防止流出阻塞的假体瓣膜 |
AU2017240687B2 (en) * | 2016-04-01 | 2022-06-02 | New York Stem Cell Foundation, Inc. | Customized hybrid bone-implant grafts |
CN113893064A (zh) | 2016-11-21 | 2022-01-07 | 内奥瓦斯克迪亚拉公司 | 用于快速收回经导管心脏瓣膜递送***的方法和*** |
WO2018156856A1 (en) * | 2017-02-23 | 2018-08-30 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Stentless biopolymer heart valve replacement capable of living tissue regeneration |
US10610591B2 (en) | 2017-03-15 | 2020-04-07 | Nanoco Technologies Ltd. | Light responsive quantum dot drug delivery system |
CA3073834A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-28 | Neovasc Tiara Inc. | Sequentially deployed transcatheter mitral valve prosthesis |
US11629318B2 (en) | 2017-10-20 | 2023-04-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for producing mature adipocytes and methods of use thereof |
AU2018354277A1 (en) * | 2017-10-24 | 2020-04-30 | Embody Inc. | Biopolymer scaffold implants and methods for their production |
US11028502B2 (en) * | 2017-11-02 | 2021-06-08 | Wake Forest University Health Sciences | Vascular constructs |
CN108764298B (zh) * | 2018-04-29 | 2022-03-08 | 天津大学 | 基于单分类器的电力图像环境影响识别方法 |
GB201813461D0 (en) * | 2018-08-17 | 2018-10-03 | Raft Enterprises Ltd | Tissue scaffold |
US11517428B2 (en) | 2018-11-01 | 2022-12-06 | Edwards Lifesciences Corporation | Transcatheter pulmonic regenerative valve |
AU2019374743B2 (en) | 2018-11-08 | 2022-03-03 | Neovasc Tiara Inc. | Ventricular deployment of a transcatheter mitral valve prosthesis |
RU2711544C1 (ru) * | 2018-12-29 | 2020-01-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Биоматериал для изготовления протезов клапанов сердца и способ получения биоматериала |
US11602429B2 (en) | 2019-04-01 | 2023-03-14 | Neovasc Tiara Inc. | Controllably deployable prosthetic valve |
WO2020210652A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Neovasc Tiara Inc. | Prosthetic valve with natural blood flow |
CA3140925A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | Neovasc Tiara Inc. | Introducer with hemostasis mechanism |
AU2020295566B2 (en) | 2019-06-20 | 2023-07-20 | Neovasc Tiara Inc. | Low profile prosthetic mitral valve |
CN111658824B (zh) * | 2020-06-15 | 2021-03-30 | 四川大学 | 一种具有协同抗凝及抗钙化功能的瓣膜材料及其制备方法 |
JP6881798B1 (ja) * | 2020-08-08 | 2021-06-02 | ティシューバイネット株式会社 | 弁機能を有する立体細胞構造体、その作製方法及び支持体 |
CN113198045B (zh) * | 2021-04-29 | 2022-03-11 | 武汉纺织大学 | 一种贴合型生物瓣膜及其制备方法 |
WO2023108091A1 (en) * | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Trustees Of Tufts College | Compositions and methods for protecting animal cells from compressive forces |
CN114984332B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-06-06 | 山东大学 | 一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层及其制备方法 |
CN115721781B (zh) * | 2022-09-09 | 2023-11-07 | 哈尔滨工业大学(深圳) | 一种兼具细胞密度和机械强度的人工肌腱的制备工艺 |
Family Cites Families (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2917037C2 (de) | 1979-04-27 | 1980-12-11 | Josef Dipl.-Chem. Dr. 8000 Muenchen Gaensheimer | Parenteral arzneimittelhaltige partiell resorbierbare Mehrkomponentenmasse auf Basis von polymeren Stoffen |
US5698271A (en) | 1989-08-22 | 1997-12-16 | Immunivest Corporation | Methods for the manufacture of magnetically responsive particles |
US5281422A (en) | 1991-09-24 | 1994-01-25 | Purdue Research Foundation | Graft for promoting autogenous tissue growth |
SE504429C2 (sv) * | 1995-05-17 | 1997-02-10 | Tetra Laval Holdings & Finance | Sätt att styra mjölkning med hjälp av spengummits abrupta rörelse jämte mjölkningsmaskin med avkännare härför |
US5855610A (en) | 1995-05-19 | 1999-01-05 | Children's Medical Center Corporation | Engineering of strong, pliable tissues |
US5645532A (en) | 1996-03-04 | 1997-07-08 | Sil-Med Corporation | Radiopaque cuff peritoneal dialysis catheter |
NZ331629A (en) | 1996-04-01 | 2000-04-28 | Epix Medical Inc | Bioactivated diagnostic imaging contrast agents |
US5788625A (en) | 1996-04-05 | 1998-08-04 | Depuy Orthopaedics, Inc. | Method of making reconstructive SIS structure for cartilaginous elements in situ |
US6171344B1 (en) | 1996-08-16 | 2001-01-09 | Children's Medical Center Corporation | Bladder submucosa seeded with cells for tissue reconstruction |
US6099832A (en) * | 1997-05-28 | 2000-08-08 | Genzyme Corporation | Transplants for myocardial scars |
EP0989893B1 (en) | 1997-06-18 | 2002-12-18 | Act Labs Ltd. | Video game controller system with interchangeable interface adapters |
WO1999001538A1 (en) | 1997-07-03 | 1999-01-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-engineered constructs |
US6471993B1 (en) * | 1997-08-01 | 2002-10-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional polymer matrices |
WO1999011191A1 (en) | 1997-08-28 | 1999-03-11 | Boston Scientific Corporation | System for implanting a cross-linked polysaccharide fiber and methods of forming and inserting the fiber |
US6143293A (en) | 1998-03-26 | 2000-11-07 | Carnegie Mellon | Assembled scaffolds for three dimensional cell culturing and tissue generation |
US6530956B1 (en) | 1998-09-10 | 2003-03-11 | Kevin A. Mansmann | Resorbable scaffolds to promote cartilage regeneration |
US7662409B2 (en) | 1998-09-25 | 2010-02-16 | Gel-Del Technologies, Inc. | Protein matrix materials, devices and methods of making and using thereof |
US20020090725A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-07-11 | Simpson David G. | Electroprocessed collagen |
US6592623B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-07-15 | Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation | Engineered muscle |
US20020081732A1 (en) | 2000-10-18 | 2002-06-27 | Bowlin Gary L. | Electroprocessing in drug delivery and cell encapsulation |
US7615373B2 (en) * | 1999-02-25 | 2009-11-10 | Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation | Electroprocessed collagen and tissue engineering |
US6662805B2 (en) | 1999-03-24 | 2003-12-16 | The Johns Hopkins University | Method for composite cell-based implants |
DE19919625C2 (de) * | 1999-04-29 | 2002-10-31 | Symetis Ag Zuerich | In-vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen Herzklappe und durch dieses Verfahren herstellbare Klappe |
US6596296B1 (en) | 1999-08-06 | 2003-07-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Drug releasing biodegradable fiber implant |
US6753454B1 (en) | 1999-10-08 | 2004-06-22 | The University Of Akron | Electrospun fibers and an apparatus therefor |
US6432712B1 (en) * | 1999-11-22 | 2002-08-13 | Bioscience Consultants, Llc | Transplantable recellularized and reendothelialized vascular tissue graft |
US6503273B1 (en) | 1999-11-22 | 2003-01-07 | Cyograft Tissue Engineering, Inc. | Tissue engineered blood vessels and methods and apparatus for their manufacture |
US6428802B1 (en) | 1999-12-29 | 2002-08-06 | Children's Medical Center Corp. | Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate |
US20030229393A1 (en) * | 2001-03-15 | 2003-12-11 | Kutryk Michael J. B. | Medical device with coating that promotes cell adherence and differentiation |
WO2001071009A2 (en) | 2000-03-17 | 2001-09-27 | Anticancer, Inc. | Whole-body optical imaging of gene expression and uses thereof |
EP1274469A2 (en) | 2000-04-20 | 2003-01-15 | Emory University | Native protein mimetic fibers, fiber networks and fabrics for medical use |
AU2001273632A1 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Drexel University | Polymeric, fiber matrix delivery systems for bioactive compounds |
DE10050199A1 (de) | 2000-10-11 | 2002-04-25 | Ethicon Gmbh | Flächiges Implantat mit im Ultraschall detektierbaren Elementen |
DE20019928U1 (de) * | 2000-11-17 | 2001-02-15 | Auto Tissue Gmbh | Vorrichtung zur Herstellung biologischer Prothesen |
IT249353Y1 (it) | 2000-12-28 | 2003-04-14 | Soveta S R L | Rete per uso chirurgico. |
SE525131C2 (sv) | 2001-01-15 | 2004-12-07 | Artimplant Ab | Implantat för rekonstruktion av leder |
US6995013B2 (en) | 2002-07-08 | 2006-02-07 | Biomed Solutions, Llc | Cell-scaffold composition containing five layers |
US20040110439A1 (en) * | 2001-04-20 | 2004-06-10 | Chaikof Elliot L | Native protein mimetic fibers, fiber networks and fabrics for medical use |
EP1416874A4 (en) | 2001-07-16 | 2007-04-18 | Depuy Products Inc | BIOLOGICAL / SYNTHETIC POROUS EXTRACELLULAR HYBRID MATRIX SCUFF |
US20040044403A1 (en) * | 2001-10-30 | 2004-03-04 | Joyce Bischoff | Tissue-engineered vascular structures |
US20030097180A1 (en) | 2001-11-20 | 2003-05-22 | Pertti Tormala | Joint prosthesis |
AU2003219916A1 (en) | 2002-02-22 | 2003-09-09 | University Of Washington | Bioengineered tissue substitutes |
JP4638735B2 (ja) | 2002-06-24 | 2011-02-23 | タフツ ユニバーシティー | 絹糸生体材料およびその使用方法 |
JP4117463B2 (ja) * | 2002-07-24 | 2008-07-16 | グンゼ株式会社 | 人工心臓弁及びその製造方法 |
DE10235237A1 (de) | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Symetis Ag | In-vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen "gestenteten" Tissue eingineerten Herzklappe |
TW200410714A (en) | 2002-08-07 | 2004-07-01 | Smithkline Beecham Corp | Electrospun amorphous pharmaceutical compositions |
CA2497349C (en) | 2002-09-26 | 2008-07-08 | Angiotech International Ag | Perivascular wraps |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
JP4184917B2 (ja) | 2002-10-23 | 2008-11-19 | 東レ株式会社 | ナノファイバー集合体 |
WO2004044281A2 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | The Regents Of The University Of California | Nano-porous fibers and protein membranes |
US20040098023A1 (en) | 2002-11-15 | 2004-05-20 | Scimed Life Systems, Inc. | Embolic device made of nanofibers |
WO2004098420A2 (en) | 2003-05-06 | 2004-11-18 | Replication Medical, Inc. | Fiber implant system for soft tissue augmentation |
US7351262B2 (en) | 2003-06-05 | 2008-04-01 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone implants and methods of making same |
CA2535857A1 (en) | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Hydrogel porogens for fabricating biodegradable scaffolds |
US7704740B2 (en) | 2003-11-05 | 2010-04-27 | Michigan State University | Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture |
EP1698358A4 (en) * | 2003-12-26 | 2007-12-26 | Cardio Inc | TRANSPLANTABLE BIOMATERIAL AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME |
US20050142161A1 (en) | 2003-12-30 | 2005-06-30 | Freeman Lynetta J. | Collagen matrix for soft tissue augmentation |
KR20060114366A (ko) * | 2004-02-09 | 2006-11-06 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 | 클론원성 내피 전구 세포의 분리, 팽창 및 용도 |
JP2007526322A (ja) | 2004-03-02 | 2007-09-13 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | ナノセル薬物送達系 |
EP1604697A1 (en) | 2004-06-09 | 2005-12-14 | J.A.C.C. GmbH | Implantable device |
WO2006031190A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Optoqrit Ab | Superparamagnetic gadolinium oxide nanoscale particles and compositions comprising such particles |
US7531503B2 (en) | 2005-03-11 | 2009-05-12 | Wake Forest University Health Sciences | Cell scaffold matrices with incorporated therapeutic agents |
EP1863547B1 (en) | 2005-03-11 | 2016-05-11 | Wake Forest University Health Sciences | Tissue engineered blood vessels |
US8728463B2 (en) | 2005-03-11 | 2014-05-20 | Wake Forest University Health Science | Production of tissue engineered digits and limbs |
EP1863546B1 (en) | 2005-03-11 | 2015-10-07 | Wake Forest University Health Sciences | Production of tissue engineered heart valves |
US20060204539A1 (en) | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Anthony Atala | Electrospun cell matrices |
US20060204445A1 (en) | 2005-03-11 | 2006-09-14 | Anthony Atala | Cell scaffold matrices with image contrast agents |
-
2006
- 2006-03-10 EP EP06738070.9A patent/EP1863546B1/en not_active Not-in-force
- 2006-03-10 US US11/373,066 patent/US9248015B2/en active Active
- 2006-03-10 JP JP2008501039A patent/JP4975013B2/ja active Active
- 2006-03-10 WO PCT/US2006/008964 patent/WO2006099334A2/en active Application Filing
- 2006-03-10 AU AU2006223112A patent/AU2006223112B2/en not_active Ceased
- 2006-03-10 CA CA2602050A patent/CA2602050C/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-01-04 US US14/987,601 patent/US9801713B2/en active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10751447B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-08-25 | Wake Forest University Health Sciences | Laminous vascular constructs combining cell sheet engineering and electrospinning technologies |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1863546B1 (en) | 2015-10-07 |
US9801713B2 (en) | 2017-10-31 |
AU2006223112B2 (en) | 2011-12-01 |
CA2602050A1 (en) | 2006-09-21 |
CA2602050C (en) | 2013-12-03 |
AU2006223112A1 (en) | 2006-09-21 |
EP1863546A2 (en) | 2007-12-12 |
US20160199179A1 (en) | 2016-07-14 |
JP2008532653A (ja) | 2008-08-21 |
US9248015B2 (en) | 2016-02-02 |
US20060253192A1 (en) | 2006-11-09 |
WO2006099334A3 (en) | 2007-04-26 |
WO2006099334A2 (en) | 2006-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4975013B2 (ja) | 組織が工作された心臓弁の製造 | |
JP5232636B2 (ja) | 組織の工作された血管 | |
US9163331B2 (en) | Electrospun cell matrices | |
US7531503B2 (en) | Cell scaffold matrices with incorporated therapeutic agents | |
US20060204445A1 (en) | Cell scaffold matrices with image contrast agents | |
US9039782B2 (en) | Production of tissue engineered digits and limbs | |
US11028502B2 (en) | Vascular constructs | |
EP3041522B1 (en) | A flap for de-novo tissue regeneration | |
AU2016298145B2 (en) | Vascular cast-based scaffolds and methods of making the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090310 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090310 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20090310 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110405 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110705 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110713 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110804 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120403 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120410 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150420 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |