JP4972295B2 - Immunoassay method and biochip - Google Patents
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Description
本発明は、免疫分析方法及びバイオチップに関し、より詳細には、高濃度で存在する被検物質を検出するための免疫分析方法及びこの方法を実施するためのバイオチップに関する。 The present invention relates to an immunoassay method and a biochip, and more particularly to an immunoassay method for detecting a test substance present at a high concentration and a biochip for carrying out this method.
一般に、高濃度又は高分子量の被検物を定量するためには、その被検物の操作性を考慮し、また、適用する検出器の特性などによって、被検物の検出値を適切に検出レンジに収めるために、被検物を含むサンプルを、適当な倍率で希釈する。これにより、正確な測定を行うことができる。 In general, in order to quantify a high-concentration or high-molecular-weight specimen, the operability of the specimen is taken into consideration, and the detected value of the specimen is appropriately detected according to the characteristics of the detector to be applied. To fit the range, the sample containing the sample is diluted at an appropriate magnification. Thereby, an accurate measurement can be performed.
例えば、高濃度の生物学的サンプルを免疫測定法で測定するためには、まずはじめに、被検物を含むサンプルを任意の倍率に希釈し、次いで、その希釈物を免疫反応に付し、比色定量法などによる測定し、その結果から、希釈倍率等を考慮して、サンプルに含まれていた被検物を算出する。 For example, to measure a biological sample at a high concentration by immunoassay, first, a sample containing a test substance is diluted to an arbitrary magnification, and then the diluted sample is subjected to an immune reaction to obtain a ratio. Measurement is performed by a color quantification method or the like, and the specimen contained in the sample is calculated from the result in consideration of the dilution factor and the like.
しかし、サンプルの希釈は、近年の種々の測定系での態様、例えば、極微量のサンプルを、小さな基板上で混合し、反応させるなどして検出等を行うバイオチップを用いる測定系においては、必しも容易に実現できない場合がある。つまり、数センチの大きさの基板において、所定量の希釈液を正確に加え、短時間に均一にサンプルと混合することは困難である。また、希釈工程を行うことに伴って、バイオチップ上に、希釈混合槽、希釈液の導入路などを追加形成しなければならず、限られたサイズで一連工程の完結を実現するバイオチップでは、希釈工程を組み合わせることは困難である。 However, sample dilution is performed in various measurement systems in recent years, for example, in a measurement system using a biochip that performs detection and the like by mixing and reacting a very small amount of sample on a small substrate. There are cases where it cannot be easily realized. In other words, it is difficult to accurately add a predetermined amount of diluent on a substrate having a size of several centimeters and uniformly mix with the sample in a short time. In addition, along with the diluting process, a diluting / mixing tank and a diluting solution introduction path must be additionally formed on the biochip. In a biochip that realizes completion of a series of processes with a limited size. It is difficult to combine dilution steps.
一方、高濃度又は高分子量の被検物を希釈することなく免疫測定法で定量等する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。
この方法では、例えば、被検物として高濃度の抗原を測定するために、この抗原に対して低い親和性を有する抗体を標識して用いる。そして、これら抗原及び抗体の間で免疫反応を行わせ、標識抗体と結合した抗原を測定することにより、得られた標識抗体の測定結果に基づいて、本来の被検物質濃度を算出することができる。
In this method, for example, in order to measure a high concentration antigen as a test substance, an antibody having a low affinity for the antigen is labeled and used. Then, by performing an immune reaction between these antigens and the antibody, and measuring the antigen bound to the labeled antibody, the original concentration of the test substance can be calculated based on the measurement result of the obtained labeled antibody. it can.
しかし、この方法によれば、抗原に対して低い親和性を有する抗体を準備するために、まずマウスを免疫化し、次いで、クローニングするなどによる相当に煩雑な作業を伴う。しかも、このような煩雑な工程には、通常、数ヶ月もの時間を要する。
また、抗体は、クローニング等により実際に得られた抗体からスクリーニングして用いるため、所望の親和性を自由に設定するには至っていない。
However, according to this method, in order to prepare an antibody having a low affinity for an antigen, a mouse is first immunized and then cloned, which involves considerable labor. Moreover, such a complicated process usually takes several months.
Further, since antibodies are used after screening from antibodies actually obtained by cloning or the like, the desired affinity has not been set freely.
本発明は、上記課題を鑑みなされたものであって、希釈工程を省略して一連の分析工程を簡略化することができ、正確かつ迅速な分析を実現することができる免疫分析方法を提供することを目的とし、さらにこの免疫分析方法を、小型で安価に実現することができるバイオチップを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and provides an immunoassay method capable of simplifying a series of analysis steps by omitting a dilution step and realizing an accurate and rapid analysis. It is another object of the present invention to provide a biochip capable of realizing the immunoassay method in a small size at a low cost.
本発明の免疫分析方法は、被検物質を含むサンプルと、前記被検物質と反応する標識物質と、該標識物質と競合的に前記被検物質と反応する非標識物質と、固定化抗原／抗体とを、任意の順序で混合して反応させ、前記固定化抗原／抗体との反応生成物と、固定化抗原／抗体との未反応物とを分離し、該分離された前記反応生成物又は未反応物のいずれかにおける標識物質を分析することにより被検物質を検出することを特徴とする。 The immunoassay method of the present invention comprises a sample containing a test substance, a labeled substance that reacts with the test substance, an unlabeled substance that reacts competitively with the labeled substance, and an immobilized antigen / The antibody is mixed and reacted in an arbitrary order to separate the reaction product of the immobilized antigen / antibody and the unreacted product of the immobilized antigen / antibody, and the separated reaction product Alternatively, the test substance is detected by analyzing the labeling substance in any of the unreacted substances.
このように非標識物質を標識物質と組み合わせて用いることにより、被検物質に反応する標識物質の一部が非標識物質に置き換えられることになるため、被検物質の測定濃度を見かけ上低減させることができる。そして、これは被検物質を希釈した場合と同様の作用を示すため、従来必要とされていた稀釈工程を省略することができる。これにより一連の分析工程を簡略化することができ、正確かつ迅速な分析を実現することが可能となる。 By using a non-labeled substance in combination with a labeled substance in this way, a part of the labeled substance that reacts with the test substance is replaced with the non-labeled substance, so the measured concentration of the test substance is apparently reduced. be able to. And since this shows the same effect | action as the case where a test substance is diluted, the dilution process conventionally required can be skipped. As a result, a series of analysis steps can be simplified, and accurate and rapid analysis can be realized.
この免疫分析方法においては、標識物質と非標識物質とを、所定比率の混合物として用いることが好ましい。
これにより、被検物質の見かけ上の測定結果から、正確に被検物質の定量を実現することができるとともに、用いる測定系の種類及び性能等に応じて、測定値を適切な検出レンジに収めることが可能となり、より精度の高い被検物質の定量を行うことができる。
In this immunoassay method, it is preferable to use a labeled substance and a non-labeled substance as a mixture in a predetermined ratio.
This enables accurate quantification of the test substance from the apparent measurement result of the test substance, and keeps the measured value within an appropriate detection range according to the type and performance of the measurement system used. Therefore, the test substance can be quantified with higher accuracy.
また、標識物質及び非標識物質を、被検物質に対して過剰量添加することが好ましい。
これによって、被検物質をもれなく確実に抗体と結合させることができ、非常に精度の高い被検物質の分析が可能になる。しかも、被検物質と反応しなかった残余の標識物質又は非標識物質は、固定化抗原／抗体を用いることによって、確実に分離することができるため、より高精度な分析を実現することができる。
Moreover, it is preferable to add an excessive amount of a labeled substance and an unlabeled substance with respect to the test substance.
As a result, the test substance can be surely bound to the antibody without fail, and the test substance can be analyzed with very high accuracy. Moreover, since the remaining labeled substance or unlabeled substance that has not reacted with the test substance can be reliably separated by using the immobilized antigen / antibody, a more accurate analysis can be realized. .
さらに、固定化抗原／抗体との反応生成物が、固定化抗原／抗体と標識物質又は非標識物質とが抗原抗体反応によって結合したものであるか、固定化抗原／抗体と被検物質とが抗原抗体反応によって結合し、さらに該被検物質に抗原抗体反応によって標識物質又は非標識物質が結合したものであることが好ましい。
これにより、被検物質の定量のために機能しない標識物質の誤検出を防止することができる。
Further, the reaction product of the immobilized antigen / antibody is a product of the immobilized antigen / antibody and a labeled substance or non-labeled substance bound by an antigen-antibody reaction, or the immobilized antigen / antibody and the test substance are It is preferable that it is bound by an antigen-antibody reaction, and further, a labeled substance or an unlabeled substance is bound to the test substance by an antigen-antibody reaction.
Thereby, it is possible to prevent erroneous detection of a labeling substance that does not function for quantification of the test substance.
また、被検物質の検出を電気化学的又は光学的に行うことが好ましい。
これにより、本発明の免疫分析方法に対して特別な設定や工程変更を行うことなく、従来から当該分野で用いられている装置等をそのまま利用して、分析することができる。特に電気化学的に被検物質の検出を行う場合には、光学的に検出を行う場合に比較して、簡便、小型かつ安価な測定装置を利用することが可能となる。
Moreover, it is preferable to detect a test substance electrochemically or optically.
Thereby, it is possible to perform an analysis by using an apparatus or the like conventionally used in the field as it is without performing any special setting or process change for the immunoassay method of the present invention. In particular, when electrochemically detecting a test substance, it is possible to use a simple, small, and inexpensive measuring device as compared with optical detection.
さらに、分離された反応生成物を、電子伝達メディエータ又は発色物質をさらに反応させて分析することが好ましい。
これによって、光学的又は電気化学的手法により、被検物質のより正確な分析を行うことができる。
Furthermore, it is preferable to analyze the separated reaction product by further reacting with an electron transfer mediator or a coloring substance.
Thus, a more accurate analysis of the test substance can be performed by an optical or electrochemical method.
本発明の免疫分析方法の一実施形態では、被検物質を含むサンプル、標識物質及び非標識物質とを予め混合して、反応させ、次いで、これらの混合物を固定化抗原／抗体と混合して、被検物質と反応していない標識物質及び非標識物質を固定化抗原／抗体と反応させ、得られた固定化抗原／抗体との反応生成物と、固定化抗原／抗体との未反応物とを分離し、該分離された前記反応生成物又は未反応物のいずれかを分析することにより、被検物質を検出することが好ましい。 In one embodiment of the immunoassay method of the present invention, a sample containing a test substance, a labeled substance, and an unlabeled substance are premixed and reacted, and then the mixture is mixed with an immobilized antigen / antibody. The labeled substance and the non-labeled substance that have not reacted with the test substance are reacted with the immobilized antigen / antibody, and the resulting reaction product with the immobilized antigen / antibody and the unreacted substance with the immobilized antigen / antibody It is preferable to detect the test substance by analyzing the separated reaction product or unreacted substance.
この方法においては、（１）被検物質が抗原、標識物質及び非標識物質が抗体であり、固定化抗原／抗体が抗イディオタイプ抗体又は標識物質及び非標識物質の抗体に対する抗原であるか、あるいは（２）被検物質が抗体、標識物質及び非標識物質が抗原又は抗イディオタイプ抗体であり、固定化抗原／抗体が標識物質及び非標識物質の抗原に対する抗体であることが好ましい。
このような組み合わせを選択することにより、免疫分析を確実に行うことができる。
In this method, (1) whether the test substance is an antigen, the labeled substance and the unlabeled substance are antibodies, and the immobilized antigen / antibody is an anti-idiotype antibody or an antigen against the labeled substance and the unlabeled substance antibody, Or (2) It is preferable that the test substance is an antibody, the labeling substance and the non-labeling substance are antigens or anti-idiotype antibodies, and the immobilized antigen / antibody is an antibody against the antigen of the labeling substance and the non-labeling substance.
By selecting such a combination, immunoassay can be reliably performed.
また、本発明の免疫分析方法の別の実施形態では、被検物質を含むサンプルと、固定化抗原／抗体とを予め混合して、前記被検物質と固定化抗原／抗体とを反応させ、次いで、これらの混合物を、標識物質及び非標識物質と混合し、得られた固定化抗原／抗体との反応生成物と、固定化抗原／抗体との未反応物とを分離し、該分離された前記反応生成物又は未反応物のいずれかを分析することにより、被検物質を検出することが好ましい。 In another embodiment of the immunoassay method of the present invention, a sample containing a test substance and an immobilized antigen / antibody are mixed in advance, and the test substance and the immobilized antigen / antibody are reacted, Subsequently, these mixtures are mixed with a labeled substance and an unlabeled substance, and the obtained reaction product with the immobilized antigen / antibody is separated from the unreacted substance with the immobilized antigen / antibody, and the separated product is separated. It is preferable to detect the test substance by analyzing either the reaction product or the unreacted substance.
この方法においては、（１）被検物質が抗原、標識物質及び非標識物質が抗体であり、固定化抗原／抗体が被検物質の抗原に対する抗体であるか、あるいは（２）被検物質が抗体、標識物質及び非標識物質が抗原であり、固定化抗原／抗体が抗イディオタイプ抗体又は被検物質の抗体に対する抗原であることが好ましい。
このような組み合わせを選択することにより、免疫分析を確実に行うことができる。
In this method, (1) the test substance is an antigen, the labeled substance and the unlabeled substance are antibodies, and the immobilized antigen / antibody is an antibody against the antigen of the test substance, or (2) the test substance is It is preferable that the antibody, the labeling substance and the non-labeling substance are antigens, and the immobilized antigen / antibody is an anti-idiotype antibody or an antigen against the antibody of the test substance.
By selecting such a combination, immunoassay can be reliably performed.
さらに本発明のバイオチップは、標識物質及び非標識物質が保持された保持槽と、抗原又は抗体を固定するための固定手段が収容された反応槽とを含むことを特徴とする。
このように、保持槽を設けることにより、標識物質と非標識物質との組み合わせを確保することができ、上述した免疫分析方法を、容易に実現することができる。また、標識及び非標識物質又は固定化抗原／抗体と混合された（反応した）状態での被検物質を、任意に捕捉又は通過させることができるため、測定対象である標識された被検物質のみを分離することが可能となり、より正確な分析を実現することができる。しかも、非標識物質を利用し得る保持槽の存在によって、従来行われていた抗原−抗体反応の後の洗浄工程を省略することが可能になり、バイオチップ自体の占有面積を小型化することができる。
Furthermore, the biochip of the present invention includes a holding tank in which a labeled substance and an unlabeled substance are held, and a reaction tank in which fixing means for fixing an antigen or an antibody is accommodated.
Thus, by providing a holding tank, a combination of a labeled substance and an unlabeled substance can be secured, and the above-described immunoassay method can be easily realized. In addition, since the test substance mixed (reacted) with the labeled and unlabeled substance or the immobilized antigen / antibody can be arbitrarily captured or passed, the labeled test substance to be measured It is possible to separate only those, and more accurate analysis can be realized. In addition, the presence of a holding tank that can utilize an unlabeled substance makes it possible to omit the conventional washing step after the antigen-antibody reaction, thereby reducing the area occupied by the biochip itself. it can.
このバイオチップにおいては、固定手段が、抗原又は抗体を担持する微粒子であることが好ましい。
これにより、反応槽に抗原又は抗体を簡便かつ確実に固定することが可能となる。
In this biochip, the immobilization means is preferably fine particles carrying an antigen or antibody.
Thereby, it becomes possible to fix an antigen or an antibody to a reaction tank simply and reliably.
また、固定手段には、（１）被検物質と抗原抗体反応によって結合するが、標識物質及び非標識物質とは直接結合しない抗原又は抗体が担持されてなるか、あるいは（２）固定手段には、標識物質及び非標識物質と抗原抗体反応によって結合するが、被検物質とは直接結合しない抗原又は抗体が担持されてなることが好ましい。
このような組み合わせを選択することにより、免疫分析を確実に行うことができる。
Further, the fixing means carries (1) an antigen or an antibody that binds to a test substance by an antigen-antibody reaction but does not directly bind to a labeled substance and an unlabeled substance, or (2) the fixing means Is preferably carried by an antigen or antibody that binds to a labeled substance and an unlabeled substance by an antigen-antibody reaction but does not directly bind to a test substance.
By selecting such a combination, immunoassay can be reliably performed.
さらに、反応槽に又は反応槽の下流に基質保持槽が連結されてなることが好ましい。
これにより、標識物質と結合した被検物質を、基質を利用して、より確実に定量することができ、精度よく被検物質の分析をすることが可能になる。
Furthermore, it is preferable that a substrate holding tank is connected to the reaction tank or downstream of the reaction tank.
As a result, the test substance bound to the labeling substance can be more reliably quantified using the substrate, and the test substance can be analyzed with high accuracy.
また、被検物質を検出するための検出部をさらに含むことが好ましい。
これにより、測定対象となる被検物質のみを検出部に導入して分析することができることとなり、他の物質に干渉されることなく、バックグラウンドを低減することができる。よって、より精度の高い分析を行うことが可能となる。
Moreover, it is preferable to further include a detection unit for detecting the test substance.
As a result, only the analyte to be measured can be introduced into the detection unit for analysis, and the background can be reduced without being interfered by other substances. Therefore, it is possible to perform analysis with higher accuracy.
さらに、検出部に一対の電極が形成されてなることが好ましい。
このような構成により、従来の光学的検出装置のような大掛かりで、高価かつ大型の装置を用いることなく、電流又は電圧等の検出という簡便な方法によって、被検物質の分析を行うことができる。従って、分析にかかる費用を低減させることができるとともに、より小型のバイオチップ及びより小型で安価な分析装置の使用を実現することができる。
Furthermore, it is preferable that a pair of electrodes is formed on the detection unit.
With such a configuration, a test substance can be analyzed by a simple method of detecting current or voltage without using a large-scale, expensive and large-sized apparatus like a conventional optical detection apparatus. . Therefore, the cost for analysis can be reduced, and the use of a smaller biochip and a smaller and less expensive analyzer can be realized.
本発明の方法によれば、非標識物質を用いることにより、被検物質の測定濃度を見かけ上低減させることができるために、稀釈工程を省略することができ、これによって一連の分析工程を簡略化することができ、正確かつ迅速な分析を実現することが可能となる。加えて、この方法を実現するために、バイオチップ自体をシンプルな構造とすることにより、チップの占有面積を低減し、より小型で安価なバイオチップを提供することができる。 According to the method of the present invention, since the measurement concentration of the test substance can be apparently reduced by using the non-labeled substance, the dilution step can be omitted, thereby simplifying the series of analysis steps. It is possible to realize accurate and quick analysis. In addition, in order to realize this method, the biochip itself has a simple structure, so that the occupied area of the chip can be reduced, and a smaller and cheaper biochip can be provided.
本発明の免疫分析方法においては、まず、サンプル、標識物質、非標識物質、固定化抗原／抗体を、任意の順序で混合して、反応させる。 In the immunoassay method of the present invention, first, a sample, a labeled substance, an unlabeled substance, and an immobilized antigen / antibody are mixed and reacted in an arbitrary order.
ここでサンプルとは、被検物質を含有するサンプルを意味し、生物学的サンプル、例えば、全血、赤血球、白血球、血小板、血清、プラスマ、尿、脳脊髄液、腹水、その他の生物学的試料等が挙げられる。被検物質とは、特定の化合物又は成分であれば特に限定されないが、抗原又は抗体のいずれかであることが好ましい。抗原としては、例えば、細菌、ウィルス、寄生虫、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ等が挙げられる。また、抗体としては、例えば、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＡ抗体等が挙げられる。これらの抗体は、抗体分子がそのまま含まれているものであってもよいし、抗体を酵素処理等して得られる抗原結合部位を含む抗体フラグメントであるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等であってもよい。なかでも、抗原であることがより好ましい。 Here, the sample means a sample containing a test substance, and is a biological sample such as whole blood, red blood cells, white blood cells, platelets, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, ascites, and other biological samples. A sample etc. are mentioned. The test substance is not particularly limited as long as it is a specific compound or component, but is preferably either an antigen or an antibody. Examples of the antigen include bacteria, viruses, parasites, proteins, peptides, and DNA. Examples of the antibody include anti-IgG antibody, anti-IgM antibody, anti-IgD antibody, anti-IgE antibody, and anti-IgA antibody. These antibodies may contain antibody molecules as they are, or Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 which are antibody fragments containing an antigen binding site obtained by enzymatic treatment of the antibody. Etc. Of these, an antigen is more preferable.
標識物質は、被検物質と反応する部位、好ましくは抗原抗体反応により結合する部位を備える物質（例えば、被検物質に対する抗体、抗原、抗体フラグメント等）に、被検物質を定量するための標識化合物が結合して構成されるものである。 The labeling substance is a label for quantifying the test substance on a substance (for example, an antibody against the test substance, an antigen, an antibody fragment, etc.) having a site that reacts with the test substance, preferably a site that binds by an antigen-antibody reaction. A compound is composed by bonding.
標識化合物としては、酵素（例えば、グルコース・オキシダーゼ等のオキシダーゼ；ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ；ガラクトシダーゼ等）、色素、酸化還元物質、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ダンシル等）、放射性物質（例えば、125Ｉ、14Ｃ等を含む化合物）、金属粒子、磁性体等、当該分野で通常使用される標識化合物のいずれをも用いることができる。標識化合物と、被検物質に対する結合部位を備える物質との組み合わせは、標識抗体又は標識抗原であることが好ましい。標識化合物は、予め当該分野で通常使用される方法によって、上述した被検物質と反応、結合等する物質に結合させておくことが適している。 Labeled compounds include enzymes (eg, oxidases such as glucose oxidase; peroxidases such as horseradish peroxidase; alkaline phosphatase; galactosidase, etc.), dyes, redox substances, fluorescent substances (eg, fluorescein, dansyl, etc.), radioactive substances Any of the labeling compounds usually used in the art such as (compounds containing 125 I, 14 C, etc.), metal particles, magnetic materials, etc. can be used. The combination of the labeled compound and the substance having a binding site for the test substance is preferably a labeled antibody or a labeled antigen. The labeling compound is suitably bound in advance to a substance that reacts with or binds to the aforementioned test substance by a method that is usually used in the field.
非標識物質は、上述した標識抗体と競合的に被検物質と反応する物質であって、被検物質と反応する部位、好ましくは抗原抗体反応により結合する部位を備える物質を意味する。非標識物質は、標識化合物が結合していないことを除いて、上述した標識物質と同様のものを用いることができる。ただし、被検物質と反応する部位の種類等は、必ずしも、同じ測定において使用される標識物質を構成するものと同じものでなくてもよい。 The unlabeled substance means a substance that reacts with the test substance competitively with the above-described labeled antibody and has a site that reacts with the test substance, preferably a site that binds by an antigen-antibody reaction. As the non-labeled substance, the same labeling substance as described above can be used except that the labeled compound is not bound. However, the type of the site that reacts with the test substance is not necessarily the same as that constituting the labeling substance used in the same measurement.
なお、標識物質と非標識物質とは、所定比率で用いることが適当であり、さらに均一な混合物として用いることが好ましい。このように標識物質と非標識物質とを用いることにより、従来の希釈液による希釈工程を省略することができる。つまり、標識物質及び非標識物質を被検物質と混合、反応させることにより、被検物質が高濃度で存在していたとしても、後工程で検出される被検物質は、標識物質と反応したもののみとして分析することができる。従って、非標識物質を被検物質と反応させることにより、見かけ上の被検物質の希釈が可能となり、被検物質を測定するために用いる検出装置の特性などを考慮して、被検物質の検出値を適切に検出レンジに収めることが可能となる。その結果、正確な測定を行うことができる。 It should be noted that the labeling substance and the non-labeling substance are suitably used in a predetermined ratio, and more preferably used as a uniform mixture. As described above, by using the labeling substance and the non-labeling substance, the conventional dilution step with the diluent can be omitted. In other words, by mixing and reacting the labeled substance and the non-labeled substance with the test substance, the test substance detected in the subsequent process reacted with the labeled substance even if the test substance was present at a high concentration. It can be analyzed as a thing only. Therefore, by reacting the unlabeled substance with the test substance, the apparent test substance can be diluted, and the characteristics of the detection device used for measuring the test substance are taken into account. The detection value can be appropriately within the detection range. As a result, accurate measurement can be performed.
例えば、標識物質：非標識物質は、０．１：１０〜１０：０．１程度が適当であり、１：１０〜１０：１程度が好ましく、１：１０〜５：１程度がより好ましい。
また、標識及び非標識物質は、被検物質の量に対して、過剰量で反応させることが好ましい。これによって、被検物質の全てに標識又は非標識物質を反応させることが可能となり、より正確な被検物質の分析を行うことができる。ここで、被検物質自体の量は、通常は不明であるため、過剰量の標識及び非標識物質を導入するために、例えば、予め測定可能な被検物質濃度又はその範囲を予備測定等により設定し、その設定した濃度又は範囲上限の１〜１００倍（モル比）を過剰量として導入することが適している。
For example, the labeling substance: non-labeling substance is suitably about 0.1: 10 to 10: 0.1, preferably about 1:10 to 10: 1, and more preferably about 1:10 to 5: 1.
The labeled and unlabeled substances are preferably reacted in excess with respect to the amount of the test substance. As a result, it becomes possible to cause all of the test substance to react with the labeled or non-labeled substance, and the test substance can be analyzed more accurately. Here, since the amount of the test substance itself is usually unknown, in order to introduce an excessive amount of labeled and non-labeled substance, for example, the pre-measured test substance concentration or its range can be determined by preliminary measurement or the like. It is suitable to set and introduce the set concentration or 1 to 100 times (molar ratio) of the upper limit of the range as an excess amount.
なお、標識物質と非標識物質とが、被検物質と反応する部位について、同じものであるとすると、通常、被検物質との反応性は同等であると考えられるが、標識化合物の種類、反応時の種々の条件等によっては異なることも考えられる。したがって、予め、両者の被検物質への反応性、例えば結合係数等を得ておくことにより、後述する分析の際に、その結合係数に基づいて実測値を換算するなどの手法を用いて、より正確な検出を行うことができる。なお、標識物質と非標識物質とが、被検物質と反応する部位について、異なるものを用いる場合についても同様である。 If the labeled substance and the non-labeled substance are the same for the site that reacts with the test substance, the reactivity with the test substance is usually considered to be equivalent, but the type of the labeled compound, It may be different depending on various conditions during the reaction. Therefore, by obtaining the reactivity of both of the test substances in advance, for example, a binding coefficient, etc., using a technique such as converting an actual measurement value based on the binding coefficient in the later-described analysis, More accurate detection can be performed. The same applies to the case where different substances are used for the site where the labeled substance and the non-labeled substance react with the test substance.
固定化抗原／抗体は、固定化抗原／抗体としては、固定手段に担持された抗原又は抗体を意味し、これらの種類は、被検物質、標識及び非標識物質の種類、これらとの混合順序等によって、適宜選択することができる。例えば、被検物質、あるいは標識及び非標識物質と抗原抗体反応によって結合し得る抗原又は抗体であることが適している。 The immobilized antigen / antibody means the antigen or antibody supported on the immobilizing means as the immobilized antigen / antibody, and these types include the types of the test substance, the labeled and unlabeled substances, and the mixing order thereof. It can be appropriately selected depending on the above. For example, an antigen or antibody that can bind to a test substance or a labeled or unlabeled substance by an antigen-antibody reaction is suitable.
固定手段としては、抗原又は抗体を固定し得るものであり、抗原又は抗体等の活性に影響を与えないものであれば特に限定されるものではなく、その形状、材質、量等は、被検物質及び標識物質の種類、用いる抗原又は抗体等の種類等によって適宜調整することができる。例えば、固定の方法は、抗原及び抗体等の活性に影響を与えないものであれば、物理的吸着、共有結合、イオン結合、架橋、静電相互作用等公知の方法のいずれかを利用することができる。 The immobilization means is not particularly limited as long as it can immobilize an antigen or antibody and does not affect the activity of the antigen or antibody, and its shape, material, amount, etc. It can be appropriately adjusted according to the type of substance and labeling substance, the type of antigen or antibody used, and the like. For example, as long as the immobilization method does not affect the activities of antigens and antibodies, any of known methods such as physical adsorption, covalent bond, ionic bond, cross-linking and electrostatic interaction should be used. Can do.
また、固定手段の形状は、フィルター状、微粒子状等の形状の、多孔質体等、表面積を増大させ得る種々のもの、一般にバイオリアクター及びクロマトグラフィー等用の担体として使用されているもの等が挙げられる。微粒子状のものとしては、ガラスビーズ、ポリスチレン等のポリマービーズ、アガロース、デキストラン、キトサン、タンパク等の高分子化合物（ゲル）の微粒子、シリカ、金属等のビーズ、さらに市販されている微粒子状の固体担体等のいずれかを用いることができる。その直径は、１ｍｍ程度以下のもの、１０〜１ｍｍ程度のもの、１００〜８００μｍ程度のもの、２００〜６００μｍ程度のもの、２００〜１ｍｍ程度のもの等が挙げられる。なお、固定手段は、例えば、後述するように、バイオチップ内に収められる場合には、上述したような固定手段とともに又はそれに代えて、バイオチップ内の流路又は槽自体が、必要な表面積を確保する（つまり表面積を増大する）ように形成されているものを利用することもできる。例えば、流路又は槽を構成する壁面表面が粗いもの、壁面自体に凹凸が形成されたもの等が挙げられる。 The shape of the fixing means may be various shapes that can increase the surface area, such as filter-like, fine-particle-like, porous bodies, etc., and those that are generally used as carriers for bioreactors, chromatography, etc. Can be mentioned. Examples of fine particles include glass beads, polymer beads such as polystyrene, fine particles of polymer compounds (gel) such as agarose, dextran, chitosan, protein, beads of silica, metal, etc., and commercially available fine particle solids Either a carrier or the like can be used. The diameter is about 1 mm or less, about 10 to 1 mm, about 100 to 800 μm, about 200 to 600 μm, about 200 to 1 mm, and the like. For example, as will be described later, when the fixing means is accommodated in the biochip, the flow path in the biochip or the tank itself has a necessary surface area together with or instead of the fixing means as described above. What is formed so that it may ensure (that is, surface area is increased) can also be utilized. For example, the surface of the wall surface constituting the flow path or the tank is rough, or the wall surface itself has irregularities formed.
固定化抗原／抗体は、被検物質に対して過剰量であることが好ましく、さらに、標識及び非標識物質の総量に対しても過剰量であることが好ましい。
ここでの任意の順序は、特に限定されるものではなく、被検物質の種類、用いる標識及び非標識物質の種類、固定化抗原／抗体の種類、後述する被検物質の検出方法等に応じて適宜決定することができる。例えば、
（i)まず、サンプルと、標識及び非標識物質とを混合し、その後、これらの混合物を、固定化抗原／抗体と混合する、
(ii)まず、サンプルと固定化抗原／抗体とを混合し、その後、これらの混合物を、標識及び非標識物質と混合する、又は
(iii)サンプルと、標識及び非標識物質と、固定化抗原／抗体とを同時に混合すること等が挙げられる。
The immobilized antigen / antibody is preferably in an excessive amount with respect to the test substance, and more preferably in an excessive amount with respect to the total amount of the labeled and unlabeled substance.
The arbitrary order here is not particularly limited, and depends on the type of test substance, the type of label and unlabeled substance to be used, the type of immobilized antigen / antibody, the test substance detection method described later, and the like. Can be determined as appropriate. For example,
(I) First, the sample is mixed with the labeled and unlabeled substances, and then these mixtures are mixed with the immobilized antigen / antibody.
(ii) First, mix the sample with the immobilized antigen / antibody and then mix these mixtures with labeled and unlabeled substances, or
(iii) A sample, a labeled / unlabeled substance, and an immobilized antigen / antibody are mixed at the same time.
なお、標識及び非標識物質を他の成分と混合する場合には、これらを予め混合して均一にし、これとその他の成分とを混合することが好ましい。
上述した（i)の混合方法を採用する場合には、被検物質と固定化抗原／抗体とは、直接反応しない、結合しない、つまり、抗原抗体反応を行わないものであることが好ましい。言い換えると、固定化抗原／抗体と被検物質とは、標識及び非標識物質への結合に対して競合的に反応し得るものが好ましい。
In addition, when mixing a label | marker and a non-labeling substance with another component, it is preferable to mix these beforehand and to make it uniform and to mix this and another component.
When the mixing method (i) described above is employed, it is preferable that the test substance and the immobilized antigen / antibody do not react directly, do not bind, that is, do not perform the antigen-antibody reaction. In other words, the immobilized antigen / antibody and the test substance are preferably those capable of reacting competitively with the binding to the labeled and unlabeled substances.
(ii)及び(iii)の混合方法を採用する場合には、標識及び非標識物質と固定化抗原／抗体とは、直接反応しない、結合しない、つまり、抗原抗体反応を行わないものであることが好ましい。 When the mixing method of (ii) and (iii) is adopted, the labeled and unlabeled substance and the immobilized antigen / antibody do not react directly, do not bind, that is, do not undergo antigen-antibody reaction. Is preferred.
混合して反応させる場合の条件は、特に限定されるものではなく、測定しようとする被検物質、標識及び非標識物質の種類等により適宜設定することができるが、これらの物質の活性に影響を与えない条件で、例えば、２０〜４０℃程度の温度で、３０秒間〜３０分間程度が挙げられる。また、これら物質が液体中に浮遊又は懸濁している場合には、各成分の濃度比（被検物質、標識物質、非標識物質、固定化抗原／抗体のバランス）、液体の組成、ｐＨ、液量等を、適切に設定することが好ましい。これにより、測定感度を変動させずに、正確に被検物質を検出することができる。 The conditions for mixing and reacting are not particularly limited, and can be set as appropriate depending on the analyte to be measured, the type of the labeled and unlabeled substances, etc., but it affects the activity of these substances. For example, at a temperature of about 20 to 40 ° C. for about 30 seconds to 30 minutes. When these substances are suspended or suspended in the liquid, the concentration ratio of each component (test substance, labeled substance, unlabeled substance, immobilized antigen / antibody balance), liquid composition, pH, It is preferable to appropriately set the liquid amount and the like. Thereby, the test substance can be accurately detected without changing the measurement sensitivity.
本発明では、サンプル、標識物質、非標識物質、固定化抗原／抗体を混合して反応させる具体的な態様として、以下に示すものが適している。 In the present invention, the following examples are suitable as specific embodiments in which a sample, a labeled substance, an unlabeled substance, and an immobilized antigen / antibody are mixed and reacted.
上述のＡ及びＢの場合には、（i)の混合方法により、まず、被検物質を標識物質及び非標識物質と反応させ、その後、これらを固定化抗原／抗体と混合することにより、被検物質と反応していない標識物質及び非標識物質を、固定化抗原／抗体と反応させることができる。言い換えると、サンプル中の被検物質はすべて標識又は非標識物質のいずれかと結合し、混合された標識及び非標識物質のうち、被検物質と結合しなかったものが全て又はほぼ全て固定化抗原／抗体に結合されることとなる。 In the case of A and B described above, by the mixing method (i), first, the test substance is reacted with the labeled substance and the non-labeled substance, and then these are mixed with the immobilized antigen / antibody. Labeled substances and unlabeled substances that have not reacted with the test substance can be reacted with the immobilized antigen / antibody. In other words, all analytes in the sample bind to either labeled or unlabeled substances, and all or almost all of the mixed labeled and unlabeled substances that did not bind to the analyte are immobilized antigens. To be bound to the antibody.
一方、上述のＣ及びＤの場合には、(ii)の混合方法により、まず、サンプルと固定化抗原／抗体とを混合して、反応させて、サンプル中の全部の又はほぼ全部の被検物質を固定化することができる。その後、これに標識物質及び非標識物質を混合することにより、固定化された被検物質が、さらに標識物質及び非標識物質と反応して結合することにより、固定化手段と、抗原／抗体と、被検物質と、標識又は非標識物質とが一連に結合した反応生成物が得られることとなる。なお、（iii）の混合方法においては、同様の反応生成物が得られることとなる。 On the other hand, in the case of C and D described above, according to the mixing method (ii), first, the sample and the immobilized antigen / antibody are mixed and reacted, and all or almost all the test samples in the sample are reacted. The substance can be immobilized. Thereafter, by mixing the labeled substance and the non-labeled substance with this, the immobilized test substance further reacts with and binds to the labeled substance and the non-labeled substance, so that the immobilization means, the antigen / antibody and Thus, a reaction product in which a test substance and a labeled or non-labeled substance are bound in series is obtained. In the mixing method (iii), a similar reaction product is obtained.
次いで、固定化抗原／抗体との反応生成物及び未反応物を分離する。ここでの反応生成物は、固定化抗原／抗体と反応して得られたものの全てを指し、例えば、固定化抗原／抗体−標識又は非標識物質、固定化抗原／抗体−被検物質、固定化抗原／抗体−被検物質−標識又は非標識物質が挙げられる。未反応物とは、固定化抗原／抗体と反応していないものの全てを指し、例えば、標識又は非標識物質自体、標識又は非標識物質−被検物質、被検物質自体（好ましくは、これは存在しないが）が挙げられる。 Next, the reaction product and unreacted product with the immobilized antigen / antibody are separated. The reaction product here refers to all of those obtained by reacting with the immobilized antigen / antibody. For example, the immobilized antigen / antibody-labeled or unlabeled substance, the immobilized antigen / antibody-test substance, the immobilized Antigen / antibody-test substance-labeled or unlabeled substance. Unreacted refers to anything that has not reacted with the immobilized antigen / antibody, eg, labeled or unlabeled substance itself, labeled or unlabeled substance-test substance, test substance itself (preferably this is Is not present).
分離は、上述したＡ及びＢの態様の場合には、被検物質と反応した標識及び非標識物質は、固定化抗原／抗体には固定されず、自由に移動することができるため、この移動によって、固定化抗原／抗体と反応していない未反応物のみを取り出すことができる。 In the case of the above-described aspects of A and B, the separation is performed because the labeled and unlabeled substances reacted with the test substance are not immobilized on the immobilized antigen / antibody and can move freely. Thus, only unreacted substances that have not reacted with the immobilized antigen / antibody can be taken out.
また、上述したＣ及びＤの様態の場合には、固定化抗原／抗体と反応した被検物質は、その部位に固定化されており、自由に移動することはできないが、一方、未反応の標識物質及び非標識物質は、固定化抗原／抗体には固定されておらず、自由に移動することができる。この移動によって、未反応の標識物質及び非標識物質を、被検物質と結合した標識物質及び非標識物質から（固定化抗原／抗体にも結合）分離することができ、被検物質と結合した標識物質及び非標識物質のみを取り出すことができる。 In the case of the above-described C and D modes, the test substance that has reacted with the immobilized antigen / antibody is immobilized at the site and cannot move freely. The labeled substance and the non-labeled substance are not immobilized on the immobilized antigen / antibody and can move freely. By this movement, unreacted labeled substance and unlabeled substance can be separated from the labeled substance and unlabeled substance bound to the test substance (also bound to the immobilized antigen / antibody) and bound to the test substance. Only labeled and unlabeled substances can be removed.
最後に、分離された反応生成物及び未反応物の少なくとも一方を分析することにより、被検物質を検出することができる。
分離された反応生成物又は未反応物を分析するとは、反応生成物中に結合している標識化合物、あるいは未反応物中に存在する標識化合物を直接、間接に検出し得る方法を用いることにより、測定することを意味する。これによって、見かけ上、被検物質又は標識化合物の検出値を減少させることができ、適当な倍率で希釈液を用いて希釈した場合と同様に、被検物質又は標識化合物の検出値を適切に検出レンジに収めることができる。
Finally, the test substance can be detected by analyzing at least one of the separated reaction product and unreacted substance.
Analyzing the separated reaction product or unreacted substance means that a labeled compound bound in the reaction product or a method capable of directly or indirectly detecting the labeled compound present in the unreacted substance is used. Means to measure. As a result, the detection value of the test substance or the labeled compound can be apparently decreased, and the detection value of the test substance or the labeled compound can be appropriately set in the same manner as when diluted with a diluent at an appropriate magnification. Can fit in the detection range.
なお、標識化合物の種類によっては、反応生成物を分析する前に、その反応生成物を、基質と反応させてもよい。ここで、基質とは、例えば、色素、染料、蛍光物質等、有機酸又は無機酸、電極と被検物質との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能し得る電子伝導メディエータ等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。 Depending on the type of the labeled compound, the reaction product may be reacted with a substrate before analyzing the reaction product. Here, the substrate is, for example, a dye, a dye, a fluorescent substance, or the like, an organic acid or an inorganic acid, an electron conduction mediator that can function as an electron transfer medium that can transfer electrons between the electrode and the test substance, or the like. A seed | species or a 2 or more types of combination is mentioned.
色素、染料、蛍光物質としては、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-テトラメチルビンジジン）、チラミン（Tyramin）、ルミノール、ルシフェリン等が挙げられる。
有機酸又は無機酸としては、過酸化水素、蟻酸、酢酸等が挙げられる。
Examples of the pigment, dye, and fluorescent substance include OPD (orthophenylenediamine), TMBZ (3,3 ′, 5,5 ′,-tetramethylbindidine), tyramine, luminol, and luciferin.
Examples of the organic acid or inorganic acid include hydrogen peroxide, formic acid, acetic acid and the like.
電子伝達メディエータとしては、例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル、エチル、プロピル置換体等）、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビオローゲン、ビタミンＫ等の酸化還元性の化合物の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好ましい。 Examples of the electron transfer mediator include ferrocene, alkali metal ferricyanide (potassium ferricyanide, lithium ferricyanide, sodium ferricyanide, etc.) or alkyl substitution products thereof (methyl, ethyl, propyl substitution products, etc.), p-benzoquinone. , 2,6-dichlorophenolindophenol, phenazine methosulfate, methylene blue, potassium β-naphthoquinone-4-sulfonate, phenazine etsulfate, viologen, vitamin K, etc., one or a combination of two or more Is mentioned. Of these, ferrocene, potassium ferricyanide and the like are preferable.
ここでの分析又は検出方法は、特に限定されず、被検物質、標識化合物、固定化抗原／酵素等の種類及び量、基質を用いるか否か等に応じて適宜選択することができる。例えば、標識化合物の定量法として、色素の発色強度を測定する光学的方法（比色法、蛍光法、散乱光法等）、電子の授受による電流値又は電圧値用を測定する電気化学的方法、電気的方法、放射性同位元素の強度を測定するラジオイムノアッセイ法、磁気による方法（例えば、標識に磁気ビーズを用いた場合）等の当該分野で公知のいずれの方法によっても行うことができる。 The analysis or detection method here is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type and amount of the test substance, the labeled compound, the immobilized antigen / enzyme, etc., whether or not the substrate is used, and the like. For example, as a method for quantifying the labeling compound, an optical method for measuring the color intensity of the dye (colorimetric method, fluorescence method, scattered light method, etc.), and an electrochemical method for measuring the current value or voltage value by electron transfer , Electrical methods, radioimmunoassay methods for measuring the intensity of radioisotopes, magnetic methods (for example, when magnetic beads are used for labeling), and any other methods known in the art.
例えば、検出方法が光学的方法である場合には、被検物質、標識化合物又は基質からの生成物に光を照射し、その光（透過光、反射光、散乱光等）を検出することができる。また、電気化学的方法である場合には、被検物質を含む溶液の電荷を検出し得るように、この溶液に接触する導電性材料による一対の電極を用いて検出することができる。 For example, when the detection method is an optical method, light can be irradiated to a test substance, a labeled compound or a product from a substrate, and the light (transmitted light, reflected light, scattered light, etc.) can be detected. it can. In the case of an electrochemical method, detection can be performed using a pair of electrodes made of a conductive material in contact with the solution so that the charge of the solution containing the test substance can be detected.
本発明のバイオチップは、少なくとも標識物質及び非標識物質が保持された保持槽と、抗原又は抗体を固定するための固定手段が収容された反応槽とを含む。 The biochip of the present invention includes a holding tank in which at least a labeled substance and an unlabeled substance are held, and a reaction tank in which a fixing means for fixing an antigen or an antibody is accommodated.
保持槽は、標識物質と非標識物質とが保持されている限り、大きさは特に限定されるものではなく、この目的を実現するために十分な大きさを有していることが必要であり、標識物質と非標識物質との種類、量などに応じて適宜設定することができる。形状は、保持の目的に適切なものであれば特に限定されるものではなく、平面及び断面形状ともに、例えば、四角形、台形等の多角形及びこれらの角部分が丸みを帯びた形状、円形、だ円形、ドーム形状あるいは左右非対称の不均一形等どのような形状であってもよい。なお、保持槽は、標識及び非標識物質を保持する目的のみならず、流路、混合槽等として機能し得るものとしてもよい。 The size of the holding tank is not particularly limited as long as the labeled substance and the non-labeled substance are held, and the holding tank needs to have a sufficient size to achieve this purpose. Depending on the kind and amount of the labeled substance and the non-labeled substance, it can be set as appropriate. The shape is not particularly limited as long as it is suitable for the purpose of holding, for example, both a planar shape and a cross-sectional shape, such as a polygon such as a quadrangle and a trapezoid, and a shape with rounded corners, a circle, Any shape such as an oval, a dome shape, or a non-symmetrical non-uniform shape may be used. Note that the holding tank may function not only for the purpose of holding the labeling and non-labeling substances but also functioning as a flow path, a mixing tank, and the like.
また、上述した(i)の混合方法の場合には、保持槽の下流にサンプルとの混合槽を有していてもよく、保持槽の上流又は保持槽自体に、あるいはさらに混合槽を有する場合には混合槽の上流又は混合槽自体に、サンプルの導入口を有していることがより好ましい。これにより、予め、サンプルと標識及び非標識物質の混合を簡便に行うことができる。 In the case of the mixing method of (i) described above, the sample may have a mixing tank downstream of the holding tank, and may have a mixing tank upstream of the holding tank or in the holding tank itself, or further. It is more preferable to have a sample inlet upstream of the mixing tank or in the mixing tank itself. Thereby, a sample, a label | marker, and a non-labeling substance can be easily mixed beforehand.
上述した（ii)及び(iii)の混合方法の場合には、後述する反応槽の上流であって、保持槽とは直列に連結しない位置又は反応槽自体に、サンプルの導入口を有することが好ましい。これにより、サンプルと固定化抗原／抗体とを簡便に混合させ、反応させることができる。 In the case of the mixing methods (ii) and (iii) described above, a sample inlet may be provided at a position upstream of the reaction tank described later and not connected in series with the holding tank or the reaction tank itself. preferable. As a result, the sample and the immobilized antigen / antibody can be easily mixed and reacted.
反応槽は、抗原又は抗体を固定するための固定手段がその内部に収容されている。したがって、反応槽は、固定手段を保持するための十分な空間を有していることが必要であるが、その形状等は、固定手段の種類、量等に応じて適宜設定することができる。反応槽は、ここに含まれる固定手段が反応槽外に移行しないように、反応槽の上流及び下流直近に、チャネル部が形成されていることが好ましい。 The reaction tank contains a fixing means for fixing the antigen or antibody. Therefore, the reaction tank needs to have a sufficient space for holding the fixing means, but the shape and the like can be appropriately set according to the type and amount of the fixing means. In the reaction tank, it is preferable that a channel portion is formed in the immediate vicinity of the upstream and downstream of the reaction tank so that the fixing means included therein does not move out of the reaction tank.
チャネル部は、反応槽内に存在する固定手段の径よりも小さい径を有するなどして、反応槽に存在する固定手段を、反応槽内にのみ止めるために、反応槽の出口（好ましくは入口にも）に、固定手段を通過させない機能又は形状を与える。これにより、上述した混合物等が反応槽を通過する際、固定手段に担持された抗原又は抗体と、これに結合した被検物質、標識または非標識化合物、あるいは被検物質−標識又は非標識物質結合体とが、チャネル部によって反応槽から槽外へ移動することができない、一方、固定手段に結合されていない成分のみが、チャネル部を通り抜けて、反応槽外、例えば、後述する検出部に移動させ、いわゆるＢ／Ｆ分離を行うことができる。このように、反応槽での処理により、分析の際に所望しない標識化合物の存在を、測定結果の精度に影響しない程度に抑えることにより、より正確な分析、検出が可能となる。 The channel part has a diameter smaller than the diameter of the fixing means existing in the reaction tank, for example, so that the fixing means existing in the reaction tank is stopped only in the reaction tank. A function or shape that does not allow the fixing means to pass through. Thereby, when the above-mentioned mixture or the like passes through the reaction vessel, the antigen or antibody carried on the fixing means and the test substance, the labeled or unlabeled compound, or the test substance-labeled or unlabeled substance bound thereto. The combined body cannot move from the reaction tank to the outside of the tank by the channel part, while only the components not bound to the fixing means pass through the channel part and pass outside the reaction tank, for example, to the detection part described later. It can be moved and so-called B / F separation can be performed. As described above, the treatment in the reaction vessel can suppress the presence of the undesired labeled compound at the time of analysis to a level that does not affect the accuracy of the measurement result, thereby enabling more accurate analysis and detection.
なお、反応槽は、反応させるのみならず、後述するような検出部としての機能を兼ね備えていてもよい。また、上述した（ii)及び(iii)の混合方法に用いる場合には、反応槽と、保持槽との両機能を備える槽としてもよい。この場合には、固定化抗原／抗体と、標識物質及び非標識物質とは、接触しない状態が保持・収容されていることが好ましい。 In addition, the reaction tank may have not only a reaction but also a function as a detection unit as described later. Moreover, when using for the mixing method of (ii) and (iii) mentioned above, it is good also as a tank provided with both functions of a reaction tank and a holding tank. In this case, it is preferable that the immobilized antigen / antibody and the labeling substance and the non-labeling substance are held and accommodated so as not to contact each other.
また、本発明のバイオチップには、例えば、反応槽又は反応槽の下流に、あるいは、後述するような検出部を備える場合には検出部の上流に、直接に又は付加的に、基質保持槽が連結されていることが好ましい。これにより、標識化合物の種類によっては、より正確に被検物質の測定をすることができる。 In addition, the biochip of the present invention has, for example, a substrate holding tank directly or additionally downstream of the reaction tank or reaction tank, or upstream of the detection section in the case where a detection section as described later is provided. Are preferably linked. As a result, depending on the type of the labeled compound, the test substance can be measured more accurately.
さらに、本発明のバイオチップは、検出部を備えることが好ましい。検出部は、被検物質、標識化合物又は基質からの生成物を検出するための空間であって、反応槽自体、つまり、固定手段が収容された空間であってもよいし、反応槽とは別の空間として形成されていてもよい。検出部の大きさ及び形状は特に限定されず、例えば、検出方法（手法）、被検物質の種類及び量等に応じて適宜設定することができる。 Furthermore, the biochip of the present invention preferably includes a detection unit. The detection unit is a space for detecting a product from a test substance, a labeled compound or a substrate, and may be a reaction tank itself, that is, a space in which a fixing means is accommodated. It may be formed as a separate space. The size and shape of the detection unit are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the detection method (method), the type and amount of the test substance, and the like.
特に、反応槽とは別の空間として形成されている場合には、１〜１０3ｍｍ3程度が大きさが挙げられ、その形状は、種々の形状に設定することができる。また、例えば、検出方法が光学的方法である場合には、検出部において、被検物質、標識化合物又は基質からの生成物等に光を照射し、その光を検出し得るように、所定長さの光路を確保することができる形状及び大きさであることが必要である。また、電気化学的方法である場合には、検出部において、被検物質を含む溶液の電荷を検出し得るように、導電性材料による一対の電極がこの溶液に接触するように形成されていることが好ましい。 In particular, when it is formed as a space separate from the reaction vessel, the size is about 1 to 10 3 mm 3 , and the shape can be set to various shapes. Further, for example, when the detection method is an optical method, the detection unit irradiates the test substance, the labeled compound or the product from the substrate with light, and the predetermined length so that the light can be detected. It is necessary to have a shape and size that can secure the optical path. In the case of an electrochemical method, a pair of electrodes made of a conductive material is formed in contact with the solution so that the charge of the solution containing the test substance can be detected in the detection unit. It is preferable.
ここで、一対の電極は、通常、電極として機能することができる材料、大きさ及び形状であれば特に限定されることはなく、どのようなものでも用いることができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム等の金属又は合金、ＴｉＯ2等導電性酸化物等の単層又は２以上の積層構造が挙げられる。この電極は、導電材料片をバイオチップに貼り付けるか、一部を埋設するなどして形成してもよいし、導電剤ペーストを用いたスクリーン印刷法等の印刷法を用いて形成してもよい。 Here, the pair of electrodes is not particularly limited as long as it is a material, size, and shape that can function as an electrode, and any one can be used. For example, graphite, carbon, carbon fabric or the like; a metal or alloy such as aluminum, a single layer or a laminated structure of two or more conductive oxides such as TiO 2 can be given. This electrode may be formed by attaching a conductive material piece to a biochip or by embedding a part thereof, or by using a printing method such as a screen printing method using a conductive agent paste. Good.
検出部は、反応槽と、流路を通して又は流路を介さないで直接、直列で連結されていることが好ましい。いずれの場合にも、反応槽に含まれる固定手段が流路及び／又は検出部側に移行しないように、検出部と反応槽との間に、チャネル部が形成されており、両者が分離されていることが適している。 It is preferable that the detection unit is directly connected in series with the reaction tank through the channel or not through the channel. In any case, a channel part is formed between the detection part and the reaction tank so that the fixing means included in the reaction tank does not move to the flow path and / or the detection part side, and both are separated. It is suitable.
上述したバイオチップは、通常、従来のチップと同様の材料で形成することができる。例えば、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）、ポリエチレン、ポリシロキサン、アリルエステル樹脂、シクロオレフィンポリマーなどの有機化合物、あるいは、ゼオノア、シリコン、石英、ガラス、セラミック等の無機化合物等が挙げられる。 The biochip described above can usually be formed of the same material as a conventional chip. For example, PET (polyethylene terephthalate), PDMS (polydimethylsiloxane), PMMA (polymethyl methacrylate), PC (polycarbonate), PP (polypropylene), PS (polystyrene), PVC (polyvinyl chloride), polyethylene, polysiloxane, allyl Examples thereof include organic compounds such as ester resins and cycloolefin polymers, and inorganic compounds such as zeonore, silicon, quartz, glass, and ceramic.
また、例えば、主として、一方又は双方に凹部による種々の形状のパターンを有する第１基板と第２基板とを、例えば、溶着、接着剤、超音波処理等によって、貼り合わせることにより、簡便に製造することができる。具体的には、所望の反応槽等に対応する形状を有する金型を準備する。この金型は、機械的加工により形成することができる。次に、この金型に、樹脂をモールド等して反応槽等の形状が転写された基板を得る。最後に、この基板を、パターン同士が対向するように、２枚張り合わせる。なお、混合槽等に対応するパターンを有する基板を一方のみとし、他方を平板基板としてもよい。また、金型を用いたモールディングに代えて、射出成型法あるいはインプリント法等を利用してもよい。 In addition, for example, the first substrate and the second substrate mainly having a pattern of various shapes due to the recesses on one or both sides, for example, can be easily manufactured by bonding, for example, by welding, an adhesive, ultrasonic treatment, or the like. can do. Specifically, a mold having a shape corresponding to a desired reaction tank or the like is prepared. This mold can be formed by mechanical processing. Next, a substrate in which the shape of a reaction vessel or the like is transferred by molding resin in the mold is obtained. Finally, two substrates are laminated so that the patterns face each other. In addition, it is good also considering the board | substrate which has a pattern corresponding to a mixing tank etc. as one side, and making the other into a flat substrate. Further, instead of molding using a mold, an injection molding method or an imprint method may be used.
さらに、平板基板の一方又は双方に、フォトリソグラフィー工程、機械的加工等を直接施して、混合槽等に対応するパターンが転写された基板を得てもよい。 Furthermore, one or both of the flat substrates may be directly subjected to a photolithography process, mechanical processing, or the like to obtain a substrate on which a pattern corresponding to a mixing tank or the like is transferred.
実験例
まず、被検物質としてＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）、標識物質としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＣＲＰ抗体、非標識物質として非標識の抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧ、固定化抗原／抗体として、固定手段である直径約０．４ｍｍの球状のキトパール（富士紡績製）に抗ＣＲＰ抗体に対する抗イディオタイプ抗体を固定したものを準備した。なお、標識物質は、例えば、一般的な架橋剤を用いて調製した。
Experimental Example First, C-reactive protein (CRP) as a test substance, horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-CRP antibody as a labeling substance, non-labeled anti-CRP antibody IgG as a non-labeled substance, and immobilized as an immobilized antigen / antibody An anti-idiotype antibody against an anti-CRP antibody was immobilized on a spherical chitopearl (Fujibo) having a diameter of about 0.4 mm as a means. The labeling substance was prepared using a general crosslinking agent, for example.
次いで、種々の濃度（０．１から５０ｍｇ／ｄｌ程度の範囲）のＣＲＰ１μｌに対して、
（Ｑ）２０μｇ／ｄｌのＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体のみ５０μｌ、
（Ｒ）２０μｇ／ｄｌのＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体と１．７４μｇ／ｄｌの非標識の抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧとの１０：１混合物、
（Ｘ）２０μｇ／ｄｌのＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体と１７．４４μｇ／ｄｌの非標識の抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧとの１：１混合物、又は
（Ｙ）２０μｇ／ｄｌのＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体と１７４．４２μｇ／ｄｌの非標識の抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧｌとの１：１０混合物
２５０μｌをそれぞれ添加し、１０分間攪拌して混合し、反応させた。
Then, for 1 μl of CRP at various concentrations (ranging from 0.1 to 50 mg / dl),
(Q) 50 μl of 20 μg / dl HRP-labeled anti-CRP antibody only,
(R) a 10: 1 mixture of 20 μg / dl HRP-labeled anti-CRP antibody and 1.74 μg / dl unlabeled anti-CRP antibody IgG;
(X) 1: 1 mixture of 20 μg / dl HRP-labeled anti-CRP antibody and 17.44 μg / dl unlabeled anti-CRP antibody IgG, or (Y) 20 μg / dl HRP-labeled anti-CRP antibody and 174.42 μg 250 μl of a 1:10 mixture with / dl non-labeled anti-CRP antibody IgGl was added, respectively, and stirred for 10 minutes to mix and react.
続いて、得られた混合物の５μｌを採取し、これを、キトパールに固定した１０μｌの抗イディオタイプ抗体と混合し、室温にて１０分間上下攪拌して反応させ、いわゆるＢ／Ｆ分離を行って、上清を回収した。 Subsequently, 5 μl of the obtained mixture was collected, mixed with 10 μl of anti-idiotype antibody immobilized on chitopearl, and reacted by stirring up and down at room temperature for 10 minutes to perform so-called B / F separation. The supernatant was collected.
得られた上清から２μｌを採取して、これに色素（ＳＡＴ−Blue）１８μｌを加えて混合し、それぞれのサンプルについて６７０ｎｍにて吸光度変化率（単位時間当たりの吸光度変化量）を測定した。 2 μl was collected from the obtained supernatant, mixed with 18 μl of dye (SAT-Blue), and the absorbance change rate (absorbance change per unit time) was measured at 670 nm for each sample.
その結果を図１に示す。なお、図１においてＱ〜Ｙの曲線は、上述したサンプル（Ｑ）〜（Ｙ）にそれぞれ対応する。 The result is shown in FIG. In FIG. 1, the curves Q to Y correspond to the samples (Q) to (Y) described above, respectively.
図１の結果から、例えば、ＣＲＰ１０ｍｇ／ｄｌの場合、非標識物質を用いない場合には、吸光度変化率の測定値が適切な検出レンジに収まらず、判別することができない。一方、標識物質及び非標識物質の双方を用いた場合には、吸光度変化率の測定値が検出レンジに収まっており、判別することができる。また、非標識物質を、非標識物質／標識物質比が大きくなるように用いるほど、被検物質の吸光度変化率が小さくなり、見かけ上、被検物質が希釈されているのと同様になる。 From the result of FIG. 1, for example, in the case of CRP 10 mg / dl, when the unlabeled substance is not used, the measured value of the absorbance change rate does not fall within an appropriate detection range and cannot be determined. On the other hand, when both the labeled substance and the non-labeled substance are used, the measured value of the absorbance change rate is within the detection range and can be discriminated. In addition, as the non-labeled substance is used so that the ratio of the non-labeled substance / labeled substance increases, the absorbance change rate of the test substance decreases, which appears to be the same as the test substance is diluted.
さらに、非標識物質／標識物質の値が大きくなるほど、高濃度の被検物質を測定するのに有利であることが分かった。 Furthermore, it has been found that the larger the value of the non-labeled substance / labeled substance, the more advantageous for measuring a high concentration of the test substance.
実施例１
本発明のバイオチップ１０は、図２（ａ）及び（ｂ）に示したように、保持槽１１と、反応槽１２と、チャネル部１５と、検出部１４とが直列に配設されて構成されている。
Example 1
As shown in FIGS. 2A and 2B, the biochip 10 of the present invention is configured by a holding tank 11, a reaction tank 12, a channel unit 15, and a detection unit 14 arranged in series. Has been.
保持槽１１は、標識物質及び非標識物質とが保持されている槽であって、例えば、５０ｍｍ2（平面積）×１ｍｍ（深さ）程度の空間を有する。ここには、例えば、標識物質としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＣＲＰ抗体、非標識物質として非標識の抗ＣＲＰ抗体ＩｇＧが１：１で保持されている。 The holding tank 11 is a tank in which a labeling substance and a non-labeling substance are held, and has, for example, a space of about 50 mm 2 (planar area) × 1 mm (depth). Here, for example, horseradish peroxidase (HRP) labeled anti-CRP antibody as a labeling substance and unlabeled anti-CRP antibody IgG as a nonlabeling substance are held at 1: 1.
反応槽１２は、例えば、５０ｍｍ2（平面積）×１ｍｍ（深さ）程度の空間を有し、その中に、抗原又は抗体を固定するための固定手段１３が含まれている。固定手段１３としては、直径０．４ｍｍ程度の球状のキトパール（富士紡績製）が、例えば、反応槽１２の７０％程度の空間を占める程度収容されている。この固定手段１３には、標識及び非標識物質と抗原抗体反応によって結合し得る物質として、抗ＣＲＰ抗体に対する抗イディオタイプ抗体が固定されている。 The reaction tank 12 has, for example, a space of about 50 mm 2 (planar area) × 1 mm (depth), and includes a fixing means 13 for fixing the antigen or antibody therein. As the fixing means 13, spherical chitopearl having a diameter of about 0.4 mm (manufactured by Fuji Boseki) is accommodated, for example, to occupy about 70% of the space in the reaction tank 12. An anti-idiotype antibody against the anti-CRP antibody is immobilized on the immobilizing means 13 as a substance that can bind to the labeled and unlabeled substance by an antigen-antibody reaction.
反応槽１２の直近の上下流にはチャネル部１５が形成されている。チャネル部１５は、幅が１００μｍ程度で、深さが０．２ｍｍ程度に設定されており、上記のキトパールの直径よりも小さい径を有し、キトパールが反応槽１２から他の部位に移動しないように形成されている。 A channel portion 15 is formed immediately upstream and downstream of the reaction tank 12. The channel portion 15 has a width of about 100 μm and a depth of about 0.2 mm, and has a diameter smaller than the diameter of the above-mentioned chitopearl so that the chitopearl does not move from the reaction vessel 12 to other parts. Is formed.
検出部１４は、例えば、光学的検出として吸光度を測定するために、長さ１００ｍｍ程度で、断面積が１ｍｍ2程度の一定形状を有している。
なお、保持槽１１には、被検物質を含むサンプルを注入するための注入口が連結されている。
For example, the detection unit 14 has a fixed shape with a length of about 100 mm and a cross-sectional area of about 1 mm 2 in order to measure absorbance as optical detection.
The holding tank 11 is connected to an injection port for injecting a sample containing a test substance.
このような構成のバイオチップ１０では、まず、図３に示したように、Ｓ１において、被検物質を含むサンプル３μｌを、この被検物質に対して過剰量（予めバイオチップを用いて被検物質濃度を設定し、その設定濃度の１〜１００倍程度のモル比）の標識及び非標識物質（１：１モル比）が保持された保持槽に導入する。 In the biochip 10 having such a configuration, first, as shown in FIG. 3, in S1, 3 μl of a sample containing a test substance is excessively added to the test substance (preliminary test using a biochip). The substance concentration is set, and the substance is introduced into a holding tank in which a labeled and unlabeled substance (1: 1 molar ratio) having a molar ratio of about 1 to 100 times the set concentration is held.
導入されたサンプルは、Ｓ２において、保持槽１１で混合され、被検物質と標識物質及び非標識物質とが反応する。ここで、被検物質のほぼ全てが標識物質または非標識物質のいずれかと結合し、過剰量の標識物質及び非標識物質が被検物質と結合しないまま残存する。 In S2, the introduced sample is mixed in the holding tank 11, and the test substance reacts with the labeled substance and the unlabeled substance. Here, almost all of the test substance binds to either the labeling substance or the non-labeling substance, and an excessive amount of the labeling substance and the non-labeling substance remain without binding to the test substance.
続いて、Ｓ３において、バイオチップ１０を回転させて得られる遠心力等によって、得られた混合物を反応槽１２に移動させ、混合する。ここでの固定手段１３の抗体は、被検物質であるＣＲＰと競合的に標識物質及び非標識物質における抗ＣＲＰ抗体と反応する。従って、標識物質及び非標識物質のうち、被検物質と結合していないもののみが全部又はほぼ全部、固定手段１３における抗体と結合する。なお、固定手段１３への抗体固定化法は、供給元の推奨方法に従った。 Subsequently, in S3, the obtained mixture is moved to the reaction vessel 12 and mixed by centrifugal force or the like obtained by rotating the biochip 10. The antibody of the fixing means 13 here reacts with an anti-CRP antibody in a labeled substance and an unlabeled substance in a competitive manner with CRP as a test substance. Accordingly, only the labeling substance and the non-labeling substance that are not bound to the test substance are all or almost all bound to the antibody in the fixing means 13. In addition, the antibody immobilization method to the immobilization means 13 followed the supplier's recommended method.
これによって、Ｓ４に示したように、チャネル部１５によって、固定手段１３と結合した標識物質及び非標識物質は反応槽１２内に留まり、標識物質及び非標識物質と結合した被検物質のみが、固定手段１３に結合することなく、検出部に移動することができ、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる。 Thereby, as shown in S4, the labeling substance and the unlabeled substance bound to the fixing means 13 remain in the reaction tank 12 by the channel unit 15, and only the test substance bound to the labeling substance and the unlabeled substance remains. Without being coupled to the fixing means 13, it can move to the detection unit, and so-called B / F separation is performed.
その後、Ｓ５に示したように、検出部に導入された標識物質と結合した被検物質について、予め検出部に導入しておいた発色物質（ＳＡＴ−Blue（（株）同仁化学研究所）を標識物質におけるＨＲＰの活性によって発色させる。そして、例えば、６７０ｎｍにおけるサンプルの吸光度の変化を測定する。得られた結果を、用いた標識物質及び非標識物質の量及び比、被検物質への反応性等を考慮して換算することにより、サンプル中の被検物質を定量することができる。 Thereafter, as shown in S5, for the test substance bound to the labeling substance introduced into the detection unit, the color developing substance (SAT-Blue (Dojindo Laboratories)) previously introduced into the detection unit is used. The color is developed by the activity of HRP in the labeling substance, and the change in the absorbance of the sample at 670 nm, for example, is measured. By converting in consideration of the properties and the like, the test substance in the sample can be quantified.
なお、被検物質の反応及び測定は、すべて室温で行った。
この方法によれば、固定手段に被検物質を結合させることを要しないため、測定対象となる物質のみを検出部に導入して分析することができ、バックグラウンドを低減することができ、より精度の高い分析を行うことが可能となる。
The reaction and measurement of the test substance were all performed at room temperature.
According to this method, since it is not necessary to bind the test substance to the fixing means, only the substance to be measured can be introduced into the detection unit and analyzed, and the background can be reduced. It becomes possible to perform analysis with high accuracy.
実施例２
実施例１におけるＢ／Ｆ分離の後、反応槽１２の固定手段１３に結合した標識化合物に対して発色物質を添加して発色させ、反応槽において実施例１と同様に吸光度変化を測定する。得られた結果を換算することにより、サンプル中の被検物質を定量することができる。
Example 2
After the B / F separation in Example 1, a coloring substance is added to the labeled compound bound to the fixing means 13 of the reaction tank 12 to cause color development, and the change in absorbance is measured in the reaction tank in the same manner as in Example 1. By converting the obtained results, the test substance in the sample can be quantified.
実施例３
実施例１において、図２（ａ）及び（ｂ）のバイオチップ１０に代えて、検出部１４内に一対の電極が形成されたバイオチップを用いる。
これにより、Ｂ／Ｆ分離の後、図３のＳ５１に示したように、基質として加えたフェロセンを、標識化合物である酵素によってフェリシニウムイオン（Ｆｃ+）に変換し、さらにこれを電極上で還元するという酸化還元反応を行わせることにより、その際に生じる電流値を測定する。
この電流値は、被検物質の量、つまり、被検物質と標識物質との反応生成物の濃度に比例した値となり、被検物質の測定を定量的に行うことができる。
Example 3
In Example 1, instead of the biochip 10 of FIGS. 2A and 2B, a biochip having a pair of electrodes formed in the detection unit 14 is used.
Thus, after the B / F separation, as shown in S51 of FIG. 3, ferrocene added as a substrate is converted to ferricinium ion (Fc + ) by the enzyme as a labeling compound, and this is further converted on the electrode. By carrying out an oxidation-reduction reaction of reduction, the current value generated at that time is measured.
This current value becomes a value proportional to the amount of the test substance, that is, the concentration of the reaction product between the test substance and the labeling substance, and the test substance can be measured quantitatively.
実施例４
この実施例のバイオチップ２０は、図４に示したように、固定化手段１３が収容された反応槽１２に、標識物質及び非標識物質が保持された保持槽１１が接続されている。また、反応槽１２の上流に試料の導入口が接続されており、反応槽１２直近の上下流部分にチャネル１５が形成されている。
Example 4
In the biochip 20 of this embodiment, as shown in FIG. 4, the holding tank 11 holding the labeling substance and the non-labeling substance is connected to the reaction tank 12 in which the immobilizing means 13 is accommodated. In addition, a sample inlet is connected upstream of the reaction vessel 12, and a channel 15 is formed in the upstream / downstream portion in the immediate vicinity of the reaction vessel 12.
このような構成のバイオチップ２０では、まず、図５に示したように、Ｓ１において、被検物質を含むサンプル３μｌを、導入口から反応槽１２に導入し、Ｓ２において、反応槽１２で、サンプルと固定化手段１３に固定された抗体とを反応させる。これにより、被検物質のほぼ全てが固定化抗体と結合する。 In the biochip 20 having such a configuration, as shown in FIG. 5, first, in S1, 3 μl of a sample containing the test substance is introduced into the reaction tank 12 from the introduction port. In S2, in the reaction tank 12, The sample is reacted with the antibody immobilized on the immobilizing means 13. Thereby, almost all of the test substance binds to the immobilized antibody.
続いて、Ｓ３において、反応槽１２の固定化抗体と結合した被検物質に対して過剰量（予めバイオチップを用いて被検物質濃度を設定し、その設定濃度の１〜１００倍程度のモル比）の標識及び非標識物質（１：１モル比）が保持された保持槽１１から、反応槽１２に、標識物質及び非標識物質を導入し、Ｓ４において、反応させる。これにより、被検物質のほぼ全てに標識物質または非標識物質のいずれかが結合し、過剰量の標識物質及び非標識物質が被検物質と結合しないまま残存する。 Subsequently, in S3, an excessive amount of the test substance bound to the immobilized antibody in the reaction tank 12 (a test substance concentration is set in advance using a biochip, and a mole of about 1 to 100 times the set concentration is set. The labeling substance and the non-labeled substance are introduced into the reaction tank 12 from the holding tank 11 in which the ratio) of the label and the non-labeled substance (1: 1 molar ratio) are held, and reacted in S4. Thereby, either the labeled substance or the unlabeled substance is bound to almost all of the test substance, and an excessive amount of the labeled substance and the unlabeled substance remain without being bound to the test substance.
続いて、Ｓ５に示したように、チャネル部１５によって、固定手段１３と結合した被検物質にさらに結合した標識物質及び非標識物質が反応槽１２内に留まり、被検物質と結合していない標識物質及び非標識物質が、固定手段１３に結合することなく、反応槽１２の下流に移動し、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる。 Subsequently, as shown in S5, the labeled part and the non-labeled substance further bound to the test substance bound to the fixing means 13 remain in the reaction tank 12 by the channel portion 15 and are not bound to the test substance. The labeling substance and the non-labeling substance move downstream of the reaction tank 12 without being bound to the fixing means 13, and so-called B / F separation is performed.
その後、Ｓ６に示したように、反応槽１２の固定化手段１３によって保持された、標識物質と結合した被検物質について、発色物質と混合して、標識物質におけるＨＲＰの活性によって発色させる。そして、実施例１と同様に吸光度変化を測定する。得られた結果を換算することにより、サンプル中の被検物質を定量することができる。 Thereafter, as shown in S6, the test substance bonded to the labeling substance held by the immobilizing means 13 of the reaction tank 12 is mixed with the coloring substance and colored by the activity of HRP in the labeling substance. Then, the change in absorbance is measured in the same manner as in Example 1. By converting the obtained results, the test substance in the sample can be quantified.
実施例５
この実施例におけるバイオチップは、図４のバイオチップ４０の下流に、図２のバイオチップ１０における検出部１４を備えたものを用いる。
実施例４におけるＢ／Ｆ分離の後、反応槽の下流に移動した被検物質と結合していない標識物質及び非標識物質を、検出部に導入し、標識化合物に対して発色物質を添加して発色させ、実施例１と同様に吸光度変化を測定する。得られた結果を換算することにより、サンプル中の被検物質を定量することができる。
Example 5
As the biochip in this embodiment, a biochip provided with the detection unit 14 in the biochip 10 in FIG. 2 downstream of the biochip 40 in FIG. 4 is used.
After the B / F separation in Example 4, a labeled substance and an unlabeled substance that are not bonded to the test substance moved downstream of the reaction tank are introduced into the detection unit, and a coloring substance is added to the labeled compound. The color is developed and the change in absorbance is measured in the same manner as in Example 1. By converting the obtained results, the test substance in the sample can be quantified.
１０、２０ バイオチップ
１１ 保持槽
１２ 反応槽
１３ 固定手段
１４ 検出部
１５ チャネル部
10, 20 Biochip 11 Holding tank 12 Reaction tank 13 Fixing means 14 Detection unit 15 Channel unit
Claims (17)
次いで、これらの混合物を、固相の固定手段に固定された固定化抗原／抗体と混合して、被検物質と反応していない標識物質及び非標識物質を固定化抗原／抗体と反応させ、
得られた固定化抗原／抗体との反応生成物と、固定化抗原／抗体との未反応物と、から前記未反応物を分離し、
該分離された前記未反応物を分析することにより、被検物質を検出する方法。 A sample containing a test substance, a labeled substance that specifically reacts with the test substance, and a non-labeled substance that reacts specifically with the test substance are mixed in advance and reacted.
Subsequently, these mixtures are mixed with the immobilized antigen / antibody immobilized on the solid phase immobilization means, and the labeled substance and the unlabeled substance that have not reacted with the test substance are reacted with the immobilized antigen / antibody.
Separating the unreacted product from the obtained reaction product with the immobilized antigen / antibody and the unreacted product with the immobilized antigen / antibody;
A method for detecting a test substance by analyzing the separated unreacted substance.
次いで、これらの混合物を、前記被検物質と特異的に反応する標識物質及び前記被検物質と特異的に反応する非標識物質と混合し、固定化抗原／抗体に結合した被検物質に標識物質及び非標識物質を反応させ、
得られた固定化抗原／抗体との反応生成物と、固定化抗原／抗体との未反応物と、から前記未反応物を分離し、
該分離された前記未反応物を分析することにより、被検物質を検出する方法。 A sample containing a test substance and an immobilized antigen / antibody fixed to a solid phase fixing means are mixed in advance, and the test substance and the immobilized antigen / antibody are reacted.
Next, the mixture is mixed with a labeled substance that specifically reacts with the test substance and an unlabeled substance that reacts specifically with the test substance, and the test substance bound to the immobilized antigen / antibody is labeled. Reacting substances and unlabeled substances,
Separating the unreacted product from the obtained reaction product with the immobilized antigen / antibody and the unreacted product with the immobilized antigen / antibody;
A method for detecting a test substance by analyzing the separated unreacted substance.
抗原又は抗体を固定するための固定手段が収容された反応槽とを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法に用いられるバイオチップ。 A holding tank in which a labeled substance and an unlabeled substance are held;
The biochip used in the method according to any one of claims 1 to 10, further comprising a reaction tank containing a fixing means for fixing an antigen or an antibody.
抗原又は抗体を固定するための固定手段が収容された反応槽とを含み、
固定手段には、被検物質と抗原抗体反応によって結合するが、標識物質及び非標識物質とは直接結合しない抗原又は抗体が担持されてなる、請求項４〜１０のいずれかに記載の方法に用いられる記載のバイオチップ。 A holding tank in which a labeled substance and an unlabeled substance are held;
A reaction vessel containing a fixing means for fixing the antigen or antibody,
The method according to any one of claims 4 to 10, wherein the fixing means carries an antigen or an antibody that binds to a test substance by an antigen-antibody reaction but does not directly bind to a labeled substance and an unlabeled substance. The described biochip used.
抗原又は抗体を固定するための固定手段が収容された反応槽とを含み、
固定手段には、標識物質及び非標識物質と抗原抗体反応によって結合するが、被検物質とは直接結合しない抗原又は抗体が担持されてなる、請求項１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。 A holding tank in which a labeled substance and an unlabeled substance are held;
A reaction vessel containing a fixing means for fixing the antigen or antibody,
The biochip according to any one of claims 1 to 3, wherein the fixing means carries an antigen or an antibody that binds to a labeled substance and an unlabeled substance by an antigen-antibody reaction but does not directly bind to a test substance. .
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