JP4951204B2 - 組換えアデノウイルスベクターとその応用 - Google Patents

Description

本発明は、新規な組換えアデノウイルスとそれらの調製方法、ならびにワクチンを目的とした、もしくは癌治療などの治療目的のための、遺伝子発現ベクターおよび遺伝子トランスファーベクターとしてのそれらの使用に関するものである。

アデノウイルスは、短い逆方向反復配列（ＩＴＲ）を伴う、約３０−４０ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡの線状ゲノムを有するエンベロープのないウイルスである。

アデノウイルスのゲノムは、初期の転写単位（Ｅ１からＥ４）と、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって発現が分離された五つの転写産物のファミリー（Ｌ１からＬ５）で構成された後期の単位（ＭＬＴＵ）とから成る。

初期の段階は、Ｅ１Ａ領域、ついでＥ４領域、ほぼ同時にＥ３ならびにＥ１Ｂ領域、ついでＥ２Ａ領域、そして最後にＥ２Ｂ領域の、順次続く、転写および発現による感染から二時間後に始まる。最も初期のＥ１Ａ領域は、アデノウイルスの他の初期遺伝子（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）のトランスアクチベーターならびに細胞遺伝子のトランスアクチベーターをコードする。感染から八時間後にウイルスＤＮＡの複製が始まる。感染から十二時間後に始まる後期の段階の特徴は、細胞のタンパク質の合成が消失して後期のウイルスタンパク質がアデノウイルス粒子構造の構成に入り、ビリオンの組立に参加し、ついで感染細胞の構造健全性に作用してその放出に参加することにある。

アデノウイルスは、それらの特徴と、それらの遺伝子組成およびそれらの生態に関する利用可能な知識の量との故に、ウイルスベクターの開発にとくに魅力がある。

宿主（ヒトまたは動物）において増殖できる複製型ウイルスを得るという目的か、もしくは宿主において増殖できない非複製型ウイルスを得るという目的かによって、異なる構築戦略が考えられた。

非複製型ベクターの構築は、ウイルス複製に欠かせない領域を欠失させることを含む。その結果得られるウイルスは、複製ができないため、対応する野生型ウイルスによる感染を許容する細胞内で感染粒子を産生できず、欠失した遺伝子の生成物をトランスで提供できる変更された細胞株内で産生する。

通常用いられる戦略は、プロモーターおよびＥ１Ａ遺伝子（Ｅ１の部分欠失）ならびに場合によってはＥ１Ｂ遺伝子（Ｅ１領域の完全欠失）のコード領域の代わりに、左ＩＴＲとＥ１領域との間のゲノムの左部分に、異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）を挿入することにある。Ｅ１Ａが欠失したウイルスは、Ｅ１Ａの機能を補完しない細胞内で複製することができない。しかしながら、それらは、感染細胞内で大量の外因性タンパク質を発現することができる。

Ｅ１領域および場合によってはＥ３領域の欠失した多数のヒトアデノウイルスベクター（Ａｄ２およびＡｄ５）は、主にヒトの遺伝子治療を目的に構築された。これらのベクターを改善するために、突然変異（Ｅ２領域）またはさらなる欠失（Ｅ２またはＥ４領域）が導入された。

Ｅ１領域全体が欠失した非複製型イヌアデノウイルスベクターも、ヒトの遺伝子治療の応用のために開発された（ＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ８， ２１０３−２１１５， １９９７， ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｄｅｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ４１１ ａ ２８９８ ｄｅ Ｃａｖ２；出願人ＲＨＯＮＥ ＰＯＵＬＥＮＣ ＲＯＲＥＲによる国際公開第９５／１４１０１号パンフレットおよび米国特許第５８３７５３１号明細書；ＫＲＥＭＥＲら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７４， ５０５−５１２， ２０００， ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｄｅｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ４１２ ａ ２４９７ ｄｅ Ｃａｖ２）。

これらの非複製型ベクターは、多くの組織内で高い遺伝子転移効率を示した。しかしながら、該非複製型ベクターにはいくつか難点もあり、とくに腫瘍細胞のように活発に***している細胞内への遺伝子転移に問題がある。これらの細胞において、連続する***の際に染色体外ベクターが損失することに関連して転移遺伝子発現が急速に消失することが観察される。

複製型ベクターの構築では、宿主におけるその複製および感染ウイルス粒子の産生（ウイルス産生サイクル）に必須のウイルスゲノムの配列をいっさい削除しないことが必要になる。現在、アデノウイルスにおいて、これらの要求を満足させることのできる異種配列挿入部位は少数しか分かっていない。

複製型ベクターは、Ｅ３領域、および右ＩＴＲとＥ４プロモーターの転写制御配列との間のゲノムの右部分などの、必須ではない領域内に異種遺伝子を挿入することで得られた。複製型ベクターは、Ｅ１機能遺伝子を保存されることを条件に、左ＩＴＲとＥ１領域との間のゲノムの左部分に異種遺伝子を挿入することによっても得られた。より正確には、ヒトアデノウイルス（Ａｄ５）の４５５位と９１７位との間への異種配列の挿入は、プロモーターおよびＥ１Ａのコード領域の一部を欠失させることによってＥ１Ａ遺伝子を不活性化するものであるが、ベクター内の本来とは別の位置にこの遺伝子のコピーを挿入することで補償される（ＥＬＯＩＴら， Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ７６， １５８３−１５８９， １９９５）。

このように、複製型ベクターは、ヒトアデノウイルス（前掲のＥＬＯＩＴら）、ウシアデノウイルス（ＭＩＴＴＡＬら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ７６， ９３−１０２， １９９５）、ヒツジアデノウイルス（ＸＵら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２３０， ６２−７１， １９９７）、トリアデノウイルス（ＭＩＣＨＯＵら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３， １３９９−１４１０， １９９９； ＳＨＥＰＰＡＲＤら， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．， １４３， ９１５−９３０， １９９８）、イヌアデノウイルス（Ｃａｖ２； 出願人ＲＨＯＮＥ ＭＥＲＩＥＵＸによる国際公開第９８／００１６６号パンフレットおよび米国特許第６０９０３９３号明細書； 出願人グラスゴ大学による国際公開第９１／１１５２５号パンフレットおよび米国特許第５６１６３２６号明細書、ＭＯＲＲＩＳＯＮら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２９３， ２６−３０， ２００２）およびブタアデノウイルス（ＲＥＤＤＹら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ８０， ５６３−５７０， １９９９； ＴＵＢＯＬＹら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ８２， １８３−１９０， ２００１）から構築された。

これらの複製型アデノウイルスベクターは、主としてワクチンとしての用途のために開発された。それらは、抗体に対する反応に関してもＣＴＬに対する反応に関しても、全体として、免疫応答の誘導の際に高い効率を示した（参照文献として、ＥＬＯＩＴ， Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ， ２， １０９−１２０， １９９８およびＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩら， Ｉｎ 《Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ： ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ》， ｐｐ． １６３−１７３， Ｐ． Ｓｅｔｈ， Ｅｄ．， Ｒ． Ｇ． Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｕｓｔｉｎ Ｔｅｘａｓ， ＵＳＡ）。
国際公開第９５／１４１０１号パンフレット 国際公開第９８／００１６６号パンフレット

しかしながら、これらの複製型ベクターにはいくつかの難点があり、それらは、
・かかる複製型ウイルスが拡散するおそれに関連するバイオセイフティーの問題があること、
・感染細胞によって大量のウイルス粒子が産生されることによりベクターに対する高い免疫応答の誘導が引き起こされ、追加免疫の有効性が制限されること、
・感染によって破壊された細胞から塩析したワクチン抗原が母親の抗体によって中和されることにより、若い個体におけるこれらの複製型ベクターの有効性が低下すること、である。

周囲に拡散するというおそれなしに、細胞を、とくに腫瘍細胞のような***している細胞を効果的に形質導入できるような組換えアデノウイルスは、現在のところ全くないことが分かっている。

イヌアデノウイルス２型（Ｃａｖ２）を実験モデルに選択して、発明者らは複製型組換えアデノウイルスを得ることを可能にする新規な挿入部位を識別できないか研究した。

その結果、左ＩＴＲの終わりとＥ１Ａのコード配列の始めとの間に位置する領域の始めの小さな部分の欠失は、アデノウイルスが許容宿主においてそれらのゲノムを複製し、増殖する能力に影響しないことが確認されたため、この欠失箇所が異種遺伝子の新規な挿入部位を構成することができる。

さらに発明者らは、意外なことに、同じ領域における他の欠失により、許容宿主においてそれらのゲノムの複製は可能であるが増殖はできないアデノウイルスを得ることができることを確認した。これらのアデノウイルスは、今後「擬複製型アデノウイルス」と称するものとする。

以下において、アデノウイルスゲノムのさまざまな領域の位置は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８配列におけるイヌアデノウイルス２型のゲノムの対応する（すなわち、類似の機能配列を含む）領域の位置を基準に定義されるものとする。

たとえば、左ＩＴＲの終わりとＥ１Ａのコード配列の始めとの間に位置する領域は、イヌアデノウイルス２型のＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８ゲノム配列の３１１位と４９９位との間に位置する領域に対応する。

本発明は、複製型アデノウイルスから得ることのできる組換えアデノウイルスを対象とするものであって、該組換えアデノウイルスは、イヌアデノウイルス２型のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８）の３１１位と４９９位との間に位置する領域に対応する前記複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部を欠失させることによって得ることができ、前記欠失がイヌアデノウイルス２型のゲノムの３１１位と４０１位との間に位置する領域に対応する元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部を含むことを特徴とする。

本発明による組換えアデノウイルスの第一の実施態様によれば、欠失部分は、イヌアデノウイルス２型のゲノムの３１１位と３１９位との間に位置する領域に対応する、元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部によって構成されており、この欠失によって、元の野生型アデノウイルスによる感染を許容する宿主において増殖することのできる（ウイルス産生サイクル）、複製型組換えアデノウイルスを得ることが可能になる。

本発明による組換えアデノウイルスの第二の実施態様によれば、欠失部分は、イヌアデノウイルス２型のゲノムの３１８位と４０１位との間に位置する領域に対応する、元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部を含んでおり、この欠失によって擬複製型アデノウイルスを得ることが有利には可能になるのであるが、該擬複製型アデノウイルスとは、すなわち、複製はできるが、感染ウイルス粒子を産生できず、したがって、元の野生型アデノウイルスによる感染を許容する宿主において増殖することのできない（産生不能サイクル）ものである。

本発明による擬複製型アデノウイルスの獲得には、（Ｃａｖ２ ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８配列の３４１−３４４位、３７７−３８０位および３８８−３９１位にそれぞれ位置する）５’−ＴＴＴＡ／Ｇ−３’型の推定されるキャプシド形成シグナルＡ_x、Ａ_xIおよびＡ_XIIの全体または一部を削除することがとくに含まれる。

これらの擬複製型アデノウイルス内の欠失部分は、さらに、
・イヌアデノウイルス２型のゲノムの３１１位と３１９位との間に位置する領域に対応する、元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部、および／または、
・イヌアデノウイルス２型のゲノムの４００位と４３９位との間に位置する領域に対応する、元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部；この欠失により、（Ｃａｖ２ ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８配列の４０９位に位置する）Ｅ１ＡのプロモーターのＴＡＴＡボックスがとくに削除される；および／または、
・イヌアデノウイルス２型のゲノムの４３８位と４９９位との間に位置する領域に対応する、元の複製型アデノウイルスのゲノム領域の全体または一部；この欠失により（Ｃａｖ２ ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８配列内の４３９位に位置する）Ｅ１Ａの転写開始部位がとくに削除される；
を含むことができる。

いずれの場合にも、本発明による（複製型または擬複製型）組換えアデノウイルスは、複製、転写活性化に必須の左ＩＴＲ配列（Ｃａｖ２ゲノムの６２位と９９位との間に位置する４つの反復したＧＧＴＣＡモチーフ）を保存する一方で、（それぞれＣａｖ２ゲノムの１９７−２００位、２０６−２０９位、２１３−２１６位、２２６−２３２位、２３９−２４２位、２５０−２５３位、２５８−２６１位、２７２−２７５位および３０６−３０９位に位置する）５’−ＴＴＴＧＮ₈ＣＧ−３’型のキャプシド形成シグナルＡ_I、および５’−ＴＴＴＡ／Ｇ−３’型のキャプシド形成シグナルＡ_IIからＡ_IXも保存する。該組換えアデノウイルスはまた、Ｅ１Ａのコード配列の全体、ならびにその下流に位置するＥ１遺伝子領域（Ｅ１Ａのポリアデニル化シグナルとＥ１Ｂ領域）の全体も保存する。

本発明による組換えアデノウイルスのある推奨実施態様によれば、該組換えアデノウイルスは、さらに少なくとも一つの、そのゲノム内に挿入された関心のある異種配列も含んでいる。

この実施態様による組換えアデノウイルスの構築のために、前記異種配列は、複製型アデノウイルスの場合、イヌアデノウイルス２型のゲノムの３１１位と３１９位との間に位置する領域に対応するゲノム領域に挿入されるものとする。

擬複製型アデノウイルスの場合、前記異種配列は、同様にこの領域に挿入されるか、もしくはイヌアデノウイルス２型のゲノムの３１１位と４９９位との間に位置する領域に対応するゲノム領域における全く別の場所にも挿入することができる。この領域への挿入は、欠失部分の代わりに、あるいは欠失部分の近傍で行うことができる。

複製型アデノウイルスの構築のために通常使用される任意の部位にも、同様に異種配列を挿入することができる。挿入は、例えばＥ３領域内、または米国特許第６０９０３９３号明細書に記載のごとく、Ｅ４領域と右ＩＴＲとの間に位置する領域内、または米国特許第５６１６３２６号明細書に記載のごとく、右ＩＴＲの３’部分内で行うことができる。

「異種配列」は、前記野生型アデノウイルスのゲノムの３１１位と４９９位との間に含まれる配列とは別のいっさいの配列を意味するものとする。

非制限的な例として挙げると、
・ワクチン抗原のコード遺伝子、例えば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｇａｇ遺伝子もしくはｅｎｖ遺伝子、ネココロナウイルスのＳタンパク質、Ｍタンパク質もしくはＮタンパク質、イヌまたはネコのパルボウイルスのキャプシドタンパク質、狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｇ、またはレプトスピラｓｐ．のＨａｐ−１タンパク質、など
・遺伝子治療に利用できる修正遺伝子、例えば、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の修正遺伝子、など
・癌治療に利用できる遺伝子、例えば、ＩＬ−２遺伝子、ＩＦＮγ遺伝子、
などがある。

本発明による組換えアデノウイルスは、より詳細には哺乳類のアデノウイルス、またとりわけイヌアデノウイルス、とくにイヌアデノウイルス２型に由来するものとすることができる。

本発明による組換えアデノウイルスは、当業者にはそれ自体周知の通常の技術（参照として、例えば、ＧＲＡＨＡＭおよびＰＲＥＶＥＣ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ７， １０９−１２８， １９９１）によって調製でき、とりわけ、（ｉ）二つの相同組換えの古典的技術による大腸菌における組換えゲノムの作成、および（ｉｉ）前記ゲノムの増幅と感染ウイルス粒子内へのそれらのキャプシド形成を可能にする適切な細胞株内へのこのようにして得られた組換えゲノムのトランスフェクションを含む技術によって、調製することができる。

例えば、大腸菌における相同組換え技術を用いることができ、該相同組換え技術は、ＣＨＡＲＴＩＥＲら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ７， ４８０５−４８４０， １９９６）および出願人ＴＲＡＮＳＧＥＮＥによる米国特許第６１１０７３５号明細書によって記載されたもの、もしくはＣＲＯＵＺＥＴら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４， １４１４−１４１９， １９９７）によって記載されたものなどである。これらの方法は、アデノウイルスの完全なゲノムを含む「レシピエント」ＤＮＡ分子と、アデノウイルスゲノムにおける挿入を実施しようとする領域の配列と相同の配列を伴う、前記ゲノム内に挿入する異種配列を含む「ドナー」ＤＮＡ分子との間の、分子間の相同組換えに基づいている。該レシピエント分子は、挿入部位にある、アデノウイルスゲノム内の唯一の制限部位における切断によって線状化される。組換えゲノムの選択はさらに、レシピエント分子を環状にすることに基づく。

したがって、これらの方法は、アデノウイルスのゲノムにおいて唯一の制限部位を含んでいる領域にしか前記異種配列を挿入できないという難点がある。

そこで発明者らは、挿入部位における切断によるアデノウイルスゲノムの線状化を必要としない、アデノウイルス内に異種配列を挿入する方法を開発した。

この方法がＣＨＡＲＴＩＥＲらによって記載された方法と異なる点は、
１）アデノウイルスのゲノム（レシピエント分子）内に挿入される異種ＤＮＡ断片（ドナー分子）が、アンピシリンおよびカナマイシンに対するそれらの二重の耐性に基づいて組換えプラスミドを単離することを可能にする選択マーカーを含んでいる、また
２）前記断片が、環状で、もしくは挿入部位の外側に位置する制限部位における切断によって線状化された形で、レシピエント分子と共形質転換される、
という点である。

結果として、本発明はまた、原核細胞における相同分子間組換えによる組換えアデノウイルスの調製方法を対象とするものでもあり、該調製方法は、
α）（ｉ）アデノウイルスのゲノムおよび第一の選択遺伝子を含むプラスミド；および（ｉｉ）前記プラスミドにおける挿入を実施する部位が伴う配列と相同の配列を伴った、前記ゲノム内に挿入するための異種配列を含み、さらに第一のものとは異なる第二の選択遺伝子を含んだ、あらかじめ線状化されたＤＮＡ断片；を、前記原核細胞内へ導入する過程と、
β）第一および第二の選択遺伝子を発現する組換えプラスミドを含む細胞の作成と選択を可能にするために、選択的条件で前記原核細胞を培養する過程と、
γ）選択した細胞から、前記組換えアデノウイルスのゲノムを単離する過程、
とから成ることを特徴とする。

「選択的条件」とは、第一および第二の選択因子（例えば抗生物質）が、形質転換されていない細胞は増殖させないが、共形質転換された細胞の増殖は可能にする濃度で存在する培養条件を意味するものとする。

本発明の第一の実施態様によれば、α）で用いられるプラスミドは、環状である。

本発明の第二の実施態様によれば、過程α）で用いられるプラスミドは、挿入部位の外側に位置する制限部位での切断によってあらかじめ線状化されている。

本発明のもう一つの有利な実施態様によれば、第一および／または第二の選択遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であって、例えば、アンピシリンおよびカナマイシンに対して耐性のある遺伝子である。

本発明のさらに別の実施態様によれば、第二の選択遺伝子は、過程α）で用いられるアデノウイルスのゲノム内にはない、同一または異なる、２つの制限部位に囲まれており、したがって、かかる選択遺伝子は、これらの部位での消化によって組換えアデノウイルスのゲノム配列から削除することができる。

有利には、本発明による方法は、上記の過程α）からγ）による組換えゲノムの調製の後、適切な細胞株内への該組換えゲノムのトランスフェクションという追加の過程を含んでおり、該追加の過程により、前記ゲノムの増幅と感染ウイルス粒子内へのそのキャプシド形成が可能になる。

本発明による組換えアデノウイルスの調製のために、アデノウイルスのＥ１領域、また関心のある異種配列の挿入によってＥ４領域が改変したときにはアデノウイルスのＥ４領域を発現する細胞株を使用することができ、これらの細胞株は当業者にはそれ自体周知のものである（例えば、前掲のＧＲＡＨＡＭおよびＰＲＥＶＥＣを参照）。使用可能な株の中で、２９３株のようなヒト由来の株（ＧＲＡＨＡＭら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３６， ５９−７４， １９７７）およびＤＫ／Ｅ１−２８株のようなイヌ由来の株（前掲のＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）をとりわけ挙げることができる。有利には、発明者らが構築した新規な株を用いることができ、該新規な株は、イヌアデノウイルス２型のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０４３６８）の４３９位から３５９５位に伸びている配列に対応する配列によって構成された断片の挿入によって変更されているのだが、かかる株は、上述の先行技術の株には存在している、４３９位の上流に位置する配列は含んでいない。

好ましくは、前記細胞株はイヌに由来する。

本発明はさらに、本発明による組換えアデノウイルス、とくにイヌアデノウイルスのゲノムの調製に使用できるプラスミドおよび核酸分子、ならびに先に定義したような方法によって得ることのできる、前記組換えゲノムも対象とする。

本発明は、とくに下記の核酸分子およびプラスミドを対象とする。
・下記から構成されるグループにおいて選択されたいっさいの核酸分子：
ａ）先に定義したような本発明による組換えアデノウイルスのゲノムに相当する核酸分子、および
ｂ）欠失部分の上流に位置する元の複製型アデノウイルスの配列を１０から１０００ｂｐの間、好適には少なくとも３００ｂｐ有し、また欠失部分の下流に位置する元の複製型アデノウイルスの配列を１０から５０００ｂｐの間、好適には１０と１０００ｂｐの間、さらに好適には少なくとも３００ｂｐ有する、上述のａ）の分子の断片によって構成される核酸分子（かかる分子は、さらに、欠失部分の代わりに、あるいは欠失部分の近傍に挿入された異種配列の全体または一部を含むことができる）。
・先に定義したａ）またはｂ）の核酸分子を含む、いっさいの核酸ベクター、とくにいっさいのプラスミド。

本発明はさらに、医薬品として使用するための本発明による組換えアデノウイルスも対象とする。

本発明はとくに、免疫原組成物もしくはワクチン組成物の調製、または遺伝子治療もしくは癌治療向けの医薬品の調製、ならびに組換えタンパク質の産生のための、本発明によるアデノウイルスの利用を対象とする。

好適には、前記医薬品または前記組成物は、家畜のまたは野生の肉食動物、とりわけネコ、イヌ、もしくはキツネ、またはヒトに投与するためのものである。

本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトまたは動物における、ワクチンなどの、治療のための利用にとくによく適合している。実際、ゲノムが細胞当たり少数のコピーでしか存在せず、かつ活発に***している細胞内ですぐに除去される非複製型組換えアデノウイルスとは反対に、本発明による組換えアデノウイルスは、複製型か擬複製型かを問わず、形質導入された細胞の核内で大幅に増殖し、静止細胞も腫瘍細胞のように活発に***している細胞も効果的に形質導入することを可能にする。さらに、感染粒子をまったく産生しない本発明による擬複製型アデノウイルスは、高いバイオセイフティーを示し、さらに追加免疫の際に強い免疫応答を誘導することができる。

例えばイヌアデノウイルスに由来する本発明による組換えアデノウイルスは、家畜のまたは野生の肉食動物、とりわけネコ、イヌまたはキツネにおけるワクチン接種および癌治療に用途分野がある。さらに、宿主自身の指向性があるので、これらのイヌアデノウイルスは、ヒトの遺伝子治療において、ヒトベクターによって形質導入できる組織とは異なる組織、例えば中枢神経系細胞に標的を合わせるために使用することができる。

本発明は、本発明による組換えアデノウイルスの構築および調製、ならびに、とりわけワクチン接種のための、関心のある遺伝子を発現させるためのその使用を例示する非制限的な実施例に関連した、下記の補足説明を読むことによってより良く理解できるものである。

実施例１：アデノウイルスＣＡＶ３１１−３１９、ＣＡＶ３１１−４３９ならびにＣＡＶ３１１−４０１の構築

１）組換えプラスミドの構築

下記のプラスミドを、ＤＮＡの調製、クローニングならびに分析の従来の手順を用いて構築したが、該手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡＵＳＵＢＥＬ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載のようなものである。

ａ）イヌアデノウイルス２型（Ｃａｖ２）のゲノムの完全な配列を含むプラスミドｐＣａｖ２

このプラスミドを、前掲のＣＨＡＲＴＩＥＲらによって記載されたヒトアデノウイルスの調製方法に類似の方法で、大腸菌内で相同組換えによって構築した。

このプラスミドの主要な構築過程を、図１に示した。

より正確には、１位から１０６０位の配列（断片Ａ）および２９３２３位−３１３２３位の配列（断片Ｂ）に対応する、Ｃａｖ２のマンハッタン株のゲノムの左右の末端を、下記のプライマーを用いて、Ｃａｖ２のマンハッタン株のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって別個に増幅する（ＡＰＰＥＬら， Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．， ３４， ５４３−５５０， １９７３）。
断片Ａ
５’−ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
断片Ｂ
５’−ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＧＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）

得られた断片ＡおよびＢを、プラスミドｐＣＲ２．１（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）内で別個にクローニングして、それぞれｐＣＲ２．１／左ＩＴＲプラスミドとｐＣＲ２．１／右ＩＴＲプラスミドを得る。ｐＣＲ２．１／左ＩＴＲプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによって消化し、このようにして生じた１１１１ｂｐの断片を、ｐＰｏｌｙＩＩ Ａｍｐ^Rプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１８１２８， ＬＡＴＨＥら， Ｇｅｎｅ， ５７， １９３−２０１， １９８７）のＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間でクローニングして、ｐＰｏｌｙＩＩ／左ＩＴＲと称するプラスミドを得る。ｐＣＲ２．１／右ＩＴＲプラスミドを、ＢａｍＨＩによって切断し、Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理した後に、ＸｂａＩによって切断し、このようにして生じた２０５２ｂｐの断片を、ｐＰｏｌｙＩＩ／左ＩＴＲプラスミドのＸｂａＩ部位とＰｖｕＩＩ部位の間でクローニングして、ｐＰｏｌｙＩＩ・ＩＴＲｓ・Ｃａｖ２プラスミドを得る。このプラスミドは、１０６６位にＸｂａＩ部位を含む３０７３ｂｐのＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片の形でクローニングされた、Ｃａｖ２のマンハッタン株のゲノムの左右の末端を含んでおり、ＸｂａＩ部位によって、ＤＮＡ挿入部位でのプラスミドの線状化が可能になる。

Ｃａｖ２のマンハッタン株のゲノムＤＮＡ、およびＸｂａＩ部位で線状化したｐＰｏｌｙＩＩ・ＩＴＲｓ・Ｃａｖ２のＤＮＡを、大腸菌ＢＪ５１８３ ｒｅｃＢＣ ｓｂｃＢＣ株内で共形質転換する（ＨＡＮＡＨＡＮら， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １６６， ５５７−５８０， １９８３）。ｐＣａｖ２と称する３３４２５ｂｐの組換えプラスミドを、アンピシリン耐性コロニーから単離する。

ｐＣａｖ２プラスミドは、このプラスミドの中で他にない二つのＡｓｃＩ部位を伴う３１３３１ｂｐの断片の形でクローニングされた、Ｃａｖ２の完全なゲノム（マンハッタン株）を含んでいるが、これらの部位は、Ｃａｖ２のゲノム（マンハッタン株およびトロント株）およびウシアデノウイルスつまりＯＡＶ株のゲノムの中にはない。

ｂ）シャトルプラスミド

ｂ₁）ｐＮａｖｅｔｔｅ／３１１−４３９．ＣＭＶｅＧＦＰ

６１１１ｂｐのこのプラスミドは、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現カセットの両側に、欠失部分である３１２−４３８の上流および下流（ＵｐＲｅｃＳｅｑ１−３１１およびＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ４３９−１０６０）のＣａｖ２の配列を挿入することによって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）から得られる。

このプラスミドは、下記から成る過程によって構築した。

１°）Ｃａｖ２の１位から３１１位の配列（ＵｐＲｅｃＳｅｑ）に対応する断片Ｃを、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
５’−ＴＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
５’−ＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１／ＵｐＲｅｃＳｅｑ（１−３１１）を得る。

２°）Ｃａｖ２の４３９位から１０６０位の配列（ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ）に対応する断片Ｄを、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＣＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングして、プラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（４３９−１０６０）を得る。

３°）約２０５０ｂｐの断片Ｅは、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、イントロン、ｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のコード配列ならびにポリアデニル化シグナルを含むものであり、下記の過程によって得た。

プラスミドｐＥＧＦＰ−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、ＢａｍＨＩによって切断し、Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理した後にＮｏｔＩによって消化し、このようにして得られた７４１ｂｐの断片を、プラスミドｐＣＩ（ＰＲＯＭＥＧＡ）のＸｈｏＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理してあらかじめ修復）とＮｏｔＩ部位との間でクローニングし、プラスミドｐＣＭＶｅＧＦＰを得る。

つぎにプラスミドｐＣＭＶｅＧＦＰを、ＢｇｌＩＩによって切断し、Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理した後にＢａｍＨＩによって消化して、２０５０ｂｐの断片（断片Ｅ）を得る。

４°）断片Ｅを、プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＫＳのＳｍａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入して、プラスミドｐＫＳ／ＣＭＶｅＧＦＰを得る。プラスミドｐＣＲ２．１／ＵｐＲｅｃＳｅｑ（１−３１１）を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩによって切断し、このようにして得られた３７１ｂｐの断片（断片Ｃ）を、プラスミドｐＫＳ／ＣＭＶｅＧＦＰのＫｐｎＩ部位とＳａｌＩ部位との間でクローニングして、プラスミドｐＫＳ／ＣＭＶｅＧＦＰ−Ｃを得る。プラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（４３９−１０６０）を、ＸｂａＩによって切断し、このようにして得られた６５０ｂｐの断片（断片Ｄ）を、プラスミドｐＫＳ／ＣＭＶｅＧＦＰ−ＣのＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰと称するプラスミドを得る。

ｂ₂）ｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰ

シャトルプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰを、下記の過程にしたがって、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰから構築した。

配列４０１−１０６０（ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ）を、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
５’−ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングして、プラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（４０１−１０６０）を得る。

このプラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（４０１−１０６０）を、ＥｃｏＲＩによって消化した後にＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理し、このようにして得られた断片４０１−１０６０を、あらかじめＸｂａＩによって消化した後にＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理したプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰの断片４３９−１０６０で置換して、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰを得る。

ｂ₃）ｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰ

シャトルプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰを、下記の過程にしたがって、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰから構築した。

配列３１９−１０６０（ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ）を、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
５’−ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングして、プラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（３１９−１０６０）を得る。

このプラスミドｐＣＲ２．１／ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ（３１９−１０６０）を、ＥｃｏＲＩによって消化した後にＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理し、このようにして得られた断片３１９−１０６０を、あらかじめＸｂａＩによって消化した後にＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで処理したプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰの断片４３９−１０６０で置換して、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰを得る。

ｂ₄）シャトルプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ／Ｋａｎａ

７０２７ｂｐのこのプラスミドは、ＧＦＰのカセットの方向と反対の方向のカナマイシン耐性遺伝子の発現カセットのＰｍｅＩ部位でのクローニングによってプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰから得られるものであり、下記の過程によって得られた。

Ｋａｎａ遺伝子のコード領域を、下記のプライマーを用いて、プラスミドｐＥＴ−２９ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）からＰＣＲによって増幅する。
５’−ＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングして、プラスミドｐＣＲ２．１−Ｋａｎａ／ＰｍｅＩを得る。プラスミドｐＣＲ２．１−Ｋａｎａ／ＰｍｅＩを、ＥｃｏＲＩによって切断し、Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼによって処理し、Ｋａｎａ遺伝子のコード領域を含む約９５９ｂｐの断片を、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰのＥｃｏＲＶ部位に挿入して、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ／Ｋａｎａを得る。

図２に示したこのプラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ／Ｋａｎａは、挿入する異種配列の上流に、組換えの対象であるアデノウイルス配列の間でクローニングした、抗生物質耐性遺伝子を含んでおり、有利には、アンピシリンとカナマイシンの両方に耐性のある組換え体の選択を可能にする。さらに、２つのＰｍｅＩ部位での消化によって次に組換えプラスミドから削除されるＫａｎａ遺伝子は、このプラスミドから生じた組換えアデノウイルスの配列にはない。

ｂ₅）シャトルプラスミドｐＰｏｌｙ ＩＩ ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ／Ｋａｎａ（図２）

６３３２ｂｐのこのプラスミドを、図２に示したごとく、プラスミドｐＰｏｌｙ ＩＩのＫｐｎＩ部位（４２位）とＰｖｕＩＩ部位（６３位）との間での、ｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰの４２９２ｂｐのＫｐｎＩ−ＰｖｕＩＩ断片のクローニングによって得た。

ｃ）プラスミドｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ

このプラスミドを、それぞれ図３と図４に図示した、下記の２つの選択肢ｃ１およびｃ２にしたがって、大腸菌ＢＪ５１８３株における相同組換えによって得た。

ｃ₁）環状のプラスミドｐＣａｖ２によるｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａの組み換え（図３）

１）上流の組換え配列（ＵｐＲｅｃＳｅｑ１−３１１）および下流の組換え配列（ＤｏｗｎＲｅｃＳｅｑ４３９−１０６０）ならびにＣＭＶｅＧＦＰのカセットおよびＫａｎａのカセットを含むドナー分子を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶでの消化によって、プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａから調製する。

２）１）で得られた断片と環状のプラスミドｐＣａｖ２（Ａｍｐ^R）を、大腸菌ＢＪ５１８３株内で共形質転換する。

３）そして、これらの組換えプラスミドを、アンピシリンおよびカナマイシンに対する二重の耐性に基づいて単離する。それらのうちの一つの配列である、ｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａを、酵素の制限とシーケンシングによって確認する。

４）Ｋａｎａカセットを次に、ＧＦＰの発現カセットによって置換される配列３１２−４３８が欠失したＣａｖ２ゲノムを含む、プラスミドｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰを得るように、制限酵素ＰｍｅＩでの消化によって削除する。

ｃ₂）挿入部位の外側であらかじめ線状化したプラスミドｐＣａｖ２によるｐＰｏｌｙＩＩ ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａの組換え（図４）

１）ドナー分子を、制限酵素ＳｗａＩでの消化によってプラスミドｐＰｏｌｙＩＩ ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａから調製する。

２）プラスミドｐＣａｖ２を、ＰｖｕＩ部位での切断によって線状化する。

３）１）で得られた断片と２）で得られた線状化したプラスミドｐＣａｖ２を、大腸菌ＢＪ５１８３株内で共形質転換する。

４）そして、これらの組換えプラスミドを、アンピシリンおよびカナマイシンに対する二重の耐性に基づいて単離する。それらのうちの一つの配列である、ｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ・Ｋａｎａを、酵素の制限とシーケンシングによって確認する。

５）Ｋａｎａカセットを次に、ＧＦＰの発現カセットによって置換される３１２−４３８位の配列が欠失したＣａｖ２ゲノムを含む、プラスミドｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰを得るように、制限酵素ＰｍｅＩでの消化によって削除する。

ｄ）プラスミドｐＣａｖ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰ

プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰを、ＫｐｎＩおよびＳｗａＩによって消化し、このようにして得られた３１６７ｂｐの断片と、ＰｍｅＩ部位で線状化したプラスミドｐＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰを、大腸菌ＢＪ５１８５株内で共形質転換する。相同組換えによって生じた組換えプラスミドｐＣａｖ３１１−４０１ ＣＭＶｅＧＦＰを、アンピシリンおよびカナマイシンに対する二重の耐性に基づいて選択する。

ｅ）プラスミドｐＣａｖ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰ

プラスミドｐＮａｖｅｔｔｅ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰを、ＫｐｎＩおよびＳｗａＩによって消化し、このようにして得られた３２４９ｂｐの断片と、ＰｍｅＩ部位で線状化したプラスミドｐＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰを、大腸菌ＢＪ５１８５株内で共形質転換する。相同組換えによって生じた組換えプラスミドｐＣａｖ３１１−３１９ ＣＭＶｅＧＦＰを、アンピシリンおよびカナマイシンに対する二重の耐性に基づいて選択する。

２）組換えウイルスの産生

プラスミドｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ、ｐＣａｖ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰまたはｐＣａｖ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰを、組換えアデノウイルスのゲノム配列を削除するために制限酵素ＡｓｃＩによって消化する。削除されたアデノウイルスゲノムを、次に、当業者にはそれ自体周知の通常の技術（例えば、前掲のＧＲＡＨＡＭおよびＰＲＥＶＥＣを参照）にしたがって、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）の存在の下で、Ｃａｖ２のＥ１領域を構成的に発現するイヌの細胞株ＤＫ／Ｅ１−２８内にトランスフェクションする（前掲のＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）。細胞変性効果が認められたら、トランスフェクションした細胞からウイルスを回収し、ついで同じ細胞株ＤＫ／Ｅ１−２８内で増幅し、例えば前掲のＧＲＡＨＡＭおよびＰＲＥＶＥＣに記載のような従来の手順にしたがって、塩化セシウム勾配遠心法によって精製する。

ウイルスＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ、Ｃａｖ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰならびにＣａｖ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰのゲノム配列を、酵素の制限によって、そして、ＨＩＲＴ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２６， ３６５−３６９， １９６７）により調製した感染細胞ＤＫ／Ｅ１−２８から抽出したウイルスＤＮＡの部分シーケンシングによって、確認した。組換えＣａｖウイルスの調製物を、ＳＰＥＡＲＭＡＮおよびＫＡＲＢＥＲの方法にしたがって、９６ウェルプレート内で限界希釈によって滴定した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ， Ｂｒｉａｎ Ｗ Ｊ Ｍａｔｈｙ ａｎｄ Ｈｉｌｌａｒ Ｏ Ｋａｎｇｒｏ， １９９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）。この方法で得られるＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの力価は、前掲のＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩ他に記載の手順にしたがって、ＤＫ細胞でプラーク法によって得られるｐｆｕ／ｍｌの力価と同等である。

得られた結果は次の通りである：
・単離したウイルスＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ、Ｃａｖ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰならびにＣａｖ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰの制限酵素のプロフィールと配列は、所期のものと合致している、
・精製したウイルスＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ、Ｃａｖ３１１−４０１／ＣＭＶｅＧＦＰならびにＣａｖ３１１−３１９／ＣＭＶｅＧＦＰの力価は、約１０^9.2ｐｆｕ／ｍｌである。

実施例２：組換えウイルスＣＡＶ３１１−４３９の解析

１）ネコおよびイヌの細胞へのＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰの形質導入効率と細胞変性効果の分析

イヌの細胞株（ＤＫ／Ｅ１−２８とＤＫ）およびネコの細胞株（ＣＲＦＫ）を、細胞当たり１０ｐｆｕの感染多重度で、ウイルスＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた。非感染細胞と野生型Ｃａｖウイルス（Ｃａｖ２）に感染させた細胞とをコントロールとして用いた。

感染から３日と５日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在を、光学顕微鏡で感染細胞を観察することにより分析した。さらに、ウイルスＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた細胞内の導入遺伝子の発現を、蛍光顕微鏡によるＧＦＰの検出によって確認した。

この実験の結果を、下記の表Ｉおよび表ＩＩに示した。

これらの結果が示すところは、
・導入遺伝子の高い発現レベルが、ウイルスＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた細胞で認められること、
・変更されていないイヌの細胞（ＤＫ細胞）またはこのウイルスＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰに感染させたネコの細胞では細胞変性効果がいっさい認められなかったのに対して、Ｅ１領域を発現する、このウイルスＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰに感染させたイヌの細胞にのみ大きな細胞変性効果が認められたこと、
・コントロールにおいて、野生型Ｃａｖ（Ｃａｖ２）に感染させたイヌの細胞（ＤＫとＤＫ／Ｅ１−２８）では大きな細胞変性効果が認められたのに対して、Ｃａｖ２に感染させたネコの細胞では細胞変性効果がいっさい認められないこと、である。

これらの実験結果が示すように、ウイルスＣａｖ３１１−４３９は、野生型イヌアデノウイルスの複製を許容するイヌの細胞、ならびにネコの細胞において、細胞変性効果を誘導することなしに細胞をきわめて効率的に形質導入することができる。

２）ネコおよびイヌの細胞におけるＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰの複製の分析

イヌの細胞株（ＤＫ／Ｅ１−２８とＤＫ）またはネコの細胞株（ＣＲＦＫ）を、細胞当たり１０ｐｆｕの感染多重度で、ウイルスＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた。非感染細胞と野生型Ｃａｖウイルスに感染させた細胞とをコントロールとして用いた。

感染から２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に、細胞を回収し、遠心分離した。細胞内ウイルスＤＮＡをＨＩＲＴ法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６， ３６５−３６９， １９６７）にしたがって調製し、ＥｃｏＲＩ酵素によって消化し、ついで電気泳動した後にアガロースゲル上に視覚化した。

結果を、図５に示した。

図５は、アデノウイルスＣａｖ３１１−４３９．ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた後に異なる時間（２時間、２４時間、４８時間および７２時間）でネコの細胞（ＣＲＦＫ）またはイヌの細胞（ＤＫ、ＤＫ／Ｅ１−２８）から抽出したウイルスＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲルで分析したものを示している。該アデノウイルスのＥ１領域を発現するＤＫ／Ｅ１−２８株を、複製のポジティブコントロールとして用いた。

これらの結果が示すところは、
・ウイルスＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰが、試験したイヌおよびネコの株内でそのゲノムを複製すること、
・複製レベルが、ネコの細胞内よりもイヌの細胞内での方が高いこと、
・複製のピークに達するのが、ＤＫ／Ｅ１−２８細胞内が２４時間後、ＤＫ細胞内が４８時間後であり、おそらくＤＫ／Ｅ１−２８細胞内のＥ１領域の細胞による発現がその理由であること、である。

比較として、野生型Ｃａｖウイルスに感染させたコントロールの細胞において、３つの細胞株内に同様な量のゲノムＤＮＡが認められる。

この実験の結果が示すように、３１１−４３９の欠失はイヌのアデノウイルスの複製に影響するものではなく、この欠失を有するベクター（Ｃａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰ）は、イヌまたはネコの細胞内のそのゲノムの複製に関して野生型アデノウイルスのように機能する。

３）ウイルスＣａｖ３１１−４３９・ＣＭＶｅＧＦＰに感染させたイヌの細胞におけるウイルス粒子の産生の分析

イヌの細胞株（ＤＫ）を、それぞれ細胞当たり０．１ｐｆｕ、１ｐｆｕならびに１０ｐｆｕの感染多重度で、ベクターＣａｖ３１１−４３９ ＣＭＶｅＧＦＰに感染させた。非感染細胞と野生型のウイルスＣａｖに感染させた細胞とをコントロールとして用いた。

感染細胞を、感染から２時間と６日後に回収し、冷凍と解凍を数サイクル繰り返して溶解した。細胞溶解物は、前掲の限界希釈法で滴定した。

細胞内に存在するウイルスの量を、ｐｆｕ／ｍｌで表し、下記の表ＩＩＩに示した。

これらの結果から分かるように、ウイルスＣａｖ３１１−４３９は、ＤＫ細胞のようなＥ１領域を発現しないイヌの細胞内で感染ウイルス粒子を産生せず、Ｃａｖ３１１−４３９のウイルスサイクルは、イヌの細胞内では途中で止まる。

４）ウイルスＣａｖ３１１−４３９による通常のネコへのワクチン接種

次の用量のＣａｖ３１１−４３９を複数の区のネコに筋肉内接種した。
１区（ｎ＝２）：９．６×１０⁷ｐｆｕ
２区（ｎ＝２）：９．６×１０⁶ｐｆｕ
３区（ｎ＝２）：コントロール

第１４日、第２１日ならびに第３１日に、抗ｅＧＦＰ血清抗体をＥＬＩＳＡによって滴定した。

結果を、図６に示した。

図６は、ウイルスＣａｖ３１１−４３９・ＣＭＶｅＧＦＰを以下の異なる用量で接種した後の日数第７日、第１４日、第２１日ならびに第３１日のネコにおける抗ｅＧＦＰ血清抗体の力価（Ａｃ）を示している：−■−９．６×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ（ｐｆｕ：プラーク形成単位）、―▲―９．６×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ、・・・□・・・９．６×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ、・・・○・・・９．６×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ。

これらの結果が示すように、Ｃａｖ３１１−４３９を１回注射するだけで、関心のある遺伝子に特異的な（体液性）免疫応答をネコにおいて誘導することができる。

実施例３：ＣＡＶ２のＥ１領域を構成的に発現するイヌ由来の株の構築

Ｅ１領域を発現する新規な株を、下記の過程にしたがって、ＤＫ株（イヌの腎臓細胞の不死化した株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ６２４７）から構築した。

Ｃａｖ２の４３９位から３５９５位の配列（マンハッタン株）を、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。
５’−ＣＧＧＣＣＧＡＣＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）

ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドｐＣＲ２．１内でクローニングして、プラスミドｐＣＲ２．１／Ｅ１を得る。

プラスミドｐＴＲＥ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をＢａｍＨＩによって消化し、Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼによって処理し、さらに再び環状化して、プラスミドｐＴＲＥ／ｄｌ ＢａｍＨＩを得る。

プラスミドｐＣＲ２．１／Ｅ１をＥｃｏＲＩによって消化し、このようにして得られた３１８７ｂｐの断片を、プラスミドｐＴＲＥ／ｄｌ ＢａｍＨＩのＥｃｏＲＩ部位でクローニングして、プラスミドｐＴＲＥ Ｅ１ Ｃａｖ２を得る。

このプラスミドｐＴＲＥ Ｅ１ Ｃａｖ２は、最小のＣＭＶプロモーターとＴｅｔ応答配列（Ｔｅｔ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＥｌｅｍｅｎｔすなわちＴＲＥ）オペロンによる制御下のＥ１Ａタンパク質のコード配列、それら自身のプロモーターの制御下のＥ１Ｂタンパク質のコード配列（１３３Ｒと４３８Ｒ；ＳＨＩＢＡＴＡら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７２， ４６０−４６７， １９８９）、ならびにこれらの配列の固有のポリアデニル化シグナルを含んでいる。

ｐＴＲＥ Ｅ１ Ｃａｖ２から、ＤＫ／Ｅ１−２８株（前掲のＫＬＯＮＪＫＯＷＳＫＩら）と同様な方法でＥ１領域を発現する株が得られた。

より正確には、ＡａｔＩＩ部位で線状化したプラスミドｐＴＲＥ Ｅ１ Ｃａｖ２とＡｓｅＩ部位で線状化したプラスミドｐＴＫ−Ｈｙｇ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）とを用いて、ＤＫ細胞をコトランスフェクションした。クローンをハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）の存在の下で選択し、ついでサザンブロット、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲならびにウェスタンブロットによって分析した。本発明による欠失したベクターを効果的に産生することのできる、Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）を発現する４つのクローンを単離した。

実施例４：ウイルスＣａｖ３１１−３１９によるマウスへの免疫付与

１０⁸ｐｆｕの用量の下記のウイルスを、三区に分けたマウスに筋肉内接種した。
１区（ｎ＝４）：Ｃａｖ３１１−３１９ ｅＧＦＰ
２区（ｎ＝４）：Ｃａｖ３１１−３１９ ＣＯＮＴＲＯＬ
３区（ｎ＝１）：非接種であるコントロール

ウイルスＣａｖ３１１−３１９ ＣＯＮＴＲＯＬは、挿入した異種遺伝子を除いて（ＧＦＰコード遺伝子の代わりに、ＧＦＰと抗原の類縁関係のないタンパク質をコードする異種遺伝子を挿入）、ウイルスＣａｖ３１１−３１９ｅＧＦＰと同質遺伝子である。

第７日に、接種したマウスによって産生された抗ｅＧＦＰ血清抗体をＥｌｉｓａによって滴定した。

結果を、図７に示した。

図７は、ｅＧＦＰ区（◆）、ＣＯＮＴＲＯＬ区（■）ならびにコントロール区（▲）のマウス血清の異なる希釈度（１から８は、それぞれ１／５、１／１５、１／４５、１／１３５、１／４０５、１／１２１５、１／３６４５および１／１０９３５）における４０５ｎｍでのＯＤを示している。

これらの結果が示すように、Ｃａｖ３１１−３１９を１回注射するだけで、このアデノウイルス内に挿入された異種遺伝子に特異的な（体液性）免疫応答をマウスにおいて誘導することができる。

イヌアデノウイルス２型（Ｃａｖ２）のゲノムの完全な配列を含むプラスミドｐＣａｖ２の構築過程を示した図。 ｐＰｏｌｙ ＩＩ ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰ／Ｋａｎａの構築過程を示した図。 ｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰの構築過程を示した図。 ｐＣａｖ３１１−４３９／ＣＭＶｅＧＦＰの構築過程を示した図。 各細胞から抽出したウイルスＤＮＡの断片を示した図。 各個体の抗ｅＧＦＰ血清抗体の力価（Ａｃ）を示したグラフ。 各区の光学濃度を示したグラフ。

Claims (13)

1. 配列番号１２の３１１位と３１９位との間のセグメントが欠失した、複製および感染性ウイルス粒子の産生が可能な組換えイヌアデノウイルス２型であって、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａのコード配列の全体、およびその下流に位置するＥ１遺伝子領域の全体を保持し、前記領域が、Ｅ１Ａのポリアデニル化シグナルおよびＥ１Ｂ領域を含むことを特徴とする、組換えアデノウイルス。
2. 複製型イヌアデノウイルス２型のＥ１、Ｅ２、およびＥ４コード領域、ならびに右および左ＩＴＲを包含することを特徴とする、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
3. 複製型イヌアデノウイルス２型のＥ１、Ｅ２、およびＥ４コード領域、右および左ＩＴＲ、ならびにＥ３コード領域を包含することを特徴とする、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
4. 欠失部分が、さらに、
   ・配列番号１２の４００位と４３９位との間に位置する領域に対応する、複製型イヌアデノウイルス２型のゲノム領域の全体または一部、および／または
   ・配列番号１２の４３８位と４９９位との間に位置する領域に対応する、複製型イヌアデノウイルス２型のゲノム領域の全体または一部、
   を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の組換えアデノウイルス。
5. さらにそのゲノム内に挿入された関心のある異種ポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一つに記載の組換えアデノウイルス。
6. 前記異種配列が、配列番号１２の３１１位と３１９位との間に位置する領域に対応するゲノム領域に挿入されることを特徴とする、請求項５に記載の組換えアデノウイルス。
7. 請求項１から６のいずれか一つに記載の組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする医薬品。
8. 核酸分子であって、
   ａ）請求項１から６のいずれか一つに記載の組換えアデノウイルスのゲノムに相当する核酸分子、および
   ｂ）欠失部分の上流に位置する複製型イヌアデノウイルス２型の配列を１０と１０００ｂｐの間有し、また欠失部分の下流に位置する複製型イヌアデノウイルス２型の配列を１０と５０００ｂｐの間有する、上述のａ）の分子の断片によって構成される核酸分子、
   から構成されるグループにおいて選択されることを特徴とする、核酸分子。
9. 複製型イヌアデノウイルス２型における欠失部分の下流の配列の少なくとも１０から１０００ｂｐをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の核酸。
10. 請求項８または９に記載の核酸分子を包むことを特徴とする、プラスミド。
11. ペプチドまたはタンパク質に特異的な免疫応答を誘導するための方法であって、
    特異的なペプチドまたはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドがゲノムに含まれる請求項１から６のいずれか一つに記載の組換えアデノウイルスを、その投与を必要とする対象（ヒトを除く）に投与することを含むことを特徴とする方法。
12. 特異的なペプチドまたはタンパク質に対する抗体の産生を刺激することを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 特異的なペプチドまたはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドが、組換えアデノウイルスのゲノムの３１１位と３１９位との間に導入される、請求項１１または１２に記載の方法。