JP4970424B2 - 蛋白質を包囲するナノリポソームの製造方法及び蛋白質−包囲ナノリポソーム - Google Patents
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Description
本明細書で全体に亙り多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として、本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本発明の他の目的は蛋白質-包囲ナノリポソームを提供することにある。
本発明のさらに他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面により一層明確になる。
リポソームを形成させる為の分散液を製造する段階で利用される蛋白質の濃度は、一般的に、0.1-50mg/ml、好ましくは0.2-30mg/ml、より好ましくは0.3-20mg/ml、最も好ましくは0.8-3mg/mlである。利用される燐脂質の初期濃度は、分散液の総重量対比1-50w/v%、好ましくは2-40w/v%、より好ましくは3-20w/v%、最も好ましくは5-10w/v%である。
引き続き前記分散液に剪断力(shearing force)を付加して、蛋白質-包囲リポソームを形成させる。
剪断力を付加する方法は、当業界に公知されており、好ましくは、高圧均質機(high pressure homogenizer)、音波発生機(sonicator)、微小流動機(microfluidizer)、押出器(extrusion apparatus)又はフレンチプレス(French press)を利用して実施され、最も好ましくは、高圧均質機を利用して実施される。
好ましくは、前記段階(b)-(d)によりなされる順次的に増加する剪断力の付加は、0-1200barの範囲、より好ましくは、0-1000barの範囲、最も好ましくは、0-800barの範囲で圧力を増加させながら高圧均質機を利用して実施される。高圧均質機での圧力の増加は好ましくは、50-200barずつ、より好ましくは約100barずつ増加させる。
それぞれの圧力下での高圧均質機処理は、好ましくは数回、より好ましくは2-5回を実施する。高圧均質機の処理は総5-40回、好ましくは10-40回、より好ましくは20-40回、最も好ましくは20-30回実施する。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の方法は50%以上の包囲効率を表す。用語“包囲効率”とは、本発明の過程で最初利用される蛋白質水溶液に含まれている蛋白質の量に対するナノリポソームに包囲された蛋白質の量の比率を意味する。より好ましくは、本発明の方法は70%以上の包囲効率、よりさらに好ましくは80%以上の包囲効率、最も好ましくは90%以上の包囲効率を表す。
ナノリポソームの小さい粒子径は、本発明のナノリポソームが望む目標組織への伝達を容易にする。
A型(クリーム型):人間成長ホルモン-含有クリーム剤形
A型の製造に利用された燐脂質はlipoid S100(Lipoid GmbH, Germany)又はlipoid S75(Lipoid GmbH, Germany)である。
機器出口(outlet)の温度が30℃を超えないように熱交換器を装置した高圧均質機(max. output 5 L/hr, 最大圧力1200 bar, Model HS-1002, (株)華成機械(South Korea)の熱交換器を氷水中に装置し、蒸留水で機器内部を洗滌して作動準備後、緩衝溶液(20mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1mM EDTA)に溶解されている1mg/ml濃度の人間成長ホルモン(LG Life Sciences, Ltd)溶液100mlに燐脂質を5w/v%の比率で添加して十分に水和させ撹拌し、これを常温で均質機を利用して低圧0barで3回以上均質機を通過させた。均質機処理をした溶液に燐脂質を6w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、100barで3回以上均質機を通過させた。その後、100bar条件で均質機を経た溶液に燐脂質を7w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、200barで3回以上均質機を通過させた。その後、200bar条件で均質機を経た溶液に燐脂質を8w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、300barで3回以上均質機を通過させた。前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を9w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、400barで3回以上均質機を通過させた。引続き、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を10w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、500barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を11w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、600barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を12w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、800barで3回以上均質機を通過させ、最終的にクリーム型の人間成長ホルモン-含有リポソーム(Nanolipo-hGH)を製造した。
本実施例で製造された人間成長ホルモン-含有リポソームクリーム剤形の電子顕微鏡の写真は図1に示してある。本実施例で製造されたクリーム型リポソームをゴールドコーティングして走査電子顕微鏡(HITACHI S 2500)で観察した結果、屈曲して連結されている基物の形態はゲルと推定され、球型の小さい粒等はナノ大(0.02-0.3μm)のリポソームと判断される。
B型の製造に利用された燐脂質は大豆レシチン(soybean lecithin;(株)新東邦、 South Korea)、Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)、Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)又はEmultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)である。
機器出口(outlet)の温度が30℃を超えないように熱交換器を装置した高圧均質機(max. output 5L/hr, 最大圧力1200bar, Model HS-1002、(株)華成機械(Korea))の熱交換器を氷水の中に装置した後、蒸留水で機器内部を洗滌して作動準備後、緩衝溶液(20mM NaH2PO4 pH6.5-7.5, 1mM EDTA)に溶解されている1mg/ml濃度の人間成長ホルモン(LG Life Sciences, Ltd)溶液100mlに、燐脂質を10w/v%の比率で十分に水和させ撹拌し、これを常温で均質機を利用して低圧 0barで3回以上均質機を通過させた。引続き、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を14w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、100barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を18w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、200barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を20w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、300barで3回以上均質機を通過させた。引続き前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を22w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、400barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を24w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、500barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を26w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、600barで3回以上均質機を通過させた。引続き前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を28w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、700barで3回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液を800barで3回以上均質機を通過した後、均質機から溶液を排出し、15,000xgで30分間高速遠心分離して上澄液を分離した。この時、リポソーム内に入らなかった人間成長ホルモンはゲル透過クロマトグラフィー(GE Healthcare, USA)で除去して液状のリポソームを収得した(参照:図2)。
B剤形で溶液を蒸留水及び緩衝溶液pH6.0-7.5(20mM NaH2PO4, 1mM EDTA, pH6.0-7.5)を使用して製造した結果、リポソームの物性及び安定性に差異点がなく、さらに、結果物を15-30℃で大豆レシチン10w/v%以上で長期間保管(1ヶ月以上)すれば、脂質層と水溶液の相分解が発生(上層は水溶液、下層は脂質層)したものの、10w/v%未満の大豆レシチンでは相分解が起こらず安定性が優れていた。
C型に利用された燐脂質はS(lipoid S100)とB(lipid B)をそれぞれ配合してB型均質方法によりlipo-hGHを製造する方法である。AとB燐脂質配合比率は、それぞれ1型(5%S+10%B)、2型(10%S+10%B)及び3型(5%S+20%B)としてB型均質方法でlipo-hGHを製造し、均質機から溶液を排出して高速遠心分離し、上澄液を分離する。常温(15〜30℃)で1型結果物は略、3ヶ月後層分離が起こり、2型結果物は略1ヶ月後層分離が起こる。3型結果物は層分離が起こらない。3型結果物は高濃縮リポソームとして保存が容易なformulation方法である。
前記実施例Iの剤形Bの人間成長ホルモン-含有リポソーム分析のため、常温でFPLC(Acta explorer, Amersham Bioscience)にSuperdex 200 HR/30コラムを装置し、コラムボリューム2倍の緩衝溶液(20mM NaH2PO4、1mM EDTA及び150mM NaCl)で平衡化させ、人間成長ホルモン-含有リポソームを分離及びその分画を分取後、これをSDS-PAGEで分析した。図3で確認し得るように、約22kDa付近で人間成長ホルモンのバンドが見られる。
HPLC(Shimazu)にC18 Delta packコラム(Waters, USA)を装着し、溶媒Aは0.1% TFAアセトニトリル、溶媒Bは0.1% TFA H2Oを使用して濃度勾配(B 60-10%:0-25min, B 60%:25.01-30min)方式で流速1ml/minで逆相-HPLCを実施した。蛍光検出器(Excitation:295nm, range:270-300nm, Emission:350nm, range:300-400nm)を利用してoven temp(55℃), run time 30min器機条件において、標準試料(International Standard人間成長ホルモンNIBSC code 98/574)を定量後、試料前処理過程(人間成長ホルモン含有したリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング)し、を蛍光検出器を利用してHPLCで定量した(参照:図4)。
定量結果、実施例Iの剤形BのNanolipo-hGHは3.69μg/mlの人間成長ホルモンを含有していることが分かった。
HPLC(Shimazu)にSpherisorb S5 NH2コラム(Waters)を装着し、溶媒として60%アセトニトリル、30%メタノール及び5% H2Oを使用して等溶媒濃度勾配(isocratic gradient)方式で流速1ml/minでHPLCを実施した。紫外線検出器(215nm)を利用してoven temp(35℃)、run time 20min器機条件で燐脂質をメタノール:クロロホルム(90%:10%)である溶液に完全溶解させて定量した。同一な方式で本発明の人間成長ホルモン-含有リポソーム溶液をメタノール:クロロホルム(90%:10%)溶液に完全溶解させてHPLCで定量した(参照:図5)。
定量結果、実施例Iの剤形BのLipo-hGHは3.26mg/mlの燐脂質を含有していることが分かった。
前記実施例Iで製造されたB剤形の人間成長ホルモン-含有リポソームの安定性試験を次のように実施した:0.1% methyl parabenを含有した本発明のNanolipo-hGHを褐色の瓶に入れて、それぞれ4℃及び15-30℃に放置して1週置きにhGH含量をHPLCで定量して安定性を調査した。図6で確認できるように、本発明のNanolipo-hGHは貯蔵10ヶ月後、4℃では、初期hGH含量の87.5%に存在し、室温では75%に存在することを確認した。従って、本発明のLipo-hGH安定性が優れていることが分かる。
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソーム(実施例IのB剤形)の安全性を検査する為に、人間角質細胞株であるHaCaT(DKFZ, Germany)と人間胚芽繊維芽細胞であるHEF(gift from Prof. Lee, Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University)に対する細胞毒性を調査した。
HaCaTとHEFをそれぞれ1×105細胞/ml及び5×104細胞/mlの濃度で10% FBS/DMEM(FD培地)に懸濁し、これを24wellプレートに1ml添加後、37℃、5% CO2インキュベータで1日間培養した。培養1日後、上層培地を用心深く除去し、適切な量の10%FD培地と濃度別に準備した試料をプレートのウェルに添加し、37℃、5% CO2インキュベータで1日間反応させた。試料として利用されたものは緩衝液(20mM Na-Pi, pH7.0, 1mM EDTA及び0.1% Methyl paraben含有)、リポソーム、人間成長ホルモン及び実施例IのB剤形のNanolipo-hGHである。反応後、細胞の生存力を3-(4,5-ジメイルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニールテトラゾリウムブロマイド(MTT:Sigma, USA)を利用して測定した(Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91(4):1470-4(1994), Shearman et al., J. Neurochem. 65(1):218-27(1995)及びKaneko et al., J. Neurochem.65(6):2585-93(1995))。MTT反応結果物に対してELISAリーダ(Molecular Devices, USA)を利用して570nmでの吸光度を測定した。各試料による生存度は試料が添加されていないウェルの吸光度を100%にして、相対的な値で表した(図7)。
図7で確認できるように、本発明のHgh-含有ナノリポソームはHaCaTとHEFの細胞生存度に影響を及ぼさないことが分かり、結局生体に極めて安全な剤形であることか分かった。
Nb2ノーブルラットリンパ腫細胞株(noble rat lymphoma cell line, NIBSC ECACC #97041101)1×105細胞/ml 50μlがある96-ウェルプレートのウェルにS-hGH(標準人間成長ホルモン)、Standard human growth hormone, NIBSC code 98/574), S-hGH 1000倍希釈された試料前処理溶液(人間成長ホルモンを含有しないリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング)が添加された試料、又は試料前処理過程(人間成長ホルモンを含有したリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング)を経た実施例IのB剤形Nanolipo-hGH(N-hGH)を1000倍希釈した溶液が添加された試料を添加した。5日間37℃、5% CO2で培養した後、増殖された細胞の量をMTTを利用して測定した。hGHが添加されない対照群の平均吸光度を100%にしたとき、試料が添加された群の相対的な値を計算した。
図8に示した通り、本発明のNanolipo-hGHに包囲された人間成長ホルモンは本来の活性を維持していることが分かった。
前記実施例でゲル透過クロマトグラフィーで分離した剤形BのNanolipo-hGHをParticle Size Analyzer(Mastersizer 2000/ Malvern Instruments Ltd)を利用して屈折率1.52で粒子のサイズ分布を分析した(参照:図9)。図9で見られる通り、本発明のNanolipo-hGHの粒子のサイズは0.193μmの大きさで最大分布を表しており、剤形BのNanolipo-hGHはナノ大で存在することが分かる。
4週令の無毛マウス(韓国化学研究院から購入)と実施例IのB剤形Nanolipo-hGH(N-hGH)を利用して実験した。動物飼育室の温度は22±2℃、湿度は55-60%に維持させ、明暗循環が12時間単位に調節されるようにし、放射線照射で滅菌した固形飼料(中央実験動物, Seoul, KOREA)と滅菌された給水を自在に摂取できるようにした。2週程の適応期間を有した。このようなヌードマウスの背中に皺を誘導する為に、UVB-20 mJを1週に3回照射する方式で8週間照射した。その後、化粧用ブラシを利用して飼料及び対照群溶液をUVBが照射された背中に8週間塗布した。その後、皺改善効果をDonald方法(Hyun-Seok Kim et. al, Mech. Ageing Dev. (2005. 8.16 In press))で評価した。実験結果は図10及び図11に示してある。図10において、対照群(n=3)は何等の処理もしていない群であって、UVB-対照群(n=3)はUVB-20mJを処理して皺のみを誘導した群であり、リポソーム(n=3)はUVB-20 mJを処理して皺を誘導し、リポソームを処理した群であり、Nanolipo-hGH(n=3)はUVB-20 mJを処理して皺を誘導し、本発明のNanolipo-hGHを処理した群である。図10及び図11に示された通り、本発明のNanolipo-hGHはUVにより誘導された皺を効果的に除去し、その効果は局所投与後、約2週後から明らかに表れていることが分かる。
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソームのにきび治療効能を次のように調査した:
15-40才の女性の内、顔の皮膚ににきびを有する60名を20名ずつ無作為で3グループに分け、前記実施例IのhGH-含有リポソーム剤形B型(剤形1)、リポソームのみが含まれた比較溶液(剤形2)、さらに比較緩衝溶液(剤形3)をそれぞれ3週間朝/夕に1日2回ずつ洗顔後一番先に使用するようにした。その他には平素使用する化粧品に対する特別な制限はしなかった。その後、使用者の意見によりにきびに対する改善程度を下記の評価基準により判定した。試験結果は表に示してある。評価基準:+++(極めて良好な改善効果がある)、++(かなりの改善効果がある)、+(若干の改善効果がある)、±(改善効果はないものの、弱化もしない)、-(弱化した)。
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソームの染み除去効能を下記の通り調査した: 40-60才の女性の内、顔の皮膚に染みを有する60名を20名ずつ無作為で3グループに分け、前記実施例IのhGH-含有リポソーム剤形B型(剤形1)、リポソームのみが含まれた比較溶液(剤形2)、さらに比較緩衝溶液(剤形3)をそれぞれ8週間朝/夕に1日2回ずつ洗顔後一番先に使用するようにした。その他は平素使用する化粧品に対する特別な制限はしなかった。その後、使用者の意見により染みに対する改善程度を下記の評価基準により判定した。試験結果は表2に示してある。評価基準:+++(極めて良好な改善効果がある)、++(かなりの改善効果がある)、+(若干の改善効果がある)、±(改善効果はないものの弱化もしない)、-(弱化した)。
スプラグドリラットの腹の部分を6個の区域(それぞれ半径1cm円)に分けて、下記の試料を処理した:0.1% methyl-paraben緩衝液、0.1%リポソーム、hGH 0.001 U、hGH 0.0001 U、Lipo-hGH 0.001 U及びLipo-hGH 0.0001 U。
24時間毎に50μlずつ2回処理し、総7回処理した。最後の試料処理後24時間が経つと、ラットより組織を採取した。採取した組織を40μm厚に断片化して、1次抗体としてポリクロナル兎、抗-人間成長ホルモン抗体(DAKO,U.S.A.)を処理後、2次抗体としてビオチンが結合されているanti-rabbit antibody(VECTOR. VECTASTAIN ABC kit(RABBIT IgG), U.S.A.)を室温で30分間処理した。以降、VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, U.S.A.)で室温で30分間処理し、DAB基質(Diaminobenzidine, Sigma, USA)で発色反応させた。78%エタノール、85%エタノール、95%エタノール及び100%エタノールで順に脱水させ、ザイレンで5分間処理した。組織をスライドガラスに固定し、Lipo-hGHに含有された人間成長ホルモンの位置を観察した。
図12aで見られる通り、本発明のNanolipo-hGHに包囲された人間成長ホルモン、又はラットが本来有したラット成長ホルモンが毛嚢(hair follicle)のバルジ幹細胞(bulge stem cells)に見られる位置で確認できる。
さらに、図12bで見られる通り、本発明のNanolipo-hGH (0.0001 UのhGH含有)が塗布されたラットの皮膚から真皮層(dermal layer)が広くなり、毛嚢の数が増加したことが分かった。しかも、図12bでhGH水溶液のみを皮膚に塗布した場合にも、毛嚢のバルジ幹細胞位置にhGHが到達していることが分かるものの、このような発見は当業界の技術水準と常識を考慮するに、極めて驚異に値するものである。この結果はリポソームで包囲されたhGHのみならず、hGH水溶液自体を皮膚に塗布する場合にも皮膚状態の改善が達成できる可能性を見せてくれる。
実施例Iで製造した本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHがICRマウスの皮膚に及ぼす影響をH&E(Hematoxylin & Eosin)染色で分析した。先ず、ICRマウスの背中の毛を除去し、脊椎を中心に分けて対照群と本発明のLipo-hGHを4時間毎に2週間処理した:グループ1(3匹)、非処理グループ2(3匹)、リポソーム/0.1 U本発明のlipo-hGH処理グループ3(3匹)、リポソーム/0.01 U本発明のLipo-hGH処理グループ4(3匹)、リポソーム/0.001 U本発明のLipo-hGH処理。2週処理後、マウスから組織を採取した。採取した組織をパラフィンブロックを造り、4μm厚で断片化してスライドガラスの上に乗せた。引続き前記断片から脱パラフィンした後、ヘマトザイレン溶液で室温で10分間処理し、エオシン溶液で室温で1分間処理した。78%エタノール、85%エタノール、95%エタノール及び100%エタノールで順に脱水させ、ザイレンで5分間処理した。組織を固定化した後、顕微鏡下で染色された組織を観察した。
図13aで見られる通り、本発明のナノリポソーム剤形のLipo-hGHを処理した皮膚の表皮層において、細胞の増殖が大きく増加することが分かり、真皮層では結合組織のリモデリングが発生して、より緻密な結合組織が形成されたことが分かった。図13bは400倍の拡大像にして、真皮層で結合組織のリモデリングが発生したことをより明確に確認できる。
Neoderm-EDTM(Tego Science, South Korea)を利用して本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHが人工皮膚に及ぼす影響を分析した。Neoderm-EDTMはin vitro試験の為の人間皮膚モデルとして、表皮と真皮マトリックスで構成されている。実験群はグループ1は非処理、グループ2は緩衝液のみ処理、グループ3と4はリポソーム処理、グループ5及び6はそれぞれ0.001 unit及び0.01 unitの本発明のLipo-hGH処理群でなされている。パラフィン処理及びH&E染色は前記実施例と同一に実施した。最終的に顕微鏡下で染色された組織を観察した。
図14で見られる通り、本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHを処理したNeoderm-EDTMの角質細胞層で細胞の細胞の増殖が活発になされた。
8週令の休止期(telogen)時期のC57BL/6(Jung Ang Lab Animal Inc., South Korea)をケタミン(柳韓洋行)&ラムフン(バイエルコリア株式会社)で麻酔して除毛剤を使用して背中部分の毛を除去した。区域を分けて0.1 U Nanolipo-hGHと0.1 U hGHをそれぞれ150ulずつ19日間1日2回処理した。組織を得る4時間前から30分置きに処理した後組織を得た。組織は10%ホルマリン溶液に固定してパラフィンブロックを造り10umに切断し、1次抗体としてポリクロナル兎抗-人間成長ホルモン抗体(DAKO,U.S.A.)を12時間処理後、Texas-Red蛍光が結合されている抗-兎2次抗体(VECTOR)を室温で1時間30分間処理した。その後、DAPIを含むmounting medium (VECTOR)を落してCover glassを覆い蛍光顕微鏡で観察した。結果は写真で見られるようにNanolipo-hGHで処理した皮膚の毛嚢の外毛根鞘に沿って点々と赤く染色されたhGHを図15で確認することができた。
Claims (12)
- 下記の段階を含む蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法:
(a)蛋白質を含有する水溶液に燐脂質を分散させ分散液を製造する段階;
(b)前記分散液に剪断力(shearing force)を付加(applying)する段階;
(c)段階(b)の結果物に燐脂質を追加的に添加し、段階(b)より高い剪断力を付加する段階;及び
(d)追加的な燐脂質と前段階より高い剪断力を利用して、段階(c)を繰返し実施して、望む粒子径及び包囲効率を有するナノリポソームを成型する段階。 - 前記蛋白質はホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質又はその一部分、抗体又はその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質又はその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及び植物生体防御誘導蛋白質で構成された群より選ばれることを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記燐脂質は水添大豆レシチンであることを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記剪断力の付加は、高圧均質機を利用して実施されることを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記高圧均質機での圧力の増加は50−200barずつ増加することを特徴とする第4項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記高圧均質機での圧力の増加は100barずつ増加することを特徴とする第5項記載のナノリポソームの製造方法。
- 最終的に存在する燐脂質の量は30w/v(%)であることを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記燐脂質の量の順次的増加は1−5w/v(%)ずつ増加することを特徴とする第7項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記最終的に成型されたナノリポソームは50−350nmの粒子径を有することを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記最終的に成型されたナノリポソームは小型単一層小胞(small unilamellar vesicle)構造を有することを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記最終的に成型されたナノリポソームは液状の剤形を有することを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
- 前記最終的に成型されたナノリポソームに包囲された蛋白質は、包囲される以前の蛋白質の活性を90−100%保有することを特徴とする第1項記載のナノリポソームの製造方法。
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